Summary
Las mitocondrias contienen varias enzimas flavin dependientes que pueden producir especies reactivas del oxígeno (ROS). Monitoreo ROS liberación de sitios individuales en la mitocondria es difícil debido a reacciones secundarias no deseadas. Presentamos un método fácil y económico para la evaluación directa de tasas nativas para la liberación ROS con flavoenzymes purificada y microplacas fluorometría.
Abstract
Se ha reportado que las mitocondrias pueden contener hasta 12 fuentes enzimáticas de especies reactivas del oxígeno (ROS). La mayoría de estos sitios incluyen complejos respiratorios dependiente de flavin y Deshidrogenasas que producen una mezcla de superóxido (O2● -) y peróxido de hidrógeno (H2O2). Cuantificación precisa del potencial de producción de ROS de sitios individuales en mitocondrias aisladas puede ser difícil debido a la presencia de reacciones laterales que también forman O2●-/ h2O2y sistemas de defensa antioxidantes. Uso de inhibidores no específicos que pueden perturbar la bioenergética mitocondrial también puede comprometer medidas alterando la liberación ROS de otros sitios de producción. Aquí, presentamos un método sencillo para la medida simultánea de H2O2 liberación y producción de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) por Deshidrogenasas purificadas flavin-ligado. Para nuestros propósitos aquí, hemos utilizado el complejo de purificado de la piruvato deshidrogenasa (PDHC) y α-cetoglutarato deshidrogenasa complejo (KGDHC) de origen porcino corazón como ejemplos. Este método permite una medida exacta nativas H2O2 liberación de las tasas de sitios individuales de la producción mediante la eliminación de otras posibles fuentes de ROS y antioxidante. Además, este método permite una comparación directa de la relación entre la liberación de H2O2 y la actividad enzimática y la proyección de la eficacia y selectividad de los inhibidores para la producción de ROS. En general, este enfoque puede permitir la evaluación en profundidad de nativas tasas de liberación ROS para enzimas individuales antes de la realización de experimentos más sofisticados con mitocondrias aisladas o fibra muscular permeabilized.
Introduction
El objetivo final del metabolismo de nutrientes es hacer trifosfato de adenosina (ATP). En células de mamíferos, esto ocurre en las mitocondrias, orgánulos de doble membrana que convierten la energía almacenada en el carbón en ATP. La producción de ATP comienza cuando el carbón es quemado por las mitocondrias formando dos portadores de electrones, NADH y flavin-adenin-dinucleótido (FADH2)1. NADH y FADH2 es entonces oxidado por complejos respiratorios de multi-subunidades I y II, respectivamente, y los electrones liberados se transportaron para el oxígeno molecular (O2) de terminal del electrón aceptor en el complejo IV1. La termodinámicamente favorable "cuesta abajo" transferencia de electrones al O2 en el final de la cadena se acopla a la exportación de protones en la intermembrana del espacio por los complejos I, III y IV. Esto crea un gradiente electroquímico transmembrana de protones (fuerza protón-motriz), una forma temporal de la energía libre de Gibbs que es aprovechada por el complejo V para hacer ATP2. Reacciones de transferencia de electrones en las mitocondrias no están perfectamente acopladas a la producción de ATP. En varios puntos en el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria, los electrones prematuramente pueden interactuar con O2 para formar ROS3. El ROS biológicamente más relevante generado por las mitocondrias son O2● - y H2O2. Aunque O2●- a menudo se considera el ROS proximal formado por mitocondrias, ahora es evidente que los sitios de producción forman una mezcla de O2● - y H2O2, que se asocia con el libre los grupos de química radical de flavin prótesis4,5. En niveles elevados, ROS puede ser peligroso, dañar a los componentes biológicos necesarios para la función de la célula dando como resultado sufrimiento oxidativo6. Sin embargo, en bajas cantidades, ROS mitocondriales cumplir funciones vitales de señalización. Por ejemplo, liberación H2O2 las mitocondrias se ha implicado en el control de la activación del T-cell, señalización de estrés (p. ej., inducción de vías de señalización Nrf2), la inducción de proliferación celular y diferenciación, señalización de la insulina y liberación, alimentación y comportamiento7. Considerables progresos en la comprensión de la función de señalización de ROS. Sin embargo, importantes preguntas permanecen con respecto a que las enzimas de las mitocondrias sirven como las fuentes más importantes y cómo se controla la producción.
Liberación ROS por un sitio de producción depende de varios factores: 1) la concentración de la donación de electrones del sitio, 2) el estado redox del sitio donando electrones, 3) acceso a oxígeno y 4) la concentración y tipo de sustrato de oxidación3, 8 , 9. en las mitocondrias, otros factores como la concentración de NADH y la membrana fuerza potencial también influyen ROS producción8,10. Por ejemplo, la tasa de O2●/h2O2 producción purificada PDHC o KGDHC aumenta con la creciente disponibilidad de NADH5,11. En este escenario, los electrones están fluyendo hacia atrás de NADH para el centro de la moda en la subunidad de3 E de la PDHC o KGDHC, el sitio de O2●-/ h2O2 producción12. Asimismo, la disposición de NAD+ tiene el efecto contrario, disminuyendo la liberación ROS de KGDHC12. Así, control entrada o salida de electrones de sitios de producción de ROS puede alterar la cantidad O2●-/ h2O2 está formado. Por ejemplo, el bloqueo de la subunidad de2 E de la PDHC o KGDHC con CPI-613, un ácido lipoico analógico, resultados en un casi 90% disminución O2●-/ h2O2 producción13. Resultados similares pueden obtenerse con la química S glutathionylation catalizadores, diamida y disulfiram, que casi abolir O2●/h2O2 producción PDHC o KGDHC a través de la conjugación del glutatión para el E 2 subunidad14. La compensación por bloqueo del flujo de electrones a través de la subunidad de2 E de la PDHC y KGDHC es una disminución en la producción de NADH que disminuye la formación de ROS por la cadena de transporte del electrón (e.g., complejo III). Esto también puede disminuir la producción de ATP por la cadena de transporte de electrones. En general, bloqueo de entrada de electrones a los sitios de producción de ROS puede ser un medio muy eficaz de controlar O2●/h2O2 producción.
Las mitocondrias pueden contener hasta 12 posibles O2●-/ h2O2 fuentes6. La mayoría de estos sitios son el flavin-que contiene las enzimas que generan una mezcla de O2● - y H2O2. Uso de combinaciones de inhibidor y sustrato diferentes han permitido la identificación de que complejos respiratorios y deshidrogenasas mitocondriales sirven dealta capacidad O2●-/ h2O2 formando sitios en diferentes tejidos3. PDHC y KGDHC han demostrado servir de alta capacidad O2●-/ h2O2 sitios emisores en músculo y hígado mitocondria13,15. Sin embargo, quedan algunas dificultades en relación con el examen de la O2●-/ h2O2 formando potenciales de sitios individuales en las mitocondrias y el impacto que tienen sustrato diferentes y combinaciones del inhibidor en las actividades de las enzimas. Esto es debido a la presencia de reacciones laterales no deseadas (por ejemplo, la formación de O2●-/ h2O2 por sitios con excepción de la enzima de interés), contaminante nutrientes endógenos (p. ej.,grasos ácidos) u organelos (e.g., peroxisomas que también forman O2●-/ h2O2) y uso de inhibidores que carecen de selectividad, o uso de compuestos que no inhibir totalmente la producción de ROS. Ciertos inhibidores también pueden alterar la bioenergética mitocondrial y la dirección del flujo de electrones, y esto altera la liberación ROS de otros sitios de la producción y confunde los resultados. Tasas absolutas para O2●/h2O2 liberación de sitios individuales en las mitocondrias también son difíciles de cuantificar debido a la alta concentración de O2● - y H2O2 la eliminación de enzimas en el espacio intermembrana matriz. Por lo tanto, eliminación de reacciones concurrentes que pueden interferir con O2●/h2O2 liberación mediciones puede ser útil identificar alta capacidad O2● -/H2O2 formación de sitios.
Aquí, presentamos un método simple que permite el examen simultáneo de O2●/h2O2 producción y formación de NADH deshidrogenasas dependientes de flavina purificadas. Mediante el uso de enzimas purificadas, no deseados ROS formando reacciones secundarias y ROS degradando enzimas pueden eliminarse permitiendo una medida más precisa de nativos O2●-/ h2O2 tasas de producción para flavoenzymes individual. Este método puede utilizarse para comparar directamente el O2●-/ h2O2 formando la capacidad de diferentes Deshidrogenasas purificadas o inhibidores específicos del sitio potencial de pantalla O2●-/ h2O liberación de 2 . Por último, medición O2●-/ h2O2 y producción de NADH al mismo tiempo permite una evaluación en tiempo real de la relación entre la actividad enzimática y la capacidad de liberación ROS.
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Protocol
1. productos químicos y enzimas purificadas
- Adquirir los siguientes materiales: PDHC y KGDHC de corazón porcino origen (o de otro flavoenzyme mitocondrial purificado); H2O2 (solución al 30%), piruvato, α-cetoglutarato,+de NAD, NADH, CoASH, pirofosfato de tiamina (TPP), sacarosa manitol, HEPES, EGTA, 3-metil-2-oxo-ácido valeriánico (KMV), superóxido dismutasa (SOD), peroxidasa de rábano (HRP), 10-acetilo-3,7-dihydroxyphenoxazine reactivo (AUR) y el CPI-613.
2. planificación de los análisis y preparación de los reactivos
- Configurar el ensayo según la tabla 1 en una placa de 96 pocillos.
Nota: El volumen total para cada reacción es 200 μl. concentraciones de población se ajustan tales que se añade 20 μl del reactivo a cada pocillo. Esto asegura la rápida adición de cofactores y substratos a cada reacción bien antes de comenzar el ensayo. - Preparar el tampón de reacción que contiene manitol de 220 mM de sacarosa de 70 mM, 1 mM EGTA y 20 mM HEPES (pH 7.4 con HCl).
Nota: Esto puede cambiar dependiendo de las propiedades físicas de las diferentes enzimas purificadas. - Examinar la KGDHC o la PDHC purificada de contaminación utilizando enzima actividad ensayos14,16,17 o por el immunoblot o tinción de Coomassie5.
- Preparar todos los reactivos en el tampón de reacción según las concentraciones de la solución de trabajo en la tabla 1.
- Conservar todos los reactivos como alícuotas de 1 mL a-20 ° C. Tienda piruvato y α-cetoglutarato a-80 ° C en alícuotas de 100 μL para evitar la degradación espontánea debido a la auto oxidación y congelación y descongelación repetida.
- Prepare el reactivo AUR stock principal en 1 mL de DMSO y luego diluya a 100 μm en buffer de reacción. Almacenar protegido de la luz.
Nota: Aquí, la solución de trabajo de 100 μm es hecho frescas cada 2 a 3 semanas y protegidos de la luz.
3. configuración de la plantilla de análisis
- Establecer el procedimiento del ensayo con un lector de microplacas monocromática con capacidades de medición dual.
- Definir el procedimiento de lectura seleccionando "Protocolo". Haga clic en "Procedimiento".
- Establezca la "Temperatura" a 25 ° C (figura 1A).
- Haga clic en "Iniciar cinético" para establecer las condiciones de lectura (figura 1A). Ajustar la hora y el número de experimentos de intervalos de lectura.
- Haga clic en "leer" (figura 1B).
Nota: Las muestras se leen desde la posición superior con una ganancia de 50. Tiempo: 5 minutos, leer en intervalos de 30 s. Canal 1: Fluorescencia Resorufin - excitación/emisión = 565 nm:600 nm, ancho de longitud de onda de 13,5 nm. Canal 2: NADH autofluorescence - excitación/emisión = 376 nm:450 nm, ancho de longitud de onda de 20 nm. - En "Leer", seleccione pozos para monitor (por ejemplo, A1-A4 y B1-B4).
- Seleccione "Fin cinético".
4. estándar de curvas
- Descongelar los reactivos y almacenar en hielo hasta que se necesite.
-
Curva estándar de NADH (figura 2A)
- Preparar las soluciones de trabajo de NADH en el intervalo de concentraciones de 0.5 a 10 mM de tampón de reacción.
- Añadir 20 alícuotas μl de cada NADH trabajando la concentración de la solución a los pozos que contienen 180 μl de tampón de reacción. La concentración final de NADH en cada bien es de 0.05-1 mM.
- Haga clic en "Leer" y sistema de excitación/emisión = 376 nm:450 nm, ancho de longitud de onda de 20 nm.
Nota: Este es un extremo de sólo lectura, parámetros cinéticos no son obligatorios.
-
Curva estándar de AUR (figura 2B)
- Preparar las acciones de trabajo del peróxido de hidrógeno en solución tampón de reacción; valores de las concentraciones entre 200-4.000 nM.
- Añadir 120 μl de tampón de la reacción a cada pocillo.
- Añadir 20 μl de HRP (concentración stock de trabajo = 30 U/mL, concentración final en el pozo = 3 U/mL), 20 μl de SOD (concentración stock de trabajo = 250 U/mL, concentración final en el pozo = 25 U/mL) y 20 μl de AUR (concentración stock de trabajo = 100 μm concentración final en el pozo = 10 μm) para cada bien que contiene tampón de reacción.
- Añadir 20 μl de cada H2O2 solución stock a cada bien que contenga reactivos tampón y ensayo. El volumen de reacción final es 200 μl y la concentración final de H2O2 en cada pozo es de 20-400 nM.
- Incubar las placas durante 1 min en el lector de placas a 25 ° C.
- Haga clic en "Leer" y sistema de excitación/emisión = 565 nm/600 nm, ancho de longitud de onda de 13,5 nm. Tenga en cuenta que se trata de un extremo de sólo lectura, parámetros cinéticos no son obligatorios.
5. medición O2 ●/h2 O2 liberación y producción de NADH por KGDHC y PDHC
- Vea la tabla 1 para la orden de adición de los diferentes reactivos, la concentración de cada solución de trabajo y el volumen añadido a cada pozo.
- Agregar 40 μl de tampón de reacción a cada pocillo. Para los ensayos de uso de KMV o CPI-613, añadir 20 μl de buffer a cada pocillo.
- Añadir 20 μl de la PDHC o KGDHC (bolsa de trabajo de 1 U/mL, concentración final por pozo = 0,1 U/mL) a cada pocillo.
- Incubar PDHC y KGDHC a 25 ° C por 2 min.
- Añadir 20 μl de KMV (bolsa de trabajo = 100 mM, concentración final = 10 mM) o 20 μl de CPI-613 (concentración stock de trabajo = 1,5 mM, concentración final = 150 μm) (tabla 2).
Nota: Este paso puede ser excluido si no se utilizan inhibidores para los ensayos. - Incubar durante 1 min a 25 ° C.
Nota: Este paso puede ser excluido si no se utilizan inhibidores para los ensayos. - Añadir 20 μl de HRP (concentración stock de trabajo = 30 unidades/mL, concentración final en el pozo = 3 unidades/mL) y 20 μl de SOD (concentración stock de trabajo = 250 unidades/mL, concentración final en el pozo = 25 unidades/mL) a cada pocillo.
- Añadir 20 μl de la coenzima A (concentración stock de trabajo = concentración final de 1 mM = 0,1 mM), 20 μl de TPP (concentración stock de trabajo = 3 mM, concentración final = 0,3 mM) y 20 μl de NAD+ (concentración stock de trabajo = 10 mM, concentración final = 1 mM) a cada w ELL.
- Eliminar el reactivo AUR de la cubierta protectora de papel de estaño y añadir 20 μl a cada pocillo.
- Añadir 20 μl de piruvato (trabajo concentración stock de 1 100 mM, concentración final de ensayos = 0.1-10 mM) en los pocillos que contengan PDHC y α-cetoglutarato (trabajo concentración stock de 1 100 mM, concentración final de ensayos = 0.1-10 mM) a pozos que contienen KGDHC.
- Haga clic en "Leer" para iniciar la medición cinética.
6. Análisis de datos
- Mantenga pulsada la tecla 'CTRL' en el teclado y haga clic en la opción de pozos para generar un gráfico que contiene todas las medidas cinéticas correspondientes para canal 1 (Figura 3A).
- Haga clic en "datos" en el icono Vista en la esquina superior derecha para valores crudos para las unidades de fluorescencia relativa (RFU) medidas en los puntos de tiempo diferentes (figura 3B).
- Exportar los valores para el análisis (tabla 3).
- Haga clic en el menú en la parte superior derecha (figura 3B) desplegable "Gráfico" para obtener acceso a valores RFU asociados al canal 2 de la fluorescencia.
- Repita los pasos 6.1 a 6.3 para el canal 2.
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Representative Results
Figura 3A proporciona un rastro representativo para la RFU recopilado durante la medición simultánea de la producción de NADH y H2O2 por KGDHC purificada. Los datos brutos de la RFU para cada intervalo de tiempo se representan en la figura 3B. Entonces se exportan los datos brutos de la RFU para el análisis. Por extrapolación de curvas estándar presentadas en la figura 2, se puede determinar la cantidad absoluta de NADH y H2O2 formado en cada intervalo de medición durante el período de 5 minutos. Un ejemplo de este cálculo se proporciona en la tabla 3. Una vez que la cantidad de NADH y H2O2 formado por KGDHC o PDHC intervalos diferentes ha sido determinado, los valores son copiados e introducidos en un software de gráficos estadísticos para su posterior análisis. Mediante el análisis del tipo de gráfico XY, la cantidad de NADH (μmol) y H2O2 (pmol) formado por KGDHC o PDHC se puede trazar como una función del tiempo (Figura 4A). Usando estos valores, la tasa de formación de2 NADH y H2O durante la oxidación de sustrato también se puede calcular. Como se muestra en la Figura 4B, KGDHC y PDHC muestran características diferentes en cuanto a NADH y H2O2 formando capacidad.
Una vez se ha establecido que KGDHC y PDHC estan enzimáticamente activa NADH y H2O2 formación puede rastrearse simultáneamente, ROS liberar propiedades y actividades enzimáticas pueden medirse. Elegimos comparar KGDHC y PDHC ya que son altamente homólogas en la estructura básica y se han documentado para ser sitios de alta capacidad para la producción de ROS5. Figura 5 y figura 6 muestran la dependencia de la producción de2 NADH y H2O en la concentración del substrato. PDHC se satura fácilmente por bajas cantidades de sustrato con la tasa de NADH y H2O2 producción alcanzando su máximo en 0.1-0.5 piruvato mM. KGDHC, por el contrario, muestra aumentos incrementales en NADH y H2O2 producción con el aumento de α-cetoglutarato (figura 5). Esto demuestra que KGDHC y PDHC, aunque altamente homólogas en la estructura básica, tienen diferentes propiedades cinéticas en términos de cuánto substrato es necesaria para inducir la máxima liberación ROS. Figura 5 también demuestra que liberación2 H2O KGDHC se correlaciona fuertemente con la disponibilidad de producción y sustrato NADH. PDHC por otro no tiene las mismas características cinéticas. KGDHC y PDHC también difieren en cuanto aNADH y O2●-/ h2O2 formación de capacidad cuando se varía la concentración de NAD+ (figura 6).
Aprovechando la medida simultánea de NADH y H2O2, pueden someterse a potenciales inhibidores específicos del sitio para la producción de ROS. Esto puede ayudar a determinar la cantidad de inhibidor que se requiere para inducir la máxima inhibición de la liberación de H2O2 . Además, mediante la medición de la producción de NADH al mismo tiempo, puede identificarse el sitio de inhibidor de la acción, así como la fuente de ROS. Estudios previos han demostrado que el análogo de la α-cetoglutarato, KMV, es altamente eficaz para inhibir la liberación ROS de KGDHC (≥ 90% de inhibición)13,15. También demostramos que CPI-613, un análogo de ácido lipoico que bloquea Dihidrolipoil de la subunidad de2 E de la PDHC y KGDHC, también puede inhibir la liberación ROS de cualquier complejo de ~ 90%13,14. El sitio de acción para KMV y CPI-613 se muestran en la figura 7. CPI-613 es un sulfuro que contiene la molécula y por lo tanto se aconseja que reductores ricos en grupos tiol (Ditiotreitol; TDT) o proteínas (albúmina) se omiten de la procedimiento13. Figura 7 se muestra que tanto KMV y CPI-613 fueron altamente eficaz en limitar a NADH y H2O2 por KGDHC. Además, CPI-613 totalmente había suprimido liberación H2O2 PDHC (figura 7). Colectivamente, estos resultados demuestran que KMV y CPI-613 son inhibidores altamente efectivos para la liberación de H2O2 y por lo tanto se pueden aplicar a experimentos con mitocondrias aisladas. Dicha pantalla sería altamente beneficiosa para otras enzimas formadoras de ROS potencial ya que permite una evaluación directa de la eficacia y selectividad de diferentes inhibidores de Deshidrogenasas purificadas flavin-que contiene. La medida simultánea de NADH también tiene la ventaja de permitir la identificación preliminar de la fuente potencial de ROS en una enzima compleja. Figura 7 proporciona una descripción del mecanismo catalítico de KGDHC, que es altamente homólogo a la PDHC. La observación que KMV y CPI-613, que bloquean la E1 y E2 subunidad de KGDHC, casi totalmente supriman H2O2 y producción de NADH, confirma que la subunidad3 de E, es probable que la moda, es la fuente ROS 18. CPI-613 ejerce un efecto similar en el PDHC confirmando que el sitio de principio para la liberación de H2O2 es el E3 subunidad18. Un enfoque similar puede utilizarse para otras Deshidrogenasas. Esto requeriría la identificación de inhibidores que bloquean el flujo de electrones a través de diferentes partes de un complejo de la enzima.
Figura 1 : Capturas de pantalla representativa para la configuración del análisis. (A) representación del procedimiento establecido para la medición de la cinética de los cambios en NADH y resorufin de la fluorescencia. (B) establecer los parámetros de fluorescencia para el análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Representante curvas estándar de fluorescencia NADH y resorufin. Las curvas se utilizan para estimar la tasa de NADH y O2●/h2O2 producción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Huellas representativos para los datos crudos de la RFU recolectan durante el ensayo. Curvas de (A) para cada bien que se leyó durante el ensayo. Se generan curvas de placa vista manteniendo pulsado el botón CTL y haciendo clic en cada bien que se lee. (B) para la exportación de datos, los datos se hace clic en vista a generar una tabla que contiene los valores representativos de la RFU. Luego hacer clic en el botón de exportar hoja de cálculo para exportar los resultados crudos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Directa comparación de H2 O 2 y tasas forma NADH de KGDHC y PDHC. (A) medición simultánea de H2O2 y NADH formación potencial de KGDHC y PDHC. (B) Cálculo de la tasa de formación de NADH por KGDHC y PDHC y H2O2 . Comparación directa de la producción de NADH y ROS por ambas enzimas flavin-que contiene muestra que KGDHC produce más H2O2 que se relaciona con su mayor capacidad enzimática. n = 4, promedio ± SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Medida simultánea de H 2 O 2 y NADH formando tasas por KGDHC y PDHC oxidantes concentraciones de sustrato diferentes. Cambios en la fluorescencia se midieron como se describió anteriormente excepto la concentración de sustrato final fue varió de 0 mM a 10 mM. Este acercamiento fue utilizado para determinar la dependencia de H2O2 del lanzamiento de en las propiedades cinéticas de KGDHC y PDHC. n = 4, promedio ± SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : KGDHC y PDHC también mostrar diferentes H2 O 2 y propiedades de formación de NADH al NAD + niveles cambian. Cambios en la fluorescencia se miden como se describió anteriormente excepto la concentración final de NAD+ se varió de 0 mM a 1 mM. Este acercamiento fue utilizado para determinar la dependencia de H2O2 del lanzamiento de en las propiedades cinéticas de KGDHC y PDHC. n = 4, promedio ± SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 : Proyección de diferentes inhibidores específicos del sitio para NADH y H2 O 2 producción de. (A) diagrama que representa el ciclo catalítico de KGDHC y los sitios de acción para KMV y CPI-613. Observe que la PDHC tiene un ciclo catalítico homólogo, excepto que KMV no compiten por el sitio de unión del piruvato. E1: piruvato o α-cetoglutarato deshidrogenasa, E2: Dihidrolipoil Aciltransferasa, E3: Dihidrolipoil deshidrogenasa. (B) efecto de KMV y CPI-613 en NADH y H2O2 producción por KGDHC y PDHC. Las muestras se incuba en KMV (10 mM) o CPI-613 (150 μm) y entonces se ensayaron para NADH y H2O2 . n = 4, promedio ± SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo de | Concentración stock de trabajo | Volumen agregado bien | Concentración final en el pozo |
| KGDHC o PDHC | 1 unidad/mL | 20 ΜL | 0,1 unidades/mL |
| Superóxido dismutasa | 250 unidades/mL | 20 ΜL | 25 unidades/mL |
| Peroxidasa de rábano | 30 unidades/mL | 20 ΜL | 3 unidades/mL |
| Pirofosfato de tiamina | 3 mM | 20 ΜL | 0,3 mM |
| Coenzima A | 1 mM | 20 ΜL | 0,1 mM |
| NAD+ | 10 mM | 20 ΜL | 1 mM |
| 10-acetilo-3,7-dihydroxyphenoxazine | 100 ΜM | 20 ΜL | 10 ΜM |
| Sustrato | 1-100 mM | 20 ΜL | 0.1-10 mM |
Tabla 1: Ejemplo de un protocolo básico establecido para la medición de O 2 ●– / H 2 O 2 y producción de NADH por purificada PDH o KGDH. Desde 20 μl de cada reactivo se añade a cada pocillo y el último volumen de reacción es 200 μL, la concentración final de cada reactivo es 10 veces menor que la concentración de la población (por ejemplo, la concentración final de NAD+ en la mezcla de reacción es de 1 mM ). Tenga en cuenta que los reactivos deben añadirse al pozo en el orden que se presentan en la tabla.
| Inhibidor de la | Blanco |
| Valerio ácido 3-metil-2-oxo | Subunidad E1 de KGDHC |
| IPC-613 | Subunidad E2 de Deshidrogenasas ácido oxo |
Tabla 2: lista de inhibidores y sus objetivos. Sitios de acción son también representados en la figura 8.
| Autofluorescencia de NADH | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Tiempo | T ° 376.450 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:04 | 24.4 | 99 | 99 | 91 | 88 | 85 | 82 | 58 | 88 |
| 0:00:34 | 24.4 | 128 | 107 | 99 | 108 | 81 | 80 | 77 | 78 |
| 0:1:04 | 24.4 | 124 | 128 | 117 | 139 | 97 | 88 | 97 | 76 |
| 0:1:34 | 24.4 | 146 | 142 | 129 | 132 | 91 | 97 | 84 | 78 |
| 0:2:04 | 24.4 | 161 | 153 | 148 | 146 | 90 | 107 | 95 | 88 |
| 0:2:34 | 24.4 | 171 | 160 | 156 | 145 | 97 | 103 | 111 | 122 |
| 0:3:04 | 24.4 | 176 | 176 | 161 | 169 | 109 | 120 | 99 | 116 |
| 0:3:34 | 24.4 | 186 | 180 | 179 | 167 | 118 | 123 | 121 | 119 |
| 0:4:04 | 24.4 | 201 | 182 | 187 | 183 | 127 | 124 | 119 | 131 |
| 0:4:34 | 24.4 | 225 | 190 | 195 | 186 | 136 | 143 | 124 | 132 |
| 0:5:04 | 24.4 | 227 | 227 | 203 | 197 | 115 | 143 | 121 | 143 |
| Resorufin fluorescencia | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Tiempo | T ° 565.600 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:00 | 24.4 | 204 | 178 | 169 | 152 | 148 | 113 | 107 | 90 |
| 0:00:30 | 24.4 | 224 | 188 | 167 | 152 | 144 | 116 | 124 | 112 |
| 0:1:00 | 24.4 | 212 | 186 | 178 | 161 | 153 | 114 | 122 | 120 |
| 0:1:30 | 24.4 | 212 | 188 | 165 | 164 | 160 | 132 | 127 | 116 |
| 0:2:00 | 24.4 | 222 | 203 | 190 | 169 | 154 | 128 | 133 | 127 |
| 0:2:30 | 24.4 | 217 | 198 | 193 | 179 | 165 | 129 | 147 | 130 |
| 0:3:00 | 24.4 | 223 | 218 | 202 | 179 | 183 | 142 | 145 | 137 |
| 0:3:30 | 24.4 | 239 | 223 | 208 | 188 | 179 | 150 | 155 | 148 |
| 0:4:00 | 24.4 | 236 | 219 | 202 | 183 | 180 | 163 | 156 | 153 |
| 0:4:30 | 24.4 | 249 | 220 | 214 | 177 | 199 | 149 | 150 | 167 |
| 0:5:00 | 24.4 | 251 | 232 | 225 | 196 | 211 | 170 | 169 | 161 |
Tabla 3: vista de hoja de cálculo de los resultados obtenidos en el conjunto de experimentos. Valores RFU crudos generados a partir de la experiencia son exportados a una hoja de cálculo para su posterior análisis. Usando el estándar curvas generadas antes de la experimentación, se puede calcular la tasa de producción de2 NADH y H2O en la hoja de cálculo.
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Discussion
Este protocolo es ventajosa desde, 1) que elimina cualquier competencia reacciones que de lo contrario pueden interferir con la detección de H2O2 (p. ej., sistemas antioxidantes u otras fuentes de ROS), 2) ofrece una evaluación directa de la tasa natural de ROS liberar por una deshidrogenasa mitocondrial de flavin-que contiene, 3) permite la comparación del nativo ROS liberar las tasas de dos o más purificaron basada en flavin Deshidrogenasas, 4) puede permitir una comparación directa de la tasa de ROS liberación y actividad enzimática y 5) permite la detección de inhibidores selectivos de la competencia para la liberación ROS. Nuestro grupo y otros han utilizado este método en publicaciones anteriores para examinar la regulación de ROS por alostéricos y redox señalización mecanismos antes de llevar a cabo experimentos con las mitocondrias o músculo permeabilized14,16, 17,19,20.
Modificaciones y resolución de problemas:
Este procedimiento utiliza equipo básico disponible en casi todas las instituciones. El enfoque también es de bajo costo y aplicaciones disponibles a través de diversos proveedores de productos químicos comunes. La composición del tampón puede variar según las propiedades de la enzima - aunque hemos encontrado que un tampón de reacción básico compuesto por sacarosa, HEPES, manitol y EGTA funciona bien en la mayoría de las aplicaciones. Valores crudos de resorufin fluorescencia son típicamente alrededor RFU 50-500 para un ROS liberación de enzima diluida a 0,1 U/mL. Valores más altos de la RFU pueden indicar que el reactivo AUR ha sido auto oxidado debido a la exposición a la luz o congelación y descongelación repetida. Por lo tanto, soluciones de trabajo de AUR deben ser sistemáticamente reemplazadas cada 2 a 3 semanas (dependiendo de la frecuencia de uso). Impurezas en la preparación de enzimas o desnaturalización pueden conducir a menor normales lecturas ROS y NADH. Pureza de la enzima debe ser vigilado rutinariamente por electroforesis en gel. Propiedades cinéticas (Km y Vmax para sustrato y NAD+) también deben ser evaluados inmediatamente después de la compra o purificación de una enzima y luego rutinariamente monitoreadas después de eso. La mayoría de los reactivos utilizados en el ensayo es estable y puede ser sometida a varios ciclos de congelación y descongelación. Piruvato y α-cetoglutarato deben almacenarse en alícuotas de 100 μl a-80 ° C para evitar la auto oxidación. Evitar el uso de agentes reductores como DTT desde forma O2●-/ h2O2 directamente a través de la formación radical PDHC y KGDHC (y potencialmente otras flavoenzymes)17. Los ensayos pueden llevarse a cabo a 37 ° C; sin embargo, nuestro grupo ha encontrado que realizar estos experimentos a 25 ° C es ideal para proporcionar datos más consistentes.
Limitaciones de la técnica:
Un obstáculo importante asociado a esta técnica se encuentra purificadas enzimas mitocondriales flavin-que contiene. Aquí, se utilizaron comercialmente disponibles KGDHC y PDHC para demostrar que esta técnica puede utilizarse para comparar directamente el ROS comunicado de capacidad y actividad enzimática de deshidrogenasas mitocondriales flavin-que contiene. Sin embargo, la mayoría ROS producir enzimas flavin-que contiene no están comercialmente disponibles y debe ser purificadas en el laboratorio. Esto puede ser un desafío teniendo en cuenta algunas de estas enzimas son membrana enlazado o absorber a la membrana interna mitocondrial. Nuevos protocolos para la purificación exitosa de membrana-limitan flavin-que contiene enzimas que producen ROS están ahora disponibles. Esto incluye métodos de purificación para el complejo I, complejo II y sn-glicerol-3-fosfato deshidrogenasa21,22,23. Por lo tanto, aunque la mayoría de los mencionados generadores ROS no puede ser disponible en el mercado, existen protocolos para su aislamiento y purificación. La importancia fisiológica de los resultados obtenidos utilizando enzimas flavin-base purificadas es también una limitación. Por lo tanto, los resultados recogidos con enzimas purificadas deben tener seguimiento con ensayos usando mitocondria aislada permeabilized. Cinco estudios independientes utilizan este enfoque para investigar mecanismos de regulación de la liberación ROS KGDHC y PDHC14,16,17,19,20. Preliminar de resultados para el papel de interruptores redox para controlar la liberación ROS inicialmente fueron analizadas usando purificada KGDHC y PDHC y entonces mecanismos de regulación fueron analizados más en hígado y mitocondrias cardíacas y fibras musculares14, 16,17,20.
Importancia con respecto a los métodos existentes:
ROS de medición liberación de sitios individuales de producción en la mitocondria puede ser difícil debido a la presencia de competidores reacciones secundarias que también producen O2●/h2O2 y antioxidante sistemas que pueden originar la subestimación de los tipos nativos de. El potencial de membrana también puede alterar las tasas de liberación ROS de varios sitios y el uso de inhibidores puede alterar el flujo del electrón, confusión O2●/h2O2 formación medición. El método aquí presentado permite la evaluación directa de la capacidad de liberación ROS de enzimas individuales mientras que al mismo tiempo evaluar la relación entre las tasas nativas de O2●-/ h2O2 y actividad enzimática. Este método de bajo costo puede servir como una herramienta para comparar las tarifas de lanzamiento ROS nativas para enzimas mitocondriales flavin-que contiene individuales antes de la realización de experimentos más sofisticados con las mitocondrias, las células o tejido. Además, el método presentado en este documento puede ser utilizado para preseleccionar la efectividad y selectividad de los inhibidores de la liberación de ROS antes de realizar ensayos con mitocondrias aisladas.
Futuras aplicaciones:
El método presentado en este documento se ha utilizado en cinco estudios por separado para investigar el control sobre la liberación ROS del PDHC y KGDHC14,16,17,19,20. En estos estudios, inhibidores fueron defendidos y liberación de ROS y tasas de NADH produciendo fueron evaluadas usando enzimas purificadas. Resultados obtenidos con las enzimas purificadas luego fueron verificadas utilizando mitocondrias aisladas y permeabilized fibras musculares14,16,17,20. Por lo tanto, este método puede aplicarse a un número de futuros estudios dirigidos a estudiar tasas de liberación ROS nativas de mitocondrias, las células y las fibras musculares.
Pasos críticos en el protocolo:
Pureza de la enzima y las propiedades cinéticas deben ser vigiladas rutinariamente. El AUR trabajo reactivo stock también se debe cambiar con frecuencia. Esto garantizará resultados obtenidos son consistentes. El orden de adición de reactivos es vital para el funcionamiento de un exitoso experimento (tabla 1). Inhibidores deben titularse para determinar la concentración requerida para obtener la máxima inhibición de la liberación ROS. En este estudio optamos por 10 mM KMV y 150 μm CPI-613 ya que previamente habíamos determinado que estas concentraciones inducen la máxima inhibición de la liberación ROS por KGDHC y PDHC13.
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Disclosures
No hay nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por las ciencias naturales e Ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC). Producción de video se llevó a cabo en colaboración con el centro para la innovación en la enseñanza y aprendizaje (CITL) en Universidad conmemorativa de Terranova.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
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