मॉडल प्रणाली ढाणियो rerio (zebrafish) में लक्षित जीनोम संपादन बहुत CRISPR के उद्भव द्वारा सुविधा है आधारित दृष्टिकोण । इस के साथ साथ, हम पीढ़ी और CRISPR की पहचान के लिए एक सुव्यवस्थित, मजबूत प्रोटोकॉल का वर्णन-बकवास alleles कि heteroduplex गतिशीलता परख और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग कर उत्परिवर्तनों की पहचान को शामिल कर ली ।
संकुल, नियमित रूप से अंतराल, लघु, palindromic दोहराने (CRISPR) स्ट्रेप्टोकोकस pyogenes की प्रणाली के लक्षण वर्णन एक अनुकूलन मंच के विकास के लिए तेजी से एक विस्तृत विविधता में जीन संशोधनों उत्पंन सक्षम है जीवों सहित zebrafish. CRISPR आधारित जीनोम संपादन एक CRISPR संबद्ध (कैस) endonuclease एक जीनोमिक डीएनए (gDNA) ब्याज के लक्ष्य के लिए लक्ष्य है, जहां कैस endonuclease एक डबल-किनारा तोड़ (DSB) उत्पंन करने के लिए एक एकल गाइड आरएनए (sgRNA) का उपयोग करता है । त्रुटि-प्रवण तंत्र के द्वारा DSBs के सम्मिलन और/या हटाए गए (indels) के लिए लीड की मरंमत । यह frameshift उत्परिवर्तनों है कि अक्सर कोडन अनुक्रम के भीतर एक समय से पहले बंद codon परिचय, इस प्रकार एक प्रोटीन-अशक्त एलील पैदा कर सकता है । CRISPR आधारित जीनोम इंजीनियरिंग केवल कुछ आणविक घटकों की आवश्यकता है और आसानी से microinjection द्वारा zebrafish भ्रूण में शुरू की । इस प्रोटोकॉल zebrafish microinjection के लिए CRISPR रिएजेंट उत्पंन करने के लिए और CRISPR के germline संचरण का प्रदर्शन मछली की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों का वर्णन-संशोधित जीन । इन तरीकों sgRNAs के इन विट्रो प्रतिलिपि में शामिल हैं, CRISPR रिएजेंट के microinjection, लक्ष्य साइट पर एक पीसीआर आधारित विधि का उपयोग कर प्रेरित indels की पहचान एक heteroduplex गतिशीलता परख (HMA) कहा जाता है, और indels के लक्षण वर्णन दोनों एक कम प्रवाह और एक शक्तिशाली अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) का उपयोग-आधारित दृष्टिकोण है कि कई पीसीआर heterozygous मछली से एकत्र उत्पादों का विश्लेषण कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक मछली की दोनों संख्या और उपकरणों के विश्लेषण प्रदर्शन की जरूरत के प्रकार को कम करने के लिए सुव्यवस्थित है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को स्नातकों सहित अनुभव के सभी स्तरों के प्रयोगशाला व्यक्तिगत द्वारा उपयोग के लिए उत्तरदाई बनाया गया है, इस शक्तिशाली उपकरण को सक्षम करने के लिए आर्थिक रूप से किसी भी शोध CRISPR प्रदर्शन में रुचि समूह द्वारा नियोजित हो आधारित zebrafish में जीनोमिक संशोधन ।
eukaryotes भर में आणविक मशीनरी के संरक्षण अनुसंधान के लिए मॉडल जीवों का उपयोग करने की शक्ति को निर्भर करता है । इन मॉडल प्रणालियों के कई रिवर्स के उपयोग की सुविधा-आनुवंशिक दृष्टिकोण जैसे लक्षित जीन नॉकआउट के लिए एक जैविक या ब्याज की बीमारी की प्रक्रिया के लिए एक जीन उत्पाद के योगदान को चिह्नित । ऐसे zebrafish के रूप में जीवों में जीन व्यवधान तकनीक ऐतिहासिक frameshift उत्परिवर्तनों के लक्षित परिचय पर भरोसा किया है कि DSBs1,2की गलत मरंमत से परिणाम । जब एक DSB जीनोम में पेश किया है, डीएनए घाव दो रास्ते है कि लगभग सभी कोशिका प्रकार और जीवों में सार्वभौमिक मौजूद है में से एक के माध्यम से मरंमत की है: गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने (NHEJ) और समरूपता-निर्देशित मरंमत (HDR)3,4 . NHEJ मशीनरी की गलत प्रकृति अक्सर विभिन्न लंबाई5,6,7,8,9के indels पैदा करता है । एक जीन के कोडिंग अनुक्रम में frameshift उत्परिवर्तनों का परिचय एक समय से पहले बंद codon, जो अक्सर जीन unfunctioned renders उत्पादन कर सकते हैं ।
zebrafish में जल्दी जीनोम इंजीनियरिंग रणनीतियों को बढ़ावा देने के लिए indels शामिल meganucleases, जस्ता उंगली nucleases, और प्रतिलेखन उत्प्रेरक-जैसे प्रभाव nucleases, जो सभी का उपयोग डीएनए प्रोटीन बातचीत के लिए एक nuclease लक्ष्य एक विशिष्ट जीनोमिक लक्ष्य जहां यह एक DSB10,11,12,13,14,15की शुरुआत की । हालांकि, इन प्रौद्योगिकियों अक्सर श्रमसाध्य और जटिल इंजीनियरिंग के लिए एक nuclease है कि ब्याज की डीएनए अनुक्रम लक्ष्य उत्पंन करने की आवश्यकता के कारण लागू करने के लिए मुश्किल हैं । पिछली रणनीतियों के विपरीत, CRISPR आधारित जीन संपादन प्रोटीन पर भरोसा नहीं है लक्ष्यीकरण के लिए डीएनए बातचीत । इसके बजाय, CRISPR-संबद्ध (Cas) endonuclease एक आरएनए गाइड के माध्यम से निर्देशित किया गया है कि न्यूक्लियोटाइड आधार बाँधना बातचीत का उपयोग करता है एक जीनोमिक साइट के हित के लक्ष्य के लिए16,17,18,19 ,20,21. लक्ष्य के लिए वांछित आधार बाँधना के साथ एक आरएनए गाइड डिजाइनिंग की सादगी के कारण यह अपेक्षाकृत वांछित लोकस को कैस endonuclease को लक्षित करने के लिए आसान है. प्रकार द्वितीय CRISPR प्रणाली विशेष रूप से जीनोम संपादन एक एकल multidomain कैस nuclease (Cas9) कि डीएनए के साथ बातचीत की आवश्यकता है endonuclease गतिविधि को उत्तेजित करने के उपयोग सहित कई लाभप्रद सुविधाओं के कारण अनुप्रयोगों के लिए विकसित किया गया है और एक गाइड आरएनए (sgRNA) का उपयोग करने के लिए यह cognate डीएनए अनुक्रम18को लक्षित करने के लिए । अनुक्रम cognate sgRNA के लक्ष्यीकरण के लिए आवश्यक आवश्यकताओं को अच्छी तरह से19समझ रहे हैं, और वांछित sgRNA आसानी से इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा उत्पंन होता है । सादगी और CRISPR/Cas9 दृष्टिकोण की मजबूती बहुत zebrafish में लक्षित आनुवंशिक संशोधन और अंय जीवों की एक विस्तृत विविधता की सुविधा ।
बढ़ाया CRISPR के विकास का एक परिणाम के रूप में zebrafish में जीनोम संपादन को लक्षित करने की क्षमता आधारित रिएजेंट काफी वृद्धि हुई है इस तरह केंद्रीय तंत्रिका हड्डीवाला जीवों की प्रक्रियाओं का द्योतक अध्ययन करने का अवसर सिस्टम. zebrafish जीनोम में मानव जीनोम में पाए जाने वाले प्रोटीन-कोडिंग जीन के ७०% के orthologs होते हैं और साथ ही मनुष्यों में रोगों से जुड़े जीन का ८४%22. Zebrafish विकास कई प्रमुख गुण है कि रिवर्स आनुवंशिक अध्ययन में इसके उपयोग को बढ़ाने दर्शाती है: भ्रूण बड़े चंगुल में रखी, मां उंहें microinjection द्वारा आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी बनाने से बाह्य विकसित कर रहे हैं, और वयस्क Zebrafish उंर के 3 महीने से यौन परिपक्व, वांछित लाइनों के तेजी से प्रचार के लिए अनुमति23।
कई प्रोटोकॉल उपलब्ध है कि उत्पंन करने के लिए दृष्टिकोण की एक किस्मका वर्णन और zebrafish24,25,26,27,28,29 में CRISPR व्युत्पंन indels की पहचान ,३०,३१. हालांकि, इन प्रक्रियाओं के कई समय गहन हैं, महंगे उपकरणों के लिए उपयोग की आवश्यकता होती है, और सीमित विशेषज्ञता के साथ प्रयोगशालाओं के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है । कदम यहां वर्णित एक सरल, मजबूत, और किफायती CRISPR/Cas9-zebrafish पीटकर लाइनों इंजीनियर रणनीति प्रदान करते हैं । यह प्रोटोकॉल डीएनए oligonucleotides (ओलिगोस्पर्मिया), अंय दृष्टिकोण है कि पहले३२वर्णित किया गया है के समान का उपयोग sgRNAs संश्लेषित करने के लिए एक अत्यधिक कुशल किट के उपयोग का वर्णन करता है । वर्णित प्रोटोकॉल विशेष रूप से दो कदम है कि बहुत CRISPR के विश्लेषण को सरल-रूपांतरित लाइनों में शामिल है: पीसीआर के कदम-दर-कदम उपयोग HMA३३ आसानी से जीनोम संशोधनों की उपस्थिति का निर्धारण करने के लिए, और अनुक्रमण विश्लेषण के heterozygous zebrafish तेजी से और आसानी से एक किफायती फैशन में एकाधिक indels की प्रकृति का निर्धारण करने के लिए । इसके अलावा, कदम दर कदम निर्देश मजबूत चयन, विश्वसनीय उत्पादन, और गाइड RNAs के इंजेक्शन के लिए शामिल किए गए हैं । कदम यहां उदाहरण देना एक मजबूत, अपेक्षाकृत सस्ती प्रोटोकॉल है कि विशेषज्ञता की एक सीमा के साथ प्रयोगशाला कर्मियों को सक्षम बनाता है zebrafish में जीन नॉकआउट की पहचान में योगदान प्रदान करता है ।
इस प्रोटोकॉल zebrafish हड्डीवाला मॉडल CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकी का उपयोग कर प्रणाली में जीन नॉकआउट के उत्पादन का वर्णन है । प्रोटोकॉल के एक नंबर पहले zebrafish15,25,26,५०,५१,५२में CRISPR-मध्यस्थता जीनोम इंजीनियरिंग शुरू करने के लिए वर्णित किया गया है । इस प्रोटोकॉल सरल अभी तक reproducibly लगातार प्रयोगात्मक तकनीक के एक नंबर के संयोजन के द्वारा पिछले प्रयासों पर बनाता है, विशेष रूप से HMA और कई heterozygous मछली के NGS में, एक सीधा, किफायती, और प्रयोग मजबूत प्रोटोकॉल बनाने के लिए zebrafish में CRISPR-मध्यस्थता mutagenesis के लिए कि प्रशिक्षण और अनुभव की एक सीमा के साथ कर्मियों के साथ कर्मचारियों प्रयोगशालाओं के लिए उपयुक्त है, साथ ही शिक्षण प्रयोगशालाओं.
डिजाइन और गाइड RNAs के संश्लेषण के लिए सिफारिशें इस प्रोटोकॉल में शामिल हैं । गाइड आरएनए डिजाइन में एक प्रमुख विचार ऑफ-टारगेट इफेक्ट की ंयूनतम है । कई भविष्यवाणी एल्गोरिदम CRISPR उपयोगकर्ता के अनुकूल चित्रमय इंटरफेस है कि दोनों की गतिविधि पर लक्ष्य गाइड और ऑफ लक्ष्य प्रभाव३४का मौका भविष्यवाणी के साथ अभिकलन उपकरण का उपयोग करने की अनुमति विकसित किया गया है, ३५,३६. zebrafish प्रणाली का एक विशिष्ट लाभ बंद-लक्ष्य प्रभाव की दर कम है, क्योंकि Cas9 भ्रूण में इंजेक्शन है और इसलिए अभिव्यक्ति क्षणिक है, जो चूहों में दिखाया गया है कम लक्ष्य प्रभाव५३में परिणाम है । फिर भी, बंद लक्ष्य प्रभाव को५४zebrafish में होने का प्रदर्शन किया गया है । एक तरह से नियंत्रण के लिए बंद-लक्ष्य प्रभाव को phenotype संस्थापक zebrafish कि दो स्वतंत्र गाइड RNAs द्वारा उत्पंन किया गया है कि एक ही जीन लक्ष्य है, के रूप में इन गाइड बहुत अलग बंद लक्ष्य साइटों को प्रभावित होने की संभावना होगी । इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं है कि बंद लक्ष्य प्रभाव को कम करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका एक रूपांतरित Cas9 कि लक्ष्य डीएनए, जो उच्च दक्षता के साथ सुधार कर रहे हैं पर एकल कतरा टूटता उत्पन्न करता है का उपयोग है । एक दूसरे की निकटता के भीतर डीएनए निक बाँधना है कि वांछित लोकस में प्रभावी indel गठन में विपरीत किस्में परिणाम के लिए पूरक हैं और ऑफ-टारगेट इफेक्ट५५,५६को कम करता है.
ऑफ-टारगेट इफेक्ट्स की अलग दरें होने के अलावा, विभिन्न sgRNAs में वांछित लक्ष्य५७,५८,५९के mutagenesis की विभिन्न दरें हो सकती हैं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है HMA के mutagenesis की दक्षता का विश्लेषण करने के लिए एक दिया sgRNA heteroduplex बैंड गठन३३,४०का उपयोग कर । Heteroduplex बैंड पीसीआर जनित डीएनए किस्में कि बेमेल होते हैं, और आसानी से जेल ट्रो का उपयोग कर हल किया जा सकता है के संकरण द्वारा बनाई गई हैं । अंय आमतौर पर ऐसे T7 endonuclease परख या उच्च संकल्प पिघल विश्लेषण के रूप में indel गठन, मापने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के विपरीत25,26, HMA एक महंगा एंजाइम बेमेल डीएनए में कटौती करने की आवश्यकता नहीं है, और आवश्यकता नहीं है पीसीआर पिघल घटता के जटिल विश्लेषण । महत्वपूर्ण बात, HMA का उपयोग करने के लिए इंजेक्शन की आबादी में indel गठन की उच्च दर को सत्यापित करने के लिए भी जांचकर्ता के बाद के उत्पादन के लिए आवश्यक मछली की संख्या को कम करने में सक्षम बनाता है बाहर लाइनों, जो के साथ एक उत्परिवर्तन की पहचान की लागत कम कर देता है वांछित विशेषताओं ।
CRISPR आधारित indels पैदा करने के सापेक्ष आसानी एक बार में कई जीन के कई alleles के निर्माण में सक्षम बनाता है । वेब आधारित सॉफ्टवेयर heterozygous मछली से एकल उत्परिवर्तनों के विश्लेषण के लिए उपलब्ध है४९पीसीआर उत्पादों के सैंज अनुक्रमण का उपयोग कर । मामले में जहां तीन या अधिक CRISPR-रूपांतरित alleles विश्लेषण कर रहे हैं, NGS indel की प्रकृति की विशेषता के लिए और अधिक लागत के लिए indel की प्रकृति विशेषताएं प्रभावी होने की संभावना है के रूप में इस दृष्टिकोण को ५० विभिंन alleles के एक पूल की अनुमति देता है पर विशेषता हो ओ nce ( सामग्री की तालिकादेखें)६०,६१,६२। पैमाने की इस तरह की अर्थव्यवस्था की संभावना एक स्नातक प्रयोगशाला स्थापित करने में विशेष रूप से उपयोगी होगा ।
संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल प्रदान करता है कदम दर कदम निर्देश reproducibly पैदा करने के लिए उच्च गुणवत्ता CRISPR-रिएजेंट (विशेष रूप से, sgRNA) में ऐसी है कि कम वयस्क मछली की जरूरत है और बनाया करने के लिए सफलतापूर्वक ब्याज की उत्परिवर्ती alleles की पहचान करने के लिए विश्लेषण, जो भी वांछित लाइनों के उत्पादन का समय और लागत कम कर देता है । महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल डिजाइन किया गया है कि इस तरह के सीमित संसाधनों के साथ प्रयोगशालाओं द्वारा लागू किया जा सकता है एक किफायती तरीके से उत्परिवर्ती zebrafish का उत्पादन । इसके अलावा, हमने पाया है कि इस दृष्टिकोण स्नातकों के लिए उपयुक्त है और इस तरह शिक्षा और स्नातक हाथों में रुचि CRISPR में अनुभव-आधारित जीनोम संपादन के छात्रों के प्रशिक्षण के लिए अवसरों का विस्तार ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R21CA182197 to J.O.), राल्फ डब्ल्यू और अनुग्रह एम Showalter रिसर्च ट्रस्ट द्वारा समर्थित किया गया था, और इन्होने कृषि विज्ञान और विस्तार के लिए आर्थिक विकास (AgSEED) कार्यक्रम के द्वारा. P30 CA023168 द्वारा समर्थित इन्होने जीनोमिक्स कोर सुविधा द्वारा ओरिजिनल sequencing डेटा का अधिग्रहण किया गया था । मैरी Witucki को इन्होने यूनिवर्सिटी सेंटर फॉर कैंसर रिसर्च समर स्नातक रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित कैरोल काउंटी कैंसर एसोसिएशन द्वारा समर्थन दिया था । funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी । हम पांडुलिपि पर महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए बेंजामिन कार्टर, एलेन Denning, और टेलर षब्दो धंयवाद । हम इस कार्य के समर्थन के लिए जैव रसायन विभाग का धन्यवाद करते हैं, और हमारी Zebrafish कॉलोनी की देखभाल और कल्याण में उनके समर्पण के लिए इन्होने विश्वविद्यालय में Zebrafish अनुसंधान के लिए केंद्र/ अंत में, हम इन्होने जीनोमिक्स कोर सुविधा, और फिलिप San Miguel के योगदान NGS सेवाओं के बारे में धंयवाद ।
CRISPOR | sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/ | ||
Breaking-Cas | sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool | ||
ChopChop | sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/ | ||
Primer 3 | PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ | ||
Rnase free technique | http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf | ||
RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. | |
Rnase-free ethanol | Any brand | Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol. | |
Cas9 Protein | PNA Bio | CP01 | Cas9 protein with nuclear localization signal. |
Target specific oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | Synthesize guide RNAs. | |
PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product. | |
PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended. | |
EnGen sgRNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E3322 | In vitro transccribe guide RNAs. |
10X TBE | Thermo Fisher | B52 | RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids. |
6X Load Dye | New England BioLabs | B7025S | Loading DNA for electropheresis. |
5M Ammonium acetate | Thermo Fisher | AM9071 | Clean up reagent for purification of guide RNAs. |
Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any brand | Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free. | |
Nuclease-free Water | Any brand | For synthesis and purification of guide RNAs. | |
RNase away | Thermo Fisher | 10328011 | Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware. |
DNA Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N0467S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
DNA Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N0552S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
RNA Ladder | New England BioLabs | N0364S | Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized |
TEMED | Thermo Fisher | 17919 | Casting polyacrylamide gel. |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Casting polyacrylamide gel. |
40% Polyacrylamide (19:1) | BioRad | 161-0154 | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
Urea | Sigma-Aldrich | U5378-100G | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher | R0641 | Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis. |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | Visualization of nucleic acids. |
SYBER Green | Thermo Fisher | S7563 | Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels. |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | RNA clean up, PCR purification. |
MyTaq Polymerase | Bioline | BIO-21105 | For amplification of DNA using PCR. |
Thermocycler | Any brand | PCR amplification. | |
Spectrophotometer | Any brand | NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA. | |
E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate. |
Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection. |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection. |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos. | |
Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
Incubator | Any brand | Maintaining embryos at 28.5 oC. | |
Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long |
Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles. |
Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
30% Polyacylamide (29:1) | BioRad | 161-0156 | Heteroduplex gel casting. |
MS-222 (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A-5040 | Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE |
Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection. | |
1,000 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
NGS Sequencing platform: Wideseq | If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35). | ||
Software for sequence analysis | For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/ | ||
Software for sequence analysis | SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing. |