Summary
Mitokondrier indeholder flere flavin-afhængige enzymer, der kan producere reaktive ilt arter (ROS). Overvågning af ROS er udgivelse fra individuelle websteder i mitokondrier udfordrende på grund af uønskede side reaktioner. Vi præsenterer en nem og billig metode til direkte vurdering af indfødte satser for ROS udgivelse ved hjælp af renset flavoenzymes og mikrotiterplade fluorometry.
Abstract
Det er blevet rapporteret, at mitokondrier kan indeholde op til 12 enzymatisk kilder af reaktive ilt arter (ROS). Et flertal af disse websteder omfatter flavin-afhængige respiratorisk komplekser og dehydrogenases, der producerer en blanding af superoxid (O2● -) og hydrogenperoxid (H2O2). Nøjagtig kvantificering af individuelle websteder i isolerede mitochondrier ROS-producerende potentiale kan blive udfordrende på grund af tilstedeværelsen af antioxidant forsvarssystemer og side reaktioner, som også danner O2● -h2O2. Brug af uspecifikke inhibitorer, der kan forstyrre mitokondrie bioenergetik kan også svække målinger ved at ændre ROS udgivelse fra andre steder i produktionen. Her præsenterer vi en nem metode til samtidig måling af H2O2 release og nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH) produktion af renset flavin-knyttet dehydrogenases. For vores formål her, har vi brugt renset pyruvat dehydrogenase komplekset (PDHC) og α-ketoglutarat dehydrogenase kompleks (KGDHC) af svin hjerte oprindelse som eksempler. Denne metode giver mulighed for en nøjagtig måling af indfødte H2O2 release satser af enkelte steder i produktionen ved at eliminere andre potentielle kilder til ROS og antioxidant systemer. Desuden, denne metode giver mulighed for en direkte sammenligning af forholdet mellem H2O2 release og enzymaktivitet og screening af effektiviteten og selektivitet af inhibitorer for ROS produktion. Samlet set kan denne tilgang for dybdegående vurdering af indfødte satser af ROS udgivelse for enkelte enzymer før gennemføre mere avancerede eksperimenter med isolerede mitochondrier eller permeabilized muskelfiber.
Introduction
Det ultimative mål af næringsstoffer stofskifte er at gøre adenosin trifosfat (ATP). I pattedyrceller sker dette i mitokondrierne, dobbelt-membraned organeller, at omforme energien gemt i kulstof i ATP. Produktionen af ATP starter da kulstof er forbrændt af mitokondrier danner to elektron luftfartsselskaber, NADH og flavin-adenin-dinucleotid (FADH2)1. NADH og FADH2 derefter oxideres af multi subunit respiratorisk komplekser I og II, henholdsvis, og de frigjorte elektroner er færget til terminal elektron acceptor Molekylær ilt (O2) på komplekse IV1. Termodynamisk gunstig "downhill" overførsel af elektroner til O2 i slutningen af kæden er koblet til eksport af protoner ind i intermembrane plads ved komplekser I, III og IV. Dette skaber en transmembrane elektrokemiske gradient af protoner (proton-motor), en midlertidig form for Gibbs fri energi, der er tappet ved komplekse V at gøre ATP2. Elektron overførsel reaktioner i mitokondrier er ikke helt koblet til ATP produktion. På forskellige punkter i Krebs cyklus og respiratoriske kæden, kan elektroner tidligt interagere med O2 til form ROS3. De mest biologisk relevante ROS genereret af mitokondrier er O2●- og H2O2. Selvom O2● - betragtes ofte den proksimale ROS dannet af mitokondrier, er det nu indlysende, at websteder af produktionen danner en blanding af O2●- og H2O2, som er forbundet med den frie radikale kemi af flavin proteser grupper4,5. På højt niveau, kan ROS blive farlige, skadelige biologiske bestanddele kræves for cellefunktion resulterer i oxidative nød6. Dog på lavt beløb opfylde mitokondrie ROS vitale signaling funktioner. For eksempel, har H2O2 udgivelse fra mitokondrier været impliceret i styring af T-celle aktivering, stress signalering (fx, induktion af Nrf2 signaling veje), induktion af celleproliferation og differentiering, insulin signalering og frigivelse, og fodring adfærd7. Har gjort betydelige fremskridt i forståelsen af funktionen signalering af ROS. Imidlertid vigtigt spørgsmål er stadig som enzymer i mitokondrierne tjene som de vigtigste kilder og hvordan produktion er kontrolleret.
ROS udgivelse af et websted produktion afhænger af flere faktorer: 1) koncentrationen af elektron donere site, 2) elektron donere site, 3) adgang til ilt, og 4) den koncentration redox tilstand og type af oxidation substrat3, 8 , 9. i mitokondrierne, andre faktorer som koncentrationen af NADH og membran potentielle styrke også påvirke ROS produktion8,10. For eksempel, stiger satsen for O2● -h2O2 produktion af renset PDHC eller KGDHC med stigende NADH tilgængelighed5,11. I dette scenario, elektroner flyde baglæns fra NADH til byens FAD i E3 subunit af PDHC eller KGDHC, stedet for O2● -h2O2 produktion12. Tilsvarende har bestemmelse af NAD+ den modsatte effekt, faldende ROS udgivelse fra KGDHC12. Således kan kontrollerende indpassage eller udpassage af elektroner fra websteder af ROS produktion ændre, hvor meget O2● -h2O2 er dannet. For eksempel, blokerer E2 subunit af PDHC eller KGDHC med CPI-613, en analog, resulterer i en næsten 90% fald i O2● -h2O2 produktion13lipoinsyre. Lignende resultater kan opnås med kemiske S-glutathionylation katalysatorer, diamide og disulfiram, som næsten afskaffer O2● -h2O2 produktion af PDHC eller KGDHC via konjugation af glutathion til E 2 subunit14. Trade-off for at blokere elektron flow gennem E2 subunit af PDHC og KGDHC er et fald i NADH produktion, som mindsker ROS dannelsen af elektron transportkæden (f.eks.komplekse III). Dette kan også mindske ATP produktion af elektron transportkæden. Samlet set kan blokering elektron adgang til websteder af ROS produktion være et yderst effektivt middel til at kontrollere O2● -h2O2 produktion.
Mitokondrier kan indeholde op til 12 potentielle O2● -h2O2 kilder6. De fleste af disse websteder er flavin-holdige enzymer, som skaber en blanding af O2●- og H2O2. Brug af forskellige substrat og inhibitor kombinationer har tilladt for identifikation som respiratorisk komplekser og mitokondriel dehydrogenases tjene som høj kapacitet O2● -h2O2 danner websteder i forskellige væv3. PDHC og KGDHC har vist sig at fungere som høj kapacitet O2● -h2O2 udsender websteder i muskel og lever mitokondrier13,15. Dog stadig nogle vanskeligheder med hensyn til behandlingen af O2● -h2O2 udgør potentielle af individuelle websteder i mitokondrierne og indvirkningen, som forskellige substrat og inhibitor kombinationer har på aktiviteterne i enzymerne. Dette på grund af tilstedeværelsen af uønskede side reaktioner (fx, dannelsen af O2● -h2O2 af sites end enzym af interesse), kontaminerende endogene næringsstoffer (f.eks.fedtsyrer syrer) eller organeller (f.eks., peroxisomer, som også danner O2● -h2O2), og brugen af hæmmere, der mangler selektivitet, og/eller anvendelse af stoffer, der ikke fuldt hæmmer ROS produktion. Visse hæmmere kan også ændre mitokondrie bioenergetik og elektron flowretningen, og dette ændrer ROS udgivelse fra andre steder i produktionen og tilintetgør resultater. Absolut satserne for O2● -h2O2 -udgivelsen fra individuelle websteder i mitokondrier er også vanskeligt at kvantificere på grund af den høje koncentration af O2●- og H2O2 at fjerne enzymer i matrix og intermembrane pladsen. Derfor, fjernelse af eventuelle konkurrerende reaktioner, der kan forstyrre O2● -h2O2 release målinger kan være nyttige, når du identificerer høj kapacitet O2●-h2O2 danner websteder.
Her præsenterer vi en simpel metode, der giver mulighed for den samtidige undersøgelse af O2● -h2O2 produktion og NADH dannelsen af renset flavin-afhængige dehydrogenases. Ved hjælp af renset enzymer, uønskede ROS danner side reaktioner og ROS nedværdigende enzymer kan elimineres giver mulighed for en mere nøjagtig måling af indfødte O2●h2O2 produktion af satserne for individuelle flavoenzymes. Denne metode kan bruges til at direkte sammenligne O2● -h2O2 danner kapacitet af forskellige renset dehydrogenases eller at skærmen potentielle lokationsspecifikke hæmmere for O2●-h2O 2 udgivelse. Endelig kan måling O2● -h2O2 og NADH produktion samtidigt tillade en real-time vurdering af forholdet mellem enzymaktivitet og ROS udgivelse kapacitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kemikalier og renset enzymer
- Skaffe følgende materialer: PDHC og KGDHC af svin hjerte oprindelse (eller en anden renset mitokondrie flavoenzyme); H2O2 (30% opløsning), pyruvat, α-ketoglutarat, NAD+, NADH, CoASH, thiamin pyrofosfat (TPP), mannitol, HEPES, saccharose, EGTA, 3-methyl-2-oxo valeric syre (KMV), superoxiddismutase (SOD), peberrodsperoxidase (HRP), 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine reagens (AUR), og CPI-613.
2. planlægning af analysen og reagens
- Opsætning af analysen i henhold til tabel 1 i en 96-brønd plade.
Bemærk: Den samlede mængde for hver reaktion er 200 µL. Stock koncentrationer er justeret således at 20 µL af reagens er tilføjet til hver brønd. Dette sikrer hurtig tilsætning af cofaktorer og substrater til hver reaktion godt før du starter analysen. - Forberede reaktion buffer indeholdende 220 mM mannitol, 70 mM saccharose, 1 mM EGTA og 20 mM HEPES (pH 7,4 med HCl).
Bemærk: Dette kunne ændre sig afhængigt af de fysiske egenskaber af forskellige renset enzymer. - Undersøge den renset KGDHC eller PDHC for kontaminering ved hjælp af enzym aktivitet assays14,16,17 eller ved immunblot eller Coomassie pletten5.
- Forberede alle reagenser i reaktion buffer pr arbejde løsning koncentrationer i tabel 1.
- Gemme alle reagenser som 1 mL alikvoter ved-20 ° C. Butik pyruvat og α-ketoglutarat ved-80 ° C i 100 µL delprøver at forhindre spontan nedbrydning som følge af auto-oxidation og gentagne fryse-tø.
- Forberede AUR reagens master lager i 1 mL af DMSO og derefter fortyndes til 100 µM i reaktion buffer. Opbevares beskyttet mod lys.
Bemærk: Her, den 100 µM brugsopløsning er lavet frisk hver 2-3 uger og beskyttet mod lys.
3. opsætning af skabelonen Assay
- Oprette analyseprocedure på en monokromatisk mikrotiterplade læser hos dobbelt måling kapaciteter.
- Definere læsning procedure ved at vælge "Protokollen". Klik derefter på "PROCEDURE".
- Indstil "Temperatur" til 25 ° C (figur 1A).
- Klik på "START KINETIC" for at indstille Læs betingelser (figur 1A). Indstille tid og antal Læs intervaller/eksperimenter.
- Klik på "Læs" (figur 1B).
Bemærk: Prøver læses fra øverste position med en gevinst på 50. Tid: 5 min, læse på 30-s intervaller. Kanal 1: Resorufin fluorescens - excitation/emission = 565 nm:600 nm, bølgelængde bredde 13,5 nm. Kanal 2: NADH autofluorescence - excitation/emission = 376 nm:450 nm, bølgelængde bredde af 20 nm. - Under "Læs", skal du vælge brønde til skærm (fxA1-A4 og B1-B4).
- Vælg "END KINETIC".
4. standard kurver
- Optø reagenserne og opbevares på is, indtil det skal bruges.
-
NADH standardkurven (figur 2A)
- Forberede arbejde løsninger til NADH i området koncentration på 0,5-10 mM i reaktion buffer.
- Tilføj 20 µL delprøver fra hver NADH arbejder opløsningens koncentration brønde indeholdende 180 µL reaktion buffer. Den endelige koncentration af NADH i hver godt er 0,05-1 mM.
- Klik på "Læs" og Angiv excitation/emission = 376 nm:450 nm, bølgelængde bredde af 20 nm.
Bemærk: Dette er et slutpunkt read-only - kinetiske parametre er ikke påkrævet.
-
AUR standardkurven (figur 2B)
- Forberede arbejder bestande af hydrogenperoxid i reaktion buffer; Stock koncentrationer spænder fra 200-4.000 nM.
- Tilsæt 120 µL af reaktion bufferen til hver brønd.
- Tilføj 20 µL af HRP (arbejder stock koncentration = 30 U/mL, endelige koncentration i brønden = 3 U/mL), 20 µL af SOD (arbejder stock koncentration = 250 U/mL, endelige koncentration i brønden = 25 U/mL), og 20 µL af AUR (arbejder stock koncentration = 100 µM endelige koncentration i brønden = 10 µM) til hver godt indeholdende reaktion buffer.
- Tilføj 20 µL af hver H2O2 arbejder stamopløsning til hver godt indeholder buffer og assay reagenser. Den endelige reaktion volumen er 200 µL og den endelige koncentrationen af H2O2 i hver brønd er 20-400 nM.
- Inkuber plader til 1 min i pladelæseren ved 25 ° C.
- Klik på "Læs" og Angiv excitation/emission = 565 nm/600 nm bølgelængde bredde 13,5 nm. Bemærk at dette er et slutpunkt read-only - kinetiske parametre er ikke påkrævet.
5. måling af O2● - h2 O2 Release og NADH produktion af KGDHC og PDHC
- Se tabel 1 for rækkefølgen af tilføjelsen af de forskellige reagenser, koncentrationen af hver brugsopløsning og volumen tilføjet til hver brønd.
- Tilføje 40 µL af reaktion buffer til hver brønd. For assays bruger KMV eller CPI-613, tilføje 20 µL af buffer til hver brønd.
- Tilføj 20 µL af PDHC eller KGDHC (arbejder status over 1 U/mL, slutkoncentration pr. brønd = 0,1 U/mL) til hver brønd.
- Inkubér PDHC og KGDHC ved 25 ° C i 2 min.
- Tilføje 20 µL af KMV (arbejdende lager = 100 mM, slutkoncentration = 10 mM) eller 20 µL af CPI-613 (arbejder stock koncentration = 1,5 mM, slutkoncentration = 150 µM) (tabel 2).
Bemærk: Dette trin kan udelukkes, hvis hæmmere ikke anvendes til assays. - Inkuber i 1 minut ved 25 ° C.
Bemærk: Dette trin kan udelukkes, hvis hæmmere ikke anvendes til assays. - Tilføj 20 µL af HRP (arbejder stock koncentration = 30 enheder/mL, endelige koncentration i brønden = 3 enheder/mL) og 20 µL af SOD (arbejder stock koncentration = 250 enheder/mL, endelige koncentration i brønden = 25 enheder/mL) til hver brønd.
- Tilføje 20 µL af coenzym A (arbejder stock koncentration = 1 mM, slutkoncentration = 0.1 mM), 20 µL af TPP (arbejder stock koncentration = 3 mM, slutkoncentration = 0,3 mM), og 20 µL af NAD+ (arbejder stock koncentration = 10 mM, slutkoncentration = 1 mM) til hver w ell.
- Fjerne AUR reagenset fra beskyttende stanniol dækker og tilføje 20 µL til hver brønd.
- Tilføj 20 µL af pyruvat (arbejder stock koncentration spænder fra 1-100 mM, endelige koncentration for assays = 0,1-10 mM) brønde, der indeholder PDHC og α-ketoglutarat (arbejder stock koncentration spænder fra 1-100 mM, endelige koncentration for assays = 0,1-10 mM) til brønde, der indeholder KGDHC.
- Klik på "Læs" at starte kinetic måling.
6. dataanalyse
- Hold 'CTRL'-knappen på tastaturet nede og klik på wells for at generere en graf der indeholder alle kinetic målinger svarende til kanal 1 (figur 3A).
- Klik på "data" i view-ikonet i øverste højre hjørne for rå værdier for relativ fluorescens enheder (RFU) målt på de forskellige tidspunkter (figur 3B).
- Eksportere værdier for analyse (tabel 3).
- Klik på "Graf" drop down menuen øverst til højre (figur 3B) for at få adgang til RFU værdier forbundet med fluorescens kanal 2.
- Gentag trin 6.1 til 6.3 for kanal 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3A giver et repræsentativt spor for RFU indsamlet under samtidig måling af H2O2 og NADH produktion af renset KGDHC. De rå RFU data for hvert tidsinterval er afbildet i figur 3B. De rå RFU data eksporteres derefter til analyse. Ved at ekstrapolere fra standard kurver i figur 2, kan den absolutte beløb for NADH og H2O2 dannet ved hver måling interval perioden 5-min bestemmes. Et eksempel på denne beregning er fastsat i tabel 3. Når mængden af NADH og H2O2 dannet af KGDHC eller PDHC med de forskellige intervaller er blevet fastlagt, værdier kopieres og indtastet i en graftegning/statistisk software for yderligere analyse. Anvendelse af XY graf-type analyse, kan mængden af NADH (µmol) og H2O2 (pmol) dannet af KGDHC eller PDHC afbildes som funktion af tiden (figur 4A). Ved hjælp af disse værdier, kan satsen for NADH og H2O2 dannelse under substrat oxidation også beregnes. Som vist i figur 4B, vise KGDHC og PDHC forskellige karakteristika med hensyn til NADH og H2O2 danner kapacitet.
Det har en gang fastslået, at KGDHC og PDHC er enzymatisk aktive og NADH og H2O2 dannelse kan spores samtidigt, ROS frigive egenskaber og enzym aktiviteter kan måles. Vi valgte at sammenligne KGDHC og PDHC, da de er yderst homologe i grundlæggende struktur og har dokumenteret for at være høj kapacitet websteder for ROS produktion5. Figur 5 og figur 6 viser afhængighed af NADH og H2O2 produktion på substratkoncentrationen. PDHC er let mættet med lavt beløb af substratet med satsen for NADH og H2O2 produktion nåede sit maksimum på 0,1-0,5 mM pyruvat. KGDHC, på den anden side viser mindre stigninger i NADH og H2O2 produktion med stigende α-ketoglutarat (figur 5). Dette viser, at KGDHC og PDHC, selv om meget homologe i grundlæggende struktur, har forskellige kinetiske egenskaber med hensyn til hvor meget substrat er nødvendig for at fremkalde maksimal ROS udgivelse. Figur 5 viser også, at H2O2 udgivelse fra KGDHC korrelerer stærkt med NADH produktion og substrat tilgængelighed. PDHC på den anden har ikke de samme kinetiske egenskaber. KGDHC og PDHC også er forskellige med hensyn til NADH og O2● -h2O2 danner kapacitet når NAD+ koncentration er varieret (figur 6).
Ved at tage fordel af den samtidige målinger af NADH og H2O2, kan potentielle lokationsspecifikke hæmmere for ROS produktion screenes. Dette kan hjælpe med at bestemme mængden af hæmmer, der er nødvendig for at fremkalde maksimal hæmning af H2O2 release. Derudover ved at måle NADH produktion på samme tid, kan webstedet for hæmmer handling såvel som kilde til ROS identificeres. Tidligere undersøgelser har vist, at α-ketoglutarat analog, KMV, er meget effektiv til at hæmme ROS udgivelse fra KGDHC (≥ 90% hæmning)13,15. Vi viste også, at CPI-613, en lipoinsyre analog der blokerer dihydrolipoamide af E2 subunit af PDHC og KGDHC, også kan hæmme ROS udgivelse fra enten kompleks af ~ 90%13,14. Webstedet for KMV og CPI-613 er vist i figur 7. CPI-613 er en svovl som indeholder molekyle og det anbefales derfor at thiol-rige reduktionsmiddel (dithiothreitol; DTT) eller proteiner (albumin) er udeladt fra procedure13. Figur 7 viser, at både KMV og CPI-613 var begge yderst effektivt at begrænse både NADH og H2O2 af KGDHC. Ligeledes afskaffet CPI-613 helt H2O2 udgivelse fra PDHC (figur 7). Kollektivt, viser disse resultater, at KMV og CPI-613 er yderst effektiv hæmmere for H2O2 release og kan således anvendes til eksperimenter med isolerede mitochondrier. Sådan en skærm ville være meget gavnlige for andre potentielle ROS-danner enzymer, da det giver mulighed for en direkte vurdering af effektiviteten og af forskellige hæmmere på renset flavin-holdige dehydrogenases selektivitet. Samtidig måling af NADH har også den ekstra fordel af at tillade den indledende identifikation af den potentielle kilde til ROS inden for et enzym kompleks. Figur 7 indeholder en skildring af den katalytiske mekanisme for KGDHC, som er yderst homologe til PDHC. Observation, KMV og CPI-613, som blokerer E1 og E2 subunit af KGDHC, næsten helt afskaffet både H2O2 og NADH produktion, bekræfter, at E3 subunit, sandsynligvis FAD, ROS-kilde 18. CPI-613 udøvede en lignende virkning på PDHC bekræfter, at webstedet princippet for H2O2 release er E3 subunit18. En lignende fremgangsmåde kan bruges til andre dehydrogenases. Dette ville kræve identifikation af hæmmere, der blokerer elektron flow gennem forskellige dele af et enzym kompleks.
Figur 1 : Repræsentant skærmbilleder for assay setup. (A) skildring af proceduren angivet til kinetic måling af ændringer i NADH og resorufin fluorescens. (B) oprettelse af fluorescens parametre for analysen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentant standard kurver til NADH og resorufin fluorescens. Kurver er udnyttet til at estimere antallet af NADH og O2● -h2O2 produktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Repræsentant spor til den rå RFU data indsamlet under analysen. (A) kurver til hver brønd, der blev læst under analysen. Pladen se kurver genereres ved at holde knappen nede over Tillidscertifikater og klikke på hver brønd, der bliver læst. (B) For dataeksport, DATA er klikket under visning til at oprette en tabel, der indeholder de repræsentative RFU værdier. Der derefter klikkes på knappen regneark eksport for at eksportere de rå resultater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Direkte sammenligning af H2 O 2 og NADH-dannende satser for KGDHC og PDHC. (A) samtidig måling af H2O2 og NADH danner potentielle KGDHC og PDHC. (B) Beregning af sats af H2O2 og NADH dannelse af KGDHC og PDHC. Direkte sammenligning af NADH og ROS produktion af både flavin-holdige enzymer viser, at KGDHC producerer mere H2O2 , som er relateret til dets højere enzymatisk kapacitet. n = 4, mener ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Samtidig måling af H 2 O 2 og NADH danner satser for KGDHC og PDHC oxiderende forskellige substrat koncentrationer. Ændringer i fluorescens blev målt som tidligere beskrevet, bortset fra den endelige substratkoncentrationen var varierede fra 0 mM til 10 mM. Denne metode blev brugt til at fastslå afhængighed af H2O2 udgivelse på de kinetiske egenskaber af KGDHC og PDHC. n = 4, mener ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : KGDHC og PDHC også vise forskellige H2 O 2 og NADH danner egenskaber når NAD + niveauer ændres. Ændringer i fluorescens blev målt som tidligere beskrevet, bortset fra den endelige koncentration af NAD+ blev varieret fra 0 mM til 1 mM. Denne metode blev brugt til at fastslå afhængighed af H2O2 udgivelse på de kinetiske egenskaber af KGDHC og PDHC. n = 4, mener ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Screening af forskellige lokationsspecifikke hæmmere for NADH og H2 O 2 produktion. (A) Diagram skildrer den katalytiske cyklus for KGDHC og websteder for KMV og CPI-613. Bemærk, at PDHC har en homolog katalytisk cyklus, bortset fra at KMV ikke konkurrerer til pyruvat bindingssted. E1: pyruvat eller α-ketoglutarat dehydrogenase, E2: dihydrolipoamide acyltransferase, E3: dihydrolipoamide dehydrogenase. (B) virkning af KMV og CPI-613 på NADH og H2O2 produktion af KGDHC og PDHC. Prøver var forinkubereret i KMV (10 mM) eller CPI-613 (150 µM) og derefter analyseres for NADH og H2O2 produktion. n = 4, mener ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | Arbejder stock koncentration | Volumen tilføjet til et godt | Endelige koncentration i godt |
| KGDHC eller PDHC | 1 enhed/mL | 20 ΜL | 0,1 enheder/mL |
| Superoxiddismutase | 250 enheder/mL | 20 ΜL | 25 enheder/mL |
| Peberrodsperoxidase | 30 enheder/mL | 20 ΜL | 3 enheder/mL |
| Thiamin pyrofosfat | 3 mM | 20 ΜL | 0,3 mM |
| Coenzym A | 1 mM | 20 ΜL | 0,1 mM |
| NAD+ | 10 mM | 20 ΜL | 1 mM |
| 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine | 100 ΜM | 20 ΜL | 10 ΜM |
| Substrat | 1-100 mM | 20 ΜL | 0,1-10 mM |
Tabel 1: Eksempel på et grundlæggende protokol, der er oprettet til måling af O 2 ●- H 2 O 2 og NADH produktion af renset PDH eller KGDH. Da 20 µL af hver reagens er føjet til hver brønd og endelige volumen/reaktion er 200 µL, den endelige koncentration af hver reagens er 10-fold mindre end den bestand koncentration (f.eks.den endelige koncentration af NAD+ i reaktionsblandingen er 1 mM ). Bemærk, at reagenser skal føjes til godt i den rækkefølge, der er præsenteret i tabellen.
| Hæmmer | Target |
| 3-methyl-2-oxo valeric syre | E1 subunit af KGDHC |
| CPI-613 | E2 underenhed af oxo syre dehydrogenases |
Tabel 2: liste over deres mål og hæmmere. Lokaliteter af handling er også afbildet i figur 8.
| NADH autofluorescence | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Tid | T ° 376,450 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:04 | 24.4 | 99 | 99 | 91 | 88 | 85 | 82 | 58 | 88 |
| 0:00:34 | 24.4 | 128 | 107 | 99 | 108 | 81 | 80 | 77 | 78 |
| 0:01:04 | 24.4 | 124 | 128 | 117 | 139 | 97 | 88 | 97 | 76 |
| 0:01:34 | 24.4 | 146 | 142 | 129 | 132 | 91 | 97 | 84 | 78 |
| 0:02:04 | 24.4 | 161 | 153 | 148 | 146 | 90 | 107 | 95 | 88 |
| 0:02:34 | 24.4 | 171 | 160 | 156 | 145 | 97 | 103 | 111 | 122 |
| 0:03:04 | 24.4 | 176 | 176 | 161 | 169 | 109 | 120 | 99 | 116 |
| 0:03:34 | 24.4 | 186 | 180 | 179 | 167 | 118 | 123 | 121 | 119 |
| 0:04:04 | 24.4 | 201 | 182 | 187 | 183 | 127 | 124 | 119 | 131 |
| 0:04:34 | 24.4 | 225 | 190 | 195 | 186 | 136 | 143 | 124 | 132 |
| 0:05:04 | 24.4 | 227 | 227 | 203 | 197 | 115 | 143 | 121 | 143 |
| Resorufin fluorescens | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Tid | T ° 565,600 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:00 | 24.4 | 204 | 178 | 169 | 152 | 148 | 113 | 107 | 90 |
| 0:00:30 | 24.4 | 224 | 188 | 167 | 152 | 144 | 116 | 124 | 112 |
| 0:01:00 | 24.4 | 212 | 186 | 178 | 161 | 153 | 114 | 122 | 120 |
| 0:01:30 | 24.4 | 212 | 188 | 165 | 164 | 160 | 132 | 127 | 116 |
| 0:02:00 | 24.4 | 222 | 203 | 190 | 169 | 154 | 128 | 133 | 127 |
| 0:02:30 | 24.4 | 217 | 198 | 193 | 179 | 165 | 129 | 147 | 130 |
| 0:03:00 | 24.4 | 223 | 218 | 202 | 179 | 183 | 142 | 145 | 137 |
| 0:03:30 | 24.4 | 239 | 223 | 208 | 188 | 179 | 150 | 155 | 148 |
| 0:04:00 | 24.4 | 236 | 219 | 202 | 183 | 180 | 163 | 156 | 153 |
| 0:04:30 | 24.4 | 249 | 220 | 214 | 177 | 199 | 149 | 150 | 167 |
| 0:05:00 | 24.4 | 251 | 232 | 225 | 196 | 211 | 170 | 169 | 161 |
Tabel 3: regnearksvisning resultater indsamlet fra sæt af eksperimenter. Rå RFU værdier genereret fra eksperimentet eksporteres til et regneark for yderligere analyse. Ved hjælp af standard kurver genereret før eksperimenter, kan satsen for NADH og H2O2 produktion beregnes i regnearket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol er fordelagtige siden, 1) det eliminerer eventuelle konkurrerende reaktioner, der måske ellers forstyrre H2O2 påvisning (fx, antioxidant systemer eller andre kilder til ROS), 2) giver en direkte vurdering af de indfødte i ROS frigivelse af en flavin-holdige mitokondrie dehydrogenase, 3) giver mulighed for sammenligning af indfødte ROS frigive satser af to eller flere renset flavin-baseret dehydrogenases, 4) kan give mulighed for en direkte sammenligning af antallet af ROS udgivelse og enzym aktivitet og 5) kan screening af selektiv kompetitive inhibitorer for ROS udgivelse. Vores gruppe og andre har brugt denne metode i tidligere publikationer til at undersøge regulering af ROS af allosteriske og redox signalering mekanismer inden gennemføre eksperimenter med mitokondrier eller permeabilized muskel14,16, 17,19,20.
Ændringer og fejlfinding:
Denne procedure bruger grundlæggende udstyr til rådighed på næsten hver institution. Metoden er også lave omkostninger og bruger almindelige kemikalier tilgængelige gennem forskellige leverandører. Buffer sammensætning kan variere alt efter enzym egenskaber - selvom vi har konstateret, at en grundlæggende reaktion buffer bestående af saccharose, HEPES, mannitol og EGTA virker godt i de fleste programmer. Rå værdier for resorufin Fluorescens er typisk omkring 50-500 RFU for en ROS, frigiver enzymet fortyndet til 0,1 U/mL. Højere RFU værdier kan indikere AUR reagenset er blevet auto-oxideret på grund af udsættelse for lys eller gentagne fryse-tø. Derfor bør AUR arbejder løsninger rutinemæssigt erstattes hver 2-3 uger (afhængig af frekvensen af brug). Urenheder i enzympræparat eller denaturering kan føre til lavere end normal ROS og NADH aflæsninger. Enzym renhed bør rutinemæssigt overvåges af gelelektroforese. Kinetiske egenskaber (Km og Vmax for substrat og NAD+) bør også vurderes umiddelbart efter købet eller rensning af et enzym og derefter rutinemæssigt overvåges derefter. De fleste af de reagenser, der anvendes i analysen er stabile og kan blive udsat for flere fryse-tø cykler. Pyruvat og α-ketoglutarat skal opbevares i delprøver på 100 µL på-80 ° C for at undgå auto-oxidation. Undgå at bruge reduktionsmiddel som DTT, da det danner O2● -h2O2 direkte gennem radikale dannelse i PDHC og KGDHC (og potentielt andre flavoenzymes)17. Assays kan gennemføres ved 37 ° C; vores gruppe fandt imidlertid, at gennemføre disse eksperimenter ved 25 ° C er ideel til at give mere konsistente data.
Begrænsninger af teknikken:
En stor hurdle forbundet med denne teknik er adgang til renset flavin-holdige mitokondrie enzymer. Her, brugt vi kommercielt tilgængelige KGDHC og PDHC til at vise, at denne teknik kan bruges til at direkte sammenligne ROS udgivelse kapacitet og enzym aktivitet af flavin-holdige mitokondrie dehydrogenases. Men de fleste ROS producerende flavin-holdige enzymer er ikke kommercielt tilgængelige og skal renses i laboratoriet. Dette kan være en udfordring i betragtning af nogle af disse enzymer er membran bundet eller absorbere til mitokondriets indre membran. Nye protokoller for en vellykket rensning af membran-bundet flavin, der indeholder enzymer, der producerer ROS er nu tilgængelige. Dette omfatter rensning metoder for kompleks I, komplekse II og sn-glycerol-3-fosfat dehydrogenase21,22,23. Derfor, selv om de fleste af de børsnoterede ROS generatorer ikke kan være kommercielt tilgængelige, protokoller findes for deres isolation og rensning. Fysiologiske relevansen af de resultater, der er indsamlet ved hjælp af renset flavin-baserede enzymer er også en begrænsning. Resultater indsamlet med renset enzymer bør derfor følges op med assays ved hjælp af isolerede mitochondrier eller permeabilized væv. Fem særskilte undersøgelser brugt denne fremgangsmåde til at undersøge mekanismer til regulering af ROS udgivelse af KGDHC og PDHC14,16,17,19,20. Foreløbige resultater for rollen af redox switches i kontrollerende ROS udgivelse blev i første omgang testet ved hjælp af renset KGDHC og PDHC, og derefter mekanismer til forordning blev yderligere analyseret i lever og hjerte mitokondrier og muskel fiber14, 16,17,20.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder:
Måling af ROS kan udgivelse fra individuelle websteder af produktion i mitokondrier være udfordrende på grund af tilstedeværelsen af konkurrerende side reaktioner, der også producerer O2● -h2O2 og antioxidant systemer, som ellers kan føre til undervurderingen af indfødte priser. Membran potentiale kan også ændre ROS udgivelse satser fra forskellige steder og brug af hæmmere kan ændre elektron flow, confounding O2● -h2O2 dannelse målinger. Metoden præsenteres her tillader direkte vurdering af ROS udgivelse kapacitet fra enkelte enzymer mens samtidig vurdere forholdet mellem indfødte satserne for O2● -h2O2 og enzym aktivitet. Denne billig metode kan tjene som et redskab til at sammenligne de indfødte ROS udgivelse priser for individuelle flavin-holdige mitokondrie enzymer før gennemføre mere avancerede eksperimenter med mitokondrier, celler eller væv. Derudover kan metoden præsenteres heri udnyttes til at pre-skærm effektivitet og selektivitet af inhibitorer for ROS udgivelse inden udførelse assays med isolerede mitochondrier.
Fremtidige ansøgninger:
Den metode, der præsenteres heri er blevet brugt i fem separate undersøgelser med henblik på at undersøge kontrol over ROS udgivelse fra PDHC og KGDHC14,16,17,19,20. I disse undersøgelser, hæmmere blev screenet og ROS frigive og NADH producerer priser blev evalueret ved hjælp af renset enzymer. Resultater indsamlet med enzymer, renset blev derefter efterprøvet ved hjælp af isolerede mitochondrier og permeabilized muskelfibre14,16,17,20. Derfor, denne metode kan anvendes til en række fremtidige undersøgelser med henblik på at studere indfødte ROS udgivelse priser fra mitokondrierne, celler og muskelfibre.
Kritiske trin i protokollen:
Enzym renhed og dets kinetiske egenskaber bør overvåges rutinemæssigt. Den AUR arbejder stock reagens skal også erstattes ofte. Dette vil sikre resultater indsamlet er konsekvent. Rækkefølgen for tilsætning af reagenser er afgørende for at køre en vellykket eksperiment (tabel 1). Hæmmere bør titreres til at bestemme den koncentration, der kræves til at fremkalde maksimal hæmning af ROS udgivelse. I denne undersøgelse, vi valgte 10 mM KMV og 150 µM CPI-613 da vi havde tidligere besluttet, at disse koncentrationer fremkalde maksimal hæmning af ROS udgivelse af KGDHC og PDHC13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er intet at videregive.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Natural Sciences and Engineering Research Rådet i Canada (NSERC). Video produktion blev gennemført i samarbejde med Center for Innovation inden for undervisning og læring (uafhængige Transaktionsjournal) ved Memorial Universitet af Newfoundland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
- Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
- Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).
- Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
- Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
- Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
- Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
- O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
- Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
- Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
- Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
- Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
- Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
- Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
- Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).
