Summary
Målrettet genom-redigering i modelsystem Danio rerio (zebrafisk) er blevet stærkt fremmet af fremkomsten af CRISPR-baserede tilgange. Heri, beskriver vi en strømlinet, robust protokol for generation og identifikation af CRISPR-afledte nonsens alleler, der inkorporerer heteroduplex mobilitet analyse og identifikation af mutationer ved hjælp af næste generation sequencing.
Abstract
Karakterisering af den grupperede, interspaced regelmæssigt, korte, palindromiske Gentag (CRISPR) system af Streptococcus pyogenes har aktiveret udviklingen af en brugerdefinerbar platform til at hurtigt generere gen ændringer i en bred vifte af organismer, herunder zebrafisk. CRISPR-baseret genom-redigering anvender en enkelt guide RNA (sgRNA) at målrette et CRISPR-forbundet (Cas) liv1975 til et genomisk DNA (gDNA) mål af interesse, hvor Cas liv1975 genererer en dobbelt-strenget pause (DSB). Reparation af DSBs af fejlbehæftede mekanismer fører til indsættelser og/eller sletninger (indels). Dette kan forårsage frameshift mutationer, der ofte indfører en tidlig stop codon inden for den kodende sekvens, således at der skabes en protein-null allel. CRISPR-baseret genom teknik kræver kun et par molekylære komponenter og er let indført i zebrafisk embryoner ved mikroinjektion. Denne protokol beskriver de metoder, der anvendes til at generere CRISPR reagenser for zebrafisk mikroinjektion og identificere fisk udstiller kønscelleoverførsel transmission af CRISPR-modificerede gener. Disse metoder omfatter in vitro transskription af sgRNAs, mikroinjektion af CRISPR reagenser, identifikation af indels induceret på mål-webstedet ved hjælp af en PCR-baserede metode, der kaldes en heteroduplex mobilitet assay (HMA) og karakterisering af indels ved hjælp af både en lav dataoverførselshastighed og en kraftfuld næste generation sequencing (NGS)-baseret tilgang, der kan analysere flere PCR produkter indsamlet fra heterozygous fisk. Denne protokol er strømlinet for at minimere antallet af fisk kræves og former for udstyr, der kræves for at udføre analyserne. Desuden, denne protokol er designet til at være modtagelig for brug af laboratoriet personal på alle niveauer af erfaring, herunder bachelorer, gør det muligt for denne kraftfulde værktøj til at være økonomisk ansat af nogen interesse for udførelse af CRISPR-baseret forskergruppe Genomisk ændring i zebrafisk.
Introduction
Bevarelse af molekylære maskineri i eukaryoter ligger til grund for magt ved hjælp af modelorganismer til forskning. Mange af disse modelsystemer lette anvendelsen af omvendte-genetiske tilgange såsom målrettet gen knockouts at karakterisere bidrag af et gen produkt til en biologisk eller sygdom proces af interesse. Gen forstyrrelser teknikker i organismer såsom zebrafisk har historisk påberåbt sig målrettet indførelse af frameshift mutationer, der skyldes upræcise reparation af DSBs1,2. Når en DSB er indført i genomet, DNA læsion er repareret gennem en af to veje, der er almindeligt stede i næsten alle celletyper og organismer: ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) og homologi-instrueret reparation (HDR)3,4 . Den upræcise karakter af NHEJ maskiner producerer ofte indels af forskellige længder5,6,7,8,9. Indførelsen af frameshift mutationer i den kodende sekvens af et gen kan producere en tidlig stop codon, som ofte gør genet fungerer ikke.
Tidlig genom engineering strategier i zebrafisk at fremme indels inkluderet meganucleases, zink-finger nukleaser og transkription aktivere-lignende effektor nukleaser, som alle udnyttede DNA-protein interaktioner for at målrette en nukleasen til en specifik genomisk mål hvor det indført en DSB10,11,12,13,14,15. Men disse teknologier er ofte vanskelig at anvende på grund af den besværlige og komplekse tekniske nødvendige for at generere en nukleasen, der henvender sig til DNA-sekvens af interesse. I modsætning til tidligere strategier, gør CRISPR-baserede gen redigering ikke stole på protein-DNA interaktioner for målretning. I stedet henvender CRISPR-forbundet (Cas) liv1975 sig via en RNA guide, der bruger nukleotid base parring interaktioner til at målrette en genomisk site af interesse16,17,18,19 ,20,21. På grund af enkelheden i designe en RNA er guide med den ønskede base parring interaktioner for at målrette det relativt let at målrette Cas liv1975 til det ønskede sted. Type II CRISPR system er i særdeleshed blevet bredt udviklet til genom redigering applikationer på grund af flere fordelagtige funktioner herunder brug af en enkelt flere domæner Cas nukleasen (Cas9) der kræver interaktionen med DNA til at stimulere liv1975 aktivitet og brug af en enkelt guide RNA (sgRNA) for at målrette det til den beslægtet DNA sekvens18. Sekvens kravene nødvendige for målretning af den beslægtet sgRNA er godt forstået19, og den ønskede sgRNA er let genereret af in vitro- transskription. Enkelthed og robusthed af CRISPR/Cas9 tilgang i høj grad letter målrettede genetisk modifikation i zebrafisk og en bred vifte af andre organismer.
Den forbedrede evne til at gennemføre målrettede genom-redigering i zebrafisk som følge af udviklingen af CRISPR-baseret reagenser har betydeligt øget mulighed for at studere processer emblematiske af hvirveldyr organismer såsom udvikling af central nervøs system. Zebrafisk genom indeholder orthologs af 70% af de protein-kodning gener i det menneskelige genom samt 84% af gener forbundet med sygdomme hos mennesker22. Zebrafisk udvikling udstiller flere centrale kvaliteter, at øge sin brug i omvendt genetiske undersøgelser: embryonerne er lagt i store koblinger, udvikle eksternt fra moderen gør dem åbne over for genetisk manipulation ved mikroinjektion og voksen zebrafisk seksuelt modne af 3 måneder, giver mulighed for hurtige formering af ønskede linjer23.
Mange protokoller er tilgængelige som beskriver en række tiltag til at generere og identificere CRISPR-afledte indels i zebrafisk24,25,26,27,28,29 ,30,31. Men mange af disse procedurer er tiden intensivt, kræver adgang til dyrt udstyr, og kan være en udfordring for laboratorier med begrænset ekspertise. De trin, der beskrives heri giver en enkel, robust og økonomisk CRISPR/Cas9-strategi til ingeniør zebrafisk knockout linjer. Denne protokol beskriver brugen af en yderst effektiv kit til at syntetisere sgRNAs ved hjælp af DNA oligonukleotider (oligos), svarende til andre tilgange, der er tidligere beskrevet32. Den beskrevne protokol omfatter to trin navnlig der i høj grad forenkle analyse af CRISPR-muteret linjer: en trinvis brug af PCR-baseret HMA33 til nemt bestemme tilstedeværelsen af genom ændringer og sekventering analyse af heterozygous zebrafisk til hurtigt og nemt bestemme karakteren af flere indels på en økonomisk måde. Derudover er trinvise instruktioner inkluderet for robust udvalg, pålidelig produktion og injektion af guide RNA'er. Fremgangsmåden her eksemplificere en robust, relativt billig protokol, der giver mulighed for laboratoriepersonalet med en vifte af ekspertise til at bidrage til identifikationen af genet knockouts i zebrafisk.
Protocol
Denne undersøgelse blev gennemført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Purdue Animal Care og brug Udvalget (PACUC nummer 08-031-11).
1. design af skabelon-specifikke Oligos for Guide RNA produktion
- Vælg target område af interesse at blive forandret i den kodende region af genet. Dette bør være tæt på 5' slutningen af for at generere en afkortet protein, men ikke så tæt, så en efterfølgende i-frame start codon giver mulighed for produktion af et protein med en beskeden N-terminale trunkering.
Bemærk: En måde at udelukke denne mulighed er at scanne den downstream kodende region af genet for en i rammen start codon. Derudover kan ved hjælp af en guide RNA, som er rettet mod midten af en stor exon, bidrage til at identificere PCR primere for efterfølgende scoring af den resulterende indel. - Identificere potentielle guide steder i regionen genomisk af interesse ved hjælp af en guide RNA udvalg program (Se Tabel af materialer)34,35,36. Indstil gennemser dataene til Danio rerio og protospacer tilstødende motiv (PAM) sekvens til 5'-NGG-3 '.
Bemærk: Ideel gRNA sekvenser indeholder en 5 '-G i den første position af gRNA for effektiv T7 in vitro- transskription. Hvis ingen acceptabel guide er fundet med et G på 5 '-position, 5 ' bunden af en anden guide kan ændres til en G eller en G kan tilføjes på 5 ' enden af guide RNA, men dette kan reducere skæring effektivitet37. For at maksimere skæring effektivitet, en optimal vejledning sekvens har 40-80% GC indhold (højere er bedre), og indeholder en G på 20th position, støder op til PAM, men er ikke påkrævet38. Et eksempel på en ideel målretning sekvens: 5 ' - G (N)18 G-3 ' - NGG (NGG er PAM). Ud over at undersøge resultaterne fra programmet guide RNA udvalg til at identificere optimale guide RNA'er som beskrevet ovenfor, bør der udvises forsigtighed at undgå guide RNA'er med forudsagte stærk off target effekter, som høj grad komplicerer downstream analyse. Især guide RNA'er med forudsagte off target effekter at falde inden for kodende regioner bør udelukkes, og de samlede ud-målwebsteder forudsagt bør minimeres. - Fra produktionen af guide RNA designværktøj, udelukke PAM sekvens (5 '-NGG-3 '); Det er ikke bruges til at målrette men omfatter anerkendelse sekvensen for Cas9 kavalergang.
- De resterende 20 nukleotider (nts), tilføje T7 promotor sekvens og overlapning sekvens (region supplement til et stillads oligo bruges til at syntetisere fuld længde sgRNAs leveres i den anbefalede i vitro transskription kit) i den anførte rækkefølge nedenfor for at få en 54 nt oligo: T7 promotor sekvens: 5 '-TTCTAATACGACTCACTATA-3 '; Guide RNA sekvens 5 ' - G (N)18 G-3 '; Overlapper sekvens: 5 '-GTTTTAGAGCTAGA-3 '
- Identificere PCR-primere, der flankerer den forudsagte cut site (Cas9 kløver 3 nt opstrøms af PAM sekvens) i en afstand af 50-150 basepar (bp) hver fra cut ved hjælp af web-baseret software (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Disse vil blive brugt i et senere trin for måling af skæring effektivitet. Hvis ingen passende primere identificeres ved hjælp af disse begrænsninger, kan en anden guide RNA websted bør overvejes. - Bestil 54 nt oligonukleotider til at producere guiden RNA og PCR primere for analyse af målwebsteder (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Som en valgfri positiv kontrol, kan det være nyttigt at producere en sgRNA rettet mod et gen, der er nødvendige for produktionen af pigment at kontrollere udførelsen af denne protokol, ved hjælp af en let scorede visuelle fænotype (Se figur 1 for repræsentative resultater). Et fælles mål er den gen tyrosinase, ved hjælp af oligo (guide RNA sekvens er understreget)39: 5 '-TTCTAATACGACTCACTATAGGACTGGAGGACTTCTGGGGGTTTTAGAGCTAGA-3 '
2. fremstilling af CRISPR-reagenser til Embryo mikroinjektion
-
Bestil kommercielt tilgængelig Cas9 protein (se tabel af materialer).
Bemærk: Injektion af Cas9 mRNA kan også bruges til at generere indels i zebrafisk40,41, men zebrafisk embryo mikroinjektion med Cas9 protein har vist sig at være mere effektiv32,42.- Suspendere Cas9 protein i den leverede buffer til at generere en 1 mg/mL opløsning. Gemme løsningen i injektion-ready delprøver i PCR rør ved-80 ° C til at minimere antallet af fryse-tø cykler. For at generere en 5 µL injektion løsning, 2 µL af 1 mg/mL Cas9 løsning er brugt, kan derfor Cas9 være aliquoted i 2 µL alikvoter ved hjælp af PCR strip-rør.
- Syntetisere sgRNA ved hjælp af sgRNA i vitro transskription kit (Se Tabel af materialer). Udføre i vitro transskription ifølge producentens anvisninger.
Bemærk: Fastholde RNase-fri teknik ved alle syntese, oprydning og injektion løsning præparationstrin. For eksempel bruger engangshandsker og ændre dem ofte, bruge rør og tips, der er certificeret fri for RNase, og rene overflader og pipetter med kommercielt tilgængelige løsninger til at rense labware (Se Tabel af materialer). -
Rense den syntetiserede sgRNA ved hjælp af en ammoniumacetat/nedbør ved hjælp af RNase-fri teknik.
Bemærk: Alternativt sgRNAs kan renses ved hjælp af en bred vifte af kommercielt tilgængelige kolonne-baserede RNA oprensning kits til en relativt beskedne omkostninger.- Tilsæt 25 µL af 5 M ammoniumacetat og vortex at blandes grundigt.
Bemærk: Ammonium acetat løsning er kommercielt tilgængelige (Se Tabel af materialer), eller en 5 M løsning kan foretages i hus ved at tilføje 385.4 mg af molekylærbiologisk kvalitet ammoniumacetat til 1 mL af RNase-fri vand og opbevares ved-20 ° C. - Tilføj 150 µL af 200-bevis nukleasen-fri ethanol til hver prøve. Sted reaktion i et-80 ° C fryser i mindst 20 min.
Bemærk: Prøverne kan opbevares natten over ved-80 ° C, men vil ikke øge den samlede RNA udbytte. - Centrifugeres prøver ved maksimal hastighed (> 16.000 x g) i en 4 ° C microcentrifuge i 20 min.
- Fjern supernatanten omhyggeligt ved langsomt pipettering off væske, sikring af RNA pellet ikke forstyrres.
- Der tilsættes 1 mL af 70% ethanol (lavet af fortynding nukleasen-fri ethanol i RNase-fri vand) og bland forsigtigt røret af invertere det flere gange at vaske resterende salt fra røret.
- Gentag trinnet centrifugering for 7 min.
- Fjern supernatanten ved første pipettering ud de fleste af løsningen ved hjælp af en P1000 pipette, derefter bruge P200 pipette til at fjerne så meget løsning som muligt uden forstyrrende pellet. Tør RNA pellet i en ren plads, såsom en laminar flow hætte eller en bænk top, være omhyggelig med at undgå RNase forurening, for 15 min eller indtil nogen mere flydende dråber er synlige i røret.
- Resuspenderes i 30 µL af RNase-fri vand, kvantificere produktet (for eksempel ved hjælp af et spektrofotometer) og alikvot løsning til langtidsopbevaring i et-80 ° C fryser.
Bemærk: Typiske koncentrationer spænder fra 800-2.500 ng/µL.
- Tilsæt 25 µL af 5 M ammoniumacetat og vortex at blandes grundigt.
-
(VALGFRIT) Kontroller, at fuld længde RNA er blevet genereret ved hjælp af urinstof/side. Alternativt kan du bruge en agarosegel til at kontrollere, at RNA er intakt.
Bemærk: Men hvis du bruger en agarosegel en større mængde af gRNA skal køres for at visualisere RNA, og længden ikke kan bestemmes nøjagtigt. Når du analyserer effektiviteten af target skære efter injektion af reagenserne i fisk, hvis der er ingen eller lille skæring stede skal derefter sgRNA kontrolleres for nedbrydning.- Støbt en 8% polyacrylamid gel i TBE med 40% polyacrylamid (19:1) og 8 M urea ved hjælp af RNAse-fri teknik til løsninger og udstyr43.
Bemærk: Kommercielt tilgængelige materialer kan bruges til at rense udstyr (Se Tabel af materialer). - Når gelen er helt størknet (ca. 30 min.), reagensglasset gel ved at placere det i TBE kører bufferen og udfører elektroforese for 30 min på 5 V/cm.
- Mix 300-500 ng af sgRNA med et lige saa stort volumen af 2 x RNA gel ladning farvestof (Se Tabel af materialer). Bruger en P1000, klart wells af eventuelle rester af pipettering kører buffer i hver godt flere gange. Indlæse løsninger og Kør gelen på 10 V/cm til 2,5 h.
Bemærk: Markør lane her er nyttig til at visualisere længden af RNA, men er ikke påkrævet; generelt det er umiddelbart indlysende, hvis fulde længde RNA er blevet syntetiseret (figur 2). - Visualisere bands bruger en nukleinsyre pletten (Se Tabel af materialer).
Bemærk: sgRNA bands skal vises som en enkelt band, mens udtværing angiver RNA nedbrydning (figur 2).
- Støbt en 8% polyacrylamid gel i TBE med 40% polyacrylamid (19:1) og 8 M urea ved hjælp af RNAse-fri teknik til løsninger og udstyr43.
3. mikroinjektion af CRISPR-komponenter i zebrafisk embryoner
- Oprette opdræt tanke om natten før injektion af sætter antallet af ønskede hanner og hunner (typisk 2 hunner og 1 eller 2 hanner) i en formering tank med en skillevæg i placere44.
- Forbered en mikroinjektion plade med 1,5% Agarosen i 1 x E3 media (Se Tabel af materialer) med 0,01% methylenblåt (fungicid) ved at hælde 35 mL af den smeltede Agarosen i en 10 cm petriskål og forsigtigt lægge en plast støber for at oprette kile-formede trug i den løsning, trykke formen for at fjerne luftbobler.
- Tillad Agarosen at indstille og gemme parabol med en lille mængde af medier og indpakket i paraffin film til beskytter pladen mod udtørring ved 4 ° C.
Bemærk: Injektion plader kan genbruges i flere uger, indtil brøndene blive deformeret eller tør, eller pladen begynder at vokse skimmel. - Om morgenen den indsprøjtning, tø renset sgRNA og Cas9 protein på is. Husk at håndtere alle materialer med handsker til at forhindre RNase forurening og anvende RNase-fri tips og rør.
- Generere en 5 µL injektion løsning ved at kombinere Cas9 protein og sgRNA i forholdet 2:1 af Cas9:sgRNA at opnå endelige koncentrationer af 400 pg/nL Cas9 protein og 200 pg/nL sgRNA. Inkubér Cas9/sgRNA løsning ved stuetemperatur i 5 min at give Cas9 og sgRNA at danne en kompleks ribonucleoprotein. Tilsæt 0,5 µL af 2,5% wt/vol phenolrødtopløsning (Se Tabel af materialer), og RNase-fri vand til en endelige mængden af 5 µL.
Bemærk: Den ioniske styrken af løsningen har vist sig at påvirke opløseligheden af Cas9/sgRNA komplekse, derfor tilsætning af KCl kan øge skæring effektiviteten af sgRNAs, som udviser lav indel dannelse28. - Gøre en injektion nålen ved at trække en 1.0 mm glas kapillær ved hjælp af en mikropipette puller. Skær spidsen af frisklavede nålen ved hjælp af en ny barberblad eller pincet til at opnå en vinklet åbning, der vil nemt gennemhuller chorion og blommesækken.
- Placer nålen i en micromanipulator, der er knyttet til en microinjector med luft kilde tændt. Juster indsprøjtning pres under et lysmikroskop ved hjælp af forstørrelse egnet til kalibrering bestemmes for den særlige apparater, indtil nålen konsekvent skubber en 1 nL løsning i en petriskål, fyldt med mineralsk olie.
Bemærk: Kvaliteten af nålen er kritisk. Praksis producerer en nål og indsprøjtning i blommesækken af embryoner, indtil det er dygtighed er mestret før forsøger yderligere eksperimenter45. - Fjerne en skillevæg og tillade fisken hen til avle i ca 15 min.
Bemærk: Længere avl gange vil producere flere embryoner, men injektion skal udfyldes, mens embryonerne er på 1-celle stadium at maksimere chancen for at Cas9 skæring sker tidligt og derfor fald genetiske mosaicisme. Embryoner kan injiceres i senere faser (2 – 4 celle faser), men dette kan muligvis nedsætte kønscelleoverførsel transmission sats af den modificerede allel. - Indsamle æg ved hjælp af en si og skyl dem i en 10 cm petriskål ved hjælp af 1 x E3 medier med 0,0001% methylenblåt. Undersøge sundheden for æg under lysmikroskop, at fjerne enhver ubefrugtede æg og debris.
- Der er afsat 10 – 15 embryoner som en uninjected kontrol i en separat, mærket petriskål.
- Ved hjælp af en overførsel pipette, forsigtigt linje op æg på injektion pladen opvarmes til stuetemperatur.
- Under en dissektion mikroskop på 2,5 X forstørrelse, indsprøjte 1 nL løsning i blommesækken af hver embryo at injicere ialt 400 pg Cas9 protein og 200 pg af sgRNA.
Bemærk: For at øge skæring, hvis ønsket eller nødvendigt, øge den endelige koncentration af Cas9 protein til 800 pg/nL og sgRNA til 400 pg/nL i injektion løsning; men dette kan også øge off target skæring og/eller fald embryonet sundhed. Skæring effektivitet kan også øges ved at injicere direkte ind i cellen46. Men injektion i blomme-sæk er teknisk mindre krævende og giver tilstrækkelig skæring til at producere fisk med høj kønscelleoverførsel transmission (> 70% af afkom der indeholder en forandret allel). - Returnere de injicerede embryoner til en korrekt mærket petriskål, dækker dem med 1 x E3 medier med methylenblåt, og læg dem i en embryo inkubator, indstillet til 28 ° C.
- På 24 h post befrugtning (hpf), inspicere sundhed af de injicerede embryoner, fjerner døde eller unormalt udvikle personer og ændre media (Se figur 3). Check satsen for overlevelse mod den uninjected kontrol.
Bemærk: Når rettet mod en unødvendig gene, mindre end 10% dødelighed forventes i forhold til den uninjected kontrol. Hvis forhøjede niveauer af dødelighed er observeret i de guide-indsprøjtning populationer i forhold til den uninjected kontrol, kan det indikere, målrettede genet er afgørende for udvikling, eller off-target effekter fører til mislykkede udvikling. At reducere mængden af injicerede CRISPR-reagenser kan være nødvendigt eller generation af en ny sgRNA med reduceret off target effekter kan være påkrævet. - Returnere embryonerne til rugemaskine og fortsat stigende embryoner til 72 hpf, ændre medierne dagligt for at bevare embryonet sundhed.
4. analyse af effektiviteten af Indel dannelse ved hjælp af en HMA
- Indsamle to sæt af fem embryoner fra injiceres pladerne vokset til 72 hpf i microcentrifuge rør og indsamle et sæt af fem embryoner fra en uninjected kontrol.
- Bedøver embryoner ved at tilføje 0,004% MS-222 (tricaine) og vente 2 min.
- Hen til uddrag gDNA, forsigtigt afpipetteres media off hver embryo sæt og tilføje 45 µL af 50 mM NaOH. Inkuber embryoner ved 95 ° C i 10 min.
- Fjerne embryoner fra den varmekilde og afkøles til stuetemperatur. Tilsæt 5 µL 1 M Tris-HCl pH = 8, og vortex prøverne kraftigt (5 – 10 s). Centrifugeres løsning på max speed (> 16.000 x g) i en stuetemperatur microcentrifuge i 3 min. overføre supernatanten til en ren, mærket slange og gemme gDNA ved-20 ° C DNA i op til 6 måneder.
Bemærk: DNA fragmenter af ca. 900 bp og mindre vil blive genereret gennem anvendelse af denne protokol. - Oprette en 50 µL PCR reaktion ved hjælp af 2 µL af den forberedte gDNA fra hver prøve (herunder en uninjected kontrol) per de instruks inkluderet med polymerase, ved hjælp af de tidligere designede primere flankerer den forudsagte cut site.
- Rense PCR produkter ved hjælp af en PCR oprydning kit (Se Tabel af materialer), elueres prøver i 30 µL vand eller eluering buffer og kvantificere DNA ved hjælp af et spektrofotometer.
- Reanneal alle 30 µL af hver renset PCR produkt ved at placere rør i en floatable rack i et vandbad med kogende (ca. 150 mL i et 500 mL bægerglas). Efter 3 min, sluk varmekilde og give løsninger til at afkøle til stuetemperatur, ca 1 time.
Bemærk: Dette trin først denaturerer DNA og derefter tillader tråde til reanneal tilfældigt for at generere eventuelle heteroduplex bands, eller forkerte dobbelt-strenget DNA, der indeholder polymorfier lavet af CRISPR-mutagenese og derfor har en ændret elektroforetisk mobilitet i forhold til homoduplexes. Den sidste cyklus af PCR eller rampe-ned i thermocycler kan også bruges til at reanneal produkter47,48, men brugen af kogende badet kan give forbedret opløsning af heteroduplex produkter. - Tilsæt 5 µL af 6 x lastning farvestof (Se Tabel af materialer) til de reannealed PCR løsninger.
- Støbt en 15% polyacrylamid/TBE gel ved hjælp af 30% polyacrylamid (29: 1). Når gel har angivet, læg det i en elektroforese apparater med TBE kører buffer. Bruger en P1000, klart wells af snavs som resterende salte eller gel fragmenter, der kan blokere brøndene forsigtigt når der afpipetteres buffer op og ned i brøndene flere gange.
- Belastning 500 ng af reannealed PCR-produkter, og belastningen en kontrol (sample fra uninjected fisk) ud for hvert sæt af sgRNA prøver. Kør gelen på 150 V i 2,5 timer, eller indtil farvestof front er i bunden af gelen.
- Visualisere bands bruger en nukleinsyre pletten (fx, ethidiumbromid eller SYBR green (Se Tabel af materialer)).
- Undersøge band mønster for hver kontrol og CRISPR-indsprøjtning pulje af embryoner.
Bemærk: Udseendet af flere bands der køre langsommere i den injicerede versus uninjected baner angiver dannelsen af roman heteroduplex produkter (figur 4). Tilstedeværelse af roman heteroduplex DNA angiver, at indels blev genereret med CRISPR-injektion. Reduktion i homoduplex band intensitet i de injicerede løsninger på ca 50% eller mere er generelt tilstrækkeligt til at resultere i tilstrækkelig kønscelleoverførsel transmission. Derudover ekstra bands er sommetider identificeres i de uninjected fisk, og bør ikke betragtes som heteroduplex bands når observeret i den injicerede fisk. - Vælg injektioner med højeste skæring effektivitet i forhold til den uninjected kontrol for hvert mål; embryoner fra disse injektioner kan bruges til at vokse op fisk at kigge efter indels forårsager for tidlig stop kodon.
Bemærk: For højeffektive skæring (reduktion i homoduplex bandet af ca > 50% intensitet), screening 20 – 30 voksne fisk bør være tilstrækkelig til at opnå kønscelleoverførsel transmission.
For sgRNAs, der genererer mindre skæring, kan flere voksne fisk være nødvendigt at øge sandsynligheden for at identificere fisk, der udviser kønscelleoverførsel transmission af modificerede alleler indeholdende et for tidligt stop-codon. Hvis indel dannelse ikke er observeret, kan det være nødvendigt at redesigne sgRNA til en anden region af genet. Hvis ingen heteroduplex band dannelse er observeret, at sgRNA kan have nedbrudt, og sgRNA kvalitet bør kontrolleres ved hjælp af en urea/side gel.
5. identifikation og udbredelse af Knock-out linjer
- For at identificere en potentiel grundlægger overordnede fisk, udføre hale klip af den voksne F0 fisk (vokset til cirka 2,5 – 3 måneder) til at identificere tilstedeværelsen af indels. Bedøver fisk i 0,62 mM tricaine (Se Tabel af materialer), derefter bruge en rene, skarpe barberblad til at fjerne cirka 1/2-3/4 af halefinnen.
- Læg halen i 45 µL af 50 mM NaOH, og returnere fisk en recovery tank. Udføre gDNA udvinding som beskrevet (trin 4.2-4.4). Når fisken genoptager normal svømning adfærd, læg fisken tilbage på flyder system vand indtil arten af indel er identificeret.
Bemærk: Det er afgørende at sikre, at enkelte fisk kan identificeres, og passende kan matches til resultater af hale klip. - Som beskrevet (trin 4.5-4.9), udføre en HMA på hale klippet gDNA til at bestemme, hvis fisken blev ændret ved CRISPR injektion (figur 5). For at identificere en grundlægger fisk, yngle de voksne, der udviser heteroduplex bands fra hale gDNA til wild-type fisk. Indsamle embryoner og dyrke dem til 72 hpf.
- På 72 hpf, indsamle 10 embryoner og placere hvert embryon i et enkelt rør. Udføre en gDNA udvinding som beskrevet ovenfor (trin 4.2-4.4) ved hjælp af 11,25 µL af 50 mM NaOH og 1,25 µL 1 M Tris pH = 8.
- Gentag PCR-elektroforese for at identificere heteroduplex bands som beskrevet ovenfor (trin 4,7-4.13) for at bestemme, hvis indel alleler er blevet videregivet til denne generation (figur 6).
- Baseret på den procentvise transmission observeret i enkelt embryoner ved hjælp af HMA, vokse et gennemsnit på 20 – 30 embryoner fremstillet ved korset for hver CRISPR-linjer af interesse til voksenalderen.
Bemærk: Dette tal kan forhøjes eller nedsættes afhængigt af hyppigheden af kønscelleoverførsel transmission. - Udføre hale klip af den voksne F1 fisk til at identificere tilstedeværelsen af indels som beskrevet (trin 5.1 – 5.2). Som beskrevet (trin 4.5-4.11), udføre en HMA på hale klippet gDNA at afgøre hvis fisken bærer en indel (figur 7).
-
For fisk, der indeholder en heteroduplex bandet, forberede DNA sekventering analyse.
- Udføre PCR ved hjælp af nye primere til at forstærke en 300 – 600 bp PCR produkt centreret omkring webstedet cut.
- Brug en PCR rensning kit til at rydde op i DNA, og elueres i 30 µL. undersøge DNA på en agarosegel at sikre en enkelt band er til stede.
Bemærk: Nogle heteroduplex striber kan være til stede på agarosegel og vises som en lille smøre eller dobbelt band lige over PCR produkt på den forventede størrelse.
- Hvis en til tre indels analyseres, sekvens PCR produkter ved hjælp af Sanger sekvensering og bestemme rækkefølgen af indel ved hjælp af en Bioinformatik værktøj49. Ellers, fastlæggelsen af rækkefølgen af flere PCR produkter ved hjælp af NGS analyse (Se Tabel af materialer) er mere økonomisk.
- Bestemme, hvis en tidlig stop codon er opnået ved at analysere den ordne i rækkefølge benytter en Bioinformatik værktøj (Se Tabel af materialer).
- Læg fisken indeholdende ønskede mutant allel ind i en ny tank med passende etiketter.
- Design PCR primere for specifikke indel alleler for fremtidige genotypebestemmelse behov. Disse primere bør span de muterede sekvens og ikke forstærke vildtype sekvens.
- I cross heterozygous zebrafisk til at generere en adskillelse befolkning, der indeholder 25% knock-out linjer.
Representative Results
De eksperimentelle metoder beskrevet i denne protokol giver mulighed for effektiv, omkostningseffektiv produktion af zebrafisk knock-out linjerne ved hjælp af CRISPR/Cas9 teknologi. De følgende figurer er medtaget i denne artikel for at lette fortolkningen og fejlfinding af resultaterne ved hjælp af denne protokol. Efter vellykket produktion og mikroinjektion af CRISPR-reagenser, zebrafisk embryoner kan analyseres for åbenlys fænotyper og indel dannelse ved hjælp af HMA. En hjælpsom kontrol at visualisere succes af CRISPR-eksperimentet er brugen af sgRNA beskrevet taktfast 1,5 at målrette pigment-producerende genet tyrosinase. Cas9-induceret indel dannelse på tyrosinase resulterer i tab af pigmentering og er let scoret af 48 hpf (figur 1). En anden nyttig kontrol at sikre at forberedelse af CRISPR-reagenser til injektion har været en succes, er at kontrollere, at fuld længde (120 nt) sgRNA er blevet syntetiseret ved hjælp af en denaturering polyacrylamid gel (figur 2, Lane 1 og 2). Hvis RNA er nedbrudt kan det vises som en smøre, for eksempel Lane 3 (figur 2) viser nedbrudt RNA, der ikke er egnet til injektion.
For at analysere indel dannelse hyppigheden af gener målrettet ved CRISPR-Cas9, der ikke resulterer i åbenlys fænotyper som tyrosinase, er HMA analyse en simpel og pålidelig metode. sgRNA/Cas9 indsprøjtet embryoner analyseret ved hjælp af HMA resultater i dannelsen af heteroduplex bands og reduktion af intensiteten af homoduplex band (figur 4). Tilstedeværelsen af heteroduplex bands yderligere udnyttes i denne protokol til at identificere potentielle grundlægger fisk fra de microinjected embryoer og som voksne (figur 4 og figur 5), til at analysere kønscelleoverførsel transmission effektivitet grundlægger ( Figur 6), og at kontrollere tilstedeværelsen af en indel i en heterozygous F1 fisk (figur 7). De heterozygous fisk, der indeholder en indel er kandidater til NGS at identificere karakteren af indel og afgøre, om en tidlig stop codon er til stede i regionen kodning af target-genet.
Figur 1 : Zebrafisk embryoner udviser en pigment fejl Når injiceres med en sgRNA rettet mod tyrosinase på én-celle stadium. (A) Wild-type, uninjected embryo på 48 hpf og (B) injiceres embryo på 48 hpf. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : In vitro transskription af sgRNA ved hjælp af syntese kit. Oligos blev syntetiseret ved hjælp af in vitro- transskription efter sgRNA syntese kit instrukser. 500 ng af RNA blev kørt på en urea/side gel som beskrevet. sgRNA indlæses i spor 1 og 2 viser et band, der svarer til den fulde længde, intakt 120 nt RNA. SgRNA i lane 3 viser en nedbrudt RNA stikprøve, der ikke er egnet til injektion.
Figur 3 : Sammenligning af 24 hpf injiceres embryoner sundhed. Et levende Foster (A) udviklet til 24 hpf, let adskiller sig fra et foster, der har afbrudt udviklingen (B). Embryoner, der ligner (B) eller har drastisk ændret funktioner til (A), som spinal krumning eller ændret hoved og øjne udvikling bør fjernes fra fad. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Heteroduplex mobilitet analyse af sgRNA-Cas9 microinjected zebrafisk embryoner. Puljer af 5 embryoner pr. sample blev indsamlet på 72 hpf og gDNA blev udvundet. Heteroduplex analyse blev udført som beskrevet, prøver lige var fyldt med 500 ng af DNA. Baner: M = 100 bp markør; 1 = uninjected kontrol; 2 = injektion prøve 1; 3 = injektion prøve 2. Forventet band størrelse = 98 bp.
Figur 5 : Heteroduplex mobilitet assay af gDNA udvundet fra halen af en voksen CRISPR-indsprøjtning zebrafisk. Embryoner, der blev sprøjtet med en sgRNA og Cas9 protein var vokset til voksenalderen (3 måneder). Fisk B og C udstille heteroduplex bands og efterfølgende blev avlet til at identificere kønscelleoverførsel overføres indels; fisk A blev ikke brugt i efterfølgende analyse, fordi det ikke udviser en positiv heteroduplex band. Baner: 1 = vildtype kontrol; 2 = fisk A; 3 = fisk B; 4 = fisk C. forventet band størrelse = 98 bp. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Heteroduplex mobilitet assay af enkelt embryoner genereret ved avl en F0 CRISPR-indsprøjtning zebrafisk til en wild-type fisk at identificere kønscelleoverførsel overføres indels. Zebrafisk blev parret, og F1 embryoner dyrkes for 72 h. enkelt embryoner blev indsamlet og heteroduplex analyse udført som beskrevet. Baner: 1 = vildtype kontrol; 2-10 = en enkelt F1 embryon pr. vognbane. Denne gel viser 7 ud af 10 embryoner en positiv heteroduplex band, der angiver en kønscelleoverførsel overførselshastighed på 70% af indel. Forventet band størrelse = 98 bp. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Heteroduplex mobilitet assay af voksen F1 zebrafisk hale clips. Voksen F1 fisk blev scoret af HMA at identificere indels. Fisk, der udstillet en positiv heteroduplex band var PCR forstærket og indsendt til bred sekventering analyse at fastslå arten af mutationen. (A) baner: 1 = vildtype kontrol; 2 = fisk (4 bp sletning, 1 bp mismatch). (B) disse F1 fisk blev identificeret fra den samme grundlægger, og endnu vise forskellige heteroduplex mønster, der angiver kønscelleoverførsel transmission af flere modificerede alleler fra en enkelt grundlægger. Baner: 1 = vildtype kontrol; 2 = fisk B (4 bp indsættelse, 7 bp mismatch), 3 = fisk C (4 bp sletning, 4 bp mismatch). Hver af disse indels lavet en tidlig stop codon i kodende sekvens af target-genet, som bestemmes af NGS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne protokol beskriver produktion af genet knockouts i zebrafisk hvirveldyr modelsystem ved hjælp af CRISPR-Cas9 teknologi. Et antal protokoller har tidligere været beskrevet for at foretage CRISPR-medieret genom engineering i zebrafisk15,25,26,50,51,52. Denne protokol bygger på tidligere indsats ved at kombinere en række enkle men reproducerbar konsekvent eksperimentelle teknikker, navnlig HMA og NGS af flere heterozygous fisk, til at skabe en enkel, økonomisk, og eksperimentelt robust protokol for CRISPR-medieret mutagenese i zebrafisk, som passer til labs bemandet med personale med en vifte af uddannelse og erfaring samt undervisning labs.
Anbefalinger for design og syntese af guide RNA'er er inkluderet i denne protokol. En vigtig overvejelse i guide RNA design er minimering af off-target effekter. Flere forudsigelse algoritmer er blevet udviklet for at give CRISPR-brugere adgang til beregning værktøjer med brugervenlige grafiske grænseflader, som forudsiger både aktiviteten af guiden på mål og chancen for off-target effekter34, 35,36. En specifik fordel af zebrafisk system er sænket priser af off-target effekter, fordi Cas9 sprøjtes ind i embryoner og derfor udtryk er forbigående, som har været vist i mus til at resultere i nedsat off target effekter53. Ikke desto mindre har ud-target effekter vist sig for at forekomme i zebrafisk54. En måde at kontrollere for off-target effekter er at fænotype grundlægger zebrafisk, der er genereret af to uafhængige guide RNA'er, rettet mod det samme gen, som disse guider vil være meget sandsynligt, at påvirker forskellige off-målwebsteder. En alternativ metode til at minimere off target effekter, der ikke er beskrevet i denne protokol er brugen af en muteret Cas9, der genererer enkelt strand pauser på target-DNA, som er repareret med høj effektivitet. Parring DNA rifter i nærhed af hinanden, der supplerer modsat strands resultater i effektiv indel dannelse på den ønskede locus og minimerer off target effekter55,56.
Ud over at have forskellige satser for off-target effekter, kan forskellige sgRNAs har forskellige satser for mutagenese ønskede mål57,58,59. Denne protokol bruger HMA for at analysere effektiviteten af mutagenese af en given sgRNA, ved hjælp af heteroduplex band dannelse33,40. Heteroduplex bands er lavet af hybridisering af PCR-genererede DNA-strenge, der indeholder uoverensstemmelser, og let kan løses ved hjælp af gelelektroforese. I modsætning til andre metoder, der almindeligvis anvendes til at måle indel dannelse, såsom T7 liv1975 assay eller høj opløsning smelte analyse25,26, HMA kræver ikke et dyrt enzym til at skære uoverensstemmelse mellem DNA, og kræver ikke kompliceret analyse af PCR smelte kurver. Vigtigere, også ved hjælp af HMA for at kontrollere høje priser af indel dannelse i den injicerede befolkning kan investigator at minimere antallet af fisk til senere fremstilling af knock-out linjer, hvilket reducerer omkostningerne ved at identificere en mutation med den ønskede karakteristika.
Den relative lethed til at generere CRISPR-baseret indels muliggør skabelsen af multiple alleler af flere gener på én gang. Web-baseret software er tilgængelig for analyse af enkelt mutationer fra heterozygous fisk ved hjælp af Sanger sekventering af PCR produkter49. I det tilfælde, hvor tre eller flere CRISPR-muterede alleler er analyseret, er NGS at karakterisere arten af indel sandsynligvis at være mere omkostningseffektivt at karakterisere arten af indel som denne tilgang giver mulighed for en pulje af op til 50 forskellige alleler til karakteriseres på o NCE (Se Tabel af materialer)60,61,62. Disse stordriftsfordele ville sandsynligvis være særlig nyttig i en bachelor laboratorium indstilling.
I Resumé, denne protokol giver trinvis rutevejledning til reproducerbar genererer høje kvalitet CRISPR-reagenser (i bestemt, sgRNA), sådan at færre voksne fisk skal være oprettet og analyseres for at med held identificere de mutante alleler af interesse, som også reducerer tid og omkostninger ved at producere de ønskede linjer. Vigtigst, er denne protokol designet sådan at den kan anvendes af laboratorier med begrænsede ressourcer til at producere mutant zebrafisk i en overkommelig måde. Desuden har vi fundet at denne strategi er velegnet til undergraduates og dermed udvider mulighederne for uddannelse og oplæring af studerende interesseret i hands-on erfaring i CRISPR-baseret genom-redigering.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R21CA182197 til J.O.), Ralph W. og nåde M. Showalter forskning tillid, og ved Purdue landbruget videnskab og Extension for økonomisk udvikling (AgSEED) program. Sanger sequencing data blev erhvervet af Purdue genomforskning Core faciliteten støttes af P30 CA023168. Mary Witucki blev støttet af Purdue University Center for Cancer Research sommer Undergraduate Research Program understøttes af Carroll County Cancer Association. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet. Vi takker Benjamin Carter, Ellen Denning og Taylor Sabato for at levere kritisk feedback på manuskriptet. Vi takker Institut for biokemi til støtte for dette arbejde, og Center for zebrafisk forskning ved Purdue University for deres engagement i pleje og omsorg af vores zebrafisk koloni. Endelig, vi takker Purdue genomforskning Core facilitet, og bidrag af Phillip San Miguel angående de NGS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CRISPOR | sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/ | ||
| Breaking-Cas | sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool | ||
| ChopChop | sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/ | ||
| Primer 3 | PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ | ||
| Rnase free technique | http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf | ||
| RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. | |
| Rnase-free ethanol | Any brand | Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol. | |
| Cas9 Protein | PNA Bio | CP01 | Cas9 protein with nuclear localization signal. |
| Target specific oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | Synthesize guide RNAs. | |
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product. | |
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended. | |
| EnGen sgRNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E3322 | In vitro transccribe guide RNAs. |
| 10X TBE | Thermo Fisher | B52 | RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids. |
| 6X Load Dye | New England BioLabs | B7025S | Loading DNA for electropheresis. |
| 5M Ammonium acetate | Thermo Fisher | AM9071 | Clean up reagent for purification of guide RNAs. |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any brand | Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free. | |
| Nuclease-free Water | Any brand | For synthesis and purification of guide RNAs. | |
| RNase away | Thermo Fisher | 10328011 | Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware. |
| DNA Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N0467S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
| DNA Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N0552S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
| RNA Ladder | New England BioLabs | N0364S | Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | Casting polyacrylamide gel. |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Casting polyacrylamide gel. |
| 40% Polyacrylamide (19:1) | BioRad | 161-0154 | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-100G | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher | R0641 | Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis. |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | Visualization of nucleic acids. |
| SYBER Green | Thermo Fisher | S7563 | Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels. |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | RNA clean up, PCR purification. |
| MyTaq Polymerase | Bioline | BIO-21105 | For amplification of DNA using PCR. |
| Thermocycler | Any brand | PCR amplification. | |
| Spectrophotometer | Any brand | NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA. | |
| E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate. |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
| Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection. |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection. |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
| Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos. | |
| Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
| Incubator | Any brand | Maintaining embryos at 28.5 oC. | |
| Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long |
| Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles. |
| Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
| Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
| 30% Polyacylamide (29:1) | BioRad | 161-0156 | Heteroduplex gel casting. |
| MS-222 (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A-5040 | Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE |
| Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection. | |
| 1,000 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| NGS Sequencing platform: Wideseq | If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35). | ||
| Software for sequence analysis | For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/ | ||
| Software for sequence analysis | SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing. |
References
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
- Hsu, P. D., Zhang, F. Dissecting neural function using targeted genome engineering technologies. ACS Chem Neurosci. 3 (8), 603-610 (2012).
- Shrivastav, M., De Haro, L. P., Nickoloff, J. A. Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice. Cell Res. 18 (1), 134-147 (2008).
- Chapman, J. R., Taylor, M. R., Boulton, S. J. Playing the end game: DNA double-strand break repair pathway choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annu Rev Biochem. 79, 181-211 (2010).
- Bee, L., Fabris, S., Cherubini, R., Mognato, M., Celotti, L. The efficiency of homologous recombination and non-homologous end joining systems in repairing double-strand breaks during cell cycle progression. PLoS One. 8 (7), e69061 (2013).
- Betermier, M., Bertrand, P., Lopez, B. S. Is non-homologous end-joining really an inherently error-prone process? PLoS Genet. 10 (1), e1004086 (2014).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Ata, H., Clark, K. J., Ekker, S. C. The zebrafish genome editing toolkit. Methods Cell Biol. 135, 149-170 (2016).
- Sertori, R., Trengove, M., Basheer, F., Ward, A. C., Liongue, C. Genome editing in zebrafish: a practical overview. Brief Funct Genomics. 15 (4), 322-330 (2016).
- Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Adv Genet. 92, 1-52 (2015).
- Liu, Y., et al. A highly effective TALEN-mediated approach for targeted gene disruption in Xenopus tropicalis and zebrafish. Methods. 69 (1), 58-66 (2014).
- Xiao, A., et al. Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish. Nucleic Acids Res. 41 (14), e141 (2013).
- Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Enriquez, P. CRISPR-Mediated Epigenome Editing. Yale J Biol Med. 89 (4), 471-486 (2016).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Ota, S., Kawahara, A. Zebrafish: a model vertebrate suitable for the analysis of human genetic disorders. Congenit Anom (Kyoto). 54 (1), 8-11 (2014).
- Samarut, E., Lissouba, A., Drapeau, P. A simplified method for identifying early CRISPR-induced indels in zebrafish embryos using High Resolution Melting analysis. BMC Genomics. 17, 547 (2016).
- Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish. PLoS One. 9 (6), e98282 (2014).
- Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
- Prykhozhij, S. V., Rajan, V., Berman, J. N. A Guide to Computational Tools and Design Strategies for Genome Editing Experiments in Zebrafish Using CRISPR/Cas9. Zebrafish. 13 (1), 70-73 (2016).
- Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), 2025-2037 (2016).
- Varshney, G. K., et al. A high-throughput functional genomics workflow based on CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in zebrafish. Nat Protoc. 11 (12), 2357-2375 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Sci Rep. 6, 34555 (2016).
- Vejnar, C. E., Moreno-Mateos, M. A., Cifuentes, D., Bazzini, A. A., Giraldez, A. J. Optimized CRISPR-Cas9 System for Genome Editing in Zebrafish. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2016).
- Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), e98186 (2014).
- Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
- Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17 (1), 148 (2016).
- Oliveros, J. C., et al. Breaking-Cas-interactive design of guide RNAs for CRISPR-Cas experiments for ENSEMBL genomes. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W267-W271 (2016).
- Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Ota, S., Hisano, Y., Ikawa, Y., Kawahara, A. Multiple genome modifications by the CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Genes Cells. 19 (7), 555-564 (2014).
- Hisano, Y., Ota, S., Kawahara, A. Genome editing using artificial site-specific nucleases in zebrafish. Dev Growth Differ. 56 (1), 26-33 (2014).
- Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. Efficient Multiple Genome Modifications Induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 Protein Complex in Zebrafish. PLoS One. 10 (5), e0128319 (2015).
- Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. (32), (2009).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods Mol Biol. 127, 125-132 (1999).
- Yin, L., Maddison, L. A., Chen, W. Multiplex conditional mutagenesis in zebrafish using the CRISPR/Cas system. Methods Cell Biol. 135, 3-17 (2016).
- Yin, L., Jao, L. E., Chen, W. Generation of Targeted Mutations in Zebrafish Using the CRISPR/Cas System. Methods Mol Biol. 1332, 205-217 (2015).
- Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Dev Dyn. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Targeted Mutagenesis in Zebrafish Using CRISPR RNA-Guided Nucleases. Methods Mol Biol. 1311, 317-334 (2015).
- Gonzales, A. P., Yeh, J. R. Cas9-based genome editing in zebrafish. Methods Enzymol. 546, 377-413 (2014).
- Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nat Methods. 12 (6), 479 (2015).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nat Methods. 11 (4), 399-402 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Ren, X., et al. Enhanced specificity and efficiency of the CRISPR/Cas9 system with optimized sgRNA parameters in Drosophila. Cell Rep. 9 (3), 1151-1162 (2014).
- Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods Enzymol. 546, 21-45 (2014).
- Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mutations using next-generation sequencing. BMC Genomics. 15, 1002 (2014).
- Jung, C., et al. Massively Parallel Biophysical Analysis of CRISPR-Cas Complexes on Next Generation Sequencing Chips. Cell. 170 (1), 35-47 (2017).
- Dijk, E. L., Auger, H., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Ten years of next-generation sequencing technology. Trends Genet. 30 (9), 418-426 (2014).
