Summary
Митохондрии содержат несколько Флавин зависимых ферментов, которые могут производить реактивнооксигенных видов (ров). Мониторинг ROS освобождение от отдельных участков в митохондриях является сложной задачей вследствие нежелательных побочных реакций. Мы представляем простой, недорогой метод для прямой оценки родной ставок для выпуска ROS, используя чистые flavoenzymes и микроплиты флюометрия.
Abstract
Сообщается, что митохондрий может содержать до 12 ферментативные источники реактивнооксигенных видов (ров). Большинство из этих сайтов включают Флавин зависимых дыхательных комплексов и дегидрогеназ, которые производят смесь супероксида (O2● -) и пероксида водорода (H2O2). Точная количественная оценка производства рос потенциал отдельных участков в изолированных митохондриях может быть сложным из-за присутствия антиоксидантных систем обороны и побочных реакций, которые также образуют O2●-/ h2O2. Использование неспецифические ингибиторы, которые могут нарушить митохондриальной биоэнергетики также может скомпрометировать измерений, изменяя ROS релиз от других мест производства. Здесь мы представляем простой метод для одновременного измерения H2O2 выпуска и Никотинамидадениндинуклеотид (NADH) производства, очищенный дегидрогеназ, Флавин связаны. Для наших целей здесь мы использовали очищенный пируват дегидрогеназа комплекс (PDHC) и альфа-кетоглутарата дегидрогеназа комплекс (KGDHC), свинину сердце происхождения в качестве примеров. Этот метод позволяет точное измерение родной H2O2 релиз ставок на отдельных участках производства путем устранения других потенциальных источников рос и антиоксидантной систем. Кроме того этот метод позволяет для прямого сравнения отношений между H2O2 выпуска и ферментативной активности и проверки эффективности и избирательности ингибиторов для производства рос. В целом такой подход может позволить для углубленной оценки родной темпы рос выпуска для отдельных ферментов до более сложных экспериментов с изолированных митохондриях или permeabilized мышечные волокна.
Introduction
Конечная цель обмена питательных веществ, чтобы аденозинтрифосфатом (АТФ). В mammalian клетках это происходит в митохондриях, двойной membraned органеллы, которые преобразуют энергию, запасенную в углерода в СПС. Начинается производство АТФ когда углерода сжигается в митохондриях, образуя два электрона перевозчиков, NADH и флавин аденин динуклеотид (ГВС2)1. NADH и ГВС2 затем окисляются, мульти Субблок дыхательных комплексов I и II, соответственно, и освобожденных электроны пролетах до терминала электрон акцептора молекулярного кислорода (2O) в комплекс IV1. Термодинамически благоприятные «спуск» передачи электронов2 O в конце цепи соединен к экспорту протонов в intermembrane пространство комплексы I, III и IV. Это создает градиент трансмембранных электрохимических протонов (Протон движущей силой), временная форма свободная энергия Гиббса, что постучал в комплекс V чтобы СПС2. Реакции переноса электрона в митохондриях не соединены идеально для производства АТФ. На различных этапах цикла Кребса и дыхательной цепи электроны могут преждевременно взаимодействовать с O2 к форме рос3. O2● - и H2O2наиболее биологически соответствующих ROS, порожденных митохондрий. Хотя O2● - часто считается проксимальной ROS, образованный митохондрий, очевидно теперь сайты производства образуют смесь O2● - и H2O2, который связан с бесплатно радикальные химии Флавин протезов группы4,5. На высоком уровне рос может быть опасным, повреждения биологических компонентов, необходимых для функции клеток, что приводит к окислительным дистресс6. Однако в низкой суммы, митохондриальных ROS выполнять жизненно важные функции сигнализации. Например H2O2 выхода из митохондрий было вовлечено в управление активации Т-клеток, стресс сигнализации (например, индукции Nrf2 сигнальных путей), индукции пролиферации и дифференцировки, Инсулин сигнализации и релиз и кормление поведение7. Значительный прогресс был достигнут в понимании сигнальные функции рос. Однако важные вопросы все еще остаются в отношении которой ферментов митохондрий служат наиболее важными источниками и как контролируется производства.
ROS релиза на веб-сайте производства зависит от нескольких факторов: 1) концентрация жертвуя электрон, 2 редокс состояние электрона пожертвования сайта, 3) доступ кислорода, и 4 концентрации и тип окислением субстрата3, сайта 8 , 9. в митохондриях, другие факторы, как концентрация NADH и мембранный потенциал силы также влияют ROS производства8,10. Например уровень O2●-/ h2O2 производства очищенной PDHC или KGDHC увеличивается с растущей NADH доступности5,11. В этом случае электроны текут назад от НАДН в Причуды центр E3 субъединица PDHC или KGDHC, на сайте O2●-/ h2O2 производства12. Аналогично предоставление NAD+ имеет противоположный эффект, уменьшение ROS освобождение от KGDHC12. Таким образом контроль входа или выхода электронов от мест его производства Рос может изменить, сколько O2●-/ h2O2 образуется. Например блокирование субъединица2 E PDHC или KGDHC с ИПЦ-613, липоевая кислота, аналоговый, результаты в почти 90% снижение O2●-/ h2O2 производство13. Аналогичные результаты могут быть получены с химической S-glutathionylation катализаторов, diamide и Дисульфирам, которые почти упразднить O2●-/ h2O2 производства PDHC или KGDHC через глагольных форм глутатиона на E 2 субъединицы14. Компромисс для блокирования потока электронов через субъединица2 E PDHC и KGDHC – это снижение производства NADH, которая уменьшает образование рос по электрон-транспортной цепи (например, комплекс III). Это также может снизить выход АТФ, электрон-транспортной цепи. В целом блокирование электрона вход к местам производства Рос может быть весьма эффективным средством контроля над O2●-/ h2O2 производства.
Митохондрии может содержать до 12 потенциальных O2●-/ h2O2 источники6. Большинство из этих сайтов, Флавин содержащие ферменты, которые генерируют смесь O2● - и H2O2. Использование различных субстрата и комбинации ингибитора позволили для идентификации которых дыхательных комплексов и митохондриальной дегидрогеназ служить высокой емкости O2●-/ h2O2 формирования участков в 3различных тканей. Было показано, что PDHC и KGDHC служить высокой емкости O2●-/ h2O2 излучающих сайтов в мышцах и печени митохондрий13,15. Однако остаются некоторые трудности в отношении рассмотрения O2●-/ h2O2 образующих потенциал отдельных участков в митохондриях и влияния, которые различные субстрата и комбинации ингибитора на деятельность ферментов. Это связано с наличием нежелательных побочных реакций (например, формирование O2●-/ h2O2 сайтов помимо фермента интерес), загрязняя эндогенного питательных веществ (например,жирные кислоты) или органеллы (например, пероксисомы, которые также образуют O2●-/ h2O2) и использование ингибиторов, которые отсутствие избирательности, и/или использование соединений, которые не полностью тормозят производство рос. Некоторые ингибиторы могут также изменить митохондриальной биоэнергетики и направление потока электронов, и это изменяет ROS релиз от других мест производства и смешивает результаты. Абсолютная тарифы заO2●-/ h2O2 релиз от отдельных участков в митохондриях также трудно определить из-за высокой концентрации O2● - и H2O2 ликвидация ферментов в матрицу и intermembrane пространстве. Таким образом ликвидация любых конкурирующих реакций, которые могут мешать O2●-/ h2O2 релиз измерений могут быть полезны при определении высокой емкости O2●-/ h2O2 формирование сайтов.
Здесь мы представляем простой метод, который позволяет одновременное рассмотрение O2●-/ h2O2 производство и формирование NADH, очищенный дегидрогеназ Флавин зависимых. С помощью очищенные ферменты, нежелательные ROS, образуя побочных реакций и рос, унижающего достоинство ферменты могут быть устранены позволяет для более точного измерения родной O2●-/ h2O2 производства ставок для отдельных flavoenzymes. Этот метод может использоваться непосредственно сравнивать O2●-/ h2O2 формирования потенциала различных очищенный дегидрогеназ или потенциальным участкам ингибиторы экрана O2●-/ h2O выпуск 2 . Наконец измерения O2●-/ h2O2 и НАДН производства одновременно может позволить для реального времени оценки взаимосвязи между ферментативной активности и способности релиз рос.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. химические вещества и очищенные ферменты
- Приобрести следующие материалы: PDHC и KGDHC свинину сердце происхождения (или другой очищенный митохондриальной flavoenzyme); H2O2 (30% раствора), пируват, альфа-кетоглутарата, NAD+, NADH, CoASH, тиамин пирофосфат (ТЭС), маннитол, HEPES, сахароза, EGTA, 3-метил-2-оксо Валериановая кислота (КМВ), супероксиддисмутаза (SOD), пероксидаза (ПХ), 10-ацетил-3,7-dihydroxyphenoxazine реагента (AUR) и ИПЦ-613.
2. Планирование пробирного и подготовка реагента
- Настройка пробирного согласно таблице 1 в 96-луночных пластине.
Примечание: Общий объем для каждой реакции составляет 200 мкл. фондовая концентрации корректируются таким образом, что добавляется 20 мкл реагента для каждой скважины. Это гарантирует быстрое добавление кофакторами и субстраты для каждой реакции хорошо до начала анализа. - Подготовьте реакции буфер, содержащий маннитол 220 мм, 70 мм сахарозы, 1 EGTA и 20 мм HEPES (рН 7,4 с HCl).
Примечание: Это может измениться в зависимости от физических свойств различных очищенные ферменты. - Изучить очищенный KGDHC или PDHC для загрязнения с помощью фермента деятельность анализов14,,1617 или immunoblot или Кумасси пятно5.
- Подготовьте все реагенты в буфере реакции согласно рабочей концентрации раствора в таблице 1.
- Хранить все реагенты в 1 мл аликвоты при-20 ° C. Хранить пируват и альфа-кетоглутарата-80 ° c в 100 мкл аликвоты для предотвращения спонтанного деградации вследствие auto окисления и повторного замораживания оттаивания.
- Подготовка реагента AUR главного склада в 1 мл ДМСО и затем разбавляют до 100 мкм в буфере реакции. Магазин, защищенном от света.
Примечание: Рабочий раствор 100 мкм здесь, сделал свежий каждые 2-3 недели и защищены от света.
3. Настройка шаблона Assay
- Настройка процедуры пробирного на монохромные Гонав читателя с двойной измерительных возможностей.
- Определите процедуру чтения, выбрав «Протокол». Нажмите кнопку «Процедура».
- Набор «Температура» до 25 ° C (рис. 1A).
- Нажмите кнопку «Начать кинетический», чтобы задать читать условия (Рисунок 1A). Задайте время и количество чтения интервалы/экспериментов.
- Нажмите кнопку «прочитать» (рис. 1B).
Примечание: Образцы считываются из верхней позиции с коэффициентом усиления 50. Время: 5 мин, читайте интервалом 30-х годов. Канал 1: Resorufin флуоресценции - возбуждения/выбросов = 565 nm:600 Нм, длина волны ширина 13,5 Нм. Канал 2: NADH аутофлюоресценция - возбуждения/выбросов = 376 nm:450 Нм, длина волны ширина 20 Нм. - В разделе «READ» выберите скважин для монитора (например, А1-А4 и В1-В4).
- Выберите «Конец КИНЕТИЧЕСКОЙ».
4. стандартные кривые
- Оттепель реагентов и хранить на льду, пока он не понадобится.
-
НАДН калибровочной кривой (рисунок 2A)
- Подготовьте рабочие решения для НАДН в диапазоне концентрации 0,5-10 мм в буфере реакции.
- Добавьте 20 мкл аликвоты каждого NADH рабочей концентрации раствора для скважин, содержащий 180 мкл буфера реакции. Конечная концентрация НАДН в каждом хорошо это 0,05-1 мм.
- Нажмите кнопку «Прочитать» и установить возбуждения/выбросов = 376 nm:450 Нм, длина волны ширина 20 Нм.
Примечание: Это является конечной точки только для чтения - кинетические параметры не требуются.
-
AUR калибровочной кривой (рис. 2B)
- Подготовить рабочие запасы перекиси водорода в буфер реакции; складе концентраций в диапазоне от 200-4000 Нм.
- Мкл 120 реакции буфера для каждой скважины.
- 20 мкл HRP (Рабочая концентрация запасов = 30 ед/мл, конечная концентрация в хорошо = 3 ед/мл), 20 мкл SOD (Рабочая концентрация запасов = 250 ед/мл, конечная концентрация в хорошо = 25 ед/мл) и 20 мкл AUR (Рабочая концентрация запасов = 100 мкм конечная концентрация в хорошо = 10 мкм) каждый хорошо содержащие буфер реакции.
- 20 мкл каждого H2O2 работает Стоковый раствор каждому хорошо содержащие буфер и пробирного реагентов. Окончательный реакции объем 200 мкл и конечная концентрация H2O2 в каждой скважине является 20-400 Нм.
- Инкубировать пластины для 1 мин в пластине читателя при 25 ° C.
- Нажмите кнопку «Прочитать» и установить возбуждения/выбросов = 565 Нм/600 Нм, длина волны ширина 13,5 Нм. Обратите внимание, что это является конечной точки только для чтения - кинетические параметры не требуются.
5. Измерение NADH производства KGDHC и PDHC и O2●- / h2 O2 выпуск
- Приведены в таблице 1 для порядок добавления различных реагентов, концентрация каждого рабочего раствора и объем добавил к каждой скважины.
- 40 мкл буфера реакции, для каждой скважины. Для анализов с использованием KMV или ИПЦ-613 добавьте 20 мкл буфера в каждой скважине.
- 20 мкл PDHC или KGDHC (рабочий запас 1 ед/мл, конечная концентрация на хорошо = 0,1 ед/мл) для каждой скважины.
- Инкубируйте PDHC и KGDHC при 25 ° C на 2 мин.
- 20 мкл KMV (рабочие запасов = 100 мм, конечная концентрация = 10 мм) или 20 мкл ИПЦ-613 (Рабочая концентрация запасов = 1.5 мм, конечная концентрация = 150 мкм) (Таблица 2).
Примечание: Этот шаг может быть исключена, если не используются ингибиторы для анализов. - Инкубировать в течение 1 мин при 25 ° C.
Примечание: Этот шаг может быть исключена, если не используются ингибиторы для анализов. - 20 мкл HRP (Рабочая концентрация запасов = 30 единиц/мл, конечная концентрация в хорошо = 3 единиц/мл) и 20 мкл SOD (Рабочая концентрация запасов = 250 единиц/мл, конечная концентрация в хорошо = 25 единиц/мл) для каждой скважины.
- 20 мкл коэнзима A (Рабочая концентрация запасов = 1 мм, конечная концентрация = 0,1 мм), 20 мкл ТЭС (Рабочая концентрация запасов = 3 мм, конечная концентрация = 0,3 мм) и 20 мкл NAD+ (Рабочая концентрация запасов = 10 мм, конечная концентрация = 1 мм) для каждого w ELL.
- Снять покрытие защитной фольги AUR реагента и 20 мкл метки для каждой скважины.
- 20 мкл пирувата (работает фондовый концентрации, начиная от 1-100 мм, конечная концентрация для анализов = 0,1-10 мм) для скважин, содержащих PDHC и альфа-кетоглютарата (работает фондовый концентрации, начиная от 1-100 мм, конечная концентрация для анализов = 0,1-10 мм) для Уэллс, содержащие KGDHC.
- Нажмите кнопку «READ», чтобы начать Кинетические измерения.
6. анализ данных
- Удерживая кнопку «CTRL» на клавиатуре и нажмите скважин для создания одного граф, содержащий все Кинетические измерения, соответствующий канал 1 (рис. 3A).
- Нажмите кнопку «данные» в представлении значка в правом верхнем углу для необработанных значений относительной флуоресценции единиц (РФС) измеряется в разное время точках (рисунок 3B).
- Экспортируйте значения для анализа (Таблица 3).
- Нажмите кнопку «График» выпадающего меню вверху справа (рис. 3B) для доступа к значениям РФС, связанный с флуоресцентным каналом 2.
- Повторите шаги 6.1 до 6,3 для канала 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 3A обеспечивает представитель трассировки для РФС, собранных во время одновременного измерения H2O2 и НАДН производства очищенной KGDHC. Необработанные данные РФС для каждого интервала времени изображен на рисунке 3B. Затем необработанные данные РФС экспортируются для анализа. Путем экстраполяции от стандартных кривых, представлен на рисунке 2, можно определить абсолютное количество NADH и H2O2 формируется на каждом интервале измерения в течение 5 мин. Пример такого расчета приводится в таблице 3. Как только количество NADH и H2O2 формируется было установлено, KGDHC или PDHC различные интервалы, значения копируются и введены в графиков/статистического программного обеспечения для дальнейшего анализа. С помощью анализа типа диаграммы XY, количество НАДН (мкмоль) и H2O2 (пмоль) KGDHC или PDHC могут быть отображены как функцию времени (рис. 4A). С помощью этих значений, скорость формирования NADH и H2O2 при окислении субстрата также может рассчитываться. Как показано на рисунке 4В, KGDHC и PDHC отображаются различные характеристики с точки зрения NADH и H2O2 формирования потенциала.
Когда-то было установлено, что KGDHC и PDHC ферментативно активной и NADH и H2O2 формирования могут быть отслежены одновременно, рос выпуск свойства и ферментативной активности могут быть измерены. Мы решили сравнить KGDHC и PDHC, поскольку они являются весьма гомологичных в базовую структуру и были задокументированы для сайтов высокой мощности для производства ROS5. Рисунок 5 и Рисунок 6 продемонстрировать зависимость NADH и H2O2 производства на концентрации субстрата. PDHC легко насыщено низкое количество субстрата с темпом NADH и H2O2 производства, достигнув своего максимума на 0,1-0,5 мм пируват. KGDHC, с другой стороны, показывает прирост добычи NADH и H2O2 с увеличением альфа-кетоглютарата (рис. 5). Это показывает, что KGDHC и PDHC, хотя весьма гомологичных в базовой структуре, имеют различные кинетические свойства с точки зрения сколько субстрат необходим для максимального выхода ROS. Рисунок 5 также демонстрирует, что H2O2 освобождение от KGDHC сильно коррелирует с НАДН производства и субстрат доступности. PDHC с другой не имеют те же кинетические характеристики. KGDHC и PDHC также различаются с точки зрения NADH и O2●-/ h2O2 формирования потенциала, когда варьируется концентрация NAD+ (рис. 6).
Воспользовавшись одновременное измерение NADH и H2O2могут проверяться потенциальным участкам ингибиторов для производства рос. Это может помочь определить количество ингибитора, что требуется навести Максимальное ингибирование H2O2 релиза. Кроме того путем измерения NADH производства в то же время, могут быть определены на сайте ингибитор действий, а также источник ROS. Предыдущие исследования показали, что альфа-кетоглутарата аналоговый, Кавказские Минеральные воды, весьма эффективны в ингибирующих рос выпуск от13,KGDHC (≥ 90% ингибирования)15. Мы также показали, что ИПЦ-613, липоевая кислота аналоговый, который блокирует dihydrolipoamide E2 субъединицы PDHC и KGDHC, может также препятствовать ROS освобождение от любой комплекс ~ 90%13,14. На сайте действий по КМВ и ИПЦ-613 показаны на рисунке 7. CPI-613 является сера, содержащие молекулы, и поэтому рекомендуется что тиоловых богатые восстановителями (Дитиотреитол; DTT) или белка (альбумина) исключены из процедуры13. Рисунок 7 демонстрирует, что КМВ и ИПЦ-613 были весьма эффективным на ограничение NADH и H2O2 по KGDHC. Аналогичным образом ИПЦ-613 полностью упразднена H2O2 освобождение от PDHC (рис. 7). Вместе эти результаты показывают, что КМВ и ИПЦ-613 высокоэффективных ингибиторов для H2O2 выпуска и таким образом могут быть применены к экспериментам с изолированных митохондриях. Такой экран будет весьма полезным для других потенциальных ROS-формирование ферментов, так как он позволяет для прямой оценки эффективности и избирательности разных ингибиторов на очищенный флавинсодержащих дегидрогеназ. Одновременное измерение NADH также имеет дополнительное преимущество, позволяя предварительное выявление потенциального источника рос в течение фермент комплекса. Рисунок 7 обеспечивает изображением каталитического механизма для KGDHC, который является весьма гомологично к PDHC. Наблюдения, что КМВ и ИПЦ-613, которые блокируют E1 и E2 субъединицы KGDHC, почти полностью отменена H2O2 и производства NADH, подтверждает, что субъединицы3 E, вероятно Причуды, источник ROS 18. ИПЦ-613 оказываемое аналогичный эффект на PDHC, подтверждает, что принцип сайт для H2O2 релиз E3 Субблок18. Аналогичный подход может использоваться для других дегидрогеназ. Это потребовало бы выявление ингибиторов, которые блокируют поток электронов через различные части комплекса фермента.
Рисунок 1 : Представитель скриншоты для установки пробирного. (A) изображение процедуры Настройка Кинетические измерения изменений в флуоресцировании NADH и resorufin. (B) Настройка параметров флуоресценции для assay. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Представитель стандартные кривые для флуоресценции NADH и resorufin. Кривые используются для оценки скорости NADH и O2●-/ h2O2 производства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Представитель следы для необработанных данных РФС, собранные в ходе assay. (A) кривые для каждой скважины, которое было зачитано в ходе анализа. Плита вид кривых генерируются, удерживая нажатой кнопку CTL и нажав на каждой скважине, который был прочитан. (B) для экспорта данных, данные нажатии под вид для создания таблицы, содержащей значения представитель РФС. Экспортировать сырые результаты затем нажатии кнопки Экспорт электронной таблицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Прямое сравнение H2 O 2 и формирования цены NADH KGDHC и PDHC. (A) одновременное измерение H2O2 и НАДН, образующих потенциал KGDHC и PDHC. (B) Расчет ставки H2O2 и формирования NADH, KGDHC и PDHC. Прямое сравнение NADH и ROS производства ферментами и флавинсодержащих показывает, что KGDHC производит больше H2O2 , которое связано с его выше ферментативные потенциала. n = 4, означает ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Одновременное измерение H 2 O 2 и НАДН, образуя ставки по KGDHC и PDHC окисляющие различные субстрата концентрации. Изменения в флуоресцировании были измерены как описано выше, за исключением окончательного субстрата концентрация варьировала от 0 мм до 10 мм. Этот подход был использован для определения зависимостей H2O2 выпуска на кинетические свойства KGDHC и PDHC. n = 4, означает ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : KGDHC и PDHC также отображать различные H2 O 2 и НАДН, образуя свойства когда NAD + уровни изменены. Изменения в флуоресцировании были измерены как описано выше, за исключением конечная концентрация NAD+ варьировала от 0 мм до 1 мм. Этот подход был использован для определения зависимостей H2O2 выпуска на кинетические свойства KGDHC и PDHC. n = 4, означает ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : Скрининг ингибиторов различных конкретных участков для NADH и H2 O 2 производство. (A) диаграмма, изображающая каталитического цикла для KGDHC и сайты действий по КМВ и ИПЦ-613. Обратите внимание, что PDHC гомологичных каталитического цикла, за исключением того, что KMV не конкурируют за пируват привязки сайта. E1: пирувата или альфа-кетоглутарата дегидрогеназа, E2: dihydrolipoamide ацилтрансфераза, E3: dihydrolipoamide дегидрогеназы. (B) эффект КМВ и ИПЦ-613 NADH и H2O2 производства KGDHC и PDHC. Образцы были преинкубации KMV (10 мм) или ИПЦ-613 (150 мкм) и затем assayed для NADH и H2O2 производства. n = 4, означает ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Реагент | Рабочая концентрация запасов | Объем, добавляется также | Конечная концентрация в колодец |
| KGDHC или PDHC | 1 единица/мл | 20 МКЛ | 0,1 единиц/мл |
| Супероксиддисмутаза | 250 единиц/мл | 20 МКЛ | 25 единиц/мл |
| Пероксидаза | 30 единиц/мл | 20 МКЛ | 3 единиц/мл |
| Тиамин пирофосфат | 3 мм | 20 МКЛ | 0,3 мм |
| Коэнзим А | 1 мм | 20 МКЛ | 0,1 мм |
| NAD+ | 10 мм | 20 МКЛ | 1 мм |
| 10-ацетил-3,7-dihydroxyphenoxazine | 100 МКМ | 20 МКЛ | 10 МКМ |
| Субстрат | 1-100 мм | 20 МКЛ | 0,1-10 мм |
Таблица 1: Пример базового протокола, созданных для измерения O 2 ●– / Ч 2 O 2 NADH производства очищенного PDH или KGDH и. Поскольку 20 мкл каждого реагента добавляется к каждой скважине и заключительный объем/реакция 200 мкл, конечная концентрация каждого реагента в 10 раз меньше, чем фондовый концентрация (например, конечная концентрация NAD+ в реакционной смеси составляет 1 мм ). Обратите внимание, что реагентов следует добавить к скважине в порядке, представлены в таблице.
| Ингибитор | Цель |
| 3-метил-2-оксо Валериановая кислота | Субблок KGDHC E1 |
| CPI-613 | E2 Субблок оксо кислоты дегидрогеназ |
Таблица 2: список ингибиторов и их целей. Сайты действий также изображены на рисунке 8.
| НАДН аутофлюоресценция | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Время | T ° 376,450 | А1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | А7 | A8 |
| 0:00:04 | 24.4 | 99 | 99 | 91 | 88 | 85 | 82 | 58 | 88 |
| 0:00:34 | 24.4 | 128 | 107 | 99 | 108 | 81 | 80 | 77 | 78 |
| 0:01:04 | 24.4 | 124 | 128 | 117 | 139 | 97 | 88 | 97 | 76 |
| 0:01:34 | 24.4 | 146 | 142 | 129 | 132 | 91 | 97 | 84 | 78 |
| 0:02:04 | 24.4 | 161 | 153 | 148 | 146 | 90 | 107 | 95 | 88 |
| 0:02:34 | 24.4 | 171 | 160 | 156 | 145 | 97 | 103 | 111 | 122 |
| 0:03:04 | 24.4 | 176 | 176 | 161 | 169 | 109 | 120 | 99 | 116 |
| 0:03:34 | 24.4 | 186 | 180 | 179 | 167 | 118 | 123 | 121 | 119 |
| 0:04:04 | 24.4 | 201 | 182 | 187 | 183 | 127 | 124 | 119 | 131 |
| 0:04:34 | 24.4 | 225 | 190 | 195 | 186 | 136 | 143 | 124 | 132 |
| 0:05:04 | 24.4 | 227 | 227 | 203 | 197 | 115 | 143 | 121 | 143 |
| Resorufin флуоресцирования | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Время | T ° 565,600 | А1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | А7 | A8 |
| 0:00:00 | 24.4 | 204 | 178 | 169 | 152 | 148 | 113 | 107 | 90 |
| 0:00:30 | 24.4 | 224 | 188 | 167 | 152 | 144 | 116 | 124 | 112 |
| 0:01:00 | 24.4 | 212 | 186 | 178 | 161 | 153 | 114 | 122 | 120 |
| 0:01:30 | 24.4 | 212 | 188 | 165 | 164 | 160 | 132 | 127 | 116 |
| 0:02:00 | 24.4 | 222 | 203 | 190 | 169 | 154 | 128 | 133 | 127 |
| 0:02:30 | 24.4 | 217 | 198 | 193 | 179 | 165 | 129 | 147 | 130 |
| 0:03:00 | 24.4 | 223 | 218 | 202 | 179 | 183 | 142 | 145 | 137 |
| 0:03:30 | 24.4 | 239 | 223 | 208 | 188 | 179 | 150 | 155 | 148 |
| 0:04:00 | 24.4 | 236 | 219 | 202 | 183 | 180 | 163 | 156 | 153 |
| 0:04:30 | 24.4 | 249 | 220 | 214 | 177 | 199 | 149 | 150 | 167 |
| 0:05:00 | 24.4 | 251 | 232 | 225 | 196 | 211 | 170 | 169 | 161 |
Таблица 3: представление таблицы результатов, собранных из множества экспериментов. Сырые РФС значения, полученные из эксперимента экспортируются в электронную таблицу для дальнейшего анализа. С помощью стандартных кривых, составленные до экспериментов, темпы NADH и H2O2 производства могут быть рассчитаны в электронной таблице.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол является выгодным с, 1) он устраняет любую конкурирующих реакций, которые могут иным образом вмешиваться H2O2 обнаружения (например, антиоксидантных систем или других источников ROS), 2) обеспечивает прямую оценку родной скорости ROS освободить флавинсодержащих митохондриальной дегидрогеназы, 3) позволяет сравнение родной рос выпуск ставок двух или более очищенная на основе Флавин дегидрогеназ, 4) можно разрешить для прямого сравнения темпов выпуска ROS деятельности ферментов и 5) позволяет скрининг селективного конкурентных ингибиторов для выпуска рос. Окислительно сигналы механизмов до проведения экспериментов с митохондрий или permeabilized мышц14,16, и наша группа и другие использовали этот метод в предыдущих публикациях для изучения регуляции ROS путем аллостерический 17,19,20.
Модификации и устранения неполадок:
Эта процедура использует базовое оборудование доступны в почти в каждом учреждении. Этот подход также является низкая стоимость и использует общие химические вещества через различных поставщиков. Состав буфера может варьироваться в зависимости от свойства фермента - хотя, мы обнаружили, что основные реакции буфера, состоящий из сахарозы, HEPES, маннитол и EGTA хорошо работает в большинстве приложений. Необработанные значения для флуоресценции resorufin, как правило, около 50-500 РФС для ROS, выпуская энзим, разбавляют до 0,1 ед/мл. Более высокие значения РФС может указывать AUR реагент был auto окисленные из-за воздействия света или повторного замораживания оттаивания. Таким образом AUR рабочие решения должны регулярно заменяться каждые 2-3 недели (в зависимости от частоты использования). Примеси в ферментный препарат или денатурации может привести к снижению чем нормальный рос и НАДН чтений. Фермент Чистота должны регулярно контролироваться электрофорезом геля. Кинетические свойства (км и Vmax для субстрата и NAD+) следует также оценить сразу же после покупки или очистки фермента и затем регулярно контролироваться впоследствии. Большинство из реагентов, используемых в assay стабильны и могут быть подвергнуты несколько циклов замораживания оттаивания. Пируват и альфа-кетоглутарата должны храниться в аликвоты 100 мкл на-80 ° C, чтобы избежать auto окисления. Избегайте использования восстановителями как DTT, поскольку она образует O2●-/ h2O2 непосредственно через радикальные формирования в PDHC и KGDHC (и потенциально другие flavoenzymes)17. Анализы могут проводиться при 37 ° C; Однако наша группа пришла к выводу, что проведение этих экспериментов при 25 ° C идеально подходит для обеспечения более последовательных данных.
Ограничения метода:
Одно крупное препятствие, связанные с этой техникой является доступ к очищенной флавинсодержащих митохондриальных ферментов. Здесь мы использовали коммерчески доступных KGDHC и PDHC, чтобы продемонстрировать, что этот метод может использоваться непосредственно сравнивать ROS релиз потенциал и фермента деятельность флавинсодержащих митохондриальной дегидрогеназ. Однако большинство ROS, производя ферменты флавинсодержащих не являются коммерчески доступными и должны быть очищены в лаборатории. Это может быть сложным рассматривает некоторые из этих ферментов являются мембраной связаны или поглощать внутренней митохондриальной мембраны. Теперь доступны новые протоколы для успешной очистки мембраны прыгните флавинсодержащих ферментов, которые производят рос. Это включает в себя методы очистки для комплекса I, комплекс II и sn-глицерин-3-фосфат дегидрогеназа21,22,23. Поэтому несмотря на то, что большинство перечисленных ROS генераторов не может быть коммерчески доступных, протоколы существуют для их очистки и изоляции. Физиологические релевантность результатов, собранных с использованием очищенной на основе Флавин ферменты также является ограничением. Таким образом результаты, собранные с очищенной ферментов следует рассматривать с анализов с использованием изолированных митохондриях или permeabilized ткани. Пять отдельных исследований использовать этот подход для изучения механизмы регулирования выпуска рос KGDHC и PDHC14,16,17,19,20. Предварительные результаты для роли редокс переключателей в Управление рос релиз первоначально были протестированы с использованием очищенной KGDHC и PDHC, а затем механизмы регулирования были далее проанализированы в печени и сердечной митохондрии и мышечных волокон14, 16,17,20.
Значение в отношении существующих методов:
Измерения ROS релиз от отдельных мест производства в митохондриях может быть сложным из-за наличия конкурирующих побочных реакций, которые также производят O2●-/ h2O2 и антиоксидантной систем которые в противном случае может привести к недооценка родной ставок. Мембранный потенциал может также изменить ROS релиз ставки с различных сайтов и использование ингибиторов может изменить поток электронов, смешаннымO2●-/ h2O2 формирования измерения. Представленные здесь метод позволяет прямой оценки потенциала выпуска рос от отдельных ферментов оценивая отношения между родной показатели деятельности O2●-/ h2O2 и фермент одновременно. Этот недорогой метод может служить инструментом для сравнения родной ROS релиз ставки для отдельных флавинсодержащих митохондриальных ферментов до более сложных экспериментов с митохондрий, клетки или ткани. Кроме того метод, представленные в настоящем документе могут быть использованы для предварительного рассмотрения эффективности и избирательности ингибиторов для выпуска рос до проведения анализов с изолированных митохондриях.
Будущих приложений:
В пяти отдельных исследований, направленных на изучение контроль над ROS освобождение от PDHC и KGDHC14,16,17,,1920был использован метод, представленные в настоящем документе. В этих исследованиях ингибиторы были экранированы и рос выпуск и НАДН производства ставки были оценены с использованием очищенные ферменты. Результаты, собранные с очищенные ферменты затем были проверены с помощью изолированных митохондриях и permeabilized мышечных волокон14,16,17,20. Таким образом этот метод может применяться к ряду будущих исследований, направленных на изучение родной ROS релиз тарифы из митохондрий, клетки и мышечных волокон.
Важнейшие шаги в протоколе:
Фермент Чистота и кинетических свойств должны регулярно контролироваться. AUR работающих запасов реагентов следует заменить также часто. Это будет гарантировать, собранные результаты согласуются. Порядок добавления реагентов является жизненно важным для запуска успешный эксперимент (Таблица 1). Ингибиторы должны титруют определить концентрацию, требуется выяснить Максимальное ингибирование ROS релиза. В этом исследовании, мы выбрали 10 мм КМВ и 150 мкм ИПЦ-613, поскольку мы ранее было установлено, что эти концентрации вызвать максимальное ингибирование ROS выпуска, KGDHC и PDHC13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Существует ничего не разглашать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась естественных наук и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ). Видео производства была проведена в сотрудничестве с центром для инноваций в области преподавания и обучения (НРЖОС) в Мемориальном университете Ньюфаундленда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
- Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
- Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P.
- Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
- Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
- Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
- Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
- O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
- Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
- Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
- Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
- Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
- Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
- Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
- Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).
