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Genetics

मॉडल प्रणाली ढाणियो rerio में कुशल उत्पादन और CRISPR/Cas9 जनित जीन नॉकआउट की पहचान

Published: August 28, 2018 doi: 10.3791/56969
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Purdue University

Summary

मॉडल प्रणाली ढाणियो rerio (zebrafish) में लक्षित जीनोम संपादन बहुत CRISPR के उद्भव द्वारा सुविधा है आधारित दृष्टिकोण । इस के साथ साथ, हम पीढ़ी और CRISPR की पहचान के लिए एक सुव्यवस्थित, मजबूत प्रोटोकॉल का वर्णन-बकवास alleles कि heteroduplex गतिशीलता परख और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग कर उत्परिवर्तनों की पहचान को शामिल कर ली ।

Abstract

संकुल, नियमित रूप से अंतराल, लघु, palindromic दोहराने (CRISPR) स्ट्रेप्टोकोकस pyogenes की प्रणाली के लक्षण वर्णन एक अनुकूलन मंच के विकास के लिए तेजी से एक विस्तृत विविधता में जीन संशोधनों उत्पंन सक्षम है जीवों सहित zebrafish. CRISPR आधारित जीनोम संपादन एक CRISPR संबद्ध (कैस) endonuclease एक जीनोमिक डीएनए (gDNA) ब्याज के लक्ष्य के लिए लक्ष्य है, जहां कैस endonuclease एक डबल-किनारा तोड़ (DSB) उत्पंन करने के लिए एक एकल गाइड आरएनए (sgRNA) का उपयोग करता है । त्रुटि-प्रवण तंत्र के द्वारा DSBs के सम्मिलन और/या हटाए गए (indels) के लिए लीड की मरंमत । यह frameshift उत्परिवर्तनों है कि अक्सर कोडन अनुक्रम के भीतर एक समय से पहले बंद codon परिचय, इस प्रकार एक प्रोटीन-अशक्त एलील पैदा कर सकता है । CRISPR आधारित जीनोम इंजीनियरिंग केवल कुछ आणविक घटकों की आवश्यकता है और आसानी से microinjection द्वारा zebrafish भ्रूण में शुरू की । इस प्रोटोकॉल zebrafish microinjection के लिए CRISPR रिएजेंट उत्पंन करने के लिए और CRISPR के germline संचरण का प्रदर्शन मछली की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों का वर्णन-संशोधित जीन । इन तरीकों sgRNAs के इन विट्रो प्रतिलिपि में शामिल हैं, CRISPR रिएजेंट के microinjection, लक्ष्य साइट पर एक पीसीआर आधारित विधि का उपयोग कर प्रेरित indels की पहचान एक heteroduplex गतिशीलता परख (HMA) कहा जाता है, और indels के लक्षण वर्णन दोनों एक कम प्रवाह और एक शक्तिशाली अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) का उपयोग-आधारित दृष्टिकोण है कि कई पीसीआर heterozygous मछली से एकत्र उत्पादों का विश्लेषण कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक मछली की दोनों संख्या और उपकरणों के विश्लेषण प्रदर्शन की जरूरत के प्रकार को कम करने के लिए सुव्यवस्थित है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को स्नातकों सहित अनुभव के सभी स्तरों के प्रयोगशाला व्यक्तिगत द्वारा उपयोग के लिए उत्तरदाई बनाया गया है, इस शक्तिशाली उपकरण को सक्षम करने के लिए आर्थिक रूप से किसी भी शोध CRISPR प्रदर्शन में रुचि समूह द्वारा नियोजित हो आधारित zebrafish में जीनोमिक संशोधन ।

Introduction

eukaryotes भर में आणविक मशीनरी के संरक्षण अनुसंधान के लिए मॉडल जीवों का उपयोग करने की शक्ति को निर्भर करता है । इन मॉडल प्रणालियों के कई रिवर्स के उपयोग की सुविधा-आनुवंशिक दृष्टिकोण जैसे लक्षित जीन नॉकआउट के लिए एक जैविक या ब्याज की बीमारी की प्रक्रिया के लिए एक जीन उत्पाद के योगदान को चिह्नित । ऐसे zebrafish के रूप में जीवों में जीन व्यवधान तकनीक ऐतिहासिक frameshift उत्परिवर्तनों के लक्षित परिचय पर भरोसा किया है कि DSBs1,2की गलत मरंमत से परिणाम । जब एक DSB जीनोम में पेश किया है, डीएनए घाव दो रास्ते है कि लगभग सभी कोशिका प्रकार और जीवों में सार्वभौमिक मौजूद है में से एक के माध्यम से मरंमत की है: गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने (NHEJ) और समरूपता-निर्देशित मरंमत (HDR)3,4 . NHEJ मशीनरी की गलत प्रकृति अक्सर विभिन्न लंबाई5,6,7,8,9के indels पैदा करता है । एक जीन के कोडिंग अनुक्रम में frameshift उत्परिवर्तनों का परिचय एक समय से पहले बंद codon, जो अक्सर जीन unfunctioned renders उत्पादन कर सकते हैं ।

zebrafish में जल्दी जीनोम इंजीनियरिंग रणनीतियों को बढ़ावा देने के लिए indels शामिल meganucleases, जस्ता उंगली nucleases, और प्रतिलेखन उत्प्रेरक-जैसे प्रभाव nucleases, जो सभी का उपयोग डीएनए प्रोटीन बातचीत के लिए एक nuclease लक्ष्य एक विशिष्ट जीनोमिक लक्ष्य जहां यह एक DSB10,11,12,13,14,15की शुरुआत की । हालांकि, इन प्रौद्योगिकियों अक्सर श्रमसाध्य और जटिल इंजीनियरिंग के लिए एक nuclease है कि ब्याज की डीएनए अनुक्रम लक्ष्य उत्पंन करने की आवश्यकता के कारण लागू करने के लिए मुश्किल हैं । पिछली रणनीतियों के विपरीत, CRISPR आधारित जीन संपादन प्रोटीन पर भरोसा नहीं है लक्ष्यीकरण के लिए डीएनए बातचीत । इसके बजाय, CRISPR-संबद्ध (Cas) endonuclease एक आरएनए गाइड के माध्यम से निर्देशित किया गया है कि न्यूक्लियोटाइड आधार बाँधना बातचीत का उपयोग करता है एक जीनोमिक साइट के हित के लक्ष्य के लिए16,17,18,19 ,20,21. लक्ष्य के लिए वांछित आधार बाँधना के साथ एक आरएनए गाइड डिजाइनिंग की सादगी के कारण यह अपेक्षाकृत वांछित लोकस को कैस endonuclease को लक्षित करने के लिए आसान है. प्रकार द्वितीय CRISPR प्रणाली विशेष रूप से जीनोम संपादन एक एकल multidomain कैस nuclease (Cas9) कि डीएनए के साथ बातचीत की आवश्यकता है endonuclease गतिविधि को उत्तेजित करने के उपयोग सहित कई लाभप्रद सुविधाओं के कारण अनुप्रयोगों के लिए विकसित किया गया है और एक गाइड आरएनए (sgRNA) का उपयोग करने के लिए यह cognate डीएनए अनुक्रम18को लक्षित करने के लिए । अनुक्रम cognate sgRNA के लक्ष्यीकरण के लिए आवश्यक आवश्यकताओं को अच्छी तरह से19समझ रहे हैं, और वांछित sgRNA आसानी से इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा उत्पंन होता है । सादगी और CRISPR/Cas9 दृष्टिकोण की मजबूती बहुत zebrafish में लक्षित आनुवंशिक संशोधन और अंय जीवों की एक विस्तृत विविधता की सुविधा ।

बढ़ाया CRISPR के विकास का एक परिणाम के रूप में zebrafish में जीनोम संपादन को लक्षित करने की क्षमता आधारित रिएजेंट काफी वृद्धि हुई है इस तरह केंद्रीय तंत्रिका हड्डीवाला जीवों की प्रक्रियाओं का द्योतक अध्ययन करने का अवसर सिस्टम. zebrafish जीनोम में मानव जीनोम में पाए जाने वाले प्रोटीन-कोडिंग जीन के ७०% के orthologs होते हैं और साथ ही मनुष्यों में रोगों से जुड़े जीन का ८४%22. Zebrafish विकास कई प्रमुख गुण है कि रिवर्स आनुवंशिक अध्ययन में इसके उपयोग को बढ़ाने दर्शाती है: भ्रूण बड़े चंगुल में रखी, मां उंहें microinjection द्वारा आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी बनाने से बाह्य विकसित कर रहे हैं, और वयस्क Zebrafish उंर के 3 महीने से यौन परिपक्व, वांछित लाइनों के तेजी से प्रचार के लिए अनुमति23।

कई प्रोटोकॉल उपलब्ध है कि उत्पंन करने के लिए दृष्टिकोण की एक किस्मका वर्णन और zebrafish24,25,26,27,28,29 में CRISPR व्युत्पंन indels की पहचान ,३०,३१. हालांकि, इन प्रक्रियाओं के कई समय गहन हैं, महंगे उपकरणों के लिए उपयोग की आवश्यकता होती है, और सीमित विशेषज्ञता के साथ प्रयोगशालाओं के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है । कदम यहां वर्णित एक सरल, मजबूत, और किफायती CRISPR/Cas9-zebrafish पीटकर लाइनों इंजीनियर रणनीति प्रदान करते हैं । यह प्रोटोकॉल डीएनए oligonucleotides (ओलिगोस्पर्मिया), अंय दृष्टिकोण है कि पहले३२वर्णित किया गया है के समान का उपयोग sgRNAs संश्लेषित करने के लिए एक अत्यधिक कुशल किट के उपयोग का वर्णन करता है । वर्णित प्रोटोकॉल विशेष रूप से दो कदम है कि बहुत CRISPR के विश्लेषण को सरल-रूपांतरित लाइनों में शामिल है: पीसीआर के कदम-दर-कदम उपयोग HMA३३ आसानी से जीनोम संशोधनों की उपस्थिति का निर्धारण करने के लिए, और अनुक्रमण विश्लेषण के heterozygous zebrafish तेजी से और आसानी से एक किफायती फैशन में एकाधिक indels की प्रकृति का निर्धारण करने के लिए । इसके अलावा, कदम दर कदम निर्देश मजबूत चयन, विश्वसनीय उत्पादन, और गाइड RNAs के इंजेक्शन के लिए शामिल किए गए हैं । कदम यहां उदाहरण देना एक मजबूत, अपेक्षाकृत सस्ती प्रोटोकॉल है कि विशेषज्ञता की एक सीमा के साथ प्रयोगशाला कर्मियों को सक्षम बनाता है zebrafish में जीन नॉकआउट की पहचान में योगदान प्रदान करता है ।

Protocol

इस अध्ययन की देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के साथ सख्त अनुसार किया गया था । इस प्रोटोकॉल को इन्होने एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी (PACUC number 08-031-11) द्वारा अनुमोदित किया था ।

1. गाइड आरएनए उत्पादन के लिए टेम्पलेट-विशिष्ट ओलिगोस्पर्मिया का डिजाइन

  1. ब्याज के लक्ष्य क्षेत्र का चयन करने के लिए जीन के कोडिंग क्षेत्र में संशोधित किया जाना है । इस जीन के 5 ' अंत के करीब होना चाहिए करने के लिए एक छोटा प्रोटीन उत्पंन, लेकिन ऐसा नहीं है कि एक बाद में फ्रेम शुरू codon एक मामूली N-टर्मिनल जनचेतना के साथ एक प्रोटीन के उत्पादन में सक्षम बनाता है बंद ।
    नोट: एक तरह से इस संभावना बाधा के लिए एक फ्रेम में codon के लिए जीन के बहाव कोडन क्षेत्र स्कैन है । इसके अलावा, एक गाइड आरएनए है कि एक बड़े एक्सॉन के बीच लक्ष्य का उपयोग कर, परिणामस्वरूप indel के बाद स्कोरिंग के लिए पीसीआर प्राइमरों की पहचान करने में मदद कर सकते हैं ।
  2. एक गाइड आरएनए चयन कार्यक्रम का उपयोग कर ब्याज की जीनोमिक क्षेत्र में संभावित गाइड साइटों की पहचान ( सामग्री की तालिकादेखें)३४,३५,३६. ब्राउज़र डेटा सेट करने के लिए ढाणियो rerio और protospacer सन्निकट आकृति (पाम) अनुक्रम करने के लिए 5 '-NGG-3 '.
    नोट: आदर्श gRNA अनुक्रम शामिल इन विट्रो प्रतिलेखन में कुशल T7 के लिए gRNA की पहली स्थिति में एक 5 '-जी । यदि कोई स्वीकार्य गाइड 5 ' स्थिति में एक जी के साथ पाया जाता है, एक और गाइड के 5 ' आधार एक जी या एक जी को बदल दिया जा सकता है गाइड आरएनए के 5 ' अंत पर जोड़ा जा सकता है, लेकिन यह क्षमता३७को काटने कम हो सकती है । काटने की क्षमता को अधिकतम करने के लिए, एक इष्टतम गाइड अनुक्रम 40-80% GC सामग्री है (उच्च बेहतर है), और शामिल 20वें स्थान पर एक जी, पाम के निकट है, लेकिन३८की आवश्यकता नहीं है । एक आदर्श लक्ष्यीकरण अनुक्रम का एक उदाहरण: 5 '-जी (एन)18 जी-3 '-NGG (NGG पाम है) । गाइड आरएनए चयन कार्यक्रम से परिणामों की जांच करने के लिए इसके अलावा ऊपर वर्णित के रूप में इष्टतम गाइड RNAs की पहचान करने के लिए, देखभाल की भविष्यवाणी की मजबूत बंद लक्ष्य प्रभाव जो बहुत बहाव विश्लेषण जटिल के साथ गाइड RNAs से बचने के लिए लिया जाना चाहिए । विशेष रूप से, गाइड RNAs के साथ बंद की भविष्यवाणी की-लक्ष्य प्रभाव है कि कोडन क्षेत्रों के भीतर गिर बाहर रखा जाना चाहिए, और कुल बंद लक्ष्य साइटों की भविष्यवाणी की कम किया जाना चाहिए ।
  3. गाइड आरएनए डिजाइन उपकरण के उत्पादन से, पाम अनुक्रम (5 '-NGG-3 ′ बाहर); यह लक्ष्यीकरण के लिए इस्तेमाल नहीं किया है, लेकिन Cas9 दरार के लिए मांयता अनुक्रम शामिल हैं ।
  4. शेष 20 न्यूक्लियोटाइड (एनटीएस) करने के लिए, T7 प्रवर्तक अनुक्रम और ओवरलैप अनुक्रम (एक पाड़ oligo पूर्ण लंबाई की सिफारिश में इन विट्रो प्रतिलेखन किट में आपूर्ति की sgRNAs के लिए उपयोग किया जाता है के लिए पूरक क्षेत्र) जोड़ने के क्रम में संकेत दिया नीचे एक ५४ nt oligo प्राप्त करने के लिए: T7 प्रवर्तक अनुक्रम: 5 ′-TTCTAATACGACTCACTATA-3 ′; गाइड आरएनए अनुक्रम 5 ′-g (N)18 g-3 ′; ओवरलैप अनुक्रम: 5 '-GTTTTAGAGCTAGA-3 ′
  5. पीसीआर प्राइमरों की पहचान है कि अनुमानित कटौती साइट पार्श्व (Cas9 पाम अनुक्रम के 3 nt ऊपर सट) 50 की दूरी पर-150 आधार जोड़े (बीपी) प्रत्येक वेब का उपयोग कर कटौती से सॉफ्टवेयर आधारित ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    नोट: ये दक्षता काटने की माप के लिए बाद में एक कदम में इस्तेमाल किया जाएगा । यदि कोई उपयुक्त प्राइमर इन बाधाओं का उपयोग कर की पहचान कर रहे हैं, एक और गाइड आरएनए साइट पर विचार करने की आवश्यकता हो सकती ।
  6. आदेश ५४ nt oligonucleotides लक्ष्य साइटों के विश्लेषण के लिए गाइड आरएनए और पीसीआर प्राइमरों का उत्पादन करने के लिए ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    नोट: एक वैकल्पिक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, यह एक sgRNA वर्णक के उत्पादन के लिए आवश्यक एक जीन लक्ष्यीकरण के लिए एक आसानी से बनाए दृश्य phenotype का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल के प्रदर्शन को सत्यापित करने के लिए उपयोगी हो सकता है (प्रतिनिधि परिणामों के लिए 1 चित्रा देखें) । एक आम लक्ष्य जीन टायरोसिनेसहै, oligo का उपयोग (गाइड आरएनए अनुक्रम रेखांकित किया जाता है)३९: 5 ′-TTCTAATACGACTCACTATAGGACTGGAGGACTTCTGGGGGTTTTAGAGCTAGA-3 ′

2. भ्रूण Microinjection के लिए CRISPR-रिएजेंट तैयार करना

  1. आदेश व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Cas9 प्रोटीन (सामग्री की तालिका देखें) ।
    नोट: Cas9 mRNA के इंजेक्शन भी zebrafish४०,४१में indels उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन zebrafish प्रोटीन के साथ microinjection भ्रूण Cas9 अधिक कुशल३२,४२दिखाया गया है ।
    1. एक 1 मिलीग्राम/एमएल समाधान उत्पंन करने के लिए आपूर्ति की बफर में Cas9 प्रोटीन निलंबित । फ्रीज-गल चक्र की संख्या को कम करने के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर ट्यूबों में इंजेक्शन के लिए तैयार aliquots में समाधान की दुकान । एक 5 µ एल इंजेक्शन समाधान उत्पन्न करने के लिए, 2 µ l की 1 mg/एमएल Cas9 सॉल्यूशन का प्रयोग किया जाता है, इसलिए Cas9 को पीसीआर स्ट्रिप-ट्यूब का प्रयोग करके 2 aliquoted l µ में aliquots जा सकता है ।
  2. sgRNA संश्लेषित इन विट्रो प्रतिलेखन किट में sgRNA का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें) । में इन विट्रो प्रतिलिपि निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन ।
    नोट: सभी संश्लेषण के दौरान RNase मुक्त तकनीक को बनाए रखने, साफ-अप, और इंजेक्शन समाधान तैयारी कदम. उदाहरण के लिए, डिस्पोजेबल दस्ताने का उपयोग करें और उंहें अक्सर बदल जाते हैं, ट्यूब और सुझाव है कि RNase मुक्त प्रमाणित कर रहे हैं, और स्वच्छ सतहों और पिपेट labware को दूषित करने के लिए उपलब्ध समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  3. RNase-मुक्त तकनीक का उपयोग करके एक अमोनियम/एसीटेट वर्षा का उपयोग कर संश्लेषित sgRNA को शुद्ध करे ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, sgRNAs एक अपेक्षाकृत मामूली लागत के लिए किट साफ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कॉलम आधारित आरएनए की एक किस्म का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है ।
    1. अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए 5 एम अमोनियम एसीटेट और भंवर के 25 µ एल जोड़ें ।
      नोट: अमोनियम एसीटेट समाधान व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है ( सामग्री की तालिकादेखें), या एक 5 मीटर समाधान RNase-मुफ्त पानी की 1 मिलीलीटर के लिए आणविक ग्रेड अमोनियम एसीटेट के ३८५.४ मिलीग्राम जोड़कर घर में बनाया जा सकता है और-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
    2. प्रत्येक नमूने के लिए २०० प्रूफ nuclease-मुक्त इथेनॉल के १५० µ एल जोड़ें । 20 मिनट की एक ंयूनतम के लिए एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में प्रतिक्रिया प्लेस ।
      नोट: नमूने-८० डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन काफी कुल आरएनए उपज में वृद्धि नहीं होगी ।
    3. 20 मिनट के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस microcentrifuge में अधिकतम गति (> 16, 000 एक्स जी) पर नमूने केंद्रापसारक ।
    4. supernatant ध्यान से धीरे से निकालें तरल बंद pipetting, आरएनए गोली सुनिश्चित करने के लिए परेशान नहीं है.
    5. ७०% इथेनॉल की 1 मिलीलीटर जोड़ें (RNase-मुक्त पानी में कमजोर nuclease-मुक्त इथेनॉल के द्वारा बनाई गई) और धीरे ट्यूब से अवशिष्ट नमक धोने के लिए इसे कई बार पलटने से ट्यूब मिश्रण ।
    6. 7 मिनट के लिए केंद्रापसारक कदम दोहराएं ।
    7. पहले pipetting से supernatant निकालें एक P1000 पिपेट का उपयोग कर समाधान के अधिकांश, तो एक P200 पिपेट का उपयोग करने के लिए गोली perturbing के बिना संभव के रूप में ज्यादा समाधान के रूप में हटा दें । इस तरह के एक लामिना प्रवाह हूड या एक बेंच शीर्ष के रूप में एक साफ अंतरिक्ष में आरएनए गोली सूखी, RNase संदूषण से बचने के लिए सावधान किया जा रहा, 15 मिनट के लिए या जब तक कोई और तरल बूँदें ट्यूब में दिखाई दे रहे हैं.
    8. RNase के 30 µ एल में गोली resuspend-नि: शुल्क पानी, उत्पाद (उदाहरण के लिए एक spectrophotometer का उपयोग) यों तो, और एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में लंबी अवधि के भंडारण के लिए समाधान aliquot ।
      नोट: ठेठ सांद्रता से लेकर 800-2500 एनजी/µ एल
  4. वैकल्पिक सत्यापित करें कि पूर्ण लंबाई आरएनए यूरिया का उपयोग कर उत्पन्न किया गया है/ वैकल्पिक रूप से, आरएनए बरकरार है सत्यापित करने के लिए एक agarose जेल का उपयोग करें ।
    नोट: हालांकि, अगर एक agarose जेल का उपयोग gRNA की एक बड़ी राशि के लिए आरएनए कल्पना चलाया जाना चाहिए, और लंबाई सही निर्धारित नहीं किया जा सकता है । जब मछली में एजेंट के इंजेक्शन के बाद लक्ष्य काटने की दक्षता का विश्लेषण, अगर वहां कोई या थोड़ा काटने मौजूद है तो sgRNA क्षरण के लिए जांच की जानी चाहिए ।
    1. TBE में ४०% polyacrylamide (19:1) और 8 मीटर यूरिया समाधान और उपकरण४३के लिए RNAse मुक्त तकनीक का उपयोग कर के साथ एक 8% polyacrylamide जेल डाली ।
      नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सामग्री उपकरणों को साफ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    2. के बाद जेल पूरी तरह से जम गया है (लगभग 30 मिनट), यह TBE चल बफर में रखकर और ट्रो प्रदर्शन 30 मिनट के लिए 5 वी/
    3. मिश्रण 300-2x आरएनए जेल लोड हो रहा है डाई के एक समान मात्रा के साथ sgRNA के एनजी 500 ( सामग्री की तालिकादेखें) । एक P1000 का प्रयोग, एक अच्छी तरह से कई बार में बफर चल pipetting द्वारा किसी भी मलबे के कुओं को साफ । समाधान (ओं) लोड और 10 V/मुख्यमंत्री पर २.५ एच के लिए जेल चलाते हैं ।
      नोट: एक मार्कर लेन यहां आरएनए की लंबाई कल्पना करने के लिए उपयोगी है, लेकिन आवश्यक नहीं है; पूरी लंबाई आरएनए (चित्रा 2) संश्लेषित किया गया है आम तौर पर यह आसानी से स्पष्ट है.
    4. एक न्यूक्लिक एसिड दाग का उपयोग कर बैंड कल्पना ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
      नोट: sgRNA बैंड एक बैंड के रूप में प्रकट होना चाहिए, जबकि धब्बा आरएनए गिरावट (चित्रा 2) इंगित करता है ।

3. Microinjection का CRISPR-अवयव Zebrafish भ्रूण में

  1. प्रजनन टैंक की स्थापना करने से पहले वांछित पुरुषों और महिलाओं (आमतौर पर 2 महिलाओं और 1 या 2 पुरुषों) की संख्या में एक डिवाइडर के साथ एक प्रजनन टैंक में४४स्थान पर रखकर इंजेक्शन के लिए रात ।
  2. 1x E3 मीडिया में १.५% agarose के साथ एक microinjection प्लेट तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) ०.०१% methylene नीले (एक फंजीसाइड) के साथ एक 10 सेमी agarose पकवान में पिघला पेट्री के ३५ मिलीलीटर डालने और धीरे से एक प्लास्टिक मोल्ड करना कील के आकार में गर्त बनाने के लिए समाधान, हवा बुलबुले को खत्म करने के लिए मोल्ड दोहन ।
  3. अनुमति agarose सेट करने के लिए, और मीडिया की एक छोटी राशि के साथ पकवान की दुकान और आयल फिल्म में लिपटे को 4 डिग्री सेल्सियस पर बाहर सुखाने से प्लेट को रोकने के ।
    नोट: इंजेक्शन प्लेटें कई हफ्तों के लिए पुनः प्रयोज्य हैं, जब तक कुओं विकृत या सूखी हो, या थाली मोल्ड बढ़ने शुरू होता है ।
  4. इंजेक्शन की सुबह, गल शुद्ध sgRNA और बर्फ पर Cas9 प्रोटीन । RNase संदूषण को रोकने के लिए दस्ताने के साथ सभी सामग्रियों को संभाल करने के लिए और RNase मुक्त सुझावों और ट्यूबों का उपयोग करने के लिए याद रखें ।
  5. Cas9 प्रोटीन और Cas9 के 2:1 के अनुपात में sgRNA के संयोजन से एक 5 µ एल इंजेक्शन समाधान उत्पन्न: sgRNA ४०० स्नातकोत्तर/nL Cas9 प्रोटीन और २०० स्नातकोत्तर/nL sgRNA के अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए. Cas9 और sgRNA एक ribonucleoprotein परिसर बनाने के लिए अनुमति देने के लिए 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर Cas9/sgRNA समाधान मशीन । जोड़ें ०.५ µ एल के २.५% wt/vol phenol लाल समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें), और RNase-मुक्त पानी की एक अंतिम मात्रा के लिए 5 µ l
    नोट: समाधान के ईओण ताकत Cas9 के घुलनशीलता को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है/sgRNA परिसर, इसलिए KCl के अलावा sgRNAs के काटने की क्षमता में वृद्धि हो सकती है कि कम indel गठन28प्रदर्शन ।
  6. एक micropipette खींचने का उपयोग कर एक १.० मिमी ग्लास केशिका खींचकर एक इंजेक्शन सुई बनाओ । हौसले से बनाया सुई एक नया उस्तरा ब्लेड या संदंश का उपयोग कर एक angled खोलने कि आसानी से घर का काम और जर्दी थैली पियर्स जाएगा प्राप्त करने के टिप में कटौती ।
  7. हवा के स्रोत के साथ एक microinjector से जुड़ी एक micromanipulator में सुई जगह पर बने. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप विशेष तंत्र के लिए निर्धारित अंशांकन के लिए उपयुक्त आवर्धन का उपयोग कर के तहत, सुई लगातार एक पेट्री खनिज तेल से भरे पकवान में एक 1 nL समाधान बाहर निकालता है जब तक इंजेक्शन दबाव समायोजित करें ।
    नोट: सुई की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है । अभ्यास एक सुई उत्पादन और भ्रूण की जर्दी थैली में इंजेक्शन जब तक इस कौशल है आगे प्रयोगों४५का प्रयास करने से पहले महारत हासिल है ।
  8. डिवाइडर निकालें और मछली लगभग 15 मिनट के लिए नस्ल के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: अब प्रजनन बार अधिक भ्रूण का उत्पादन होगा, लेकिन इंजेक्शन पूरा किया जाना चाहिए, जबकि भ्रूण 1 सेल मंच पर है मौका है कि Cas9 काटने जल्दी हो जाएगा और इसलिए आनुवंशिक मोज़ेक कमी होगी अधिकतम । भ्रूण बाद के चरणों में इंजेक्शन किया जा सकता है (2 – 4 कोशिका चरणों), लेकिन यह संभवतः संशोधित एलील के germline संचरण दर में कमी हो सकती है.
  9. एक छलनी का उपयोग कर अंडे ले लीजिए और उंहें एक 10 सेमी पेट्री ०.०००१% methylene नीले रंग के साथ 1x E3 मीडिया का उपयोग कर पकवान में कुल्ला । प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत अंडे के स्वास्थ्य की जांच, किसी भी निषेचित अंडे और मलबे को हटाने ।
  10. अलग सेट 10-एक पृथक, लेबल पेट्री डिश में एक इंजेक्शन नियंत्रण के रूप में 15 भ्रूण ।
  11. एक स्थानांतरण पिपेट का प्रयोग, धीरे इंजेक्शन प्लेट पर अंडे लाइन कमरे के तापमान को गर्म ।
  12. 2.5 x आवर्धन पर एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, प्रत्येक भ्रूण की जर्दी थैली में समाधान के 1 nL इंजेक्षन करने के लिए Cas9 प्रोटीन के ४०० स्नातकोत्तर और sgRNA के २०० स्नातकोत्तर की कुल सुई ।
    नोट: यदि वांछित या आवश्यक काटने को बढ़ाने के लिए, Cas9 प्रोटीन की अंतिम एकाग्रता में वृद्धि करने के लिए ८०० स्नातकोत्तर/nL और sgRNA के लिए इंजेक्शन समाधान में ४०० स्नातकोत्तर/nL; हालांकि, यह भी बंद लक्ष्य को बढ़ाने के लिए और/ काटने की क्षमता भी सीधे सेल४६में इंजेक्शन द्वारा बढ़ाया जा सकता है । हालांकि, जर्दी बोरी में इंजेक्शन तकनीकी रूप से कम मांग है और पर्याप्त उच्च germline संचरण के साथ मछली का उत्पादन काटने देता है (> एक संशोधित एलील युक्त वंश के 70%) ।
  13. एक ठीक से लेबल पेट्री डिश को इंजेक्शन भ्रूण लौटें, उंहें methylene नीले रंग के साथ 1x E3 मीडिया के साथ कवर, और उंहें एक भ्रूण को 28 डिग्री सेल्सियस पर सेट मशीन में डाल दिया ।
  14. 24 ज पद निषेचन (hpf) में, इंजेक्शन भ्रूण के स्वास्थ्य का निरीक्षण, मृत या असामान्य रूप से विकासशील व्यक्तियों को हटाने और मीडिया को बदलने ( चित्रा 3देखें) । इंजेक्शन नियंत्रण के खिलाफ जीवित रहने की दर की जाँच करें ।
    नोट: जब एक अनिवार्य जीन लक्ष्यीकरण, कम 10% से अधिक घातक इंजेक्शन नियंत्रण के सापेक्ष की उंमीद है । अगर घातकता के उच्च स्तर गाइड में मनाया जाता है इंजेक्शन की आबादी को इंजेक्शन के नियंत्रण की तुलना में, यह संकेत हो सकता है कि लक्षित जीन विकास के लिए आवश्यक है, या बंद लक्ष्य प्रभाव को विफल विकास के लिए अग्रणी रहे हैं । इंजेक्शन की मात्रा को कम करने के CRISPR-रिएजेंट आवश्यक हो सकता है या कम लक्ष्य प्रभाव के साथ एक नया sgRNA की पीढ़ी की आवश्यकता हो सकती है ।
  15. मशीन के लिए भ्रूण वापस लौटें और ७२ hpf के लिए भ्रूण बढ़ रही जारी, दैनिक मीडिया बदल भ्रूण स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए ।

4. एक HMA का उपयोग कर Indel गठन की दक्षता का विश्लेषण

  1. microcentrifuge ट्यूबों में ७२ hpf करने के लिए बड़े इंजेक्शन प्लेटों से पांच भ्रूण के दो सेट ले लीजिए और एक इंजेक्शन नियंत्रण से पांच भ्रूण का एक सेट इकट्ठा ।
  2. ०.००४% MS-२२२ (tricaine) जोड़कर भ्रूणों को Anesthetize और 2 मिनट रुको ।
  3. gDNA निकालने के लिए, धीरे प्रत्येक भ्रूण सेट बंद मीडिया पिपेट और ५० mM NaOH के ४५ µ एल जोड़ें । 10 मिनट के लिए ९५ ° c पर भ्रूण मशीन ।
  4. गर्मी स्रोत से भ्रूण निकालें और कमरे के तापमान को शांत । 1 एम Tris-एचसीएल पीएच = 8 के 5 µ एल जोड़ें, और नमूने जोरदार (5-10 एस) भंवर । अधिकतम गति पर समाधान केंद्रापसारक (> 16, 000 एक्स जी) के लिए एक कमरे के तापमान microcentrifuge में 3 मिनट के लिए supernatant स्थानांतरण एक साफ, लेबल ट्यूब और gDNA पर स्टोर-20 ° c डीएनए के लिए 6 महीने के लिए ।
    नोट: लगभग ९०० बीपी और छोटे के डीएनए टुकड़े इस प्रोटोकॉल के उपयोग के माध्यम से उत्पंन किया जाएगा ।
  5. एक ५० µ एल पीसीआर की प्रतिक्रिया का उपयोग कर एक नमूना (एक इंजेक्शन नियंत्रण सहित) से तैयार gDNA के 2 µ l का प्रयोग पोलीमरेज़ के साथ शामिल निर्देशों के अनुसार, पहले से डिजाइन की भविष्यवाणी कटौती साइट पार्श्व अस्तर का उपयोग कर ।
  6. पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें एक पीसीआर क्लीन अप किट ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करते हुए नमूनों को पानी या रेफरेंस बफर के 30 µ l में elute और एक spectrophotometer का उपयोग कर डीएनए को बढ़ाता है ।
  7. एक फ्लोटिंग रैक में एक उबलते पानी स्नान में ट्यूबों रखकर प्रत्येक शुद्ध पीसीआर उत्पाद के सभी 30 µ एल (एक ५०० मिलीलीटर चोंच में लगभग १५० मिलीलीटर) के लिए । 3 मिनट के बाद, गर्मी स्रोत बंद करो और समाधान कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं, के बारे में 1 एच ।
    नोट: यह कदम पहले डीएनए विकृत और फिर अनुमति देता है के लिए बेतरतीब ढंग से reanne बैंड, या बेमेल दोहरे-किनारा डीएनए है कि CRISPR-mutagenesis द्वारा बनाई गई बहुरूपताओं शामिल है और इसलिए एक बदल homoduplexes की तुलना में electrophoretic गतिशीलता । thermocycler में पीसीआर या रैंप के पिछले चक्र कार्यक्रम भी४७,४८, लेकिन उबलते स्नान का उपयोग करने के लिए किया जा सकता है reanne उत्पादों के सुधार संकल्प उपज सकता है ।
  8. 6x लोडिंग डाई के 5 µ एल जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) reannealed पीसीआर समाधान करने के लिए ।
  9. 30% polyacrylamide (29:1) का उपयोग करके 15% polyacrylamide/TBE जेल डाले । जेल सेट है के बाद, यह TBE चल बफर के साथ एक ट्रो उपकरण में रखें । एक P1000 का प्रयोग, ऐसे अवशिष्ट लवण या जेल टुकड़े के रूप में किसी भी मलबे के कुओं है कि धीरे pipetting बफर द्वारा और कुओं में नीचे कई बार बाधा कर सकते है स्पष्ट ।
  10. लोड ५०० reannealed पीसीआर उत्पादों के एनजी, और एक नियंत्रण लोड (इंजेक्शन मछली से नमूना) sgRNA नमूनों के प्रत्येक सेट के बगल में । २.५ ज के लिए १५० V पर जेल चलाने के लिए या डाई सामने जेल के नीचे है जब तक ।
  11. एक न्यूक्लिक एसिड दाग का उपयोग कर बैंड कल्पना (जैसे, ethidium ब्रोमाइड या SYBR हरी ( सामग्री की तालिकादेखें)) ।
  12. प्रत्येक नियंत्रण और CRISPR-भ्रूण के पूल इंजेक्शन के लिए बैंड पैटर्न की जांच करें ।
    नोट: कई बैंड है कि इंजेक्शन बनाम इंजेक्शन गलियों में धीमी चलाने की उपस्थिति उपंयास heteroduplex उत्पादों (चित्रा 4) के गठन को इंगित करता है । उपंयास heteroduplex डीएनए की उपस्थिति इंगित करता है कि indels CRISPR-इंजेक्शन द्वारा उत्पंन किया गया । लगभग ५०% या अधिक के इंजेक्शन समाधान में homoduplex बैंड तीव्रता में कमी आम तौर पर पर्याप्त germline संचरण में परिणाम के लिए पर्याप्त है । इसके अतिरिक्त, अतिरिक्त बैंड कभी भी इंजेक्शन मछली में पहचाने जाते हैं, और heteroduplex बैंड जब इंजेक्शन मछली में मनाया नहीं माना जाना चाहिए ।
  13. प्रत्येक लक्ष्य के लिए इंजेक्शन के लिए इंजेक्शन के सापेक्ष उच्चतम काटने क्षमता के साथ इंजेक्षन चुनें; इन इंजेक्शन से भ्रूण को विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है मछली indels के लिए देखने के लिए समय से पहले बंद codons कारण ।
    नोट: अत्यधिक कुशल काटने के लिए (लगभग द्वारा homoduplex बैंड में कमी > ५०% तीव्रता), 20 स्क्रीनिंग-30 वयस्क मछली germline संचरण प्राप्त करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए ।
    sgRNAs है कि कम काटने उत्पंन करने के लिए, अधिक वयस्क मछली की पहचान की संभावना को बढ़ाने के लिए मछली है कि संशोधित alleles एक समयपूर्व बंद codon युक्त का प्रदर्शन germline संचरण की जरूरत हो सकती है । यदि indel गठन मनाया यह जीन के एक अलग क्षेत्र के लिए sgRNA को नया स्वरूप आवश्यक हो सकता है नहीं है । यदि कोई heteroduplex बैंड गठन मनाया जाता है, sgRNA नीचा किया है हो सकता है, और sgRNA गुणवत्ता एक यूरिया/पृष्ठ जेल का उपयोग कर सत्यापित किया जाना चाहिए ।

5. नॉक आउट लाइनों की पहचान और प्रचार-प्रसार

  1. एक संभावित संस्थापक जनक मछली की पहचान करने के लिए, वयस्क F0 मछली की पूंछ क्लिप प्रदर्शन (लगभग 2.5-3 महीने के लिए हो) को indels की उपस्थिति की पहचान । Anesthetize ०.६२ mM tricaine में मछली ( सामग्री की तालिकादेखें), तो एक साफ, तेज उस्तरा ब्लेड का उपयोग करने के लिए पूंछ फिन के लगभग 1/2-3/4 हटा दें ।
  2. ५० mM NaOH के ४५ µ एल में पूंछ प्लेस, और एक वसूली टैंक के लिए मछली वापस । वर्णन के रूप में gDNA निष्कर्षण निष्पादित करें (चरण 4.2 – 4.4) । एक बार मछली सामांय तैराकी व्यवहार शुरू, indel की प्रकृति की पहचान की है जब तक प्रणाली पानी बहने पर वापस मछली जगह ।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि व्यक्तिगत मछली पहचाने जाते हैं, और उचित पूंछ क्लिप के परिणामों के लिए मिलान किया जा सकता है ।
  3. के रूप में वर्णित (कदम 4.5 – 4.9), मछली CRISPR इंजेक्शन (चित्रा 5) द्वारा संशोधित किया गया था यह निर्धारित करने के लिए पूंछ क्लिप gDNA पर एक HMA करते हैं । एक संस्थापक मछली की पहचान करने के लिए, वयस्कों कि पूंछ gDNA से जंगली प्रकार की मछली को heteroduplex बैंड प्रदर्शन नस्ल । भ्रूण ले लीजिए और उंहें ७२ hpf के लिए बढ़ता है ।
  4. ७२ hpf पर, 10 भ्रूण इकट्ठा और एक व्यक्तिगत ट्यूब में प्रत्येक भ्रूण जगह है । 1 M Tris pH = 8 के ५० mM NaOH और १.२५ µ l के ११.२५ µ l का उपयोग करके ऊपर बताए गए अनुसार एक gDNA निष्कर्षण करें (चरण 4.2 – 4.4) ।
  5. पीसीआर और ट्रो दोहराने ऊपर वर्णित के रूप में heteroduplex बैंड की पहचान करने के लिए (कदम 4.7-4.13) अगर indel alleles इस पीढ़ी (चित्रा 6) पर पारित किया गया है यह निर्धारित करने के लिए ।
  6. प्रतिशत संचरण के आधार पर एक भ्रूण HMA का उपयोग कर में मनाया, 20 के एक औसत बढ़ने-30 प्रत्येक CRISPR के लिए क्रॉस द्वारा प्राप्त भ्रूण वयस्कता के लिए ब्याज की लाइनों ।
    नोट: germline ट्रांसमिशन की आवृत्ति के आधार पर इस संख्या में वृद्धि या कमी की जा सकती है ।
  7. indels की उपस्थिति की पहचान करने के लिए वयस्क F1 मछली की पूंछ क्लिप प्रदर्शन के रूप में वर्णित (कदम 5.1 – 5.2) । के रूप में वर्णित (कदम 4.5-4.11), पूंछ क्लिप gDNA पर एक HMA करने के लिए निर्धारित अगर मछली एक indel (चित्रा 7) वहन करती है ।
  8. एक heteroduplex बैंड शामिल है कि मछली के लिए, अनुक्रमण विश्लेषण के लिए डीएनए तैयार करते हैं ।
    1. नई प्राइमरों का उपयोग कर पीसीआर एक 300-600 बीपी पीसीआर कटौती साइट के आसपास केंद्रित उत्पाद बढ़ाना करने के लिए प्रदर्शन ।
    2. डीएनए को साफ करने के लिए एक पीसीआर शुद्धि किट का प्रयोग करें, और elute 30 µ एल में एक agarose जेल पर डीएनए की जांच करने के लिए एक एकल बैंड मौजूद है ।
      नोट: कुछ heteroduplex बैंडिंग agarose जेल पर मौजूद हो सकता है और एक छोटे धब्बा या केवल पीसीआर उत्पाद के ऊपर की उंमीद आकार पर डबल बैंड के रूप में प्रकट होता है ।
  9. एक से तीन indels का विश्लेषण कर रहे हैं, तो sequencer अनुक्रमण का उपयोग कर पीसीआर उत्पादों अनुक्रम और एक bioinformatics उपकरण४९का उपयोग कर indel के अनुक्रम निर्धारित करते हैं । अंयथा, NGS विश्लेषण का उपयोग कर एकाधिक पीसीआर उत्पादों के अनुक्रम का निर्धारण ( सामग्री की तालिकादेखें) अधिक किफायती है ।
  10. यदि एक समयपूर्व रोक codon एक bioinformatics उपकरण का उपयोग कर अनुक्रम का विश्लेषण करके प्राप्त किया गया है निर्धारित ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  11. उपयुक्त लेबल के साथ एक नया टैंक में वांछित उत्परिवर्ती एलील युक्त मछली प्लेस ।
  12. डिजाइन भविष्य genotyping जरूरतों के लिए विशिष्ट indel alleles के लिए पीसीआर प्राइमरों । इन प्राइमरों रूपांतरित अनुक्रम अवधि और जंगली प्रकार अनुक्रम बढ़ाना नहीं चाहिए ।
  13. में पार heterozygous zebrafish एक अलग आबादी है कि 25% नॉक आउट लाइनों को शामिल करेंगे उत्पंन करने के लिए ।

Representative Results

प्रयोगात्मक इस प्रोटोकॉल में वर्णित दृष्टिकोण कुशल के लिए अनुमति देते हैं, लागत प्रभावी zebrafish नॉक आउट लाइनों के उत्पादन CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी का उपयोग कर । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त परिणामों के व्याख्या और समस्या निवारण की सुविधा के लिए इस आलेख में निम्न आंकड़े शामिल किए गए हैं. सफल उत्पादन और CRISPR के microinjection-रिएजेंट के बाद, zebrafish भ्रूण प्रकट phenotypes के लिए और indel का उपयोग HMA गठन के लिए विश्लेषण किया जा सकता है । एक उपयोगी नियंत्रण CRISPR की सफलता की कल्पना करने के लिए-प्रयोग sgRNA के चरण १.५ में वर्णित के उपयोग के लिए वर्णक उत्पादन जीन टायरोसिनेस लक्ष्य है । रंजकता के नुकसान में टायरोसिनेस परिणाम पर Cas9 प्रेरित indel गठन और आसानी से ४८ hpf (चित्रा 1) द्वारा बनाए गए हैं । एक और उपयोगी नियंत्रण CRISPR के लिए कि तैयारी सुनिश्चित करने के लिए इंजेक्शन के लिए एजेंट सफल रहा है, सत्यापित करने के लिए है कि पूर्ण लंबाई (१२० nt) sgRNA एक denaturing polyacrylamide जेल (चित्रा 2, लेन 1 और 2) का उपयोग कर संश्लेषित किया गया है । यदि आरएनए नीचा किया गया है यह एक धब्बा के रूप में प्रकट हो सकता है, उदाहरण के लिए लेन 3 (चित्रा 2) नीचा दिखा आरएनए कि इंजेक्शन के लिए उपयुक्त नहीं है से पता चलता है.

CRISPR द्वारा लक्षित जीन की indel गठन आवृत्ति का विश्लेषण करने के लिए-Cas9 कि प्रकट phenotypes में ऐसी टायरोसिनेस के रूप में परिणाम नहीं है , HMA विश्लेषण एक सरल और विश्वसनीय तरीका है. sgRNA/Cas9 इंजेक्शन भ्रूण heteroduplex बैंड के गठन में HMA परिणामों का उपयोग कर विश्लेषण, और homoduplex बैंड की तीव्रता की कमी (4 चित्रा) । heteroduplex बैंड की उपस्थिति आगे इस प्रोटोकॉल में उपयोग के लिए microinjected भ्रूण से संभावित संस्थापक मछली की पहचान और वयस्कों के रूप में (चित्रा 4 और चित्रा 5), एक संस्थापक के germline संचरण क्षमता का विश्लेषण करने के लिए है ( चित्रा 6), और एक heterozygous F1 मछली (चित्रा 7) में एक indel की उपस्थिति सत्यापित करने के लिए । heterozygous मछली है कि एक indel होते है NGS के लिए उंमीदवारों के लिए indel की प्रकृति की पहचान और निर्धारित अगर एक समयपूर्व बंद codon लक्ष्य जीन की कोडिंग क्षेत्र में मौजूद है ।

Figure 1
चित्रा 1 : Zebrafish भ्रूण एक वर्णक दोष प्रदर्शित जब एक sgRNA लक्ष्यीकरण टायरोसिनेस एक सेल मंच पर के साथ इंजेक्शन । (क) जंगली प्रकार, ४८ hpf पर इंजेक्शन भ्रूण और (ख) ४८ hpf में भ्रूण इंजेक्शन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : में इन विट्रो प्रतिलेखन संश्लेषण किट का उपयोग sgRNA. ओलिगोस्पर्मिया sgRNA संश्लेषण किट निर्देश के अनुसार इन विट्रो प्रतिलेखन का उपयोग कर संश्लेषित किया गया । ५०० आरएनए के एनजी को बताए गए अनुसार यूरिया/पेज जेल पर चलाया गया । sgRNA गलियों में लोड 1 और 2 पूर्ण लंबाई के लिए इसी बैंड से पता चलता है, बरकरार १२० nt आरएनए । 3 लेन में sgRNA एक नीचा आरएनए नमूना है कि इंजेक्शन के लिए उपयुक्त नहीं है से पता चलता है ।

Figure 3
चित्रा 3 : 24 hpf इंजेक्शन भ्रूण के स्वास्थ्य की तुलना । एक जीवित भ्रूण (एक) 24 hpf को विकसित, आसानी से एक भ्रूण है कि विकास (ख) को निरस्त कर दिया है से प्रतिष्ठित है । भ्रूण है कि समान (ख) या काफी बदल विशेषताएं (क), जैसे रीढ़ की वक्रता या बदल सिर और आंख के विकास के रूप में पकवान से हटा दिया जाना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : sgRNA-Cas9 microinjected zebrafish भ्रूण की Heteroduplex गतिशीलता परख । नमूना प्रति 5 भ्रूण के पूल ७२ hpf पर एकत्र किए गए और gDNA निकाली गई थी । Heteroduplex विश्लेषण के रूप में वर्णित किया गया था, नमूने डीएनए के ५०० एनजी के साथ समान रूप से लोड थे । लेन: एम = १०० बीपी मार्कर; 1 = इंजेक्शन नियंत्रण; 2 = इंजेक्शन नमूना 1; 3 = इंजेक्शन नमूना 2. अपेक्षित बैंड आकार = ९८ bp ।

Figure 5
चित्रा 5 : एक वयस्क CRISPR की पूंछ से निकाले गए gDNA की Heteroduplex गतिशीलता परख-zebrafish इंजेक्शन । भ्रूण है कि एक sgRNA और Cas9 प्रोटीन के साथ इंजेक्शन थे वयस्कता (3 महीने) के लिए बड़े हो रहे थे । मछली बी और सी प्रदर्शन heteroduplex बैंड और बाद में germline संचारित indels की पहचान नस्ल थे; मछली एक बाद के विश्लेषण में इस्तेमाल नहीं किया गया था क्योंकि यह एक सकारात्मक heteroduplex बैंड प्रदर्शित नहीं करता है । गलियाँ: १ = वन्य-प्रकार नियंत्रण; 2 = मछली A; 3 = मछली बी; 4 = Fish C. अपेक्षित बैंड आकार = ९८ bp. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6 : एक F0 CRISPR प्रजनन द्वारा उत्पंन एकल भ्रूण के Heteroduplex गतिशीलता परख-एक जंगली प्रकार के मछली को zebrafish इंजेक्शन को germline संचारित indels की पहचान । Zebrafish साथी थे, और F1 ७२ एच. एकल भ्रूण के लिए हो भ्रूण एकत्र और heteroduplex विश्लेषण के रूप में वर्णित प्रदर्शन किया गया । गलियाँ: १ = वन्य-प्रकार नियंत्रण; 2-10 = एक एकल F1 लेन प्रति भ्रूण । इस जेल से पता चलता है कि 10 में से 7 भ्रूण एक सकारात्मक heteroduplex बैंड दिखाने के लिए, indel के ७०% की एक germline संचरण दर का संकेत है । अपेक्षित बैंड आकार = ९८ bp. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7 : वयस्क F1 zebrafish पूंछ क्लिप्स के Heteroduplex गतिशीलता परख । वयस्क F1 मछली HMA द्वारा बनाए गए indels की पहचान । मछली है कि एक सकारात्मक heteroduplex बैंड प्रदर्शन पीसीआर परिलक्षित और व्यापक अनुक्रमण विश्लेषण के लिए प्रस्तुत उत्परिवर्तन की प्रकृति का निर्धारण किया गया । (क) गलियाँ: १ = वन्य-प्रकार का नियंत्रण; 2 = मछली एक (4 बीपी विलोपन, 1 बीपी बेमेल) । (ख) इन F1 मछली एक ही संस्थापक से पहचाने गए थे, और अभी तक अलग heteroduplex patterning दिखाने के लिए, एक संस्थापक से एकाधिक संशोधित alleles के germline संचरण का संकेत है । गलियाँ: १ = वन्य-प्रकार नियंत्रण; 2 = fish B (4 बीपी बिंद, 7 बीपी बेमेल), 3 = fish C (4 बीपी विलोपन, 4 बीपी बेमेल) । इन indels में से प्रत्येक लक्ष्य जीन के कोडन अनुक्रम में एक समयपूर्व बंद codon बनाया, के रूप में NGS द्वारा निर्धारित किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल zebrafish हड्डीवाला मॉडल CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकी का उपयोग कर प्रणाली में जीन नॉकआउट के उत्पादन का वर्णन है । प्रोटोकॉल के एक नंबर पहले zebrafish15,25,26,५०,५१,५२में CRISPR-मध्यस्थता जीनोम इंजीनियरिंग शुरू करने के लिए वर्णित किया गया है । इस प्रोटोकॉल सरल अभी तक reproducibly लगातार प्रयोगात्मक तकनीक के एक नंबर के संयोजन के द्वारा पिछले प्रयासों पर बनाता है, विशेष रूप से HMA और कई heterozygous मछली के NGS में, एक सीधा, किफायती, और प्रयोग मजबूत प्रोटोकॉल बनाने के लिए zebrafish में CRISPR-मध्यस्थता mutagenesis के लिए कि प्रशिक्षण और अनुभव की एक सीमा के साथ कर्मियों के साथ कर्मचारियों प्रयोगशालाओं के लिए उपयुक्त है, साथ ही शिक्षण प्रयोगशालाओं.

डिजाइन और गाइड RNAs के संश्लेषण के लिए सिफारिशें इस प्रोटोकॉल में शामिल हैं । गाइड आरएनए डिजाइन में एक प्रमुख विचार ऑफ-टारगेट इफेक्ट की ंयूनतम है । कई भविष्यवाणी एल्गोरिदम CRISPR उपयोगकर्ता के अनुकूल चित्रमय इंटरफेस है कि दोनों की गतिविधि पर लक्ष्य गाइड और ऑफ लक्ष्य प्रभाव३४का मौका भविष्यवाणी के साथ अभिकलन उपकरण का उपयोग करने की अनुमति विकसित किया गया है, ३५,३६. zebrafish प्रणाली का एक विशिष्ट लाभ बंद-लक्ष्य प्रभाव की दर कम है, क्योंकि Cas9 भ्रूण में इंजेक्शन है और इसलिए अभिव्यक्ति क्षणिक है, जो चूहों में दिखाया गया है कम लक्ष्य प्रभाव५३में परिणाम है । फिर भी, बंद लक्ष्य प्रभाव को५४zebrafish में होने का प्रदर्शन किया गया है । एक तरह से नियंत्रण के लिए बंद-लक्ष्य प्रभाव को phenotype संस्थापक zebrafish कि दो स्वतंत्र गाइड RNAs द्वारा उत्पंन किया गया है कि एक ही जीन लक्ष्य है, के रूप में इन गाइड बहुत अलग बंद लक्ष्य साइटों को प्रभावित होने की संभावना होगी । इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं है कि बंद लक्ष्य प्रभाव को कम करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका एक रूपांतरित Cas9 कि लक्ष्य डीएनए, जो उच्च दक्षता के साथ सुधार कर रहे हैं पर एकल कतरा टूटता उत्पन्न करता है का उपयोग है । एक दूसरे की निकटता के भीतर डीएनए निक बाँधना है कि वांछित लोकस में प्रभावी indel गठन में विपरीत किस्में परिणाम के लिए पूरक हैं और ऑफ-टारगेट इफेक्ट५५,५६को कम करता है.

ऑफ-टारगेट इफेक्ट्स की अलग दरें होने के अलावा, विभिन्न sgRNAs में वांछित लक्ष्य५७,५८,५९के mutagenesis की विभिन्न दरें हो सकती हैं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है HMA के mutagenesis की दक्षता का विश्लेषण करने के लिए एक दिया sgRNA heteroduplex बैंड गठन३३,४०का उपयोग कर । Heteroduplex बैंड पीसीआर जनित डीएनए किस्में कि बेमेल होते हैं, और आसानी से जेल ट्रो का उपयोग कर हल किया जा सकता है के संकरण द्वारा बनाई गई हैं । अंय आमतौर पर ऐसे T7 endonuclease परख या उच्च संकल्प पिघल विश्लेषण के रूप में indel गठन, मापने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के विपरीत25,26, HMA एक महंगा एंजाइम बेमेल डीएनए में कटौती करने की आवश्यकता नहीं है, और आवश्यकता नहीं है पीसीआर पिघल घटता के जटिल विश्लेषण । महत्वपूर्ण बात, HMA का उपयोग करने के लिए इंजेक्शन की आबादी में indel गठन की उच्च दर को सत्यापित करने के लिए भी जांचकर्ता के बाद के उत्पादन के लिए आवश्यक मछली की संख्या को कम करने में सक्षम बनाता है बाहर लाइनों, जो के साथ एक उत्परिवर्तन की पहचान की लागत कम कर देता है वांछित विशेषताओं ।

CRISPR आधारित indels पैदा करने के सापेक्ष आसानी एक बार में कई जीन के कई alleles के निर्माण में सक्षम बनाता है । वेब आधारित सॉफ्टवेयर heterozygous मछली से एकल उत्परिवर्तनों के विश्लेषण के लिए उपलब्ध है४९पीसीआर उत्पादों के सैंज अनुक्रमण का उपयोग कर । मामले में जहां तीन या अधिक CRISPR-रूपांतरित alleles विश्लेषण कर रहे हैं, NGS indel की प्रकृति की विशेषता के लिए और अधिक लागत के लिए indel की प्रकृति विशेषताएं प्रभावी होने की संभावना है के रूप में इस दृष्टिकोण को ५० विभिंन alleles के एक पूल की अनुमति देता है पर विशेषता हो ओ nce ( सामग्री की तालिकादेखें)६०,६१,६२। पैमाने की इस तरह की अर्थव्यवस्था की संभावना एक स्नातक प्रयोगशाला स्थापित करने में विशेष रूप से उपयोगी होगा ।

संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल प्रदान करता है कदम दर कदम निर्देश reproducibly पैदा करने के लिए उच्च गुणवत्ता CRISPR-रिएजेंट (विशेष रूप से, sgRNA) में ऐसी है कि कम वयस्क मछली की जरूरत है और बनाया करने के लिए सफलतापूर्वक ब्याज की उत्परिवर्ती alleles की पहचान करने के लिए विश्लेषण, जो भी वांछित लाइनों के उत्पादन का समय और लागत कम कर देता है । महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल डिजाइन किया गया है कि इस तरह के सीमित संसाधनों के साथ प्रयोगशालाओं द्वारा लागू किया जा सकता है एक किफायती तरीके से उत्परिवर्ती zebrafish का उत्पादन । इसके अलावा, हमने पाया है कि इस दृष्टिकोण स्नातकों के लिए उपयुक्त है और इस तरह शिक्षा और स्नातक हाथों में रुचि CRISPR में अनुभव-आधारित जीनोम संपादन के छात्रों के प्रशिक्षण के लिए अवसरों का विस्तार ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R21CA182197 to J.O.), राल्फ डब्ल्यू और अनुग्रह एम Showalter रिसर्च ट्रस्ट द्वारा समर्थित किया गया था, और इन्होने कृषि विज्ञान और विस्तार के लिए आर्थिक विकास (AgSEED) कार्यक्रम के द्वारा. P30 CA023168 द्वारा समर्थित इन्होने जीनोमिक्स कोर सुविधा द्वारा ओरिजिनल sequencing डेटा का अधिग्रहण किया गया था । मैरी Witucki को इन्होने यूनिवर्सिटी सेंटर फॉर कैंसर रिसर्च समर स्नातक रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित कैरोल काउंटी कैंसर एसोसिएशन द्वारा समर्थन दिया था । funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी । हम पांडुलिपि पर महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए बेंजामिन कार्टर, एलेन Denning, और टेलर षब्दो धंयवाद । हम इस कार्य के समर्थन के लिए जैव रसायन विभाग का धन्यवाद करते हैं, और हमारी Zebrafish कॉलोनी की देखभाल और कल्याण में उनके समर्पण के लिए इन्होने विश्वविद्यालय में Zebrafish अनुसंधान के लिए केंद्र/ अंत में, हम इन्होने जीनोमिक्स कोर सुविधा, और फिलिप San Miguel के योगदान NGS सेवाओं के बारे में धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CRISPOR sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/
Breaking-Cas sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool
ChopChop sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/
Primer 3 PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
Rnase free technique http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf
RNase-free water Any brand Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water.
Rnase-free ethanol Any brand Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol.
Cas9 Protein PNA Bio CP01 Cas9 protein with nuclear localization signal.
Target specific oligos Integrated DNA Technologies (IDT) Synthesize guide RNAs.
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product.
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended.
EnGen sgRNA Synthesis Kit New England BioLabs E3322 In vitro transccribe guide RNAs.
10X TBE Thermo Fisher B52 RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids.
6X Load Dye New England BioLabs B7025S Loading DNA for electropheresis.
5M Ammonium acetate Thermo Fisher AM9071 Clean up reagent for purification of guide RNAs.
Ethanol (200 proof, nuclease-free) Any brand Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free.
Nuclease-free Water Any brand For synthesis and purification of guide RNAs.
RNase away Thermo Fisher 10328011 Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware.
DNA Ladder, 100 bp New England BioLabs N0467S Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.
DNA Ladder, 1 kb New England BioLabs N0552S Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.
RNA Ladder New England BioLabs N0364S Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized
TEMED Thermo Fisher 17919 Casting polyacrylamide gel.
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678 Casting polyacrylamide gel.
40% Polyacrylamide (19:1) BioRad 161-0154 Casting denaturing polyacrylamide gel.
Urea Sigma-Aldrich U5378-100G Casting denaturing polyacrylamide gel.
RNA Gel Loading Dye (2x) Thermo Fisher R0641 Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis.
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E1510-10ML Visualization of nucleic acids.
SYBER Green Thermo Fisher S7563 Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels.
Microcentrifuge Eppendorf 5424 RNA clean up, PCR purification.
MyTaq Polymerase Bioline BIO-21105 For amplification of DNA using PCR.
Thermocycler Any brand PCR amplification.
Spectrophotometer Any brand NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA.
E3 embryo media Made in house Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140 Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos.
Petri dish Thermo Fisher FB0875711Z Store embryos, cast injection plate.
Agarose Denville CA3510-8 Casting injection plate, agarose gels.
Microinection mold Adaptive Science Tools TU-1 To create wells to hold embryos during injection.
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290  Dye for visualization of injection.
Mineral Oil Sigma-Aldrich M5904-5ML To calibrate needle injection volume.
Transfer pipettes Any brand Moving embryos.
Razor blade Thermo Fisher 11295-10 Cutting injection needle, tail clipping adult fish.
Incubator Any brand Maintaining embryos at 28.5 oC.
Verticle pipette puller David Kopf Instruments 700C Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long
Capillary tubes Sutter Instruments BF100-58-10 Geneate needles for injection.
Microloader tips Eppendorf 930001007 Load solution into injection needles.
Microinjector World Precision Instruments PV 820 Injecting embryos.
Disecting microscope Leica Injecting embryos.
30% Polyacylamide (29:1) BioRad 161-0156 Heteroduplex gel casting.
MS-222 (Tricaine) Sigma-Aldrich A-5040 Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE
Microwave Any brand Casting injection plate, agarose gels.
Scale Any brand Casting injection plate, agarose gels.
Gloves Any brand For all aspects of the protocol.
N2 Any brand To expell liquid from the capillary for embryo injection.
1,000 µL  tips Any brand For all aspects of the protocol.
200 µL tips Any brand For all aspects of the protocol.
10 µL tips Any brand For all aspects of the protocol.
PCR strip tubes Any brand For all aspects of the protocol.
Micropipettes Any brand For all aspects of the protocol.
NGS Sequencing platform: Wideseq If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35).
Software for sequence analysis For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/
Software for sequence analysis SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing.

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References

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आनुवंशिकी १३८ अंक ढाणियो rerio zebrafish CRISPR/Cas9 भ्रूण microinjection जीन नॉकआउट heteroduplex गतिशीलता परख अगली पीढ़ी अनुक्रमण रिवर्स आनुवंशिकी
मॉडल प्रणाली <em>ढाणियो rerio</em> में कुशल उत्पादन और CRISPR/Cas9 जनित जीन नॉकआउट की पहचान
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Sorlien, E. L., Witucki, M. A.,… More

Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. J. Vis. Exp. (138), e56969, doi:10.3791/56969 (2018).

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