斑马斑马(斑马鱼) 在模型系统中的靶向基因组编辑由于 CRISPR 方法的出现而大大促进。在这里, 我们描述了一个简化的, 健壮的协议, 以生成和鉴定 CRISPR 衍生的无意义的等位基因, 包括 heteroduplex 移动性检测和识别突变使用下一代测序。
化脓链球菌的聚类、定期 interspaced、短、回文重复 (CRISPR) 系统的特性使得开发一个可定制的平台能够快速地在各种包括斑马鱼在内的生物。基于 CRISPR 的基因组编辑使用单一的指南 RNA (sgRNA) 靶向一个 CRISPR 相关 (cas) 限制性的基因组 DNA (gDNA) 目标的兴趣, 其中 Cas 限制性产生双股断裂 (争端)。通过容易出错的机制修复 DSBs 导致插入和/或删除 (indels)。这可能导致 frameshift 突变, 通常在编码序列中引入一个过早停止密码子, 从而产生蛋白质-零等位基因。基于 CRISPR 的基因组工程学只需要少量的分子成分, 通过显微注射就可以很容易地引入斑马鱼胚胎。本协议描述了用于为斑马鱼注射生成 CRISPR 试剂的方法, 并确定了 CRISPR 修饰基因生殖传播的鱼类。这些方法包括 sgRNAs 的体外转录、CRISPR 试剂的显微注射、在靶点诱导的 indels 的识别, 使用一种称为 heteroduplex 移动性试验 (HMA) 的 PCR 方法, 并描述 indels使用低吞吐量和强大的下一代测序方法, 可以分析从异型鱼收集的多个 PCR 产品。该议定书得到简化, 以尽量减少所需的鱼数和进行分析所需的设备类型。此外, 本议定书的目的是让实验室个人使用包括本科生在内的所有级别的经验, 使这一强有力的工具能够在经济上由任何感兴趣的研究小组执行 CRISPR斑马鱼基因组的改良。
在真核生物中, 分子机械的保护是利用模型有机体进行研究的力量。这些模型系统中的许多都有助于使用反向遗传方法, 如靶向基因挖空, 以描述基因产品对生物或疾病过程的贡献。像斑马鱼这样的生物体中的基因干扰技术历来依赖于对 DSBs1、2的不精确修复导致的 frameshift 突变的定向引入。当一个争端研究小组引入到基因组中时, DNA 损伤通过两个途径之一来修复, 在几乎所有细胞类型和有机体中普遍存在: 非同源端连接 (NHEJ) 和同源定向修复 (HDR)3,4.NHEJ 机械的不精确性质经常产生不同长度的 indels5,6,7,8,9。在基因编码序列中引入 frameshift 突变, 可以产生一个过早停止密码子, 这往往使基因无法正常地呈现。
早期的基因组工程战略在斑马鱼促进 indels 包括 meganucleases, 锌手指核酸和转录激活剂类似的效应核酸, 所有这些都利用 DNA 蛋白相互作用的目标核酸酶到特定的基因组目标, 它引入了争端的10,11,12,13,14,15。然而, 这些技术往往很难应用, 因为需要费力和复杂的工程, 以生成一个核酸酶的目标 DNA 序列的兴趣。与以前的策略不同, 基于 CRISPR 的基因编辑并不依赖于蛋白质-DNA 相互作用来进行靶向。相反, CRISPR 相关 (Cas) 限制性是通过 RNA 指南, 使用核苷酸基配对相互作用的目标基因组站点的兴趣16,17,18,19 ,20,21。由于简单的设计一个 RNA 指南与期望的基础配对相互作用的目标, 这是相对容易的靶向 Cas 限制性到所需的轨迹。特别是 II. 型 CRISPR 系统已被广泛开发为基因组编辑应用, 由于几个有利的特点, 包括使用单一多域 Cas 核酸酶 (Cas9), 需要与 DNA 的相互作用, 以刺激限制性活动和使用一个单一的指南 RNA (sgRNA) 靶向它的同源 DNA 序列18。对同源 sgRNA 的靶向序列要求有很好的理解19, 而所需的 sgRNA 很容易通过体外转录产生。CRISPR/Cas9 方法的简单性和健壮性极大地促进了斑马鱼和其他多种生物的靶向基因修饰。
由于开发基于 CRISPR 的试剂, 在斑马鱼中进行靶向基因组编辑的能力增强, 这大大增加了研究诸如中枢神经发育等脊椎动物的过程的机会。系统。斑马鱼基因组包含了在人类基因组中发现的70% 蛋白质编码基因的 orthologs, 以及84% 与人类疾病相关的基因22。斑马鱼的发展展示了几个关键品质, 增强其在逆向遗传学研究中的应用: 胚胎被放置在大的离合器, 外部发展的母亲使他们服从基因操作的显微注射, 和成年斑马鱼性成熟3月的年龄, 允许快速繁殖所需的线23。
许多协议可用于描述在斑马鱼24、25、26、27、28、29 中生成和识别 CRISPR 衍生 indels 的各种方法. ,30,31。然而, 这些程序中的许多都是时间密集型的, 需要获得昂贵的设备, 而且对于具有有限专门知识的实验室来说, 这是很有挑战性的。这里描述的步骤提供了一个简单, 健壮, 经济的 CRISPR/Cas9-strategy, 以工程师斑马鱼淘汰赛线。该协议描述了使用一种高效的试剂盒合成 sgRNAs 使用 DNA 寡核苷酸 (寡核苷酸), 类似于以前描述的其他方法32。所描述的协议包括两个步骤, 特别是大大简化分析 CRISPR 变异线: 逐步使用 PCR 为基础的 HMA33 , 以方便地确定存在的基因组修改, 并排序分析异型斑马鱼以一种经济的方式快速、容易地确定多种 indels 的性质。此外, 还包括分步指导, 用于健壮的选择、可靠的生产和引导 rna 的注入。这里提供的步骤举例说明了一个健壮的、相对低廉的协议, 使实验室人员能够提供一系列专门知识, 有助于鉴定斑马鱼中的基因挖空。
本协议描述了利用 CRISPR-Cas9 技术生产斑马鱼脊椎动物模型中基因挖空的方法。一些协议以前被描述进行 CRISPR 介导的基因组工程学在斑马鱼15,25,26,50,51,52。该协议建立在以前的努力基础上, 结合了一些简单而重现性一致的实验技术, 特别是多异型鱼的 HMA 和, 以创建一个简单、经济和实验性强的协议。CRISPR 介导的对斑马鱼的诱变, 适用于配备有一系列培训和经验的人员的实验室, 以及教学实验室。
本议定书包括了指南 rna 的设计和合成建议。指南 RNA 设计的一个主要考虑是最小化的离靶效应。开发了几种预测算法, 允许 CRISPR 用户使用友好的图形界面访问计算工具, 同时预测目标指南的活动和离目标效果34的几率, 35,36。斑马鱼系统的一个特定优势是降低了离靶效果的比率, 因为 Cas9 被注入胚胎, 因此表达是瞬态的, 这已经显示在小鼠, 以减少离靶效应53。然而, 在斑马鱼54中已经证明了非靶向效应的发生。控制离靶效果的一个方法是, 表型创建者斑马鱼是由两个独立的指南 rna 产生的, 目标相同的基因, 因为这些指南将很可能会影响不同的目标地点。在本协议中没有描述的减少目标效果的另一种方法是使用突变的 Cas9, 在目标 DNA 上产生单链断裂, 并以高效率修复。配对 DNA 刻痕在彼此附近互相是互补的对相反的链导致有效的 indel 形成在期望的轨迹并且最小化目标作用55,56。
除了有不同的率的非目标效应, 不同的 sgRNAs 可以有不同的率的突变的预期目标57,58,59。该协议使用 HMA 分析 sgRNA33、40的 heteroduplex 带的诱变效果。Heteroduplex 带是由 PCR 生成的 DNA 链的杂交产生的, 含有不匹配, 可以很容易地解决使用凝胶电泳。与通常用于测量 indel 形成的其他方法不同, 如 T7 限制性法或高分辨率熔体分析25、26, HMA 不需要昂贵的酶来切割不匹配的 DNA, 也不需要PCR 熔体曲线的复杂分析。重要的是, 使用 HMA 来验证注射的人群中 indel 形成的高比率, 也使调查人员能够尽量减少随后生产出的排线所需的鱼数, 从而降低了识别突变的成本。期望的特征。
生成基于 CRISPR 的 indels 相对容易, 可以同时创建多个基因的多个等位基因。基于 Web 的软件可用于分析异型鱼的单一突变, 利用 PCR 产品49的基因测序。在分析了三或更多 CRISPR 变异的等位基因的情况下, indel 的性质可能更具成本效益, 以描述 indel 的性质, 因为这种方法允许有多达50种不同的等位基因的池在 o(见材料表)60,61,62。这种规模经济在本科实验室设置中可能特别有用。
总之, 本协议提供了重现性生成高质量 CRISPR 试剂 (特别是 sgRNA) 的分步指导, 这样就需要创建和分析更少的成年鱼, 以成功地识别出感兴趣的突变等位基因, 这还可以减少生成所需行的时间和成本。重要的是, 这项议定书的设计, 使它可以适用于有限资源的实验室, 生产突变的斑马鱼以负担得起的方式。此外, 我们发现这种方法适合本科生, 从而扩大了对 CRISPR 基因组编辑的亲身体验有兴趣的本科生的教育和培训机会。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了国家卫生研究院 (R21CA182197 联办)、拉尔夫 W 和格雷斯 m. 肖沃尔特研究信托基金的支持, 并由普渡农业科学和经济发展推广 (AgSEED) 计划提供。P30 CA023168 支持的普渡大学基因组核心设施获得了桑格测序数据。玛丽 Witucki 得到了普渡大学癌症研究中心暑期本科生研究计划的支持, 卡罗尔县癌症协会支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。我们感谢本杰明. 卡特, 艾伦丹宁, 泰勒萨巴托为手稿提供了关键的反馈。我们感谢生物化学系对这项工作的支持, 以及在普渡大学的斑马鱼研究中心, 他们致力于我们的斑马鱼殖民地的照顾和福利。最后, 我们感谢普渡大学基因组核心设施, 以及菲利浦 San 米格尔对服务的贡献。
CRISPOR | sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/ | ||
Breaking-Cas | sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool | ||
ChopChop | sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/ | ||
Primer 3 | PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ | ||
Rnase free technique | http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf | ||
RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. | |
Rnase-free ethanol | Any brand | Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol. | |
Cas9 Protein | PNA Bio | CP01 | Cas9 protein with nuclear localization signal. |
Target specific oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | Synthesize guide RNAs. | |
PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product. | |
PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended. | |
EnGen sgRNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E3322 | In vitro transccribe guide RNAs. |
10X TBE | Thermo Fisher | B52 | RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids. |
6X Load Dye | New England BioLabs | B7025S | Loading DNA for electropheresis. |
5M Ammonium acetate | Thermo Fisher | AM9071 | Clean up reagent for purification of guide RNAs. |
Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any brand | Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free. | |
Nuclease-free Water | Any brand | For synthesis and purification of guide RNAs. | |
RNase away | Thermo Fisher | 10328011 | Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware. |
DNA Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N0467S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
DNA Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N0552S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
RNA Ladder | New England BioLabs | N0364S | Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized |
TEMED | Thermo Fisher | 17919 | Casting polyacrylamide gel. |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Casting polyacrylamide gel. |
40% Polyacrylamide (19:1) | BioRad | 161-0154 | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
Urea | Sigma-Aldrich | U5378-100G | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher | R0641 | Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis. |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | Visualization of nucleic acids. |
SYBER Green | Thermo Fisher | S7563 | Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels. |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | RNA clean up, PCR purification. |
MyTaq Polymerase | Bioline | BIO-21105 | For amplification of DNA using PCR. |
Thermocycler | Any brand | PCR amplification. | |
Spectrophotometer | Any brand | NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA. | |
E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate. |
Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection. |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection. |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos. | |
Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
Incubator | Any brand | Maintaining embryos at 28.5 oC. | |
Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long |
Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles. |
Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
30% Polyacylamide (29:1) | BioRad | 161-0156 | Heteroduplex gel casting. |
MS-222 (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A-5040 | Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE |
Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection. | |
1,000 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
NGS Sequencing platform: Wideseq | If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35). | ||
Software for sequence analysis | For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/ | ||
Software for sequence analysis | SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing. |