Summary
Mitochondriën bevatten verschillende flavin-afhankelijke enzymen die van reactieve zuurstof soorten (ROS produceren kunnen). Controle van ROS is vrijlating uit afzonderlijke sites in mitochondriën uitdagend als gevolg van ongewenste kant reacties. We presenteren een gemakkelijke en goedkope methode voor directe beoordeling van inheemse tarieven voor ROS release met behulp van gezuiverde flavoenzymes en microplate fluorometry.
Abstract
Er werd gemeld dat de mitochondriën maximaal 12 enzymatische bronnen van reactieve zuurstof soorten (ROS) kunnen bevatten. Een meerderheid van deze sites zijn flavin-afhankelijke respiratoire complexen en dehydrogenases die een mengsel van superoxide (O2● -) en waterstof peroxide (H2O2) produceren. Nauwkeurige kwantificering van de ROS-producerende potentieel van afzonderlijke sites in geïsoleerde mitochondriën kunnen zijn uitdagend als gevolg van de aanwezigheid van antioxidant defense-systemen en reacties van de kant die ook O2● -/H2O2 vormen. Gebruik van niet-specifieke remmers die mitochondriale Bioenergetica verstoren kan kunt ook metingen compromis door een wijziging van de ROS release van andere sites van de productie. Hier presenteren we een eenvoudige methode voor de gelijktijdige meting van H2O2 release en nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) productie door gezuiverde flavin alternerende dehydrogenases. Wij hebben voor onze doeleinden hier, gezuiverde pyruvaat dehydrogenase complex (PDHC) en α-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) van oorsprong van de varkens hart gebruikt als voorbeelden. Deze methode zorgt voor een nauwkeurige maatstaf van inheemse H2O2 release tarieven door afzonderlijke sites van de productie door het elimineren van andere potentiële bronnen van ROS en antioxidant systemen. Bovendien, zorgt deze methode voor een directe vergelijking van de relatie tussen de H2O2 release en de enzymactiviteit en de screening van de doeltreffendheid en de selectiviteit van remmers voor de productie van ROS. Over het geheel genomen is deze aanpak kan zorgen voor de grondige evaluatie van inheemse tarieven van ROS release voor afzonderlijke enzymen voorafgaand aan meer geavanceerde experimenten met geïsoleerde mitochondriën of spiervezel permeabel.
Introduction
Het uiteindelijke doel van nutriënten metabolisme is dat adenosinetrifosfaat (ATP). In de cellen van zoogdieren, dit gebeurt in de mitochondriën, dubbel-membraned organellen die de energie opgeslagen in koolstof in ATP omzetten. De productie van ATP begint wanneer koolstof is verbrand door de mitochondriën vormen twee elektron luchtvaartmaatschappijen, NADH en flavine adenine dinucleotide (FADH2)1. NADH en FADH2 worden vervolgens geoxideerd door multi subeenheid respiratoire complexen I en II, respectievelijk, en de bevrijde elektronen zijn overgezet naar de terminal elektron acceptor moleculaire zuurstof (O2) bij complexe IV1. De thermodynamisch gunstige "afdaling" overdracht van elektronen aan O2 aan het einde van de keten is gekoppeld aan de export van protonen in de intermembrane ruimte door complexen I, III en IV. Hierdoor ontstaat een transmembraan elektrochemische gradiënt van protonen (proton-motor), een tijdelijke vorm van Gibbs vrije energie die wordt onttrokken door complexe V om ATP2te brengen. Electron transfer reacties in mitochondriën zijn niet perfect gekoppeld aan de ATP productie. Op verschillende punten in de citroenzuurcyclus en de luchtwegen keten, kunnen elektronen voortijdig communiceren met O2 aan formulier ROS3. Het meest biologisch relevante ROS gegenereerd door mitochondriën zijn O2●- en H2O2. Hoewel O2● - wordt vaak beschouwd als de proximale ROS gevormd door mitochondriën, is het nu duidelijk dat sites van productie een mengsel van O2●- en H2O2 vormen, die is gekoppeld aan het vrije verkeer radicale chemie van flavin prothetische groepen4,5. Op een hoog niveau kunnen ROS gevaarlijke, schadelijke biologische bestanddelen die nodig zijn voor cel functie wat resulteert in oxidatieve nood6. Echter bij lage bedragen vervullen mitochondriale ROS signalering lichaamsfuncties. Bijvoorbeeld heeft H2O2 vrijlating uit de mitochondriën betrokken bij de controle van T-cel activatie, stress signalering (b.v., inductie van Nrf2 signaalroutes), de inductie van celproliferatie en differentiatie, insuline signalering en versie en voeding gedrag7. Aanzienlijke vooruitgang is geboekt in het begrip van de signalering functie van ROS. Echter belangrijke vragen blijven met betrekking tot die enzymen in mitochondriën dienen als de belangrijkste bronnen en hoe de productie wordt gecontroleerd.
ROS vrijlating door een plaats van productie is afhankelijk van verschillende factoren: 1) de concentratie van het doneren van de elektron site, 2) de redox staat van de elektron doneren site, 3) toegang tot zuurstof, en 4) de concentratie en het type van oxidatie substraat,3, 8 , 9. in de mitochondriën, andere factoren zoals ook invloed op de concentratie van NADH en membraan potentiële kracht ROS productie8,10. Bijvoorbeeld, het tarief van O2● -/H2O2 productie door gezuiverde PDHC of KGDHC neemt toe met toenemende NADH beschikbaarheid-5,11. In dit scenario stromen elektronen achteruit van NADH naar het midden van de FAD in de E-3 subeenheid van PDHC of KGDHC, de site voorO2● -/H2O2 productie12. Ook heeft de levering van NAD+ het tegenovergestelde effect, afnemende ROS vrijlating uit KGDHC12. Zo kunt controlerende binnenkomen of verlaten van elektronen van sites van ROS productie wijzigenhoeveel O2● -/H2O2 wordt gevormd. Bijvoorbeeld, het blokkeren van de E-2 subeenheid van PDHC of KGDHC met de CPI-613, een analoge, resulteert in een bijna 90% afname van O2● -/H2O2 productie13liponzuur. Vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen met de chemische S-glutathionylation katalysatoren, diamide en disulfiram, die bijna af te O2● -/H2O2 productie door PDHC of KGDHC via de vervoeging van glutathion tot en met de E schaffen 2 subeenheid14. De trade-off voor het blokkeren van de elektronen stromen door de E-2 subeenheid van PDHC en KGDHC is een afname van de productie van NADH die ROS vorming door het elektronentransport keten (bijvoorbeeldcomplexe III vermindert). Dit kan door de keten elektronentransport ATP-uitvoer vertragen. Blokkeren van elektron toegang tot sites van ROS productie kunnen over het algemeen een zeer effectief middel O2● -/H2O2 productie te controleren.
Mitochondriën kunnen maximaal 12 potentiële O2● -/H2O2 bronnen6bevatten. De meeste van deze sites zijn flavin bevatten enzymen die het genereren van een mengsel van O2●- en H2O2. Gebruik verschillende substraat of remmer combinaties zijn toegestaan voor de identificatie die respiratoire complexen en mitochondriale dehydrogenases dienen alshoge capaciteit O2● -/H2O2 vorming vestigingen in verschillende weefsels en3. PDHC en KGDHC is gebleken om te dienen als hoge capaciteit O2● -/H2O2 emitterende sites in spieren en lever mitochondriën13,15. Bepaalde problemen blijven echter met betrekking tot het onderzoek van de O2● -/H2O2 vormen van afzonderlijke sites in mitochondriën en de invloed die verschillende substraat en remmer combinaties hebben op potentiële de activiteiten van de enzymen. Dit is te wijten aan de aanwezigheid van ongewenste kant Reacties (bijvoorbeeld, vorming vanO2● -/H2O2 door sites dan het enzym van belang), besmetten endogene voedingsstoffen (bvvetzuren zuren) of organellen (b.v., peroxisomen die ook O2● -/H2O2 vormen), en gebruik van Remmers, dat het gebrek aan selectiviteit, en/of gebruik van stoffen die doen niet volledig ROS productie remmen. Bepaalde remmers kunnen ook veranderen de mitochondriale Bioenergetica en de richting van de stroom van elektronen, en dit verandert ROS release van andere sites van productie en kunstdiscours resultaten. Absolute tarieven voor O2● -/H2O2 release van afzonderlijke sites in mitochondriën zijn ook moeilijk te kwantificeren vanwege de hoge concentratie van O2●- en H2O2 de afschaffing van enzymen in de matrix en intermembrane ruimte. Eliminatie van eventuele concurrerende reacties die met O2● -/H2O2 release metingen interfereren kunnen kan dus nuttig bij het bepalen van dehoge capaciteit O2● -/H2O2 vormen van sites.
Hier presenteren we een eenvoudige methode die voor de gelijktijdige behandeling van O2● -/H2O2 productie en NADH vorming door gezuiverde flavin-afhankelijke dehydrogenases zorgt. Met behulp van gezuiverde enzymen, kunnen ongewenste ROS vormen kant reacties en ROS vernederende enzymen worden geëlimineerd zodat voor een meer nauwkeurige maatstaf van inheemse O2● -/H2O2 productie tarieven voor individuele flavoenzymes. Deze methode kan worden gebruikt om rechtstreeks vergelijken de O2● -/H2O2 vormen van de capaciteit van verschillende gezuiverde dehydrogenases of scherm potentiële site-specific remmers voor O2● -/H2O 2 release. Ten slotte kan meten O2● -/H2O2 en NADH productie gelijktijdig zorgen voor een real-time beoordeling van de relatie tussen de enzymactiviteit en ROS release capaciteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. chemische stoffen en gezuiverde enzymen
- Aanschaffen van de volgende materialen: PDHC en KGDHC van oorsprong van de varkens hart (of een ander gezuiverde mitochondriale flavoenzyme); H2O2 (30%-oplossing), pyruvaat, α-ketoglutaraat, NAD+, NADH, CoASH, thiamine pyrofosfaat (TPP), mannitol, HEPES, sacharose, EGTA, 3-methyl-2-oxo valeriaanzuur (KMV), superoxide dismutase (SOD), horseradish peroxidase (HRP), 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine-reagens (AUR) en CPI-613.
2. planning van de bepaling en de bereiding van het reagens
- Instellen van de bepaling volgens tabel 1 in een 96-wells-plaat.
Opmerking: Het totale volume voor elke reactie is 200 µL. voorraad concentraties worden aangepast zodat 20 µL van het reagens wordt toegevoegd aan elk putje. Dit zorgt voor een snelle toevoeging van cofactoren en substraten voor elke reactie goed vóór het opstarten van de bepaling. - Reactie buffer met 220 mM mannitol, sacharose 70 mM, 1 mM EGTA en 20 mM HEPES (pH 7.4 met HCl) voor te bereiden.
Opmerking: Dit kan veranderen afhankelijk van de fysische eigenschappen van verschillende gezuiverde enzymen. - Onderzoeken van de gezuiverde KGDHC of PDHC voor besmetting met behulp van enzym activiteit testen14,16,17 , of door de immunoblot of Coomassie beitsen5.
- Bereiden alle reagentia in de buffer van de reactie als per de werkende oplossing concentraties in tabel 1.
- Alle reagentia opslaat als 1 mL aliquots bij-20 ° C. Winkel pyruvaat en α-ketoglutarate bij-80 ° C in 100-µL aliquots ter voorkoming van spontane achteruitgang als gevolg van auto-oxidatie en herhaalde bevriezen-ontdooien.
- Bereid de AUR reagens master voorraad in 1 mL van DMSO en vervolgens Verdun tot 100 µM in reactie buffer. Winkel beschermd tegen licht.
Nota: Hier, de 100 µM-werkoplossing is gemaakt van vers elke 2 tot 3 weken en beschermd tegen licht.
3. het opzetten van de Assay-sjabloon
- De assay-procedure op een monochromatische microplate-lezer met dubbele meting mogelijkheden instellen
- Definieer de lezing procedure door 'PROTOCOL'. Klik vervolgens op "PROCEDURE".
- "Temperatuur" instellen tot 25 ° C (figuur 1A).
- Klik op "START KINETIC" om in te stellen Lees voorwaarden (figuur 1A). Stel de tijd en het aantal lees intervallen/experimenten.
- Klik op "Lees" (figuur 1B).
Opmerking: Monsters worden gelezen uit de toppositie met een winst van 50. Tijd: 5 min, lees 30-s tussenpozen. Kanaal 1: Resorufin fluorescentie - excitatie/emissie = 565 nm:600 nm, golflengte breedte van 13,5 nm. Kanaal 2: NADH autofluorescence - excitatie/emissie = 376 nm:450 nm, golflengte breedte van 20 nm. - Selecteer onder "Lezen", wells naar monitor (bijvoorbeeldA1-A4 en B1-B4).
- Selecteer "END kinetische".
4. standaard curven
- Ontdooi de reagentia en slaan op ijs totdat het nodig is.
-
NADH standaard curve (figuur 2A)
- De werkoplossing voorbereiden door NADH in het concentratiebereik van 0,5-10 mM in reactie buffer.
- Voeg 20 µL aliquots van elke NADH werken concentratie voorraadoplossing putjes met 180 µL reactie buffer. De uiteindelijke concentratie van NADH in elk is nou 0,05-1 mM.
- Klik op "Lees" en stel excitatie/emissie = 376 nm:450 nm, golflengte breedte van 20 nm.
Nota: Dit is een alleen-lezen eindpunt - kinetische parameters zijn niet vereist.
-
AUR standaard curve (figuur 2B)
- Voorbereiden van de voorraden van de werken van waterstofperoxide in reactie buffer; voorraad concentraties variëren van 200-4000 nM.
- Voeg 120 µL van de reactie-buffer toe aan elk putje.
- Voeg 20 µL van HRP (voorraad concentratie werken = 30 U/mL, eindconcentratie in de put = 3 U/mL), 20 µL van SOD (voorraad concentratie werken = 250 U/mL, eindconcentratie in de put = 25 U/mL), en 20 µL van AUR (voorraad concentratie werken = 100 µM eindconcentratie in de put = 10 µM) aan elke buffer reactie goed bevatten.
- Voeg 20 µL van elke H2O2 voorraad werkoplossing aan elk putje met buffer en assay reagentia. De uiteindelijke reactie volume is 200 µL en de uiteindelijke concentratie van de H2O2 in elk putje is 20-400 nM.
- Incubeer de platen gedurende 1 min. in de afleesapparaat bij 25 ° C.
- Klik op "Lees" en stel excitatie/emissie = 565 nm/600 nm, golflengte breedte van 13,5 nm. Dit is een alleen-lezen eindpunt - kinetische parameters zijn niet vereist.
5. het meten van O2● - /H2 O2 Release en de NADH productie door KGDHC en PDHC
- Zie tabel 1 voor de volgorde van de toevoeging van de verschillende reagentia, de concentratie van elke werkende oplossing, en het volume toegevoegd aan elk goed.
- Voeg 40 µL van reactie buffer toe aan elk putje. Voor tests met KMV of CPI-613, Voeg 20 µL van buffer aan elk putje.
- Voeg 20 µL van PDHC of KGDHC (werkende voorraad van 1 U/mL, eindconcentratie per putje = 0.1 U/mL) aan elk putje.
- Incubeer PDHC en KGDHC bij 25 ° C gedurende 2 minuten.
- Voeg 20 µL van KMV (werkende voorraad = 100 mM, eindconcentratie = 10 mM) of 20 µL van CPI-613 (voorraad concentratie werken = 1,5 mM, eindconcentratie = 150 µM) (tabel 2).
Opmerking: Deze stap kan worden uitgesloten als remmers niet worden gebruikt voor het testen. - Incubeer gedurende 1 minuut bij 25 ° C.
Opmerking: Deze stap kan worden uitgesloten als remmers niet worden gebruikt voor het testen. - Voeg 20 µL van HRP (voorraad concentratie werken = 30 eenheden/mL, eindconcentratie in de put = 3 eenheden/mL) en 20 µL van SOD (voorraad concentratie werken = 250 eenheden/mL, eindconcentratie in de put = 25 eenheden/mL) aan elk putje.
- Voeg 20 µL van coenzym A (voorraad concentratie werken = 1 mM, eindconcentratie = 0.1 mM), 20 µL van TPP (voorraad concentratie werken = 3 mM, eindconcentratie = 0,3 mM), en 20 µL nad+ (werken voorraad concentratie = 10 mM, eindconcentratie = 1 mM) aan elke w Ell.
- Verwijder de AUR reagens van beschermende zilverpapier bedekking en Voeg 20 µL aan elk putje.
- Voeg 20 µL van pyruvaat (werken voorraad concentratie variërend van 1-100 mM, eindconcentratie voor testen = 0.1-10 mM) aan putjes met PDHC en α-ketoglutarate (werken voorraad concentratie variërend van 1-100 mM, eindconcentratie voor testen = 0.1-10 mM) te Wells met KGDHC.
- Klik op "Lees" om te beginnen van kinetische meting.
6. de gegevensanalyse
- De 'CTRL'-toets op het toetsenbord ingedrukt en klik op putten voor het genereren van een grafiek met alle kinetische metingen overeenkomt met kanaal 1 (figuur 3A).
- Klik op "gegevens" in het pictogram voor de weergave in de hogere juiste hoek voor ruwe waarden voor relatieve fluorescentie eenheden (RFU), gemeten op de punten van de verschillende tijd (figuur 3B).
- De waarden voor analyse (tabel 3) exporteren.
- Klik op de "Grafiek" drop-down menu rechtsboven (figuur 3B) voor toegang tot de RFU waarden die zijn gekoppeld aan de fluorescentie kanaal 2.
- Herhaal stap 6.1 tot 6.3 voor kanaal 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 3A wordt een representatieve trace voorziet door de RFU verzameld tijdens de gelijktijdige meting van H2O2 en NADH productie door gezuiverde KGDHC. De onbewerkte gegevens van de RFU voor elk tijdsinterval is afgebeeld in figuur 3B. De ruwe gegevens van de RFU worden vervolgens geëxporteerd voor analyse. Door extrapolatie van standaard curven weergegeven in Figuur 2, kan de absolute hoeveelheid NADH en H2O2 gedurende de periode van 5-min tussenpoos van elke meting gevormd worden bepaald. Een voorbeeld van deze berekening wordt gegeven in tabel 3. Zodra de hoeveelheid NADH en H2O2 gevormd door KGDHC of PDHC op de verschillende tijdstippen is vastgesteld, waarden worden gekopieerd en in een grafisch voorstellend/statistische software voor verdere analyse ingevoerd. Met behulp van de XY grafiek-type analyse, kan de hoeveelheid NADH (µmol) en H2O2 (pmol) gevormd door KGDHC of PDHC worden uitgezet als functie van de tijd (figuur 4A). Met deze waarden, kan het tarief van NADH en H2O2 formatie tijdens substraat oxidatie ook berekend worden. Zoals blijkt uit figuur 4B, geven KGDHC en PDHC verschillende kenmerken in termen van NADH en H2O2 vormen van vermogen.
Eens vaststaat dat KGDHC en PDHC enzymatisch actieve zijn en NADH en H2O2 vorming kan gelijktijdig worden bijgehouden, ROS eigenschappen vrijlaat en enzym-activiteiten kunnen worden gemeten. Wij kozen om te vergelijken, KGDHC en PDHC omdat ze zeer homologe in basisstructuur en zijn gedocumenteerd te worden van hoge capaciteit sites over ROS productie5. Figuur 5 en Figuur 6 tonen de afhankelijkheid van NADH en H2O2 productie op substraat concentratie. PDHC is gemakkelijk verzadigd door lage hoeveelheden substraat met het tarief van NADH en H2O2 productie bereikt zijn maximum op 0,1-0,5 mM pyruvaat. Incrementele verhoogt geeft KGDHC, aan de andere kant, in NADH en H2O2 productie met toenemende α-ketoglutarate (Figuur 5). Hieruit blijkt dat KGDHC en PDHC, hoewel zeer homologe in basisstructuur, verschillende kinetische eigenschappen in termen van hoeveel substraat is vereist hebben voor het opwekken van de maximale vrijlating van de ROS. Figuur 5 toont ook aan dat H2O2 release van KGDHC sterk met NADH productie en substraat beschikbaarheid correleert. PDHC anderzijds beschikt niet over dezelfde kinetische kenmerken. KGDHC en PDHC ook verschillen in termen vanNADH en O2● -/H2O2 vormen van capaciteit wanneer NAD+ concentratie is gevarieerd (Figuur 6).
Door gebruik te maken van de gelijktijdige meting van NADH en H2O2, kunnen de potentiële site-specific remmers voor ROS productie worden gescreend. Dit kan helpen bepalen van het bedrag van de Inhibitor van de omwenteling die vereist zijn voor het opwekken van maximale remming van H2O2 release is. Bovendien, door het meten van NADH productie op hetzelfde moment, kan de site voor remmer optreden, alsmede de bron van ROS worden geïdentificeerd. Eerdere studies hebben aangetoond dat de α-ketoglutarate analoog, KMV, zeer effectief is bij het remmen van ROS vrijlating uit KGDHC (≥ 90% remming)13,15. We toonden ook dat CPI-613, een liponzuur analoge die blokkeert de dihydrolipoamide van de E-2 subeenheid van PDHC en KGDHC, kan ook remmen ROS vrijlating uit beide complex door ~ 90%13,14. De site van actie voor KMV en CPI-613 worden weergegeven in Figuur 7. CPI-613 is een molecuul met zwavel en daarom wordt aangeraden dat thiol-rijke reductoren (dithiothreitol; DTT) of eiwitten (albumine) worden weggelaten uit de procedure13. Figuur 7 laat zien dat zowel KMV en CPI-613 beiden zeer effectief waren in het beperken van zowel NADH en H2O2 door KGDHC. Evenzo, CPI-613 afgeschaft H2O2 vrijlating uit PDHC (Figuur 7). Collectief, deze resultaten tonen aan dat KMV CPI-613 zeer effectieve remmers voor H2O2 release zijn en kan dus worden toegepast op experimenten met geïsoleerde mitochondriën. Een dergelijk scherm zou zeer nuttig zijn voor andere potentiële ROS-vormende enzymen omdat het zorgt voor een directe beoordeling van de doeltreffendheid en de selectiviteit van verschillende remmers op gezuiverde flavin-bevattende dehydrogenases. De gelijktijdige meting van NADH heeft ook het extra voordeel van het toestaan van de voorlopige identificatie van de potentiële bron van ROS binnen een enzym complex. Figuur 7 bevat een afbeelding van het katalytische mechanisme voor KGDHC, die is zeer homoloog aan PDHC. De observatie dat KMV en CPI-613, die de E-1 en E2 subeenheid van de KGDHC blokkeren, bijna volledig afgeschaft zowel de H2O2 en de NADH productie, bevestigt dat de E-3 subeenheid, waarschijnlijk de FAD, de ROS bron 18. CPI-613 uitgeoefend een soortgelijk effect op PDHC om te bevestigen dat het beginsel site voor H2O2 release de E3 subeenheid18 is. Een soortgelijke aanpak kan worden gebruikt voor andere dehydrogenases. Dit vereist de identificatie van remmers die elektronen stroom door verschillende delen van een enzym complex blokkeren.
Figuur 1 : Vertegenwoordiger het schermschoten voor assay setup. (A) afbeelding van procedure ingesteld voor de kinetische meting van veranderingen in de fluorescentie van NADH en resorufin. (B) tot instelling van de fluorescentie-parameters voor de assay. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatief standaard curven voor fluorescentie NADH en resorufin. Curven worden gebruikt om een schatting van de mate van NADH en O2● -/H2O2 productie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Representatief sporen voor de ruwe gegevens van de RFU verzameld tijdens de assay. (A) curven voor elk putje die werd voorgelezen tijdens de test. Plaat weergave curven worden gegenereerd door de CTL-knop ingedrukt te houden en te klikken op elk putje dat wordt gelezen. (B) voor gegevens exporteren, gegevens onder weergave voor het genereren van een tabel met de representatieve waarden van de RFU wordt geklikt. De SPREADSHEET exporteren wordt vervolgens geklikt om de ruwe resultaten exporteren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Directe vergelijking van de H-2 O 2 en de NADH zelftappende tarieven van KGDHC en PDHC. (A) gelijktijdige meting van H2O2 en NADH vorming potentieel van KGDHC en PDHC. (B) Berekening van het percentage van H2O2 en de NADH vorming door KGDHC en PDHC. Directe vergelijking van NADH en ROS productie door beide enzymen flavin-bevattende toont aan dat KGDHC produceert meer H2O2 dat is aan de hogere enzymatische capaciteit verwant. n = 4, ± SEM. betekenen Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Gelijktijdige meting van H 2 O 2 en NADH tarieven door KGDHC en PDHC vormen verschillende substraat concentraties oxiderende. Veranderingen in de fluorescentie werden gemeten zoals eerder beschreven, behalve de laatste substraat concentratie was varieerde van 0 mM tot 10 mM. Deze aanpak werd gebruikt om na te gaan van de afhankelijkheid van H2O2 versie op de kinetische eigenschappen van KGDHC en PDHC. n = 4, ± SEM. betekenen Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : KGDHC en PDHC ook weer verschillende H2 O 2 en NADH vormen eigenschappen wanneer NAD + levels veranderen. Veranderingen in de fluorescentie werden gemeten zoals eerder beschreven, behalve de eindconcentratie van NAD+ was varieerde van 0 mM tot 1 mM. Deze aanpak werd gebruikt om na te gaan van de afhankelijkheid van H2O2 versie op de kinetische eigenschappen van KGDHC en PDHC. n = 4, ± SEM. betekenen Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : Screening van verschillende site-specific remmers voor NADH en H2 O 2 productie. (A) Diagram waarin u ziet de katalytische cyclus voor KGDHC en de sites van acties inzake KMV en CPI-613. Merk op dat PDHC een homologe katalytische cyclus heeft, behalve dat KMV niet voor de pyruvaat bindende site concurreren. E1: pyruvaat of α-ketoglutarate dehydrogenase, E2: dihydrolipoamide acyltransferase, E3: dihydrolipoamide dehydrogenase. (B) Effect van KMV en CPI-613 productiebeperkingen NADH en H2O2 door KGDHC en PDHC. Monsters werden gepreïncubeerd in KMV (10 mM) of CPI-613 (150 µM) en vervolgens vehiculumcontrolegroep NADH en H2O2 productie. n = 4, ± SEM. betekenen Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Reagens | Voorraad concentratie werken | Volume toegevoegd aan goed | Eindconcentratie in put |
| KGDHC of PDHC | 1 eenheid/mL | 20 ΜL | 0.1 eenheden/mL |
| Superoxide dismutase | 250 eenheden/mL | 20 ΜL | 25 eenheden/mL |
| Mierikswortelperoxidase | 30 eenheden/mL | 20 ΜL | 3 eenheden/mL |
| Thiamine pyrofosfaat | 3 mM | 20 ΜL | 0.3 mM |
| Coenzym A | 1 mM | 20 ΜL | 0.1 mM |
| NAD+ | 10 mM | 20 ΜL | 1 mM |
| 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine | 100 ΜM | 20 ΜL | 10 ΜM |
| Substraat | 1-100 mM | 20 ΜL | 0.1-10 mM |
Tabel 1: Voorbeeld van een basisprotocol instellen voor het meten van O 2 ●- /H 2 O 2 en de NADH productie door gezuiverde PDH of KGDH. Aangezien 20 µL van elk reagens wordt toegevoegd aan elk putje en de finale volume/reactie is 200 µL, de uiteindelijke concentratie van elk reagens is 10-fold minder dan de voorraad concentratie (bijvoorbeeld, de uiteindelijke concentratie van NAD+ in het reactiemengsel is 1 mM ). Merk op dat de reagentia moeten worden toegevoegd aan het putje in de volgorde in de tabel.
| Inhibitor | Doel |
| 3-methyl-2-oxo valeriaanzuur | E1 subeenheid van KGDHC |
| CPI-613 | E2 subeenheid van oxo-zuur dehydrogenases |
Tabel 2: lijst van remmers en de bijbehorende doelen. Sites van actie zijn ook afgebeeld in Figuur 8.
| NADH autofluorescence | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Tijd | T ° 376,450 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:04 | 24.4 | 99 | 99 | 91 | 88 | 85 | 82 | 58 | 88 |
| 0:00:34 | 24.4 | 128 | 107 | 99 | 108 | 81 | 80 | 77 | 78 |
| 0:01:04 | 24.4 | 124 | 128 | 117 | 139 | 97 | 88 | 97 | 76 |
| 0:01:34 | 24.4 | 146 | 142 | 129 | 132 | 91 | 97 | 84 | 78 |
| 0:02:04 | 24.4 | 161 | 153 | 148 | 146 | 90 | 107 | 95 | 88 |
| 0:02:34 | 24.4 | 171 | 160 | 156 | 145 | 97 | 103 | 111 | 122 |
| 0:03:04 | 24.4 | 176 | 176 | 161 | 169 | 109 | 120 | 99 | 116 |
| 0:03:34 | 24.4 | 186 | 180 | 179 | 167 | 118 | 123 | 121 | 119 |
| 0:04:04 | 24.4 | 201 | 182 | 187 | 183 | 127 | 124 | 119 | 131 |
| 0:04:34 | 24.4 | 225 | 190 | 195 | 186 | 136 | 143 | 124 | 132 |
| 0:05:04 | 24.4 | 227 | 227 | 203 | 197 | 115 | 143 | 121 | 143 |
| Resorufin fluorescentie | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Tijd | T ° 565,600 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:00 | 24.4 | 204 | 178 | 169 | 152 | 148 | 113 | 107 | 90 |
| 0:00:30 | 24.4 | 224 | 188 | 167 | 152 | 144 | 116 | 124 | 112 |
| 0:01:00 | 24.4 | 212 | 186 | 178 | 161 | 153 | 114 | 122 | 120 |
| 0:01:30 | 24.4 | 212 | 188 | 165 | 164 | 160 | 132 | 127 | 116 |
| 0:02:00 | 24.4 | 222 | 203 | 190 | 169 | 154 | 128 | 133 | 127 |
| 0:02:30 | 24.4 | 217 | 198 | 193 | 179 | 165 | 129 | 147 | 130 |
| 0:03:00 | 24.4 | 223 | 218 | 202 | 179 | 183 | 142 | 145 | 137 |
| 0:03:30 | 24.4 | 239 | 223 | 208 | 188 | 179 | 150 | 155 | 148 |
| 0:04:00 | 24.4 | 236 | 219 | 202 | 183 | 180 | 163 | 156 | 153 |
| 0:04:30 | 24.4 | 249 | 220 | 214 | 177 | 199 | 149 | 150 | 167 |
| 0:05:00 | 24.4 | 251 | 232 | 225 | 196 | 211 | 170 | 169 | 161 |
Tabel 3: werkblad weergave van de resultaten verzameld uit de reeks experimenten. Ruwe worden RFU gegenereerd op basis van het experiment geëxporteerd naar een spreadsheet voor verdere analyse. Met behulp van standaard curven gegenereerd voorafgaand aan experimenten, kan het tarief van NADH en H2O2 productie worden berekend in het werkblad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is gunstig sinds, 1) het elimineert eventuele concurrerende reacties die anders H2O2 detectie (b.v., antioxidant systemen of andere bronnen van ROS), 2 storen) biedt een directe beoordeling van het eigen tempo van de ROS vrijgeven door een flavin-bevattende mitochondriale dehydrogenase, 3) maakt de vergelijking voor de native ROS vrijgeven tarieven van twee of meer gezuiverd flavin gebaseerde dehydrogenases, 4) kunnen zorgen voor een directe vergelijking van de snelheid van ROS release en enzym activiteit, en 5) screening van selectieve concurrerende remmers voor ROS release kunt. Onze fractie en anderen hebben gebruikt deze methode in eerdere publicaties te onderzoeken van de verordening van ROS door allosteric en het redox signalering mechanismen vóór het uitvoeren van experimenten met mitochondriën of permeabel spier14,16, 17,19,20.
Wijzigingen en probleemoplossing:
Deze procedure maakt gebruik van basisuitrusting beschikbaar bij bijna elke instelling. De aanpak is ook lage kosten en maakt gebruik van gewone chemicaliën beschikbaar door middel van verschillende leveranciers. De samenstelling van de buffer kan variëren naargelang de eigenschappen van het enzym - hoewel, we hebben gevonden dat een fundamentele reactie buffer bestaande uit sacharose, HEPES en mannitol EGTA goed in de meeste toepassingen werkt. Ruwe waarden voor resorufin fluorescentie zijn gewoonlijk rond 50-500 RFU voor een ROS vrijgeven van enzym verdund tot 0.1 U/mL. Hogere waarden van de RFU kunnen duiden op dat de AUR reagens is auto-geoxideerd door blootstelling aan licht of herhaalde bevriezen-ontdooien. Daarom moeten AUR werkoplossing worden routinematig vervangen elke 2 tot 3 weken (afhankelijk van de frequentie van gebruik). Onzuiverheden in de enzympreparaat of denaturatie kunnen leiden tot lagere dan normale ROS en NADH lezingen. Enzym zuiverheid moet regelmatig worden gecontroleerd door gelelektroforese. Kinetische eigenschappen (Km en Vmax voor substraat en NAD+) moeten ook worden beoordeeld direct na aankoop of zuivering van een enzym en dan daarna regelmatig gecontroleerd. Allermeest naar de in de test gebruikte reagentia zijn stabiel en kan worden onderworpen aan meerdere bevriezen-ontdooien cycli. Pyruvaat en α-ketoglutarate moeten worden opgeslagen in hoeveelheden van 100 µL bij-80 ° C om te voorkomen dat auto-oxidatie. Vermijd het gebruik van de reductiemiddelen als DTT aangezien het uitmaaktO2● -/H2O2 rechtstreeks via radicale vorming in PDHC en KGDHC (en mogelijk andere flavoenzymes),17. Testen kunnen worden uitgevoerd bij 37 ° C; echter, heeft onze fractie vond dat het uitvoeren van deze experimenten bij 25 ° C ideaal is voor het verstrekken van meer consistente gegevens.
Beperkingen van de techniek:
Één belangrijke hindernis die zijn gekoppeld aan deze techniek is toegang tot gezuiverde flavin-bevattende mitochondriale enzymen. Hier, we gebruikten verkrijgbare KGDHC en PDHC om aan te tonen dat deze techniek kan worden gebruikt om rechtstreeks vergelijken de ROS release capaciteit en enzym activiteit van flavin-bevattende mitochondriale dehydrogenases. Echter de meeste ROS flavin-bevattende enzymen produceren zijn niet commercieel beschikbaar en in het laboratorium moet worden gezuiverd. Dit kan lastig zijn gezien sommige van deze enzymen zijn membraan gebonden of absorberen de mitochondriale binnenste membraan. Er zijn nu nieuwe protocollen voor de succesvolle zuivering van membraan-gebonden flavin bevatten enzymen die ROS produceren beschikbaar. Dit omvat zuivering methoden voor complex I, complexe II en sn-glycerol-3-fosfaat dehydrogenase21,22,23. Daarom, hoewel de meeste van de genoemde ROS generatoren niet commercieel beschikbaar zijn kan, er zijn protocollen voor hun isolatie en zuivering. De fysiologische relevantie van de resultaten verzameld met behulp van gezuiverde flavin gebaseerde enzymen is ook een beperking. Bevindingen verzameld met gezuiverde enzymen moeten daarom worden opgevolgd met testen met behulp van geïsoleerde mitochondriën of permeabel weefsel. Vijf aparte studies gebruikt deze aanpak te onderzoeken van mechanismen voor regulering van ROS release door KGDHC en PDHC14,16,17,19,20. Voorlopige resultaten voor de rol van redox schakelaars bij het beheersen van ROS release aanvankelijk werden getest met behulp van gezuiverde KGDHC en PDHC, en vervolgens mechanismen voor verordening verder in de lever en cardiale mitochondriën en spiervezel14, werden geanalyseerd 16,17,20.
Betekenis ten opzichte van bestaande methoden:
Meten van ROS kan vrijlating uit afzonderlijke sites van de productie in de mitochondriën zijn uitdagend als gevolg van de aanwezigheid van concurrerende kant reacties die ook O2● -/H2O2 en antioxidant-systemen dat anders produceren tot leiden kunnen de onderschatting van inheemse tarieven. Het membraanpotentiaal kan ook veranderen ROS release tarieven van verschillende sites en het gebruik van remmers elektron stroom, verstorende O2● -/H2O2 formatie metingen kunt wijzigen. De methode die hier gepresenteerd staat de rechtstreekse evaluatie van de ROS release capaciteit van afzonderlijke enzymen terwijl gelijktijdig het beoordelen van de relatie tussen de inheemse tarieven van O2● -/H2O2 en enzym activiteit. Deze goedkope methode kan dienen als een instrument voor het vergelijken van de inheemse ROS release tarieven voor individuele flavin-bevattende mitochondriale enzymen voorafgaand aan meer geavanceerde experimenten met mitochondriën, cellen of weefsel. Daarnaast kan de hier vermelde methode worden gebruikt om de effectiviteit en de selectiviteit van remmers voor ROS release vóór het uitvoeren van testen met geïsoleerde mitochondriën vooraf te controleren.
Toekomstige toepassingen:
De hier vermelde methode is gebruikt in vijf afzonderlijke studies gericht onderzoek naar controle over ROS vrijlating uit PDHC en KGDHC14,16,17,19,20. In deze studies, remmers werden gescreend en ROS vrijgeven en NADH produceren tarieven werden geëvalueerd met behulp van gezuiverde enzymen. Resultaten die zijn verzameld met de gezuiverde enzymen werden vervolgens geverifieerd met behulp van geïsoleerde mitochondriën en permeabel spiervezels14,16,17,20. Daarom kan deze methode worden toegepast op een aantal toekomstige studies gericht op het bestuderen van inheemse ROS release vanaf mitochondriën, cellen en spiervezels.
Kritische stappen in het Protocol:
Enzym zuiverheid en de kinetische eigenschappen moeten regelmatig worden gecontroleerd. De AUR werken voorraad reagens moet ook regelmatig worden vervangen. Hierdoor zullen de resultaten verzameld stroken. De volgorde van de toevoeging van reagentia zijn onontbeerlijk voor het uitvoeren van een succesvolle experiment (tabel 1). Remmers, moeten worden getitreerd om te bepalen van de concentratie die nodig is te verduidelijken met maximale remming van ROS release. In deze studie kozen we 10 mM KMV en 150 µM CPI-613 aangezien we eerder had vastgesteld dat deze concentraties maximale remming van ROS release door KGDHC en PDHC13 induceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er is niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Raad van Canada (NSERC). Video productie werd uitgevoerd in samenwerking met het centrum voor innovatie in het onderwijs en leren (CITL) op de Memorial University van Newfoundland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
- Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
- Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).
- Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
- Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
- Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
- Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
- O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
- Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
- Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
- Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
- Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
- Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
- Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
- Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).
