여기에 우리가 설명 단일 분자 사진 활성화 지역화 현미경 라이브 초파리 melanogaster 의 모터 신경 맨끝에 실시 될 수 있습니다 하는 방법 3 유 충 탈피.
최고 해결책 현미경 검사 법 기술의 증가 수는 나노 세포 세계 지배 메커니즘을 밝히기를 돕고 있습니다. 살아있는 세포에 개별 분자의 시각화에 대 한 특별 액세스 제공 단일 분자 이미징 기세를 얻고 있다. 여기, 우리가 초파리 애벌레에 단일 입자 추적 사진 활성화 지역화 현미경 (sptPALM)을 수행 하기 위해 개발 하는 기술을 설명 합니다. 도킹, 프라이 밍, 및 포함 하는 신경 전달 물질의 융합을 추진 하는 주요 연 접 단백질에 의존 하는 시 냅 스 통신 플라즈마 막으로 소포. 단백질 지질 및 단백질-단백질 상호 작용의 범위는 밀접 하 게 이러한 프로세스 조절 및 연 접 단백질 따라서 이동성 각 이러한 키 이벤트와 관련 된 변화를 전시. 이 단백질의 이동성 그대로 살아있는 동물에 그들의 생리 기능으로 연결 하는 어떻게 조사 하 고 행동의 그들의 정확한 메커니즘을 이해 하는 데 필수적 이다. 높은 해상도 vivo에서 단백질 이동성 추출 광학 투명성, 접근성, 등 침투 깊이 한계 극복 필요 합니다. Photoconvertible 형광 단백질 Syntaxin-1A를 약간의 간접 조명을 통해 시각 및 모터 신경 터미널에서 또는 제 3의 모터 신경 축 삭을 따라 추적 수 연 접 단백질에 초파리 를 탈피 하는 방법 설명 유 충입니다.
신경 통신 원형질 막1시 냅 스의 소포를 포함 하는 신경 전달 물질의 규제 융합을 통해 발생 하는 신경 전달 물질 방출에 의존 합니다. Exocytosis2,,34,,56 라고 하는이 프로세스는 매우 동적 이며 업 또는 다운-통제 자극7의 속도 변동에 따라 될 수 있습니다. 이러한 프로세스에 관련 된 단백질 브라운 모션 적용 되며 따라서 전체 조직 유지 하는 다양 한 바인딩 이러한 생리 기능을 보강 하는 작업의 수를 표시. 플라즈마 막 단백질은 매우 동적, 원형질 막7,,89,10,11에 nanoclusters로 분자의 측면 트래핑을 허용 12. 따라서, 이러한 단백질의 이동성 조사 작업8의 그들의 모드를 명료 하 데 도움이 됩니다. 지금 알려진 다 측면 빠른 기동성을 전시 하 고 옆쪽으로 분자 제공할 수 있다 nanoclusters 내에서 트랩핑 녹는 N-ethylmaleimide 민감한 요소 첨부 단백질 수용 체 (SNAREs), 예를 들면 Syntaxin-1A, 같은 시 냅 스 단백질 창 고 그리고 소포 융해9,13,,1415에 대 한 사이트.
Photoconvertible 형광 단백질 단위체 (m) Eos16,17 가18, 등의 최근 개발 허용 했다 접근의 사용을 통해 신경 플라즈마 막 단백질의 전체 해상도 등 사진 활성화 지역화 현미경 (팜) 및 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍)14,,1519. 이러한 발전 성과 교양된 라이브 세포와 신경 생물학 단백질의 nanoclustering에 대 한 조사를 활성화 했습니다. 최근에, 연구는 실시 되었습니다 명료 (비슷한 높은 해상도)에서 역학과 라이브 그대로 생물의 신경에 있는이 막 단백질의 조직 같은 생쥐, 꼬마 선 충, 및 를 초파리 melanogaster14,20,,2122.
하지만 또한 같은 hindrances를 극복 하는 능력 뿐만 아니라 (예: 팜, 폭풍우, 및 photoconvertible fluorophores), 최근에 개발 된 슈퍼 해상도 이미징 도구를 사용 해야 역학과는 단백질에서 생체 내에서 의 조직 조사 단백질 및 이미징 레이저의 침투 깊이 접근으로 그대로 동물에 세포내 단백질 이미징 본질적으로 이미지 그대로 마우스의 해 마 같은 그대로 동물의 생활 조직 내의 깊은 포함 하는 구조 단백질으로 도전 이다. 따라서, 단백질 또는 직물의 표면 가까이는 몇 군데 더 쉽게. Vivo에서 화상 진 찰과 다른 어려움은 동물에서 재현성 보장 이다. 로 해부학 한 샘플에서 다른 다를 수 있습니다, 다른 그대로 동물 샘플에서 복제의 용이성과 구조를 선택 하면 증명할 수 있는 또한 도전. 틀에 박힌 구조를 사용 하 여 같은 synapses, 이러한 어려움 들을 극복에 도움이.
최근 연구 결과 다른 조사 예는 조직/기관의 표면에 단백질 조직 몇 군데 있다 하는 동안 꼬마 선 충22, 같은 광학 투명 한 표 피와 동물에서 단백질 이동성을 몇 군데 있다 살아있는 마우스21의 두개골을 통해 대뇌 피 질의 뉴런에 걸 이미지입니다. 경우에 따라 마 취약 사용 되었습니다 움직이지; 동물 유지 그러나, 특정 마 취약 관심사의 단백질을 저하 수 있습니다. 따라서 오류를 최소화 하기 위해 vivo에서 화상 진 찰 동안 동물을 움직이기 힘 드는 유지 하는 대체 수단을 탐험 한다.
슈퍼 해상도 이미징 vivo에서 다른 경고는 관심사의 단백질을 조명 하는 데 사용 하는 레이저 부정적인 주변 조직에 영향을 미칠 수 및 따라서 여기 강도 가능한 한 낮게 유지는 것이 좋습니다. 레이저에 의해 주변 조직의 조명 또한 배경 신호를 증가 경향이 있다. 낮은 자극 강도 사용 하 여 백그라운드를 줄이는 데 도움이 됩니다, 그리고 그것은 되 고 경고는 또한 형광 단백질 광자 수확량에서 감소 이어질 수 있습니다. 분석 하는 동안 배경 빼기 대안 이미지 분석 전에 배경 신호를 줄이기 위해 수단으로 사용 될 수 있습니다.
초파리 는 vivo에서 특정 단백질 기능 조사에 대 한 기초가 튼튼한 유전 도구 제공 이미징에 대 한 이상적인 유기 체를 선물 한다. 상류 활성화 순서 (UAS)-Gal4 시스템 단백질의 시간적, 공간적 표현 가능 하 고 따라서 neurotransmission23, 조작 하는 데 사용 될 그런 초파리 과도 사용 하 여 열 유전자 자극 수용 체 잠재력 하위 가족 A1 (dTRPA1)24 또는 광학 유전자 자극 훨씬 red 이동 CsChrimson25 를 사용 하 여 이미징14와 결합 될 수 있다. 우리는이 시스템에서 수행 하는 단일 분자 이미징 vivo에서 의 합병증의 많은 극복 하 고 지금 설명 하는 방법 단일 입자 추적 실시 될 수 있습니다 초파리 melanogaster 3 탈피 애벌레에서.
이 프로토콜 3 탈피 초파리 애벌레의 신경 근육 학 교차로에서 단백질 mEos2 태그의 단일 분자 추적을 설명합니다. -표현의 유전자 변형 단백질을 피하기 위해, Syntaxin-1A-mEos2 식 생 Syntaxin-1A 발기인에 의해 주도 되었다. 시 냅 스 단백질 이동성의 연구는 대부분 체 외에서 배양된 세포와 대뇌 피 질의 뉴런9,11,,1213의 조사 제한 되었습니다. 이 단백질 전시 살아있는 동물에서 비슷한 이동성 서명 여부를 하는 것은 크게 알려져 있다입니다. 단일 단백질 이동성에 vivo에서시각화 하 등 광학 투명성, 접근성, 그리고 침투 깊이 한계 극복할 수 있다. 애벌레 준비를 해 부하 고 시각화 하는 근육의 표면에 포함 된 신경 근육 접합부, 우리 광 투명성과 접근성의 문제를 피할. 일반 TIRF 구성에서 이미지 단일 분자 이동성 시도 실패 입증. 그러나, 약간 비스듬한 조명 사용 증가 여기 레이저 깊이 침투 수 있습니다. 또한, 유 충을 무력화 하는 데 사용 하는 minutien 핀을 단백질 이동성에 마 취 사용의 어떤 가능한 부정적인 영향을 피하기 위해 도움이. 그것은 기름 침수 목표, x 100 같은 높은 배율 목표를 사용 하 여 단일 분자 비보를 시각화 수 있습니다. 그러나, 증가 확대 초점 드리프트의 발생을 증가할 수 있습니다. 또한, 우리는 낮은 강도 (~ 30%) 사용 모터 신경 맨끝에 단일 분자 이미지를 성공적으로 561 nm 레이저. 추가 테스트 하는 것은 저전력 레이저를 사용 하 여 필요할 수 있습니다.
이 프로토콜은 신경 원형질 막의 근접 내의 시 냅 스 단백질의 이동성을 시각화 적당 하다. 이 방법을 사용 하 여, 작은 단백질-Syntaxin-1A 및 바인딩 단백질 Atg18a autophagosome-의 이동성 성공적으로 이미지 비보14,26되었습니다. 모터 신경 축 삭도 수에 단백질의 이동성27조사. 그러나, 뇌 또는 복 부 신경 코드에 단백질의 이동성의 기본 조직을; 제작한 높은 배경 신호 때문에 평가 하기 어려운 증명할 수 있습니다. 또한, (replicability 되도록) 뇌 구조를 태그 붙일 필요 합니다 같은 뇌 구조에 단백질 이동성을 시각화 하 고 듀얼 카메라 이미징의 사용을 필요한 것.
보다 더 많은 개발 3 탈피 애벌레38,39 초파리 에서 슈퍼 해상도 현미경에 대 한 현재 사용할 수 있는 방법은 주로 이미징 배아, 제한 됩니다. 이러한 프로토콜 주요 문제는 그들은 몇 군데, 지역에서 궤도의 낮은 수를 산출 하 고 그러므로 이동성 상태22,40의 심층 분석을 방지. 우리의 vivo에서 단일 분자 프로토콜 추적 궤적의 높은 번호를 생성 하는 능력 있으며 따라서 Caenorhabiditis 선 충 , 제 브라 등 다른 동물 모델에서 사용 될 수 있습니다. 실제로, 모든 NMJ 체인 생성 ~ 2400 궤도 다른 모바일 상태와이 상태14,27사이 전환 분석을 위해 적당 한 만들기. 또한, 많은 비보에 단일 분자 이미징 전략은 동물20,22는 이미징 이루어집니다 physiologic 기능을 변경할 수 있는 무력화 하는 마 취약의 사용에 의존 합니다. 여기 우리는 minutien 핀을 사용 하 여 애벌레를 무력화 하는 ‘ 마 취 무료 ‘ 프로토콜을 최적화.
이 프로토콜의 사용 가능성은 3 개 차원에 있는 단백질의 이동성을 시각화에 대 한 있을 수 있습니다. 슈퍼 해상도 현미경에 최근 발전 있도록 단백질 이동성 시각화 된 체 외에 ‘x’, ‘y’, 그리고 ‘z’ 차원41,42. 우리의 현재 메서드의 ‘z’ 축에 있는 단백질의 이동성에 대 한 고려 하지 않습니다. 그러나 터미널 초파리 모터 신경 구형 구조 이며 귀중 한 미래의 접근 3 차원 볼륨43단백질 이동성을 계량 하는 것. Z-차원에서 이미징은 난시 렌즈를 사용 하 여 가능 합니다. 또는, TIRF 모드44,45, z-해상도 증가 된다. 그러나, 우리의 실험에서 난시 렌즈 없이 syntaxin1A mEos2의 단일 분자 시각화에 약간 비스듬한 조명을 사용 했습니다.
결론적으로, 두 유전자 변형 초파리 비행 재고 표현 하는 단백질의 유전자 변형 유 충으로 변화의 가능성을 갖춘 TIRF 현미경을 해 부하는 photoconvertible 단백질, PDMS 기본 태그로 조명의 각도이 프로토콜에 설명 된 대로 단일 단백질을 시각화 하는 데 필요한 가장 중요 한 도구입니다.
The authors have nothing to disclose.
우리가 단일 분자 분석 종류 그들의 지원을 위해 장 바티스트 Sibarita와 다니엘 Choquet (IINS, CNRS/보르도의 대학) 감사합니다. 우리는 특히 닉 Valmas 감사와 비디오와 그들의 도움에 대 한 제시카 Mcgaw (QBI, 퀸즐랜드의 대학) 녹음, 음성으로 그래픽 디자인을 그림. 이 작품은 호주 연구 협의회 (AR) 검색 프로젝트에 의해 지원 되었다 (F.A.M. DP170100125), 호주 연구 협의회 (F.A.M. LIEF 그랜트 LE0882864), 미래 친교 (FT100100725 B.V.S.), 호주 연구 협의회 (LIEF 부여 F.A.M에 LE130100078입니다.) 그리고 NHMRC 프로젝트 부여 (B.V.S.에 APP1103923). F.A.M. NHMRC 수석 연구원 (ONT1060075)입니다.
PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
Glass-bottomed Culture Dish | In Vitro Scientific | D29-20-1.5-N | |
Optical Stereo-microscope | Olympus | SZ51 | |
Curved Tweezers (Style 5/45) | Electron Microscopy Sciences | 0208-5AC-PO | |
Minutien Pins (0.1mm) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Schneider's Insect Medium | Sigma, Life Sciences | S0146 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
ELYRA PS.1 Microscope | Zeiss | PS.1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-515Q | |
Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
Normal Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) | Axygen | MCT-175-C | |
Zen Black acquisition software | Carl Zeiss, 2012 | ||
Metamorph software | Molecular Devices | 7.7.8 | PALM Tracer Plugin |
Fly strain | w1118; HA-Sx1A-mEos2 |