Summary
تحتوي الميتوكوندريا على إنزيمات فلافين-تعتمد على عدة يمكن أن تنتج الأنواع الأكسجين التفاعلية (روس). رصد روس الإصدار من المواقع الفردية في الميتوكوندريا صعبة بسبب التفاعلات الجانبية غير المرغوب فيها. نقدم طريقة سهلة وغير مكلفة للتقييم المباشر لأسعار الأصلي للإفراج عن روس باستخدام فلافونزيميس المنقي والميكروسكوبيه فلوروميتري.
Abstract
وأفيد أن الميتوكوندريا يمكن أن تحتوي على مصادر الانزيمية يصل إلى 12 للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس). وتشمل أغلبية هذه المواقع مجمعات فلافين-تعتمد على الجهاز التنفسي و dehydrogenases التي تنتج خليط أكسيد فائق (س2●-) وفوق أكسيد الهيدروجين (H2O2). دقيقة التحديد الكمي لإمكانات إنتاج روس من المواقع الفردية في الميتوكوندريا المعزولة يمكن أن تكون صعبة بسبب وجود أنظمة الدفاع المضادة للأكسدة وردود الفعل الجانبية التي تشكل أيضاس2●-/H2س2. يمكن أن تمس استعمال مثبطات غير محدد يمكن أن تعطل الاستقلاب المتقدرية أيضا قياسات بتغيير الإصدار روس من مواقع أخرى للإنتاج. نقدم هنا، طريقة سهلة لقياس إنتاج نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NADH) وحاء2يا2 الإفراج المتزامن المنقي dehydrogenases فلافين مرتبطة. لأغراضنا هنا، استخدمنا بيروفات المنقي نازعة مجمع (بدك) و α-كيتوجلوتاراتي نازعة معقدة (كجدهك) من أصل قلب الخنزير كأمثلة. يسمح هذا الأسلوب لمقياس دقيق الأصلية ح2س2 الإفراج عن معدلات من خلال المواقع الفردية للإنتاج عن طريق القضاء على المصادر المحتملة الأخرى لنظم روس ومضادات الأكسدة. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يسمح بإجراء مقارنة مباشرة للعلاقة بين حاء2يا2 الإفراج ونشاط إنزيم وفحص فعالية والانتقائية لمثبطات لإنتاج روس. عموما، يمكن أن يسمح هذا النهج للتقييم المتعمق لمعدلات الأصلي للإفراج عن روس للإنزيمات الفردية قبل إجراء تجارب أكثر تطورا مع الميتوكوندريا المعزولة أو الألياف العضلية بيرميبيليزيد.
Introduction
أن الهدف النهائي الأيض المغذيات جعل الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). في خلايا الثدييات، وهذا يحدث في الميتوكوندريا، العضيات مزدوجة-ميمبرانيد أن تحويل الطاقة المخزنة في الكربون إلى ATP. ويبدأ إنتاج ATP عندما الكربون كومبوستيد من الميتوكوندريا تشكيل حاملتي الإلكترون NADH وفلافين الأدنين dinucleotide (القوات المسلحة الهايتية2)1. NADH والقوات المسلحة الهايتية2 ثم تتأكسد بالمجمعات الرئوي وحدة فرعية متعددة الأول والثاني، على التوالي، ويجري نقل الإلكترونات المحررة إلى محطة طرفية إلكترون يقبلون الجزيئية الأكسجين (O2) في مجمع الرابع1. [ثرمودنميكلي] مواتي "انحدار" نقل الإلكترونات إلى س2 في نهاية السلسلة يقترن بتصدير البروتونات في إينتيرميمبراني الفضاء بمجمعات الأول والثالث والرابع. يؤدي هذا إلى إنشاء تدرج الكهروكيميائية transmembrane البروتونات (بروتون--دافع القوة)، نموذج مؤقتة من طاقة جيبس الحرة التي يتم استغلالها من قبل الخامس المعقدة جعل ATP2. تفاعلات نقل الإلكترونات في الميتوكوندريا لا تقترن تماما لإنتاج ATP. في نقاط مختلفة في دورة كريبس وسلسلة التنفس، قبل الأوان يمكن أن تتفاعل الإلكترونات مع س2 على شكل روس3. روس الأكثر بيولوجيا ذات الصلة التي تم إنشاؤها بواسطة الميتوكوندريا هي س2●- وح2س2. على الرغم من أن س2●- كثيرا ما يعتبر روس الدانية التي شكلتها الميتوكوندريا، من الواضح الآن أن مواقع الإنتاج تشكل مزيجاً من س2●- وح2س2، الذي يرتبط مع الحر المجموعات الراديكالية كيمياء فلافين الاصطناعية4،5. في المستويات العليا، روس يمكن أن تكون خطيرة، إتلاف المكونات البيولوجية اللازمة لوظيفة الخلية الناتجة في الشدة الأكسدة6. ومع ذلك، تفي بروس المتقدرية عند كميات منخفضة، الوظائف إرسال الإشارات الحيوية. على سبيل المثال، قد تورط حاء2يا2 الإفراج من الميتوكوندريا في السيطرة على تنشيط خلايا تي، إشارات الإجهاد (مثلاً، تنظيم دورات تعريفية لمسارات إشارات Nrf2)، تحريض من تكاثر الخلايا وتمايزها، إشارات الأنسولين والإصدار، وتغذية السلوك7. أحرز تقدم كبير في فهم إشارات مهمة روس. ومع ذلك، هامة لا تزال هناك أسئلة فيما يتعلق بالذي الإنزيمات في الميتوكوندريا بمثابة أهم المصادر وكيفية التحكم في الإنتاج.
الإصدار روس بموقع الإنتاج يعتمد على عدة عوامل: 1) تركز التبرع بالكترون للموقع، 2) حالة الأكسدة الموقع التبرع الإلكترون، 3) الوصول إلى الأكسجين، وتركيز 4) ونوع أكسدة الركازة3، 8 , 9-في الميتوكوندريا، عوامل أخرى مثل تركيز القوة المحتملة NADH والغشاء أيضا التأثير روس إنتاج8،10. على سبيل المثال، يزيد معدل س2●-/H2س2 إنتاج المنقي بدك أو كجدهك مع تزايد NADH توافر5،11. في هذا السيناريو، تتدفق الإلكترونات إلى الوراء من NADH إلى مركز المؤسسة في وحدة فرعية3 ه بدك أو كجدهك، الموقع لس2●-/H2س2 إنتاج12. وبالمثل، قد توفير نادٍ+ تأثير معاكس، تتناقص روس الإصدار من كجدهك12. وهكذا، يمكن أن يغير المسيطر من الدخول أو الخروج من الإلكترونات من مواقع الإنتاج روس تتشكلكم س2●-/H2س2 . على سبيل المثال، حظر فرعية2 ه من بدك أو كجدهك مع مؤشر أسعار المستهلك-613، حمض ليبويك تناظرية، ينتج تقريبا 90% انخفاض في س2●-/H2س2 إنتاج13. يمكن الحصول على نتائج مماثلة مع المواد الكيميائية S-جلوتاثيونيليشن المواد الحفازة ودياميدي وديسولفيرام، التي تلغي تقريبا س2●/H2س2 إنتاج بدك أو كجدهك عن طريق تصريف الجلوتاثيون ه 2 وحدة فرعية14. المفاضلة لعرقلة تدفق الإلكترون عن طريق فرعية2 ه بدك وكجدهك هو انخفاض في إنتاج NADH مما يقلل تكوين روس بسلسلة نقل الإلكترون (مثلاً، ثالثا المعقدة). هذا أيضا تقليل إنتاج ATP بسلسلة نقل الإلكترون. عموما، يمكن حظر دخول إلكترون إلى مواقع الإنتاج روس وسيلة فعالة للغاية لمراقبة س2●/H2يا2 الإنتاج.
يمكن أن تحتوي الميتوكوندرياتصل إلى 12 المحتملة س2●-/H2س2 مصادر6. معظم هذه المواقع المحتوية على فلافين الإنزيمات التي تولد مزيجاً من س2●- وح2س2. وقد يسمح باستخدام الركيزة مختلفة وتركيبات المانع لتحديد منها مجمعات الجهاز التنفسي و dehydrogenases المتقدرية بمثابةعالية السعة س2●-/H2س2 تشكيل مواقع في 3من أنسجة مختلفة. قد ثبت بمثابة عالية السعةس2●-/H2س2 المواقع التي ينبعث منها قدر في العضلات والكبد الميتوكوندريا13،15بدك وكجدهك. ومع ذلك، تبقى بعض الصعوبات فيما يتعلق بالنظر في س2●-/H2س2 تشكيل المحتملة من المواقع الفردية في الميتوكوندريا، والأثر أن الركازة مختلفة وتركيبات مثبط على أنشطة الإنزيمات. هذا هو سبب وجود تفاعلات جانبية غير مرغوب فيها (مثلاً، تشكيلس2●-/H2س2 بالمواقع عدا الإنزيم للفائدة)، تلويث المواد الغذائية المحلية (مثلاً،الدهنية الأحماض) أو العضيات (مثل، بيروكسيسوميس التي تشكل أيضاس2●-/H2س2)، واستخدام الموانع التي تفتقر إلى الانتقائية، و/أو استخدام المركبات التي تحول دون إنتاج روس ليس كاملا. يمكن أيضا تغيير بعض مثبطات الاستقلاب mitochondrial واتجاه تدفق الإلكترونات، وهذا يغير الإصدار روس من مواقع أخرى للإنتاج ويفند النتائج. معدلات المطلقة س2●-/H2يا2 الإفراج عن المواقع الفردية في الميتوكوندريا أيضا يصعب قياسها كمياً بسبب ارتفاع تركيز O2●- وح2س2 القضاء على الإنزيمات في الفضاء intermembrane ومصفوفة. ولذلك، يمكن القضاء على أي ردود الفعل المتضاربة التي يمكن أن تتداخل مع2س●-/H2يا2 الإفراج عن قياسات مفيدة عند تحديد سعة عالية س2●-/H2س2 تشكيل مواقع.
نقدم هنا، أسلوب بسيط يسمح للنظر المتزامن في س2●/H2س2 إنتاج وتكوين NADH بتنقية فلافين-تعتمد على ديهيدروجيناسيس. باستخدام الإنزيمات النقية، روس تشكيل ردود الفعل الجانبية غير المرغوب فيها وروس اللاإنسانية الإنزيمات يمكن القضاء على السماح لتدبير أكثر دقة من الأم س2●-/H2س2 معدلات الإنتاج للفرد فلافونزيميس. يمكن استخدام هذا الأسلوب لمقارنة مباشرة س2●-/H2س2 تشكيل قدرة dehydrogenases المنقي مختلفة أو مثبطات الشاشة الخاصة بالموقع المحتمل س2●-/H2س الإصدار 2 . وأخيراً، قياسس2●-/H2يا2 والإنتاج NADH في وقت واحد يمكن أن تسمح لإجراء تقييم في الوقت الحقيقي للعلاقة بين نشاط الإنزيم وروس الإفراج عن القدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-المواد الكيميائية وتنقية الإنزيمات
- شراء المواد التالية: بدك وكجدهك الأصل قلب الخنزير (أو آخر المنقي فلافونزيمي الميتوكوندريا)؛ ح2س2 (محلول 30%)، بيروفات، α-كيتوجلوتاراتي NAD+، NADH، كوش، بيروفوسفات الثيامين (TPP)، المانيتول، حبيس، السكروز، عطا، 3-الميثيل-2-أوكسو حمض فاليريك (كمف)، دسموتاز الفاءق (الأحمق)، الفجل البيروكسيديز (HRP)، 10-أسيتيل-3.7-ديهيدروكسيفينوكسازيني كاشف (أور)، ومؤشر سعر المستهلك-613.
2-التخطيط للتحليل وإعداد كاشف
- إعداد المقايسة وفقا الجدول 1 في لوحة 96-جيدا.
ملاحظة: الحجم الإجمالي لكل رد فعل 200 الأسهم تركيزات ميليلتر. يتم ضبط مثل أن يتم إضافة 20 ميليلتر من كاشف لكل بئر. وهذا ما يضمن إضافة العوامل المساعدة وركائز لكل رد فعل جيدا قبل البدء الفحص السريع. - إعداد رد فعل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 220 مم المانيتول، السكروز 70 ملم، 1 عطا، و 20 ملم حبيس (درجة الحموضة 7.4 مع HCl).
ملاحظة: هذا يمكن أن تتغير تبعاً للخصائص الفيزيائية للإنزيمات المنقي مختلفة. - دراسة المنقي كجدهك أو بدك للتلوث باستخدام إنزيم نشاط فحوصات14،،من1617 أو إيمونوبلوت أو أخذ وصمة عار5.
- تحضير جميع المواد الكاشفة في المخزن المؤقت لرد الفعل وفقا للعامل وتركيزات الحل في الجدول 1.
- تخزين جميع المواد الكاشفة كمختبرين 1 مل في-20 درجة مئوية. تخزين بيروفات و α-كيتوجلوتاراتي في-80 درجة مئوية في مختبرين 100 ميليلتر لمنع تدهور العفوية بسبب السيارات الأكسدة وتجميد أذاب المتكررة.
- تحضير الكاشف أور الأسهم الرئيسية في 1 مل من [دمس] وتمييع ثم إلى 100 ميكرومتر في رد فعل المخزن المؤقت. مخزن محمية من الضوء.
ملاحظة: هنا، الحل العامل 100 ميكرومتر طازجة كل 2 إلى 3 أسابيع، ومحمية من الضوء.
3-إعداد القالب بالانزيم
- قم بإعداد إجراءات الفحص على قارئ ميكروسكوبية أحادية اللون مع قدرات القياس المزدوج.
- قم بتعريف الإجراء القراءة عن طريق تحديد "بروتوكول". ثم انقر فوق "إجراء".
- تعيين "درجة الحرارة" إلى 25 درجة مئوية (الشكل 1A).
- انقر فوق "بدء تشغيل الحركية" لتعيين شروط القراءة (الشكل 1A). تعيين الوقت وعدد فترات القراءة/التجارب.
- انقر فوق "قراءة" (الشكل 1B).
ملاحظة: يتم قراءة عينات من موقف الأعلى مع مكسب 50. الوقت: 5 دقائق، قراءة في فترات 30-s. قناة 1: ريسوروفين fluorescence-الإثارة/الانبعاثات = 565 nm:600 نانومتر، الطول الموجي عرض 13.5 نانومتر. قناة 2: NADH أوتوفلوريسسينسي-الإثارة/الانبعاثات = 376 nm:450 نانومتر، عرض 20 الطول الموجي نانومتر. - تحت "القراءة"، حدد آبار لمراقبة (مثلاً، A1-A4 و B1 B4).
- حدد "إنهاء الحركية".
4-معيار المنحنيات
- ذوبان الجليد في الكواشف وتخزينها على الجليد حتى حاجة.
-
NADH المنحنى المعياري (الشكل 2A)
- إعداد الحلول العامل ل NADH بتركيز يتراوح بين 0.5-10 مم في رد فعل المخزن المؤقت.
- إضافة 20 ميليلتر مختبرين من NADH كل العمل تركيز الحل إلى الآبار التي تحتوي على ميليلتر 180 رد فعل المخزن المؤقت. كذلك هو تركيز NADH النهائي في كل 0.05-1 ملم.
- انقر فوق "قراءة" وتعيين الإثارة/الانبعاثات = 376 nm:450 نانومتر، عرض 20 الطول الموجي نانومتر.
ملاحظة: هذا نقطة نهاية للقراءة فقط--معلمات الحركية غير مطلوبة.
-
أور المنحنى المعياري (الشكل 2)
- إعداد الأرصدة العامل من بيروكسيد الهيدروجين في رد فعل المخزن المؤقت؛ الأسهم تركيزات تتراوح بين 200-4,000 شمال البحر الأبيض المتوسط.
- إضافة 120 ميليلتر من رد فعل المخزن المؤقت لكل بئر.
- إضافة 20 ميليلتر من برنامج الصحة الإنجابية (العامل تركيز المخزون = 30 U/mL، التركيز النهائي في البئر = 3 U/mL)، 20 ميليلتر من الهيئة العامة للسدود (العامل تركيز المخزون = 250 U/mL، التركيز النهائي في البئر = 25 يو/مليلتر)، و 20 ميليلتر من أور (العامل تركيز المخزون = 100 ميكرومتر ، التركيز النهائي في البئر = 10 ميكرون) لكل المخزن المؤقت رد الفعل الذي يتضمن أيضا.
- إضافة 20 ميليلتر لكل2س ح2 يعمل حل الأسهم لكل جيد يحتوي على الكواشف المخزن المؤقت والمقايسة. حجم رد الفعل النهائي هو 200 ميليلتر وتركيز النهائي ح2س2 في كل بئر 20-400 نانومتر.
- احتضان لوحات لمدة 1 دقيقة في قارئ لوحة عند 25 درجة مئوية.
- انقر فوق "قراءة" وتعيين الإثارة/الانبعاثات = 565 نيوتن متر/600 نانومتر، الطول الموجي عرض 13.5 نانومتر. لاحظ أن هذه نقطة نهاية للقراءة فقط--معلمات الحركية غير مطلوبة.
5-قياس س2● /H2 يا2 الإفراج وإنتاج NADH كجدهك وبدك
- انظر الجدول 1 للنظام لإضافة الكواشف المختلفة، تركيز كل حل عملي، والحجم المضافة لكل بئر.
- إضافة 40 ميليلتر من رد فعل المخزن المؤقت لكل بئر. لفحوصات باستخدام كمف أو مؤشر أسعار المستهلك-613، إضافة 20 ميليلتر من المخزن المؤقت لكل بئر.
- إضافة 20 ميليلتر من بدك أو كجدهك (الأسهم العامل 1 يو/مل، التركيز النهائي للبئر الواحد = 0.1 U/mL) لكل بئر.
- احتضان بدك وكجدهك عند 25 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- إضافة 20 ميليلتر من كمف (الأسهم العامل = 100 مم، تركيز النهائية = 10 ملم) أو 20 ميليلتر من مؤشر أسعار المستهلك-613 (العامل تركيز المخزون = 1.5 ملم، التركيز النهائي = 150 ميكرون) (الجدول 2).
ملاحظة: يمكن استبعاد هذه الخطوة إذا لم تستخدم مثبطات لفحوصات. - احتضان لمدة 1 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن استبعاد هذه الخطوة إذا لم تستخدم مثبطات لفحوصات. - إضافة 20 ميليلتر من برنامج الصحة الإنجابية (العامل تركيز المخزون = 30 وحدة/مل، التركيز النهائي في البئر = 3 وحدات/مل) و 20 ميليلتر من الهيئة العامة للسدود (العامل تركيز المخزون = 250 وحدة/مل، التركيز النهائي في البئر = 25 وحدة/مل) لكل بئر.
- إضافة 20 ميليلتر لأنزيم (العامل تركيز المخزون = 1 مم، التركيز النهائي = مم 0.1)، 20 ميليلتر لبرنامج النقاط التجارية (العامل تركيز المخزون = 3 مم، التركيز النهائي = 0.3 مم)، و 20 ميليلتر لند+ (يعمل تركيز المخزون = 10 مم، التركيز النهائي = 1 مم) لكل ث خبرني.
- إزالة الكاشف أور من تغطية واقية ورق ألمونيوم وإضافة 20 ميليلتر لكل بئر.
- إضافة 20 ميليلتر من بيروفات (العامل المخزون تركيز تتراوح بين 1-100 مم، التركيز النهائي لفحوصات = مم 0.1-10) إلى الآبار التي تحتوي على بدك و α-كيتوجلوتاراتي (العامل المخزون تركيز تتراوح بين 1-100 مم، التركيز النهائي لفحوصات = 0.1-10 مم) إلى الآبار التي تحتوي على كجدهك.
- انقر فوق "قراءة" لبدء القياس الحركية.
6-بيانات التحليل
- اضغط باستمرار على زر 'CTRL' على لوحة المفاتيح وانقر فوق الآبار لإنشاء رسم بياني واحد يحتوي على جميع القياسات الحركية المقابلة للقناة 1 (الشكل 3A).
- انقر فوق "بيانات" في طريقة عرض الرمز في الركن الأيمن العلوي للقيم الخام للأسفار النسبية وحدات (رفو) تقاس في نقاط زمنية مختلفة (الشكل 3B).
- تصدير القيم للتحليل (الجدول 3).
- انقر فوق "الرسم البياني" المنسدلة القائمة في أعلى اليمين (الشكل 3B) الوصول إلى قيم رفو المرتبطة بقناة الأسفار 2.
- كرر الخطوات من 6، 1 إلى 6.3 للقناة الثانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوفر الشكل 3A تتبع ممثل رفو جمعتها كجدهك المنقي أثناء أخذ القياس المتزامن حاء2يا2 والإنتاج NADH. ويرد في الشكل 3Bرفو البيانات الخام لكل الفاصل الزمني. ثم يتم تصدير البيانات رفو الأولية للتحليل. باستقراء من المنحنيات القياسية المعروضة في الشكل 2، يمكن تحديد المبلغ المطلق من NADH و H2O2 شكلت في كل فاصل زمني للقياس على مدى فترة 5-دقيقة. ويرد مثال على هذا الحساب في الجدول 3. مجرد المبلغ من NADH و H2O2 يتكون من كجدهك أو بدك على فترات مختلفة قد حددت، نسخ القيم وإدخال في برنامج الرسوم البيانية/الإحصائية لمزيد من التحليل. باستخدام تحليل نوع الرسم البياني XY، يمكن رسم مبلغ NADH (µmol) وحاء2يا2 (بمول) يتكون من كجدهك أو بدك كدالة للزمن (الشكل 4 أ). يمكن أيضا حساب باستخدام هذه القيم، معدل2س2 تكوين NADH و H أثناء أكسدة الركازة. كما هو موضح في الشكل 4 باء، كجدهك وبدك بعرض خصائص مختلفة من حيث NADH و H2O2 تشكيل القدرة.
مرة واحدة وقد ثبت أن تنشط انزيماتيكالي كجدهك وبدك ويمكن تتبع تكوين2 2س NADH و H في نفس الوقت، روس الإفراج عن خصائص ويمكن قياس أنشطة الإنزيم. لقد اخترنا لمقارنة كجدهك وبدك نظراً لأنها هي الغاية مثلى في البنية الأساسية وقد تم توثيق مواقع عالية القدرة ل إنتاج روس5. الرقم 5 و الشكل 6 إثبات التبعية من NADH و H2O2 الإنتاج على تركيز الركازة. بدك مشبعة بسهولة بكميات قليلة من الركازة مع معدل إنتاج2 NADH و H2O بلوغ الحد الأقصى في 0.1-0.5 مم بيروفات. من ناحية أخرى، يعرض كجدهك، الزيادات الإضافية في NADH و H2O2 الإنتاج مع زيادة α-كيتوجلوتاراتي (الشكل 5). وهذا يدل على أن كجدهك وبدك، على الرغم من شدة مثلى في البنية الأساسية، لها الخصائص الحركية المختلفة من حيث كمية الركازة مطلوب للحث على إطلاق سراح روس القصوى. الشكل 5 كما يوضح أن حاء2يا2 الإفراج عن كجدهك يرتبط بقوة مع توافر الإنتاج والركيزة NADH. بدهك على الآخر ليس لديه نفس الخصائص الحركية. كجدهك وبدك كما تختلف من حيثNADH وس2●-/H2س2 تشكيل القدرات عندما يتنوع التركيز NAD+ (الشكل 6).
مع الاستفادة من قياس واحد من NADH و H2O2، يمكن أن يكون فحص مثبطات خاصة بالموقع المحتمل لإنتاج روس. وهذا يمكن أن يساعد في تحديد مقدار مثبط لما مطلوب للحث على تثبيط حاء2يا2 الإفراج القصوى. وبالإضافة إلى ذلك، عن طريق قياس الإنتاج NADH في نفس الوقت، يمكن تحديد الموقع لعمل مثبط، فضلا عن مصدر روس. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن التناظرية α-كيتوجلوتاراتي، كمف، وفعالة جداً في تثبيط روس الإفراج عن13،كجدهك (≥ 90% تثبيط)15. نحن أيضا أظهرت أن مؤشر أسعار المستهلك-613، حامض يبويتش تناظرية التي كتل ديهيدروليبواميدي فرعية2 ه من بدك وكجدهك، يمكن أن تمنع أيضا الإفراج عن روس من أي مجمع ب ~ 90%13،14. وترد في موقع العمل من أجل كمف ومؤشر أسعار المستهلك-613 في الشكل 7. CPI-613 كبريت التي تحتوي على جزيء وينصح بالتالي أن عوامل تخفيض الغنية ثيول (ديثيوثريتول؛ DTT) أو يتم حذف البروتين (الزلال) من الإجراء13. الشكل 7 يوضح أن كمف ومؤشر أسعار المستهلك-613 كانت فعالة للغاية في الحد من NADH و H2O2 قبل كجدهك على حد سواء. وبالمثل، ألغى CPI-613 تماما حاء2يا2 الإفراج عن بدك (الشكل 7). جماعياً، تثبت هذه النتائج أن كمف ومؤشر أسعار المستهلك-613 مثبطات فعالة للغاية للإصدار2 2س ح ويمكن تطبيقها ومن ثم إلى التجارب مع الميتوكوندريا المعزولة. شاشة من هذا القبيل سيكون مفيداً للغاية للأخرى المحتملة الإنزيمات المكونة لروس أنه يسمح لإجراء تقييم مباشر لفعالية والانتقائية لمثبطات مختلفة على تنقية dehydrogenases المحتوية على فلافين. وقد قياس متزامنة من NADH أيضا فائدة مضافة ليسمح بتحديد المصدر المحتمل لروس داخل إنزيم الأولية المعقدة. يوفر الشكل 7 تصوير إليه حفاز كجدهك، والغاية مثلى إلى بدك. الملاحظة أن كمف ومؤشر أسعار المستهلك-613، الذي حظر ه1 وه2 وحدة فرعية من كجدهك، ألغى تماما تقريبا حاء2يا2 والإنتاج NADH، يؤكد أن ه3 وحدة فرعية، يرجح أن البدعة، هو مصدر روس 18-مؤشر أسعار المستهلك-613 تمارس تأثير مماثل على بدك يؤكد أن الموقع مبدأ حاء2يا2 الإفراج عن وحدة فرعية3 ه18. يمكن استخدام نهج مماثل لأخرى ديهيدروجيناسيس. وهذا يتطلب تحديد الموانع التي تعوق تدفق الإلكترونات من خلال أجزاء مختلفة من إنزيم المعقدة.
الشكل 1 : لقطات الشاشة الممثل لإعداد المقايسة. (أ) تصوير للإجراءات التي تم إعدادها لقياس التغيرات الحركية في الأسفار NADH وريسوروفين. (ب) إعداد معلمات الأسفار المقايسة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الممثل المنحنيات القياسية للأسفار NADH وريسوروفين- وتستخدم لتقدير معدل NADH س2●-/H2س2 إنتاج والمنحنيات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : آثار الممثل رفو البيانات الخام التي تم جمعها خلال المقايسة. (أ) منحنيات لكل بئر التي تمت قراءتها أثناء المقايسة. لوحة عرض منحنيات تم إنشاؤها بواسطة الضغط باستمرار على زر CTL والنقر على كل بئر التي يتم للقراءة. (ب) لتصدير البيانات، يتم النقر فوق البيانات ضمن طريقة العرض لإنشاء جدول يحتوي على قيم رفو الممثل. ثم النقر فوق الزر تصدير جدول البيانات لتصدير النتائج الأولية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : المباشر مقارنة ح2 O 2 وتشكل معدلات NADH كجدهك وبدك. (A) قياس متزامنة ح2س2 و NADH تشكيل المحتملة كجدهك وبدك. (ب) حساب معدل ح2س2 وتكوين NADH كجدهك وبدهك. المقارنة المباشرة لإنتاج NADH وروس بكلا الإنزيمات المحتوية على فلافين يوضح أن كجدهك تنتج أكثر ح2س2 الذي يرتبط بقدرتها الانزيمية أعلى. n = 4، يعني ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : قياس واحد من ح 2 O 2 و NADH تشكيل معدلات كجدهك وبدك المؤكسدة تركيزات مختلفة من الركازة. تم قياس التغيرات في الأسفار كما هو موضح مسبقاً إلا إذا كان تركيز الركيزة النهائية وتراوحت 0 ملم إلى 10 ملم. تم استخدام هذا النهج للتحقق من تبعية ح2س2 الإفراج عن الخصائص الحركية كجدهك وبدك. n = 4، يعني ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : كجدهك وبدك أيضا عرض مختلف ح2 O 2 و NADH تشكيل خصائص عندما نادٍ + يتم تغيير المستويات. تم قياس التغيرات في الأسفار كما هو موضح مسبقاً إلا إذا كان يختلف التركيز النهائي لند+ من 0 ملم إلى 1 ملم. تم استخدام هذا النهج للتحقق من تبعية ح2س2 الإفراج عن الخصائص الحركية كجدهك وبدك. n = 4، يعني ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 : فحص مثبطات مختلفة خاصة بالموقع ل NADH و H2 O 2 الإنتاج. (أ) رسم تخطيطي يصور دورة الحفاز كجدهك والمواقع للعمل من أجل كمف ومؤشر أسعار المستهلك-613. لاحظ أن بدك دورة حفاز مثلى، إلا أنه لا تنافس كمف لموقع الربط بيروفات. E1: بيروفات أو α-كيتوجلوتاراتي نازعة، E2: ديهيدروليبواميدي أسيلترانسفيراسي، E3: نازعة ديهيدروليبواميدي. تأثير كمف (ب) ومؤشر أسعار المستهلك-6132س2 إنتاج NADH و H كجدهك وبدك. كانت بريينكوباتيد عينات في كمف (10 مم) أو مؤشر أسعار المستهلك-613 (150 ميكرون) وثم جزيئي لإنتاج2 2س NADH و H. n = 4، يعني ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| كاشف | تركيز عمل الأسهم | إضافة إلى وحدة التخزين | التركيز النهائي بشكل جيد |
| كجدهك أو بدك | 1 وحدة/مل | 20 ميليلتر | 0.1 وحدة/مل |
| فائق أكسيد الفاءق | 250 وحدة/مل | 20 ميليلتر | 25 وحدة/مل |
| الفجل البيروكسيديز | 30 وحدة/مل | 20 ميليلتر | 3 وحدات/mL |
| بيروفوسفات الثيامين | 3 مم | 20 ميليلتر | 0.3 مم |
| إنزيم | 1 مم | 20 ميليلتر | 0.1 مم |
| NAD+ | 10 ملم | 20 ميليلتر | 1 مم |
| 10-أسيتيل-3.7-ديهيدروكسيفينوكسازيني | 100 ميكرومتر | 20 ميليلتر | 10 ميكرومتر |
| الركيزة | 1-100 مم | 20 ميليلتر | 0.1-10 مم |
الجدول 1: مثال لوضع بروتوكول الأساسية تم إعدادها لقياس س 2 ●– /H 2 O 2 وإنتاج NADH بتنقية PDH أو كجده- منذ يتم إضافة 20 ميليلتر لكل كاشف لكل بئر والنهائية حجم/رد فعل 200 ميليلتر، التركيز النهائي لكل كاشف أقل بعشرة إضعاف من تركيز المخزون (مثلاً، تركيز NAD+ النهائية في الخليط رد فعل 1 مم ). لاحظ أنه ينبغي إضافة الكواشف للبئر بالترتيب الوارد في الجدول.
| مثبط | الهدف |
| 3-الميثيل-2-أوكسو حمض فاليريك | هاء-1 وحدة فرعية من كجدهك |
| CPI-613 | هاء-2 وحدة فرعية من أوكسو حمض ديهيدروجيناسيس |
الجدول 2: قائمة مثبطات وأهدافها- ويرد أيضا في الشكل 8مواقع العمل.
| أوتوفلوريسسينسي NADH | |||||||||
| بدك | كجدهك | ||||||||
| الوقت | ° تي 376,450 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:04 | 24.4 | 99 | 99 | 91 | 88 | 85 | 82 | 58 | 88 |
| 0:00:34 | 24.4 | 128 | 107 | 99 | 108 | 81 | 80 | 77 | 78 |
| 0:01:04 | 24.4 | 124 | 128 | 117 | 139 | 97 | 88 | 97 | 76 |
| 0:01:34 | 24.4 | 146 | 142 | 129 | 132 | 91 | 97 | 84 | 78 |
| 0:02:04 | 24.4 | 161 | 153 | 148 | 146 | 90 | 107 | 95 | 88 |
| 0:02:34 | 24.4 | 171 | 160 | 156 | 145 | 97 | 103 | 111 | 122 |
| 0:03:04 | 24.4 | 176 | 176 | 161 | 169 | 109 | 120 | 99 | 116 |
| 0:03:34 | 24.4 | 186 | 180 | 179 | 167 | 118 | 123 | 121 | 119 |
| 0:04:04 | 24.4 | 201 | 182 | 187 | 183 | 127 | 124 | 119 | 131 |
| 0:04:34 | 24.4 | 225 | 190 | 195 | 186 | 136 | 143 | 124 | 132 |
| 0:05:04 | 24.4 | 227 | 227 | 203 | 197 | 115 | 143 | 121 | 143 |
| ومضان ريسوروفين | |||||||||
| بدك | كجدهك | ||||||||
| الوقت | ° تي 565,600 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:00 | 24.4 | 204 | 178 | 169 | 152 | 148 | 113 | 107 | 90 |
| 0:00:30 | 24.4 | 224 | 188 | 167 | 152 | 144 | 116 | 124 | 112 |
| 0:01:00 | 24.4 | 212 | 186 | 178 | 161 | 153 | 114 | 122 | 120 |
| 0:01:30 | 24.4 | 212 | 188 | 165 | 164 | 160 | 132 | 127 | 116 |
| 0:02:00 | 24.4 | 222 | 203 | 190 | 169 | 154 | 128 | 133 | 127 |
| 0:02:30 | 24.4 | 217 | 198 | 193 | 179 | 165 | 129 | 147 | 130 |
| 0:03:00 | 24.4 | 223 | 218 | 202 | 179 | 183 | 142 | 145 | 137 |
| 0:03:30 | 24.4 | 239 | 223 | 208 | 188 | 179 | 150 | 155 | 148 |
| 0:04:00 | 24.4 | 236 | 219 | 202 | 183 | 180 | 163 | 156 | 153 |
| 0:04:30 | 24.4 | 249 | 220 | 214 | 177 | 199 | 149 | 150 | 167 |
| 0:05:00 | 24.4 | 251 | 232 | 225 | 196 | 211 | 170 | 169 | 161 |
الجدول 3: جدول البيانات نظراً للنتائج التي تم جمعها من مجموعة التجارب- يتم تصدير قيم رفو الخام المتولدة من التجربة إلى جدول لمزيد من التحليل. استخدام المنحنيات القياسية التي تم إنشاؤها قبل التجريب، يمكن حساب معدل إنتاج2 2س NADH و H في جدول البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول مفيد منذ، 1) فإنه يلغي أي ردود الفعل المتضاربة التي قد تتداخل مع الكشف عن ح2س2 (مثلاً، والنظم المضادة للأكسدة أو مصادر أخرى لروس)، وإلا 2) يقدم تقييما مباشرا لمعدل أصلي إطلاق سراح روس من نازعة المتقدرية المحتوية على فلافين، مع 3) يسمح المقارنة بين الأم روس الإفراج عن معدلات اثنين أو أكثر تنقية المستندة إلى فلافين dehydrogenases, 4) يمكن أن تسمح بإجراء مقارنة مباشرة لمعدل النشاط الصحفي وإنزيم روس، و 5) يسمح فحص مثبطات انتقائية تنافسية للإفراج عن روس. مجموعتنا وغيرها قد استخدمت هذا الأسلوب في المنشورات السابقة لدراسة تنظيم روس قبل اللوستيريك والأكسدة والاختزال مما يشير إلى الآليات قبل إجراء التجارب مع الميتوكوندريا أو العضلات بيرميبيليزيد14،، من16 17،،من1920.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:
يستخدم هذا الإجراء المعدات الأساسية المتوفرة في كل مؤسسة. هذا النهج هو أيضا منخفض التكلفة ويستخدم المواد الكيميائية الشائعة المتوفرة من خلال مختلف الموردين. وقد يختلف تكوين المخزن المؤقت وفقا لخصائص الإنزيم-على الرغم من ذلك، نجد أن رد فعل أساسي المخزن مؤقت المكونة من السكروز وحبيس، المانيتول، وعطا يعمل جيدا في معظم التطبيقات. القيم الأولية للأسفار ريسوروفين وعادة ما تكون حوالي 50-500 رفو لروس الإفراج عن إنزيم المخفف إلى 0.1 يو/مليلتر. قد يشير إلى قيم رفو أعلى الكاشف أور قد تتأكسد السيارات بسبب التعرض للضوء أو تجميد أذاب المتكررة. ولذلك، أور عمل الحلول بشكل روتيني يستعاض عن كل 2 إلى 3 أسابيع (اعتماداً على تواتر الاستخدام). يمكن أن تؤدي الشوائب في تحضير الإنزيم أو تمسخ إلى أقل من العادي قراءات روس و NADH. وينبغي رصد نقاوة الإنزيم بشكل روتيني بالتفريد هلام. الخصائص الحركية (كم و Vmax للركيزة وند+) وينبغي أيضا تقييم فورا بعد الشراء أو تنقية إنزيم وثم بشكل روتيني رصد بعد ذلك. معظم الكواشف المستخدمة في المقايسة مستقرة ويمكن أن تخضع لدورات تجميد أذاب متعددة. يجب تخزين بيروفات و α-كيتوجلوتاراتي في مختبرين من 100 ميليلتر في-80 درجة مئوية لتجنب الأكسدة التلقائية. تجنب استخدام وكلاء الحد مثل DTT نظراً لأنها تشكلس2●-/H2س2 مباشرة من خلال تشكيل جذرية في بدك وكجدهك (ويحتمل أن تكون أخرى فلافونزيميس)17. يمكن إجراء فحوصات على 37 درجة مئوية؛ ومع ذلك، وجدت مجموعتنا أن إجراء هذه التجارب عند 25 درجة مئوية ومثالي لتوفير بيانات أكثر اتساقا.
القيود المفروضة على هذه التقنية:
واحد العقبة الرئيسية المرتبطة بهذا الأسلوب هو الوصول إلى تنقية الإنزيمات المتقدرية المحتوية على فلافين. هنا، استخدمنا المتاحة تجارياً كجدهك وبدك لإثبات أنه يمكن استخدام هذه التقنية مباشرة مقارنة روس الإفراج عن القدرات وإنزيم نشاط المحتوية على فلافين dehydrogenases الميتوكوندريا. إلا أن روس معظم إنتاج الإنزيمات المحتوية على فلافين غير متوفرة تجارياً ويجب تنقية في المختبر. وهذا يمكن أن يكون تحديا النظر في بعض هذه الإنزيمات هي الغشاء ملزمة أو استيعاب للغشاء الداخلي المتقدرية. بروتوكولات جديدة لتنقية ناجحة لربط الغشاء المحتوية على فلافين الإنزيمات التي تنتج روس متوفرة الآن. وهذا يشمل أساليب تنقية للمجمع الأول والثاني المعقدة و التعطيل-الجلسرين-3-الفوسفات نازعة21،،من2223. ولذلك، على الرغم من أن معظم المولدات روس المذكورة قد لا تكون متوفرة تجارياً، وجود بروتوكولات لعزل وتنقية. أهمية النتائج التي تم جمعها باستخدام تنقية الإنزيمات على أساس فلافين الفسيولوجية قيد أيضا. ولذلك، ينبغي متابعة النتائج التي تم جمعها مع الإنزيمات المنقي مع فحوصات باستخدام الميتوكوندريا المعزولة أو الأنسجة بيرميبيليزيد. خمس دراسات منفصلة تستخدم هذا النهج للتحقيق وآليات التنظيم للإفراج عن روس كجدهك وبدك14،،من1617،،من1920. أولى النتائج للدور تبديلات الأكسدة والاختزال في السيطرة على الإفراج عن روس في البداية تم اختباره باستخدام المنقي كجدهك وبدك ومن ثم تم تحليل آليات التنظيم كذلك في الكبد والقلب الميتوكوندريا والألياف العضلية14، 16،،من1720.
أهمية فيما يتعلق بالأساليب القائمة:
قياس روس الإفراج عن المواقع الفردية من الإنتاج في الميتوكوندريا يمكن أن تكون صعبة بسبب وجود ردود فعل الجانب المتنافسة التي تنتج أيضا س2●-/H2س2 المضادة للأكسدة النظم والتي يمكن أن تؤدي إلى خلاف ذلك تقدير المعدلات الأصلية. غشاء المحتملة يمكن أن يغير أيضا معدلات إطلاق سراح روس من مواقع مختلفة ويمكن أن يغير استعمال مثبطات تدفق الإلكترون، الخلط2س●-/H2س2 تشكيل القياسات. الطريقة المعروضة هنا يسمح التقييم المباشر لقدرات إطلاق سراح روس من الإنزيمات الفردية أثناء تقييم العلاقة بين معدلات الأم س2●-/H2س2 إنزيم النشاط وفي نفس الوقت. هذا الأسلوب غير مكلفة يمكن أن تخدم كأداة لمقارنة معدلات إطلاق سراح روس الأصلية الفردية الإنزيمات المتقدرية المحتوية على فلافين قبل إجراء تجارب أكثر تطورا مع الميتوكوندريا أو الخلايا أو الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تستخدم هذه الطريقة المعروضة هنا للفحص المسبق لفعالية والانتقائية لمثبطات للإفراج عن روس قبل إجراء فحوصات مع الميتوكوندريا المعزولة.
التطبيقات المستقبلية:
وقد استخدمت الأسلوب المقدمة في هذه الوثيقة في خمس دراسات مستقلة تهدف إلى التحقيق في السيطرة على الإفراج عن روس من بدك وكجدهك14،،من1617،،من1920. في هذه الدراسات، تم فحص مثبطات والإفراج عن روس وقيمت NADH ينتج معدلات استخدام الإنزيمات المنقي. النتائج التي تم جمعها مع الإنزيمات المنقي والتحقق منها ثم استخدام الميتوكوندريا المعزولة وبيرميبيليزيد ألياف العضلات14،16،،من1720. ولذلك، يمكن تطبيق هذا الأسلوب بعدد من الدراسات المستقبلية التي تهدف إلى دراسة معدلات إطلاق سراح روس الأصلية من الميتوكوندريا، والخلايا، وألياف العضلات.
خطوات حاسمة في البروتوكول:
وينبغي رصد إنزيم النقاء وخصائصه الحركية بشكل روتيني. يجب استبدال أور يعمل كاشف الأسهم كثيرا أيضا. وهذا سيكفل تتسق النتائج التي تم جمعها. لإضافة الكواشف أمر حيوي لتشغيل تجربة ناجحة (الجدول 1). وينبغي أن تيتراتيد مثبطات لتحديد التركيز المطلوب للحصول على تثبيط الحد الأقصى من إطلاق سراح روس. في هذه الدراسة، اخترنا 10 ملم كمف و 150 ميكرومتر CPI-613 نظراً لأننا قد قررت سابقا أن هذه التركيزات الحث على تثبيط القصوى للإفراج عن روس ب كجدهك وبدك13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا يوجد شيء للكشف عنها.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من العلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة). إنتاج الفيديو أجريت بالتعاون مع مركز الابتكار في التدريس والتعلم (المعاملات) في "جامعة ميموريال في نيوفاوندلاند".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
- Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
- Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).
- Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
- Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
- Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
- Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
- O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
- Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
- Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
- Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
- Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
- Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
- Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
- Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).
