타겟된 게놈 모델 시스템 Danio rerio (zebrafish)에서 편집 CRISPR-기반 접근의 출현에 의해 크게 촉진 되어 있다. 여기, 우리 생성 및 heteroduplex 이동성 분석 결과 통합 하는 CRISPR에서 파생 된 말도 대립 유전자의 식별 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 돌연변이의 id에 대 한 간소화 된, 강력한 프로토콜을 설명 합니다.
클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은, 구조 반복의 연쇄 상 구 균 pyogenes (CRISPR) 시스템의 다양 한 유전자 수정을 빠르게 생성 하는 사용자 정의 플랫폼의 개발 활성화 생물, zebrafish를 포함 하 여 CRISPR 기반 게놈 편집 사용 하 여 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 관심, genomic DNA (gDNA) 대상에 CRISPR 관련 (Cas) endonuclease 대상 Cas endonuclease 두 배 물가 틈 (DSB)을 생성. 삽입 또는 삭제 (indels) 오류가 메커니즘 리드에 의해 DSBs의 수리. 이 종종 소개 함으로써 단백질 null 대립 유전자를 만드는 코딩 시퀀스 내에서 조 숙한 정지 codon frameshift 돌연변이 일으킬 수 있습니다. CRISPR 기반 게놈 엔지니어링만 몇 분자 구성 요소를 필요로 하 고 쉽게 microinjection에 의해 zebrafish 태아에 도입. 이 프로토콜 zebrafish microinjection에 대 한 시 약 CRISPR를 생성 하 고 CRISPR 수정 유전자의 생식 전송 전시 물고기를 식별 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 방법은 sgRNAs, microinjection CRISPR 시 약의 indels heteroduplex 이동성 분석 결과 (HMA), 및 특성화는 indels의 PCR 기반 메서드를 사용 하 여 대상 사이트에 유도의 식별에 생체 외 녹음 포함 낮은 처리량 및 강력한 차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용 하 여-기반 접근 heterozygous 물고기에서 수집 하는 여러 PCR 제품을 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 필요한 물고기의 수와 종류의 분석을 수행 하는 데 필요한 장비를 최소화 하기 위해 유선형의. 또한,이 프로토콜은 되도록 설계 되었습니다 사용에 대 한 의무가 학부생, CRISPR 기반 수행에 관심이 있는 연구 그룹에 의해 경제적으로 고용 될이 강력한 도구를 사용 하면 포함 하는 경험의 모든 수준의 실험실 개인에 의해 제 브라에 게놈 수정입니다.
진핵생물에서 분자 기계의 보전 기초 연구를 위한 모형 유기 체를 사용 하 여 전원. 이러한 모델 시스템의 많은 타겟된 유전자 녹아웃 유전자 제품의 생물 학적 또는 질병 과정에의 기여 하 등 역 유전 접근의 사용을 촉진 한다. 제 브라와 같은 유기 체에서 유전자 중단 기법 역사적 DSBs1,2의 부정확 한 수리 결과 frameshift 돌연변이의 대상된 도입에 의존 했습니다. 보편적으로 거의 모든 세포 유형 및 유기 체에 존재 하는 두 경로 중 하나를 통해 DNA 병 변 복구는 DSB 게놈에 도입 하는 경우: 비 동종 끝 결합 (NHEJ)과 상 동 감독 수리 (HDR)3,4 . NHEJ 기계의 정확 하지 않은 자연 자주 다양 한 길이5,6,7,,89의 indels를 생성합니다. Frameshift 돌연변이 유전자의 코딩 순서에의 소개는 종종 유전자 작동 하지 않는 렌더링 조 숙한 정지 codon를 생성할 수 있습니다.
초기 게놈 엔지니어링 전략 홍보 indels zebrafish 포함 meganucleases, 아연 손가락 nucleases, 및 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nucleases, nuclease 특정 게놈을 대상으로 DNA 단백질 상호 작용을 활용 하는 모두의 대상 DSB10,11,12,13,,1415를 도입. 그러나, 이러한 기술은 종종 힘들고 복잡 한 엔지니어링 nuclease을 대상으로 관심사의 DNA 순서를 생성 하는 데 필요한 때문에 적용 하기 어려운 있습니다. 이전 전략, 달리 CRISPR 기반 유전자 편집 하지 대상에 대 한 단백질 DNA 상호 작용에 의존지 않습니다. 대신, CRISPR 관련 (Cas) endonuclease 관심16,,1718,19의 게놈 사이트 대상 염기 기본 쌍 상호 작용을 사용 하는 RNA 가이드를 통해 감독 ,,2021. 설계는 RNA의 단순 그것을 대상에 대 한 상호 작용을 페어링 원하는 자료와 가이드는 상대적으로 쉽게 원하는 장소에 Cas endonuclease 대상입니다. 유형 II CRISPR 시스템 특히 널리 개발 되었습니다는 단일 다중 도메인 Ca nuclease (Cas9) endonuclease 활동을 자극 하는 DNA와 상호 작용을 필요로 하는의 사용을 포함 한 여러 유리한 기능 게놈 편집 응용 프로그램에 대 한 사용 하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 동족 DNA 시퀀스18대상. 동족 sgRNA의 대상에 대 한 필요한 순서 요구 사항을 잘 이해19, 고 원하는 sgRNA 쉽게 체 외에 전사에 의해 생성 된. 단순 하 고 CRISPR/Cas9 접근의 견고성 크게 zebrafish 및 다양 한 다른 유기 체에 타겟된 유전자 조작 용이.
크게는 타겟된 게놈 CRISPR 기반 시 약 개발의 결과로 제 브라에서 편집을 수행 하는 향상 된 능력 증가 프로세스 중앙 신경의 개발 같은 척추 생물의 상징을 공부 하는 기회 시스템입니다. Zebrafish 게놈 orthologs를 뿐만 아니라 인간22질병와 관련 된 유전자의 84%는 인간 게놈에서 발견 단백질 코딩 유전자의 70% 포함 되어 있습니다. Zebrafish 개발 전시 역 유전자 연구에 그것의 사용을 강화 하는 몇 가지 주요 자질: 배아 큰 클러치에서 누워 있다, microinjection, 및 성인 zebrafish 의무가 유전자 조작 하는 어머니 로부터 외부 개발 3 개월, 원하는 라인23의 급속 한 전파에 대 한 허용에 의해 성적으로 성숙.
수많은 프로토콜 사용할 수 있는 다양 한 생성 하 고 식별 zebrafish24,25,26,,2728,29 CRISPR 파생 indels 접근법을 설명 하는 ,,3031. 그러나,이 절차의 많은 시간 집중, 고가의 장비에 대 한 액세스를 필요 되며 제한 된 전문 기술 연구소에 대 한 일 수 있다. 여기 설명 하는 단계는 간단 하 고 강력 하 고 경제적인 CRISPR/Cas9-전략 엔지니어 zebrafish 녹아웃 라인을 제공 합니다. SgRNAs DNA oligonucleotides (oligos)를 사용 하 여 합성 하는 매우 효율적인 키트를 사용 하 여가이 프로토콜에 설명 합니다, 그리고 되었습니다 다른 접근 비슷합니다 이전32설명. 설명된 프로토콜 포함 두 단계 특히 크게 라인 CRISPR 돌연변이의 분석을 단순화 하는: 쉽게 결정 게놈 수정의 존재 및 시퀀싱 분석의 PCR 기반 HMA33 의 단계별 사용 heterozygous zebrafish 신속 하 고 쉽게 여러 indels 경제적인 방식으로의 성격을 결정 하. 또한, 단계별 지침은 강력한 선택, 믿을 수 있는 생산 및 가이드 RNAs의 주입에 대 한 포함 되어 있습니다. 여기에 제공 된 단계에는 다양 한 전문 실험실 인원 zebrafish에 유전자 녹아웃의 식별을 가능 하 게 강력 하 고 상대적으로 저렴 한 프로토콜을 예증 하다.
이 프로토콜 CRISPR Cas9 기술을 사용 하 여 zebrafish 척추 동물 모델 시스템에서 유전자 녹아웃의 생산을 설명 합니다. 프로토콜의 수는 이전 zebrafish15,25,26,50,,5152CRISPR 중재 게놈 엔지니어링 수행을 설명 되었습니다. HMA와 여러 heterozygous 생선, 만들려고 간단, 경제적, 그리고 실험적으로 강력한 프로토콜의 NGS이이 프로토콜 수 간단 하 고 그러나 reproducibly 일관 된 실험 기법, 특히에서 결합 하 여 노력 이전에 빌드 CRISPR 중재 mutagenesis zebrafish에서 실험실 다양 한 훈련 및 경험, 뿐만 아니라 교육 연구소 직원과 직원에 대 한 적절 한입니다.
RNAs는이 프로토콜에 포함 된 설명서의 설계 및 합성에 대 한 권장 사항. 가이드 RNA 설계에에서 주요 고려 대상에서 효과의 최소화입니다. CRISPR-사용자가 사용자 친화적인 그래픽 인터페이스 모두 대상에 가이드의 활동 및 오프 대상 효과34, 의 기회를 예측 하는 계산 도구를 액세스할 수 있도록 여러 가지 예측 알고리즘 개발 되었습니다 35,36. 특정 zebrafish 시스템의 장점은 오프 대상 효과의 저하 속도 Cas9 배아에 주입 되며 따라서 식 과도, 있는 감소에서 대상 효과53을 마우스에 표시 되었습니다 때문에. 그럼에도 불구 하 고, 오프 대상 효과 zebrafish54에 입증 되었습니다. 한 오프 대상 효과 대 한 제어 방법은이 가이드는 매우 다른 오프 대상 사이트에 영향을 미칠 가능성이 있을 것 이라고 동일한 유전자를 대상으로 하는 두 개의 독립적인 가이드 RNAs에 의해 생성 된 표현 형 설립자 zebrafish에. 이 프로토콜에서 설명 되지 않은 대상 오프 효과 최소화 하기 위해 다른 방법을 높은 효율으로 수리 대상 DNA 단일 가닥 휴식을 생성 하는 돌연변이 Cas9의 사용 이다. 반대로 보완 서로 근접 내의 DNA 닉스 페어링 원하는 장소에서 효과적인 indel 형성에 결과 긴 고 오프 대상 효과55,56를 최소화 합니다.
-대상 효과의 다른 요금 이외, 다른 sgRNAs mutagenesis 원하는 대상57,,5859의 다른 비율을 가질 수 있습니다. 이 프로토콜의 heteroduplex 밴드 형성33,40을 사용 하 여 주어진된 sgRNA mutagenesis의 효율성을 분석 하 HMA를 사용 합니다. Heteroduplex 밴드와 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 쉽게 해결할 수 있습니다 불일치를 포함 하는 PCR에서 생성 된 DNA 가닥의 교 잡에 의해 만들어집니다. 일반적으로 indel 형성을 측정 하는 데 사용 하는 다른 메서드와 달리 T7 endonuclease 등 분석 결과 또는 높은 해상도 분석25,26, HMA 잘라 일치 하지 않는 DNA, 비싼 효소를 필요 하지 않습니다.를 녹여 필요 하지 않습니다. PCR의 복잡 한 분석 곡선 녹아 있습니다. 중요 한 것은, 물고기와 함께 돌연변이 식별 하는 비용을 줄일 수 있는 노크 아웃 라인의 다음 생산에 필요한 수를 최소화 하기 위해 수 사관 수 또한 HMA를 사용 하 여 주입 된 인구에서 indel 형성의 높은 속도 확인 하는 원하는 특성.
CRISPR 기반 indels 생성의 비교적 쉽게 한 번에 여러 여러 유전자의 대립 유전자의 생성을 수 있습니다. 웹 기반 소프트웨어는 생어를 사용 하 여 heterozygous 물고기에서 단일 돌연변이의 분석에 사용할 수 있는 PCR 제품49의 연속. 경우 3 개 이상의 CRISPR 돌연변이 대립 유전자 분석은 NGS는 indel의 자연 하는 가능성이 더 비용 효과적이 접근으로 indel의 자연 하 수 오에 특징을 최대 50 다른 대립 유전자의 풀 후부 터 (참조 테이블의 재료)60,,6162. 이러한 경제 규모의 가능성이 학부 실험실 환경에서 특히 유용 것입니다.
요약 하자면,이 프로토콜 reproducibly 필요가 적은 성인 생선을 만들어 분석 성공적으로 관심의 돌연변이 체 대립 유전자를 식별 하는 (특히, sgRNA)에서 높은 품질 CRISPR 시 약을 생성 하기 위한 단계별 지침을 제공 하 또한 원하는 라인 생성의 비용과 시간을 줄일 수 있습니다. 중요 한 것은,이 프로토콜을 저렴 한 방식으로 돌연변이 제 브라를 생산 하는 한정 된 자원 가진 실험실에 의해 적용할 수 있는 설계 되었습니다. 또한, 우리는이 이렇게 학부생에 적합 하 고 따라서 교육 및 CRISPR 기반 게놈 편집 실습에 관심 있는 학부 학생 들의 교육 기회를 확장 발견 했다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 (R21CA182197 J.O.), 랄 프 W.와 그레이스 M. Showalter 연구 신뢰, 그리고 퍼듀 농업 과학 경제 개발 (AgSEED) 프로그램에 대 한 확장에 의해. 생어 시퀀싱 데이터 P30 CA023168에서 지 원하는 퍼듀 유전체학 핵심 시설에 의해 인수 되었다. 메리 Witucki 퍼듀 대학 센터에서 암 연구 여름 학부 연구 프로그램 캐롤 카운티 암 협회 지원 지원 한다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. 우리 감사 벤자민 카터, 런 닝, 그리고 테일러 Sabato 원고에 중요 한 피드백을 제공. 우리는이 작품의 생화학의 부 그리고 Zebrafish 관심과 우리의 zebrafish 식민지의 복지에 그들의 헌신에 대 한 퍼듀 대학에서 연구를 위한 센터 감사합니다. 마지막으로, 우리는 퍼듀 유전체학 핵심 시설, 감사 하 고 필립 산 미 구 엘의 기여에 대해서 NGS 서비스.
CRISPOR | sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/ | ||
Breaking-Cas | sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool | ||
ChopChop | sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/ | ||
Primer 3 | PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ | ||
Rnase free technique | http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf | ||
RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. | |
Rnase-free ethanol | Any brand | Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol. | |
Cas9 Protein | PNA Bio | CP01 | Cas9 protein with nuclear localization signal. |
Target specific oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | Synthesize guide RNAs. | |
PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product. | |
PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended. | |
EnGen sgRNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E3322 | In vitro transccribe guide RNAs. |
10X TBE | Thermo Fisher | B52 | RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids. |
6X Load Dye | New England BioLabs | B7025S | Loading DNA for electropheresis. |
5M Ammonium acetate | Thermo Fisher | AM9071 | Clean up reagent for purification of guide RNAs. |
Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any brand | Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free. | |
Nuclease-free Water | Any brand | For synthesis and purification of guide RNAs. | |
RNase away | Thermo Fisher | 10328011 | Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware. |
DNA Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N0467S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
DNA Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N0552S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
RNA Ladder | New England BioLabs | N0364S | Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized |
TEMED | Thermo Fisher | 17919 | Casting polyacrylamide gel. |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Casting polyacrylamide gel. |
40% Polyacrylamide (19:1) | BioRad | 161-0154 | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
Urea | Sigma-Aldrich | U5378-100G | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher | R0641 | Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis. |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | Visualization of nucleic acids. |
SYBER Green | Thermo Fisher | S7563 | Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels. |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | RNA clean up, PCR purification. |
MyTaq Polymerase | Bioline | BIO-21105 | For amplification of DNA using PCR. |
Thermocycler | Any brand | PCR amplification. | |
Spectrophotometer | Any brand | NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA. | |
E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate. |
Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection. |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection. |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos. | |
Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
Incubator | Any brand | Maintaining embryos at 28.5 oC. | |
Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long |
Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles. |
Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
30% Polyacylamide (29:1) | BioRad | 161-0156 | Heteroduplex gel casting. |
MS-222 (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A-5040 | Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE |
Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection. | |
1,000 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
NGS Sequencing platform: Wideseq | If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35). | ||
Software for sequence analysis | For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/ | ||
Software for sequence analysis | SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing. |