Summary
対象となるゲノム編集モデルにおける動脈分布(ゼブラフィッシュ) は、CRISPR ベースのアプローチの出現によって大きく促進されています。ここで、生成・ ヘテロ二本鎖移動性試金が組み込まれたナンセンスの CRISPR 由来の対立遺伝子の同定と次世代シーケンシングによる突然変異の同定の合理化された、堅牢なプロトコルについて述べる.
Abstract
クラスター化された特性が定期的に空間、短い、回文繰り返し化膿連鎖球菌の (CRISPR) システムが急速の様々 な遺伝子の変更を生成するためのカスタマイズ可能なプラットフォームの開発を有効にゼブラフィッシュを含む生物。CRISPR ベース ゲノム編集を使用して単一ガイド RNA (sgRNA) 関心のゲノム DNA (gDNA) ターゲットに CRISPR 関連 (Cas) エンドヌクレアーゼをターゲットに Cas エンドヌクレアーゼが二重鎖切断 (DSB) を生成します。エラーが発生しやすいメカニズム リードの挿入または削除 (オクターリピート) による Dsb の修復。したがってタンパク質 null 対立遺伝子を作成するコーディング シーケンス内では時期尚早停止コドンをしばしば導入フレーム シフト突然変異があります。CRISPR ベース ゲノム工学は分子のいくつかのコンポーネントだけを必要として、微量注射によるゼブラフィッシュ胚に導入が簡単に。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ マイクロインジェクションの CRISPR 試薬を生成して魚類の CRISPR 変更遺伝子の生殖を識別するために使用するメソッドについて説明します。これらのメソッドは、sgRNAs、マイクロインジェクション CRISPR 試薬のヘテロ二本鎖移動性試金 (HMA) と、オクターリピートのキャラクタリゼーションと呼ばれる PCR 法を用いたターゲット ・ サイトの誘導オクターリピートの同定の生体外のトランスクリプションスループットが低いと強力な次世代シーケンス (NGS) の両方を使用して-ヘテロ接合体の魚から収集した複数の PCR の製品を分析することができます基づきます。このプロトコルは、必要な魚の数との種類の分析を実行するために必要な機器の両方を最小限に抑えるために合理化されています。また、このプロトコルに CRISPR ベースの実行に興味を持って研究グループによって経済的に採用するこの強力なツールを有効にする、大学生を含む経験のすべてのレベルの研究所個人使用しやすくする設計ゼブラフィッシュにおけるゲノムの変更。
Introduction
真核生物の分子機械の保全研究のためのモデル有機体の使用の力の基礎となります。これらのモデルのシステムの多くは興味の生物学的または病気プロセスに遺伝子産物の貢献を特徴付けるための目標とされた遺伝子ノックアウトなど逆遺伝学的アプローチの使用を促進します。ゼブラフィッシュなど生物の遺伝子破壊技術は、Dsb1,2の不正確な修理に起因するフレーム シフト変異のターゲット導入に頼ってきました。ゲノムに、DSB を導入すると、ほぼすべてのセル型の生物に普遍的に存在する 2 つの経路のいずれかを介して DNA 損傷は修復: 非相同末端結合 (NHEJ) と相同性向け修理 (HDR)3,4.NHEJ 機械の不正確な性質はよく様々 な長さ5,6,7,8,9オクターリピートを生成します。遺伝子のコーディング シーケンスのフレーム シフト変異の導入は、しばしばレンダリング遺伝子が機能しない時期尚早停止コドンを作り出すことができます。
すべての利用対象とする特定のゲノムにヌクレアーゼ DNA 蛋白質の相互作用、転写活性化因子のようなエフェクター核酸、亜鉛指核酸 meganucleases オクターリピートを促進するゼブラフィッシュの初期のゲノム工学戦略が含まれてターゲットそれは DSB10、11,12,13,14,15を導入します。しかし、これらの技術は興味の DNA シーケンスを対象とするヌクレアーゼを生成するために必要な骨の折れると複雑な工学のために適用することは困難で、しばしば。以前の戦略とは異なり CRISPR 遺伝子編集に依存しないターゲット蛋白質 DNA の相互作用。興味16,17,18,19 のゲノムのサイトを対象とする塩基対形成相互作用が基本を使用して RNA ガイドを介して CRISPR 関連 (Cas) エンドヌクレアーゼを指示する代わりに、 ,20,21。RNA のデザインのシンプルさのためガイド目的ベースの対形成相互作用それの対象とは、目的の軌跡に Cas エンドヌクレアーゼを対象とする比較的簡単です。タイプ II CRISPR システム特に広く培われた a エンドヌクレアーゼ活性を刺激するために DNA との相互作用を必要とする単一マルチ ドメインの Ca ヌクレアーゼ (Cas9) の使用を含むいくつかの有利な特徴によるゲノム編集用同種の DNA シーケンス18を対象とする 1 つのガイド RNA (sgRNA) の使用します。同種の sgRNA のターゲットに必要なシーケンス条件がよく分かって19と希望 sgRNA が簡単に生体外のトランスクリプションによって生成されます。シンプルさと堅牢性 CRISPR/Cas9 アプローチの大幅のゼブラフィッシュとさまざまな他の有機体で目標とされた遺伝子組み換えを容易になります。
中枢神経系の開発など脊椎動物の有機体の象徴的なプロセスを勉強する機会が増えて大幅に CRISPR ベースの試薬の開発の結果としてのゼブラフィッシュの標的ゲノム編集を引き受ける能力を強化システム。ゼブラフィッシュ ゲノムには人間22で病気と関連付けられる遺伝子の 84% と同様、人間のゲノムで見つけられた蛋白質のコーディングの遺伝子の 70% が含まれています。ゼブラフィッシュの開発が逆の遺伝学的研究での利用を高めるいくつかのキーの資質を展示: 大型クラッチにおける胚のレイアウト、マイクロインジェクションと大人のゼブラフィッシュによる遺伝的に操作をさせる母親から外部開発希望する行23の急速な伝播を可能にする、生後 3 か月で性的に成熟しました。
多数のプロトコルが利用可能な様々 な生成し、ゼブラフィッシュ24,25,26,27,28,29 CRISPR 派生オクターリピートの識別にアプローチを記述します。 ,,3031。ただし、これらの手順の多くは集中的な時間、高価な機器へのアクセスを必要とする、限られた専門知識を持つ研究所の挑戦することができます。本明細書に記載されている手順戦略を提供するシンプルで堅牢、かつ経済的な CRISPR/Cas9 - エンジニア ゼブラフィッシュ ノックアウト線に。32に説明したにされている他のアプローチと同様、このプロトコルは DNA オリゴヌクレオチド (oligos) を使用して sgRNAs を合成する非常に効率的なキットの使用を説明します。記述されていたプロトコルが特に 2 つの手順を含む CRISPR 変異線路の解析を大幅に簡素化: ゲノムの変更の有無とのシーケンス解析を簡単に決定する PCR に基づく HMA33のステップバイ ステップの使用ヘテロ接合体のゼブラフィッシュ迅速かつ容易には、経済的な方法で複数オクターリピートの性質を決定します。さらに、ステップバイ ステップの手順が堅牢な選択、信頼性の高い生産ガイド Rna の注射に含まれています。ここに示す手順は、ゼブラフィッシュの遺伝子のノックアウトの同定に貢献する専門知識の範囲で研究者を可能にする強力な比較的安価なプロトコルを例示します。
Protocol
ケアと国立衛生研究所の実験動物の使用のためのガイドの推奨事項に従い、本研究を行った。プロトコルは、パーデュー大学動物ケアおよび使用委員会 (PACUC 数 11/08/31) によって承認されました。
1. テンプレート固有 Oligos のガイド RNA の生産のための設計
- 遺伝子のコーディング領域で変更される興味のターゲット地域を選択します。これは切り捨てられたタンパク質を生成がないので後続のフレームの開始コドンささやかな N 末端切り捨てと蛋白質の生産を有効にするように遺伝子の 5' 端に近いはずです。
注: この可能性を排除する方法の 1 つのフレームの開始コドン遺伝子の下流のコーディング領域をスキャンすることです。さらに、大きなエクソンの中間をターゲットとする RNA のガイドを使用して、結果の塩基の後続のスコアリングのための PCR プライマーを識別するために助けることができます。 - RNA 選択ガイドを使用して興味のゲノムの地域の潜在的なガイドのサイトを識別するプログラム (参照材料表)34,35,36。ブラウザーのデータを動脈分布および 5'-NGG-3 する protospacer 隣接するモチーフ (PAM) シーケンスに設定 '。
注: 理想的な gRNA シーケンスは、能率的なトランスクリプション体外T7 の gRNA の最初の位置に 5 ' G を含んでいます。別のガイドの 5 'ベースを変更することできます 5' の位置にある G と許容可能なガイドがない場合、ガイド RNA の 5 ' 端に G または G を追加できますが、これは切削効率37を減らすことができます。切削効率を最大にする最適ガイド シーケンスは GC 含量が 40-80% (より優れている)、パムに隣接して 20th位置に G が含まれていますが、必要な38ではないです。理想的なターゲット シーケンスの例: 5 '-G (N)18 G-3' - NGG (NGG は PAM)。最適なガイド Rna 前述を識別するガイド RNA 選択プログラムの実行結果を調べるほか大幅ダウン ストリーム解析を困難にしている予測の強いオフターゲット効果を持つガイド Rna を避けるために注意をすべき。特に、予測のオフターゲット効果予測総オフのターゲット サイトを最小化する必要があります、コード領域内の落下を除外すべきで Rna を導きます。 - ガイド RNA 設計ツールの出力から除外 PAM シーケンス (NGG 5 '-3 ');それは対象化されていないが、Cas9 胸の谷間の認識シーケンスで構成します。
- T7 プロモーターと重複シーケンス (推奨の in vitro転写キットで提供される完全な長さの sgRNAs の合成に使用される足場オリゴに相補的な領域) 追加残り 20 ヌクレオチド (nts)、示されている順序で54 nt オリゴを入手するには下: T7 プロモーター: TTCTAATACGACTCACTATA 5 '-3 ';RNA シーケンス 5 '-G (N)18 G をガイド-3 ';重複シーケンス: GTTTTAGAGCTAGA 5 '-3 '
- フランクの予測カット サイト PCR プライマーを識別 (Cas9 裂く 3 PAM シーケンスの上流 nt) 50-150 塩基対 (bp) 各 web ベースのソフトウェアを使用してカットからの距離で (材料の表を参照してください)。
注: とこれら切削効率の測定の後の手順で使用されるします。適切なプライマーが識別されない場合これらの制約を使用して、別のガイド RNA サイトは考慮する必要があります。 - 注文ガイドを生成する 54 の nt オリゴヌクレオチド (材料の表を参照) のターゲット ・ サイトの分析のための RNA および PCR のプライマー。
メモ: オプションの肯定的な制御として簡単に得点の視覚的表現を使用してこのプロトコルの性能を検証する顔料の生産に必要な遺伝子をターゲット sgRNA を生成するとよいでしょう (代表的な結果を得るのための図 1を参照)。共通の目標は、遺伝子チロシナーゼoligo の使用 (ガイド RNA シーケンスに下線を引く)39: 5 '-TTCTAATACGACTCACTATAGGACTGGAGGACTTCTGGGGGTTTTAGAGCTAGA-3 '
2. 胚マイクロインジェクションの CRISPR 試薬の調製
-
市販の Cas9 蛋白質を注文 (材料の表を参照してください)。
注: Cas9 mRNA の注入は、しかしより効率的な32,42Cas9 蛋白質とゼブラフィッシュ胚マイクロインジェクションを示されている、ゼブラフィッシュ40,41, オクターリピートを生成する使用もできます。- 1 mg/mL の溶液を生成する指定されたバッファーで Cas9 蛋白質は中止します。凍結融解サイクルの数を最小限に抑える-80 ° C で PCR チューブで注入準備因数でソリューションを保存します。したがって 1 mg/ml Cas9 ソリューションを使用すると、2 μ L、5 μ L 注入ソリューションを生成するには、Cas9 することができます PCR ストリップ管を使用して 2 μ 因数で避けようとあります。
- SgRNAの in vitro転写を使用して sgRNA を合成キット (材料の表を参照してください)。製造元の指示に従っての in vitro転写を実行します。
注: は、すべての合成、クリーンアップ、および注入ソリューション準備手順中に RNase フリー技術を保持します。たとえば、使い捨て手袋を使用して、それらを頻繁に変更、チューブと RNase フリー認定ときれいな表面は、実験器具を染する市販ソリューションをピペットの先端を使用して (材料の表を参照してください)。 -
RNase フリー法を用いた酢酸アンモニウム/沈殿物を使用して合成の sgRNA を浄化します。
注: または、sgRNAs ことができる精製するクリーン アップ キット市販列に基づく RNA のさまざまな比較的適度な費用のため。- 5 M 酢酸アンモニウムと混和する渦の 25 μ L を追加します。
注: アンモニウム酢酸溶液は市販 (参照材料表)、または 5 M 溶液を RNase フリー水 1 mL に酢酸アンモニウム分子グレード 385.4 mg を追加することで家で行われた、-20 ° C で保存できます。 - 200-証拠ヌクレアーゼ フリー エタノール 150 μ L を各サンプルに追加します。20 分以上-80 ° C のフリーザーに反応を配置します。
注: サンプルは-80 ° C で夜通し保存することができますが大幅に総 RNA の収穫は増えません。 - 遠心分離機の最大速度でサンプル (> 16,000 x g) 20 分の 4 ° C 遠心機で。
- RNA ペレットを妨げないことを確認、液体をゆっくりとピペッティング上澄みを慎重に削除します。
- (ヌクレアーゼ フリー エタノール RNase フリーの水で希釈することによって作成された) 70% エタノール 1 mL を加えるし、軽くミックス チューブをチューブから残留塩を洗浄する数回を反転します。
- 7 分間遠心分離のステップを繰り返します。
- P1000 ピペットを使用して、ソリューションの大部分を最初ピペットで上澄みを除去し、ペレットを混乱させないでできるだけ多くのソリューションを削除する P200 ピペットを使用します。層流フードなどベンチトップ、RNase の混入に注意しながら、きれいな空間で RNA のペレットを乾燥、15 分間またはないより多くの液体になるまで滴チューブに表示。
- RNase フリーの水の 30 μ L でペレットを再懸濁します、製品 (たとえば分光光度計を使用して) そして因数-80 ° C のフリーザーで長期的なストレージのためのソリューションを定量化します。
注: 標準的な濃度範囲 800-2,500 ng/μ L から。
- 5 M 酢酸アンモニウムと混和する渦の 25 μ L を追加します。
-
(省略可能)尿素/ページを使用して、フルの長さの RNA を生成されていることを確認します。また、agarose のゲルを使用して RNA が維持されていることを確認します。
注: ただし、agarose のゲルを使用して gRNA の大規模な量が、RNA を視覚化する実行する必要がある、長さは正確に決定することはできません。No か少しカットの存在がある場合、対象魚への試薬の注入後切断の効率を分析する際は、劣化のために、sgRNA をチェックしなければなりません。- 40% ポリアクリルアミドゲル (19:1) と RNAse フリーの手法を用いたソリューションおよび機器438 M 尿素 TBE で 8% のポリアクリルアミドゲルをキャストします。
注: 市販の材料は、装置をきれいに使用できます (材料の表を参照してください)。 - ゲルが完全に (約 30 分) を固化後は、それを置くことによってゲルを平衡 TBE バッファーを実行して、5 V/cm で 30 分間の電気泳動の実行で。
- ミックス RNA ゲル ロード × 2 の等量と sgRNA の 300-500 ng を染める (材料の表を参照してください)。P1000 を使用して、各も数回でバッファーを実行をピペッティングしてエアダスターの井戸を消去します。ソリューションを読み込み、2.5 h の 10 V/cm でゲルを実行します。
注: ここでレーンでマーカーが RNA の長さを視覚化するのに役立ちますは必要ありません。一般的にそれは容易に明白な場合における長さの RNA がされている (図 2) を合成しました。 - 視覚化する核酸を使用してバンド染色 (材料の表を参照してください)。
注: スミア RNA の劣化 (図 2) を示すに対し、sgRNA バンドは単一バンドとして表示されます。
- 40% ポリアクリルアミドゲル (19:1) と RNAse フリーの手法を用いたソリューションおよび機器438 M 尿素 TBE で 8% のポリアクリルアミドゲルをキャストします。
3. CRISPR コンポーネントのゼブラフィッシュの胚へのマイクロインジェクション
- 繁殖タンク希望の男性と女性の数を配置することによって注入する前に夜を設定 (通常 2 人の女性と 1 または 2 の男性) で分周器飼育槽で44を配置。
- 10 cm シャーレに溶かしたアガロースの注ぐ 35 ml 0.01% メチレン ブルー (殺菌剤) と 1 x E3 メディア (材料の表を参照) で 1.5% の agarose が付いてマイクロインジェクション プレートを準備し、穏やかに谷をくさび状を作成するプラスチック金型を置く、ソリューション、気泡を除去するためにカビをタップします。
- 設定、メディアの少量が付いている皿を格納して agarose を許可し、プレートが 4 ° C で乾燥するを防ぐためにパラフィン フィルムで包まれる
注: 射出プレートは、井戸になる変形や乾燥、またはプレート金型を成長を開始するまで数週間、再利用可能です。 - 注入の朝、浄化された sgRNA と Cas9 蛋白質氷の上を解凍します。手袋 RNase の混入を防ぐために、RNase フリーのヒントとチューブを使用するすべての材料を処理してください。
- Cas9 蛋白質および 400 pg/nL Cas9 タンパク質の最終濃度を取得する Cas9:sgRNA の 2:1 の比率で sgRNA や 200 pg/nL sgRNA を組み合わせることによって 5 μ L 注入剤を生成します。Cas9/sgRNA ソリューション リボ核蛋白質複合を形成する Cas9 と sgRNA を許可する 5 分間室温で孵化させなさい。2.5 %wt/巻フェノールレッド溶液 0.5 μ L を追加 (材料の表を参照)、5 μ L の最終巻に水 RNase フリーします。
注: Cas9/sgRNA の複雑な KCl の添加が低塩基形成28を示す sgRNAs の切削効率を増加するための溶解度に影響を与える、溶液のイオン強度が示されています。 - 注射針は 1.0 mm ガラスを引いてキャピラリー マイクロ ピペットの引き手を使用してください。新しいかみそりの刃や鉗子を使用して簡単に卵黄嚢、絨毛膜に穴を開ける斜めの開口部を取得する新鮮な製の針の先端をカットします。
- オン エア源のマイクロに添付マイクロマニピュレーターに針を置きます。決定特定装置の校正に適した倍率を使用して光学顕微鏡、下針は一貫して鉱物油でいっぱいシャーレに 1 nL ソリューションをイジェクトするまで噴射圧力を調整します。
注意: 針の品質が重要です。前に、さらに実験45針を生産、これはスキルまでを胚の卵黄嚢に注射の練習を習得します。 - 区分線を削除し、約 15 分のために繁殖する魚。
注: 繁殖時間が長くより多くの胚を作り出す、早く、したがって減少遺伝子モザイクが発生しますその Cas9 カット チャンスを最大化する 1 細胞期胚がいる間の注入の完了しかし。胚は後の段階 (2-4 セル段階) で注入することが、これがおそらく変更された対立遺伝子の生殖細胞系の伝送速度を低下します。 - ストレーナを使用して卵を収集し、10 cm シャーレ 1 x E3 メディアを用いた 0.0001% メチレン ブルーにそれらをすすいでください。未受精卵および残骸の取り外し、光学顕微鏡下で卵の状態を確認します。
- 別のラベルが付いたペトリ皿で uninjected コントロールとして 10-15 胚置いておきます。
- 部屋の温度に温めて注入皿に卵のラインアップ転送ピペットを使用して、優しく。
- 2.5 倍の倍率で解剖顕微鏡、注入 1 Cas9 蛋白質の 400 の pg と sgRNA の 200 pg の合計を挿入するソリューションをそれぞれの胚の卵黄嚢の nL。
注: 場合は希望や必要に応じて切削を増やす、注射溶液; で 400 pg/nl sgRNA の 800 pg/nl Cas9 タンパク質の最終濃度に増加します。しかし、これがまた増加オフターゲット切断、または減少胚健康。切削効率は、セル46に直接注射することによって増やされるかもしれません。ただし、卵黄の袋への注入は技術的に以下の要求と魚の高い生殖を生成するための十分な切削を与える (> 変更された対立遺伝子を含む子孫の 70%)。 - 注入された胚を正しくラベル付けされたペトリ皿に戻り、メチレン ブルーで 1 x E3 メディアとそれらをカバー、28 ° C に設定胚インキュベーターに入れてください
- 24 時間受精 (hpf) の記事、死亡あるいは異常開発個人の取り外し、注入された胚の正常性を検査およびメディア (図 3参照) を変更します。Uninjected コントロールに対して生存率を確認します。
Uninjected コントロールに対して相対的なときメモ: 致死率 10% 未満の不要な遺伝子をターゲットとなっています。致死性の高いレベルは、uninjected コントロールと比較してガイド注入集団で観察される、目標とされた遺伝子は、開発に不可欠な的外れの効果失敗した開発をリードしていることがあります。注入された CRISPR 試薬の量を減らす必要があります。 または減少オフターゲット効果を持つ新しい sgRNA の生成が必要になる場合があります。 - インキュベーターに胚を戻すし、72 に胚を成長を続ける hpf、胎児の健康を維持するために毎日のメディアを変更します。
4、HMA を使用して塩基形成の効率の解析
- Uninjected コントロールから、5 つの胚のマイクロ遠心チューブ用と収集に hpf セットを 72 に成長して注入されたプレートから 5 つの胚の収集 2 つ設定します。
- 0.004% を追加することによって胚を麻酔 MS-222 (tricaine) 2 分待ってと。
- GDNA を抽出、優しく各胚のセットをメディアのピペット、50 mM NaOH の 45 μ L を追加します。10 分 95 ° C で胚を孵化させなさい。
- 部屋の温度の熱源とクールから胚を削除します。1 M トリス塩酸の pH を 5 μ l 添加精力的に 8、および渦のサンプルを = (5-10 秒)。最大速度で溶液を遠心分離機 (> 16,000 x g) 3 分常温遠心機できれいで、ラベルの付いたチューブに上清を転送し、6 ヶ月-20 ° c DNA gDNA を格納します。
注: 約 900 bp の小さい DNA のフラグメントこのプロトコルの使用によって生成されます。 - 2 μ L (uninjected コントロールなど) 各サンプルから準備された gDNA を使用して 50 μ L の PCR 反応を予測カット サイトを並ぶ以前に設計されたプライマーを用いたポリメラーゼに含まれている指示に従って設定します。
- PCR の浄化クリーンアップを PCR を使用して製品キット (材料の表を参照してください)、水や溶出バッファーの 30 μ L のサンプルを溶出、分光光度計を使用して DNA の定量化します。
- 沸騰水浴 (500 mL ビーカーに約 150 mL) で浮くラックにチューブを配置することによって、各精製 PCR の製品のすべての 30 μ L を reanneal します。3 分後、熱源を切り、室温に約 1 時間冷却ソリューションを許可します。
注: この手順まず DNA を変化でき、その後ランダムに生成可能なヘテロ二本鎖バンドに reanneal ために鎖、または不一致の二重鎖 DNA 多型を含む CRISPR 変異によって作成され、したがって、変更があります。電気泳動度の homoduplexes と比較して。PCR または、たちのランプダウン プログラムの最後のサイクルは製品47,48、reanneal にも使用できますが、沸騰したお湯の使用はヘテロ二本鎖製品の分解能を向上をもたらす可能性があります。 - ロード x 6 の 5 μ L を追加 reannealed PCR ソリューション (材料の表を参照) を染めます。
- 30% ポリアクリルアミドゲル (29:1) を使用して 15% ポリアクリルアミド/TBE ゲルをキャストします。ゲルが設定後、TBE バッファーを実行しているが電気泳動装置に配置します。P1000 を使用して、または残留塩ような残骸の井戸をオフに軽くピペッティング バッファー上下に井戸に数回で井戸を妨げることができる断片をゲルします。
- Reannealed PCR の製品、および負荷 sgRNA サンプルの各セットの横にあるコントロール (uninjected 魚からサンプル) の負荷 500 ng。150 V 2.5 h またはゲルの底が色素前面までのゲルを実行します。
- 核酸染色を使用してバンドを可視化する (例えば、エチジウム ブロマイドや SYBR グリーン (材料の表を参照))。
- 各コントロールと胚の CRISPR 注入プールのバンド パターンを調べます。
注: 複数の外観は、挿入の実行速度が低下するバンド uninjected レーンと新規ヘテロ二本鎖製品 (図 4) の形成を示します。新規ヘテロ二本鎖 DNA の存在は、オクターリピートが CRISPR 注入によって生成されたことを示します。約 50% 以上注入ソリューションで homoduplex バンド強度の減少は一般に十分な生殖の結果に十分です。さらに、余分なバンド uninjected 魚で時々 認識し、注入された魚で観測した時のヘテロ二本鎖バンドを見なすべきではないです。 - 各ターゲットの uninjected コントロールを基準として最高の切削効率を持つ注射を選択します。これらの注射から胚を使用して、魚を探す時期尚早停止コドンを引き起こしてオクターリピート育つできます。
注: 高能率加工 (約 > 50% の強度による homoduplex バンドの低減)、20-30 成魚をスクリーニングする必要があります生殖を得るのに十分です。
低いカットを生成する sgRNAs より多くの大人の魚は時期尚早停止コドンを含む変更された対立遺伝子の生殖の展示魚の識別の可能性を高めるに必要ことがあります。塩基形成遺伝子の別の領域に sgRNA を再設計する必要があります見られない場合。ヘテロ二本鎖バンド形成を認められなかった場合、sgRNA が低下した可能性があり、尿素/ページのゲルを使用して sgRNA の品質を確認する必要があります。
5. 身分証明書と伝搬のノック アウトの行
- 潜在的な創設者親魚を識別する (約 2.5-3 ヶ月に成長) オクターリピートの存在を識別するために大人の F0 魚の尾クリップを実行します。0.62 mM tricaine で魚を麻酔 (材料の表を参照)、清潔度、シャープのかみそりの刃を使用して約 1/2-3/4 の垂直尾翼を削除します。
- 尾は 50 mm NaOH、45 μ L 回収タンクに魚を返却してください。説明されている (手順 4.2 〜 4.4) として gDNA 抽出を実行します。魚再開される通常の遊泳行動と、流れに戻って魚を置くシステム水は塩基の性質が特定されるまで。
注: 個々 の魚が識別できると尾クリップの結果を適切に照合できるように重要です。 - 前述の (手順 4.5 – 4.9)、尾クリップ gDNA CRISPR 注入 (図 5) で魚が変更されたかを決定するために、HMA を実行します。創設者魚を識別するために繁殖する野生型魚に尾 gDNA からヘテロ二本鎖バンドを示す大人。胚を収集し、それらを 72 に育てる hpf。
- 72 で hpf 10 胚を収集し、それぞれの胚が、個々 のチューブ。50 mM NaOH の 11.25 μ L と 1 M トリス pH の 1.25 の μ L を使用して (手順 4.2-4.4) 上記 gDNA 抽出を実行 = 8。
- この世代 (図 6) に塩基の対立遺伝子に渡されているかどうかを決定するために (ステップ 4.7-4.13) で前述のヘテロ二本鎖バンドを識別する PCR と電気泳動を繰り返します。
- HMA を使用して 1 つの胚にみられる透過率に基づいて、各 CRISPR 線成人に関心のために十字架によって取得 20-30 胚の平均を成長します。
注: この番号が増加または生殖の周波数に応じて減少しました。 - 説明されている (手順 5.1-5.2) としてオクターリピートの存在を識別するために大人の F1 魚の尾クリップを実行します。前述の尾クリップ gDNA 魚が、塩基 (図 7) を運ぶかどうかを決定するために、HMA を実行 (手順 4.5-4.11)。
-
ヘテロ二本鎖バンドが含まれている魚、DNA シーケンス解析のため準備します。
- カットのサイトを中心とした、300-600 bp の PCR の製品を増幅する新しいプライマーを用いた PCR を実行します。
- PCR 精製キット、DNA をクリーンアップし 30 μ L の溶出を使用は、単一のバンドが存在する agarose のゲルの DNA を確認します。
注: バンディングいくつかのヘテロ二本鎖 agarose のゲルに存在する、小さな塗抹または予想されるサイズで PCR の製品のすぐ上の二重バンドとして表示されます。
- 1 ~ 3 オクターリピートを分析した場合、シーケンス サンガーを使用して PCR の製品のシーケンス処理とバイオインフォマティクス ツール49を使用して塩基の順序を決定します。そうでなければ、NGS 解析を用いた複数の PCR の製品のシーケンスの決定 (材料の表を参照) はより経済的であります。
- 判断は時期尚早停止コドンをバイオインフォマティクスのツールを使用してシーケンスを分析することによって受けたかどうか (材料の表を参照してください)。
- 適切なラベルを持つ新しいタンクに必要な突然変異体の対立遺伝子を含む魚をプレイス.
- 将来ジェノタイピング ニーズの対立遺伝子を特定塩基の PCR プライマーを設計します。これらのプライマーが変異のシーケンスにまたがる、野生型シーケンスを増幅されていません。
- クロスのヘテロ ゼブラフィッシュ 25% ノック アウトの行を含む分離人口を生成します。
Representative Results
このプロトコルで記述されている実験的アプローチは、ゼブラフィッシュ ノック アウト行 CRISPR/Cas9 技術を使用しての効率的でコスト効果の高い生産ができます。次の図は、解釈し、このプロトコルを使用して得られた結果のトラブルシューティングを容易にするためにこの資料に含まれています。次の成功した生産、CRISPR 試薬のマイクロインジェクション ゼブラフィッシュ胚はあからさまな表現型と塩基形成 HMA を使用して分析できます。CRISPR 実験の成功を視覚化する有用なコントロールは色素を産生遺伝子を対象とする手順 1.5 で説明した sgRNA の使用チロシナーゼ。チロシナーゼに Cas9 誘起塩基形成色素沈着が失われる結果し、48 である簡単に獲得した hpf (図 1)。注入が成功している CRISPR 試薬の準備を確保する別の有用なコントロール、その実物大を確認します (120 nt) sgRNA は、変性ポリアクリルアミドゲル (図 2レーン 1 と 2) を使用して合成されています。RNA の低下それが表示されます、塗抹標本としてたとえばレーン 3 (図 2) が注入に適さない劣化した RNA を示しています。
チロシナーゼなどあからさまな表現型で起因しない CRISPR Cas9 の対象となる遺伝子の塩基形成頻度を分析するには、HMA 分析、シンプルで信頼性の高い方法です。sgRNA/Cas9 注入された胚のヘテロ二本鎖バンドの形成と homoduplex バンド (図 4) の強度の減少の結果 HMA を使用して分析します。ヘテロ二本鎖バンドの存在は更に大人 (図 4および図 5) 創設者 (の生殖細胞の伝達効率を分析して microinjected の胚から潜在的な創設者魚を識別するためにこのプロトコルで利用されます。図 6)、およびヘテロ F1 魚 (図 7) に塩基の存在を確認します。塩基を含むヘテロ接合体の魚は、NGS、塩基の性質を識別し、時期尚早停止コドンがターゲット遺伝子のコーディング領域に存在かどうかの候補です。
図 1: ゼブラフィッシュ胚展示 1 細胞期でチロシナーゼをターゲット sgRNA で注射されたとき色素欠損。(A) 野生型、uninjected 48 胚 hpf と (B) は 48 で胚を注入した hpf。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 合成キットを使用して sgRNA のin vitro転写します。Oligosの in vitro転写 sgRNA 合成キットの手順に従ってを使用して合成。500 RNA の ng は、前述の尿素/ページのゲルで実行されました。sgRNA 1 と 2 レーンのロードは、完全な長さ、そのまま 120 nt RNA に対応するバンドを示しています。レーン 3 の sgRNA の注入には適していません、劣化した RNA のサンプルを示しています。
図 3: 24 hpf 注入胚の状態を比較します。生きている胚 (A) 開発 24 hpf は (B) の開発が中止された胚から容易に区別します。(B) のように、または大幅に胚 (a)、脊柱の彎曲などの機能の変更や目の開発は、皿から除去されるべき頭に変更します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: SgRNA Cas9 のヘテロ二本鎖移動性試金 microinjected ゼブラフィッシュ胚。サンプルあたり 5 胚のプールは 72 で収集された hpf と gDNA を抽出しました。ヘテロ二本鎖分析を行ったサンプルが 500 と同じように読み込まれた前述のように、DNA の ng。車線: M = 100 bp マーカー;1 = uninjected コントロール2 = 注入例 1;3 インジェクション サンプル 2 を =。バンドのサイズを予想 = 98 bp。
図 5: 大人の CRISPR 注入ゼブラフィッシュの尾部から抽出された gDNA のヘテロ二本鎖モビリティ アッセイ。SgRNA と Cas9 タンパク質を注入した胚は大人 (3 ヶ月) に成長しました。魚 B と C ヘテロ二本鎖バンドを展示し、その後送信される生殖オクターリピート; を識別するために繁殖しました。魚 A は、肯定的なヘテロ二本鎖バンドは発生しませんので、その後の分析で使用されませんでした。車線: 1 = 野生型制御;2 = 魚。3 = 魚 B;4 バンドのサイズの魚 C. 期待を = = 98 跪くこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 送信生殖オクターリピートを識別するために野生型魚に F0 CRISPR 注入ゼブラフィッシュの繁殖によって生成された単一の胚のヘテロ二本鎖モビリティ アッセイ。ゼブラフィッシュを交配、72 h 単一胚の成長 F1 胚を採取したと説明したヘテロ二本鎖解析を実行します。車線: 1 = 野生型制御;2-10 レーンあたり 1 つの F1 胚を =。このゲルは、7 のうち 10 胚が、塩基の 70% の生殖伝送率を示す肯定的なヘテロ二本鎖バンドを表示されています。バンドのサイズを予想 = 98 跪くこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: アダルト F1 ゼブラフィッシュ尾クリップのヘテロ二本鎖モビリティ アッセイ。F1 成魚オクターリピートを識別する HMA でスコア化しました。肯定的なヘテロ二本鎖バンドの展示魚が突然変異の性質を決定するための PCR 増幅し、広いシーケンス解析のために提出します。(A) 車線: 1 = 野生型制御;2 = 魚、(削除、bp 4 1 bp が一致しません)。(B) これらの F1 魚は同じ創設者から識別され、まだ異なるヘテロ二本鎖パターン、単一の創業者から変更された対立遺伝子複数の生殖を示すを表示します。車線: 1 = 野生型制御;2 魚 (4 bp の挿入、7 bp 不一致), B = 3 = 魚 C (4 bp 削除, 4 bp 不一致)。これらオクターリピートの各は、ターゲット遺伝子のコード配列の NGS によって決定されるへの早期停止コドンを作成しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルは、CRISPR Cas9 技術を用いたゼブラフィッシュ脊椎動物のモデル システムの遺伝子のノックアウトの生産を説明します。プロトコルの番号は、ゼブラフィッシュ15,25,26,50,51,52CRISPR を介したゲノム工学に着手する以前記載されています。このプロトコルが特にシンプルで再現性をもって一貫した実験技術の数を組み合わせることによって、以前の努力ビルド HMA と複数の簡単な経済的なを作成する、ヘテロ接合体の魚と実験的堅牢なプロトコルの NGSゼブラフィッシュの CRISPR を介した突然変異誘発の研究所が教育研究所と同様に、トレーニングと経験の範囲でスタッフの適切なです。
Rna は、このプロトコルに含まれているガイドの設計と合成に関する推奨事項。ガイド RNA のデザインの主要な考慮事項は、オフターゲット効果の最小化です。CRISPR-ユーザーが両方のターゲットにガイドの活動とオフのターゲット効果34,のチャンスを予測するユーザーフレンドリーなグラフィカル ・ インタ フェースを持つ計算ツールにアクセスできるようにするいくつかの予測アルゴリズムが開発されて35,36。ゼブラフィッシュ システムの特定の利点は、Cas9 を胚に注入し、したがって式は一時的な減少のオフターゲット効果53が発生するマウスで示されているにオフターゲット効果の低下率。それにもかかわらず、ゼブラフィッシュ54で発生するオフターゲット効果を実証されています。オフターゲット効果の制御方法の 1 つは、これらのガイドは非常に異なるをターゲット ・ サイトに影響を与える可能性が高いだろうと同じ遺伝子を対象とする 2 つの独立したガイド Rna によって生成されている表現型創始者ゼブラフィッシュすることです。このプロトコルに記載されていないいるオフターゲット効果を最小限に抑える方法として、高効率で修理はターゲット DNA の一本鎖切断を生成する変異 Cas9 の使用。逆に相補的互いに近接内 DNA のニックネームをペアリング希望の軌跡で効果的な塩基形成の結果の鎖、オフターゲット効果55,56を最小限に。
オフターゲット効果の異なるレートだけでなく、異なる sgRNAs は対象57,58,59の突然変異誘発の異なる速度を持つことができます。このプロトコルは、HMA を使用してヘテロ二本鎖バンド形成33,40を使用して指定された sgRNA の突然変異誘発の効率性を分析します。ヘテロ二本鎖バンドは、ミスマッチを含むとゲル電気泳動を使用して簡単に解決することができますの PCR による DNA 鎖の交配によって作成されます。塩基形成を測定するために一般的に使用される他の方法とは異なり T7 エンドヌクレアーゼのアッセイまたは高解像度溶融分析25,26, HMA、dna 塩基のミスマッチをカットする高価な酵素を必要としないなどを必要としません。PCR の複雑な分析では、曲線を溶かします。重要なは、HMA を使用して挿入された人口の塩基形成率が高いを確認する調査官の突然変異を識別するコストを削減するノック アウト線の後続の生産に必要な魚の数を最小限に抑えることができます、必要な特性。
オクターリピートの CRISPR ベースを生成する相対的な容易さは、一度に複数の遺伝子の複数の対立遺伝子の作成をできます。Web ベースのソフトウェアはサンガーを用いたヘテロ接合体の魚から単一の突然変異の分析のため利用可能な PCR の製品の49のシーケンスします。3 つ以上の CRISPR 変異の対立遺伝子が分析される場合、塩基の性質を特徴付ける NGS がこのアプローチとして塩基の性質を特徴付けるよりコスト効果的である o で特徴付けられる最大 50 の異なる対立遺伝子のプールをことができます。nce (材料の表を参照)60,,6162。規模のような経済は、特に学部実験室の設定で役に立つでしょう。
要約すると、このプロトコルは、再現性をもってその作成し、正常に関心の突然変異体の対立遺伝子を識別するために分析する必要があります少ない成魚 (特に sgRNA) の高品質 CRISPR 試薬を生成するためのステップバイ ステップの指示を提供します。また時間と希望する行を生成するコストを削減します。重要なは、このプロトコルは、手頃な価格の方法でゼブラフィッシュ変異体を生成する限られた資源と研究所で適用できるように設計されています。さらに、我々 は、このアプローチは大学生に適しており、CRISPR ベース ゲノム編集の体験に興味がある学部学生の教育と訓練のための機会が広がることを発見しました。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この仕事は健康の国民の協会によって支えられた (ジョーに R21CA182197)、ラルフ ・ w ・とグレース ・ m ・ ヘンチ研究の信頼、パーデュー大学の農業科学および経済開発 (AgSEED) プログラムの拡張子。サンガー シーケンス データに P30 CA023168 でサポートされているパーデュー大学ゲノム中核施設によって買収されました。メアリー Witucki はキャロル郡の癌協会によってサポートされているがん研究夏学部研究プログラムのパデュー大学センターによって支えられました。資金提供者には、研究デザイン、データの収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。原稿の重要なフィードバックを提供するためベンジャミン ・ カーター、エレン ・ デニング、テイラー サバトをありがとうございます。この作業のサポートのための生物化学の部門とケアと私たちのゼブラフィッシュの植民地の福祉に奉仕するパデュー大学ゼブラフィッシュ研究センターに感謝します最後に、我々 はパーデュー大学ゲノムの中核施設に感謝し、フィリップ ・ サン ・ ミゲルの貢献について NGS サービス。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CRISPOR | sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/ | ||
| Breaking-Cas | sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool | ||
| ChopChop | sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/ | ||
| Primer 3 | PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ | ||
| Rnase free technique | http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf | ||
| RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. | |
| Rnase-free ethanol | Any brand | Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol. | |
| Cas9 Protein | PNA Bio | CP01 | Cas9 protein with nuclear localization signal. |
| Target specific oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | Synthesize guide RNAs. | |
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product. | |
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended. | |
| EnGen sgRNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E3322 | In vitro transccribe guide RNAs. |
| 10X TBE | Thermo Fisher | B52 | RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids. |
| 6X Load Dye | New England BioLabs | B7025S | Loading DNA for electropheresis. |
| 5M Ammonium acetate | Thermo Fisher | AM9071 | Clean up reagent for purification of guide RNAs. |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any brand | Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free. | |
| Nuclease-free Water | Any brand | For synthesis and purification of guide RNAs. | |
| RNase away | Thermo Fisher | 10328011 | Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware. |
| DNA Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N0467S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
| DNA Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N0552S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
| RNA Ladder | New England BioLabs | N0364S | Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | Casting polyacrylamide gel. |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Casting polyacrylamide gel. |
| 40% Polyacrylamide (19:1) | BioRad | 161-0154 | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-100G | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher | R0641 | Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis. |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | Visualization of nucleic acids. |
| SYBER Green | Thermo Fisher | S7563 | Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels. |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | RNA clean up, PCR purification. |
| MyTaq Polymerase | Bioline | BIO-21105 | For amplification of DNA using PCR. |
| Thermocycler | Any brand | PCR amplification. | |
| Spectrophotometer | Any brand | NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA. | |
| E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate. |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
| Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection. |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection. |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
| Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos. | |
| Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
| Incubator | Any brand | Maintaining embryos at 28.5 oC. | |
| Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long |
| Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles. |
| Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
| Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
| 30% Polyacylamide (29:1) | BioRad | 161-0156 | Heteroduplex gel casting. |
| MS-222 (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A-5040 | Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE |
| Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection. | |
| 1,000 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| NGS Sequencing platform: Wideseq | If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35). | ||
| Software for sequence analysis | For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/ | ||
| Software for sequence analysis | SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing. |
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