Summary
I mitocondri contengono parecchi enzimi flavina-dipendenti in grado di produrre le specie reattive dell'ossigeno (ROS). Monitoraggio ROS rilascio dai singoli siti nei mitocondri è difficile a causa di reazioni collaterali indesiderate. Presentiamo un metodo semplice e poco costoso per valutazione diretta delle tariffe native per rilascio ROS mediante flavoenzymes purificata e micropiastre fluorometria.
Abstract
È stato segnalato che i mitocondri possono contenere fino a 12 sorgenti enzimatiche di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Una maggioranza di questi siti sono dipendenti da flavina complessi respiratori e deidrogenasi che producono una miscela di superossido (O2● -) e perossido di idrogeno (H2O2). Quantificazione accurata del potenziale produzione di ROS di singoli siti in mitocondri isolati può essere difficile a causa della presenza di sistemi di difesa antiossidanti e reazioni secondarie che formano anche O2●-/ h2O2. Uso di inibitori non specifici che possono interferire con bioenergetica mitocondriale può anche compromettere misure alterando rilascio ROS da altri siti di produzione. Qui, presentiamo un metodo semplice per la misura simultanea di nicotinamide adenindinucleotide (NADH) produzione e rilascio di H2O2 da purificato legata flavina deidrogenasi. Per i nostri scopi qui, abbiamo usato complesso di purificato piruvato deidrogenasi (PDHC) e α-chetoglutarato deidrogenasi complessa (KGDHC) di origine porcina cuore come esempi. Questo metodo consente una misurazione accurata del nativo H2O2 tariffe rilascio di singoli siti di produzione eliminando altri potenziali fonti di sistemi ROS e antiossidante. Inoltre, questo metodo consente un confronto diretto del rapporto tra rilascio di H2O2 e l'attività enzimatica e la proiezione dell'efficacia e la selettività degli inibitori per la produzione di ROS. Nel complesso, questo approccio può consentire la valutazione approfondita dei nativi tassi di rilascio ROS per singoli enzimi prima conducendo esperimenti più sofisticati con mitocondri isolati o permeabilized della fibra di muscolo.
Introduction
L'obiettivo finale del metabolismo dei nutrienti è di rendere l'adenosina trifosfato (ATP). In cellule di mammifero, ciò si verifica nei mitocondri, organelli a membrana doppia che convertono l'energia immagazzinata in carbonio in ATP. Quando il carbone viene bruciato dai mitocondri formando due trasportatori di elettroni, NADH e flavina adenina dinucleotide (FADH2)1inizia la produzione di ATP. NADH e FADH2 sono quindi ossidato da complessi respiratori multi-unità secondaria I e II, rispettivamente, e gli elettroni liberati sono traghettati al terminale dell'elettrone accettore molecolare ossigeno (O2) al complesso IV1. Il thermodinamicamente favorevole "in discesa" trasferimento di elettroni a O2 all'estremità della catena è accoppiato all'esportazione di protoni nel intermembrane spazio dai complessi I, III e IV. Questo crea un gradiente elettrochimico transmembrana di protoni (Forza Protonomotrice), una forma temporanea di energia libera di Gibbs che è sfruttato da V complessa fare ATP2. Reazioni di trasferimento di elettroni nei mitocondri non sono perfettamente accoppiate alla produzione di ATP. In vari punti del ciclo di Krebs e catena respiratoria, elettroni prematuramente possono interagire con O2 al modulo ROS3. Il più biologicamente rilevante ROS generato dai mitocondri è O2● - e H2O2. Anche se O2● - è spesso considerato il ROS prossimale formato dai mitocondri, è ora evidente che siti di produzione formano una miscela di O2● - e H2O2, che è associato con il libero radicale chimica di flavin protesica dei gruppi4,5. Ad alti livelli, il ROS può essere pericoloso, danneggiando costituenti biologici necessari per la funzione delle cellule con conseguente stress ossidativo6. Tuttavia, a basse quantità, ROS mitocondriale soddisfare funzioni vitali di segnalazione. Per esempio, rilascio di H2O2 dai mitocondri è stata implicata nel controllo di attivazione delle cellule T, sforzo segnalazione (ad es., induzione delle vie di segnalazione Nrf2), l'induzione della proliferazione e differenziazione, segnalazione dell'insulina e rilascio e alimentazione comportamento7. Notevoli progressi nella comprensione della funzione di segnalazione di ROS. Tuttavia, importanti domande rimangono ancora rispetto alla quale gli enzimi nei mitocondri servono come le fonti più importanti e come produzione è controllata.
Rilascio ROS da un sito di produzione dipende da diversi fattori: 1) la concentrazione di donare l'elettrone del sito, 2) lo stato redox del sito donare elettroni, 3) accesso ad ossigeno e 4) la concentrazione e il tipo di substrato di ossidazione3, 8 , 9. nei mitocondri, altri fattori come la concentrazione di forza potenziale di membrana e NADH inoltre influenzare ROS produzione8,10. Ad esempio, il tasso di O2●-/ h2O2 produzione di purificato PDHC o KGDHC aumenta con crescente NADH disponibilità5,11. In questo scenario, gli elettroni scorrono all'indietro dal NADH al centro FAD nella subunità E3 di PDHC o KGDHC, il sito per O2●-/ h2O2 produzione12. Allo stesso modo, la fornitura di NAD+ ha l'effetto opposto, diminuire il rilascio ROS da KGDHC12. Così, controllo entrata o uscita di elettroni dai siti di produzione di ROS può alterare quanto O2●-/ h2O2 è formata. Per esempio, bloccando la subunità di2 E di PDHC o KGDHC con CPI-613, un analogico, risulta in un quasi il 90% diminuzione O2●-/ h2O2 produzione13l'acido lipoico. Risultati simili possono essere ottenuti con la chimica S-glutationilazione catalizzatori, diammide e disulfiram, che quasi abolire O2●-/ h2O2 produzione di PDHC o KGDHC tramite la coniugazione del glutatione e 2 subunità14. Il trade-off per bloccare il flusso di elettroni attraverso la subunità di2 E di PDHC e KGDHC è una diminuzione nella produzione di NADH che diminuisce la formazione di ROS dalla catena di trasporto dell'elettrone (per esempio, complesso III). Questo può anche diminuire ATP uscita dalla catena di trasporto degli elettroni. Nel complesso, bloccando l'entrata di elettroni ai siti di produzione di ROS può essere un mezzo molto efficace di controllare O2●-/ h2O2 produzione.
I mitocondri possono contenere fino a 12 potenziali O2●-/ h2O2 fonti6. Flavin-contenente la maggior parte di questi siti sono enzimi che generano una miscela di O2● - e H2O2. Uso di qualsiasi tipologia di substrato e combinazioni di inibitore hanno permesso l'identificazione di cui complessi respiratori e deidrogenasi mitocondriale servono come ad alta capacità O2●-/ h2O2 formando siti in diversi tessuti3. PDHC e KGDHC sono stati indicati per servire come ad alta capacità O2●-/ h2O2 siti che emettono in muscolo e mitocondri del fegato13,15. Restano tuttavia alcune difficoltà per quanto riguarda l'esame dell'O2●-/ h2O2 di singoli siti nei mitocondri e l'impatto che qualsiasi tipologia di substrato e combinazioni di inibitore hanno il potenziale di formazione l'attività degli enzimi. Questo è dovuto alla presenza di reazioni collaterali indesiderate (ad es., la formazione di O2●-/ h2O2 da siti diversi dall'enzima di interesse), contaminando endogene nutrienti (ad es.,grassi acidi) o organelli (ad es., peroxisomes che formano anche O2●-/ h2O2) e l'uso di inibitori che la mancanza di selettività e all'impiego di composti che completamente non inibiscono la produzione di ROS. Alcuni inibitori possono anche alterare la bioenergetica mitocondriale e la direzione di flusso dell'elettrone, e questo altera il rilascio ROS da altri siti di produzione e confonde i risultati. Tariffe di assoluta per O2●/h2O2 rilascio dai singoli siti in mitocondri sono anche difficili da quantificare dovuta all'alta concentrazione di O2● - e H2O2 eliminando gli enzimi nello spazio matrice e intermembrane. Pertanto, eliminazione di eventuali reazioni concorrenti che possono interferire con O2●-/ h2O2 rilascio misure può essere utile quando si identificano ad alta capacità O2●-/ h2O2 formando siti.
Qui, presentiamo un metodo semplice che permette l'esame simultaneo di O2●-/ h2O2 produzione e formazione di NADH di purificato dipendenti da flavina deidrogenasi. Utilizzando enzimi purificati, ROS formando reazioni collaterali indesiderate e ROS enzimi degradativi può essere eliminato consentendo una misura più accurata della nativa O2●-/ h2O2 tassi di produzione per singoli flavoenzymes. Questo metodo può essere utilizzato per confrontare direttamente l'O2●-/ h2O2 formando la capacità di diversi deidrogenasi purificati o per potenziali inibitori site-specific schermo per O2●-/ h2O versione 2 . Infine, misura O2●-/ h2O2 e la produzione di NADH contemporaneamente può consentire una valutazione in tempo reale della relazione tra l'attività dell'enzima e la capacità di rilascio ROS.
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Protocol
1. i prodotti chimici ed enzimi purificati
- Procurarsi i seguenti materiali: PDHC e KGDHC di origine porcina cuore (o un altro flavoenzyme mitocondriale purificato); H2O2 (soluzione al 30%), piruvato, α-chetoglutarato, NAD+, NADH, CoASH, pirofosfato della tiamina (TPP), saccarosio mannitolo, HEPES, EGTA, acido valerianico 3-metil-2-oxo (KMV), superossido dismutasi (SOD), perossidasi di rafano (HRP), 10-acetile-3,7-dihydroxyphenoxazine reagente (AUR) e CPI-613.
2. pianificazione delle analisi e preparazione dei reagenti
- Impostare il dosaggio secondo la tabella 1 in una piastra a 96 pozzetti.
Nota: Il volume totale per ogni reazione è 200 µ l. concentrazioni di Stock sono in modo tale che 20 µ l di reagente viene aggiunto ad ogni pozzetto. Questo assicura la rapida aggiunta di cofattori e substrati per ciascuna reazione ben prima di iniziare il dosaggio. - Preparare il tampone di reazione contenente mannitolo 220mm, saccarosio 70 mM, 1 mM EGTA e 20 mM HEPES (pH 7.4 con HCl).
Nota: Questo potrebbe cambiare a seconda delle proprietà fisiche di diversi enzimi purificati. - Esaminare il purificato KGDHC o PDHC per contaminazione utilizzando enzima attività saggi14,16,17 , o da immunoblot o Coomassie macchia5.
- Preparare tutti i reattivi nel buffer di reazione secondo le concentrazioni della soluzione di lavoro nella tabella 1.
- Conservare tutti i reagenti come aliquote di 1 mL a-20 ° C. Archivio piruvato e α-chetoglutarato a-80 ° C in aliquote di 100-µ l per evitare la degradazione spontanea a causa di auto-ossidazione e ripetuti di congelamento-scongelamento.
- Preparare il reagente AUR master stock in 1 mL di DMSO e diluire a 100 µM in tampone di reazione. Conservare al riparo dalla luce.
Nota: Qui, la soluzione di lavoro 100 µM è fatta fresca ogni 2-3 settimane e al riparo dalla luce.
3. impostazione del modello di analisi
- Impostare la routine di analisi su un lettore di micropiastre monocromatico con capacità doppia di misurazione.
- Definire la procedura di lettura selezionando "Protocollo". Fare clic su "PROCEDURE".
- Impostare "Temperatura" a 25 ° C (Figura 1A).
- Fare clic su "START KINETIC" per impostare condizioni di lettura (Figura 1A). Impostare l'ora e il numero di intervalli/esperimenti di lettura.
- Fare clic su "Leggi" (Figura 1B).
Nota: I campioni vengono lette dalla posizione superiore con un guadagno di 50. Tempo: 5 min, leggere a intervalli di 30 s. Canale 1: Fluorescenza Resorufina - eccitazione/emissione = 565 nm nm:600, larghezza di lunghezza d'onda di 13,5 nm. Canale 2: NADH autofluorescence - eccitazione/emissione = 376 nm:450 nm, larghezza di lunghezza d'onda di 20 nm. - Selezionare "READ", pozzi per monitor (ad esempio, A1-A4 e B1-B4).
- Selezionare "Fine cinetica".
4. standard curve
- Scongelare i reagenti e conservare il ghiaccio fino a quando necessario.
-
Curva standard di NADH (Figura 2A)
- Preparare le soluzioni di lavoro per NADH nella gamma di concentrazione di 0,5-10 mM di tampone di reazione.
- Aggiungere 20 aliquote µ l da ogni NADH lavorando la concentrazione della soluzione di pozzetti contenenti 180 µ l di tampone di reazione. La concentrazione finale del NADH in ogni bene è 0.05-1 mM.
- Fare clic su "Leggi" e impostare eccitazione/emissione = 376 nm:450 nm, larghezza di lunghezza d'onda di 20 nm.
Nota: Si tratta di un endpoint di sola lettura - i parametri cinetici non sono necessari.
-
Curva standard di AUR (Figura 2B)
- Preparare le scorte di lavoro di perossido di idrogeno in tampone di reazione; gamma di concentrazioni stock da 200-4.000 nM.
- Aggiungere 120 µ l di tampone di reazione ad ogni pozzetto.
- Aggiungere 20 µ l di HRP (concentrazione stock di lavoro = 30 U/mL, concentrazione finale nel pozzo = 3 U/mL), 20 µ l di SOD (concentrazione stock di lavoro = 250 U/mL, concentrazione finale nel pozzo = 25 U/mL) e 20 µ l di AUR (stock concentrazione di lavoro = 100 µM concentrazione finale nel pozzo = 10 µM) per ciascun bene contenente tampone di reazione.
- Aggiungere 20 µ l di ogni H2O2 soluzione di riserva a ciascuno contenente ben buffer e dosaggio reagenti di lavoro. Il volume di reazione finale è di 200 µ l e la concentrazione finale di H2O2 in ciascun pozzetto è 20-400 nM.
- Incubare le piastre per 1 min nel lettore della piastra a 25 ° C.
- Fare clic su "Leggi" e impostare eccitazione/emissione = 565 nm/600 nm, larghezza di lunghezza d'onda di 13,5 nm. Si noti che si tratta di un endpoint di sola lettura - i parametri cinetici non sono necessari.
5. misurazione O2●- / h2 O2 Release e produzione di NADH di KGDHC e PDHC
- Vedere la tabella 1 per l'ordine di aggiunta dei reagenti differenti, la concentrazione di ogni soluzione di lavoro e il volume aggiunto a ciascun pozzetto.
- Aggiungere 40 µ l di tampone di reazione ad ogni pozzetto. Per le analisi usando KMV o CPI-613, aggiungere 20 µ l di tampone in ciascun pozzetto.
- Aggiungere 20 µ l di PDHC o KGDHC (lavoro stock di 1 U/mL, concentrazione finale per pozzetto = 0,1 U/mL) ad ogni pozzetto.
- Incubare PDHC e KGDHC a 25 ° C per 2 min.
- Aggiungere 20 µ l di KMV (stock di lavoro = 100 mM, concentrazione finale = 10 mM) o 20 µ l di CPI-613 (concentrazione stock di lavoro = 1,5 mM, concentrazione finale = 150 µM) (tabella 2).
Nota: Questo passaggio può essere escluso se inibitori non vengono utilizzati per le analisi. - Incubare per 1 min a 25 ° C.
Nota: Questo passaggio può essere escluso se inibitori non vengono utilizzati per le analisi. - Aggiungere 20 µ l di HRP (concentrazione stock di lavoro = 30 unità/mL, concentrazione finale nel pozzo = 3 unità/mL) e 20 µ l di SOD (concentrazione stock di lavoro = 250 unità/mL, concentrazione finale nel pozzo = 25 unità/mL) ad ogni pozzetto.
- Aggiungere 20 µ l del coenzima A (concentrazione stock di lavoro = 1 mM, concentrazione finale = 0,1 mM), 20 µ l di TPP (stock concentrazione di lavoro = 3 mM, concentrazione finale = 0,3 mM) e 20 µ l di NAD+ (concentrazione stock di lavoro = 10 mM, concentrazione finale = 1 mM) per ogni w ell.
- Rimuovere il reagente AUR dal rivestimento di carta stagnola protettiva e aggiungere 20 µ l a ciascun pozzetto.
- Aggiungere 20 µ l di piruvato (concentrazione d'archivio che vanno da 1 a 100 mM, concentrazione finale per saggi di lavoro = 0,1-10 mM) per pozzetti contenenti PDHC e α-chetoglutarato (concentrazione d'archivio che vanno da 1 a 100 mM, concentrazione finale per saggi di lavoro = 0,1-10 mM) per pozzetti contenenti KGDHC.
- Clicca su "Leggi" per avviare la misurazione della cinetica.
6. analisi dei dati
- Tenere premuto il tasto 'CTRL' sulla tastiera e fare clic su pozzi per generare un grafico contenente tutte le misure cinetiche corrispondente al canale 1 (Figura 3A).
- Fare clic su "dati" nell'icona Visualizza in alto a destra per valori non elaborati per unità relativa fluorescenza (RFU) misurata a intervalli di tempo differenti (Figura 3B).
- Esportare i valori per l'analisi (tabella 3).
- Fare clic sul menu in alto a destra (Figura 3B) a discesa "Grafico" per accedere ai valori RFU associati al canale di fluorescenza 2.
- Ripetere i passaggi da 6.1 a 6.3 per il canale 2.
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Representative Results
Figura 3A fornisce una traccia rappresentativa per la RFU raccolta durante la misurazione simultanea di H2O2 e la produzione di NADH di KGDHC purificato. I dati grezzi RFU per ogni intervallo di tempo sono raffigurati nella Figura 3B. I dati grezzi RFU sono poi esportati per analisi. Estrapolando da curve standard presentate nella Figura 2, può essere determinato l'importo assoluto di NADH e H2O2 formata a ogni intervallo di misura durante il periodo di 5 min. Un esempio di questo calcolo è fornito nella tabella 3. Una volta che la quantità di NADH e H2O2 formata da KGDHC o PDHC intervalli differenti è stato determinato, i valori vengono copiati e inseriti in un software di grafica/statistica per ulteriori analisi. Utilizzando l'analisi del tipo di grafico XY, la quantità di NADH (µmol) e H2O2 (pmol) formata da KGDHC o PDHC possa essere tracciata in funzione del tempo (Figura 4A). Utilizzando questi valori, il tasso di NADH e H2O2 formazione durante l'ossidazione del substrato può anche essere calcolato. Come mostrato in Figura 4B, KGDHC e PDHC visualizzare caratteristiche diverse in termini di NADH e H2O2 formando funzionalità.
Una volta si accerti che KGDHC e PDHC sono enzimaticamente attivo e NADH e H2O2 formazione possa essere monitorata contemporaneamente, proprietà di rilascio di ROS e attività dell'enzima possono essere misurate. Abbiamo scelto di confrontare KGDHC e PDHC poiché sono altamente omologhi nella struttura di base e sono stati documentati per essere siti ad alta capacità per la produzione di ROS5. Figura 5 e Figura 6 dimostra la dipendenza di NADH e H2O2 produzione sulla concentrazione di substrato. PDHC facilmente è saturo di basse quantità di substrato con il tasso di NADH e H2O2 produzione raggiungendo il suo massimo a 0,1-0,5 piruvato mM. KGDHC, d'altra parte, Visualizza aumenti incrementali in NADH e H2O2 produzione con l'aumento di α-chetoglutarato (Figura 5). Questo dimostra che KGDHC e PDHC, sebbene altamente omologhi nella struttura di base, hanno differenti proprietà cinetiche in termini di quanto substrato è necessaria per indurre il massimo rilascio di ROS. Figura 5 dimostra inoltre che il rilascio di H2O2 da KGDHC correla fortemente con disponibilità di produzione e substrato di NADH. PDHC da altro non ha le stesse caratteristiche cinetiche. KGDHC e PDHC differiscono anche in termini diNADH e O2●-/ h2O2 capacità di formatura, quando la concentrazione di NAD+ è vario (Figura 6).
Sfruttando la misura simultanea di NADH e H2O2, potenziali inibitori site-specifici per la produzione di ROS possono essere proiettati. Questo può aiutare a determinare la quantità di inibitore che è necessaria per indurre l'inibizione massima di rilascio di H2O2 . Inoltre, misurando la produzione di NADH allo stesso tempo, il sito per azione di inibitore, nonché la fonte di ROS può essere identificato. Gli studi precedenti hanno indicato che l'analogo di α-chetoglutarato, KMV, è altamente efficace a inibizione del rilascio di ROS da KGDHC (≥ 90% inibizione)13,15. Abbiamo anche dimostrato che CPI-613, un acido lipoico analogico che blocca dihydrolipoamide della subunità2 E di PDHC e KGDHC, può anche inibire il rilascio ROS da entrambi complesso di ~ 90%13,14. Il sito d'azione per KMV e CPI-613 sono mostrati nella Figura 7. CPI-613 è uno zolfo che contiene la molecola e si consiglia pertanto che gli agenti riduttori di tiolo-ricchi (ditiotreitolo; DTT) o proteine (albumina) vengono omessi dalla procedura13. Nella figura 7 viene illustrato che sia KMV e CPI-613 erano entrambi altamente efficace a limitare sia NADH e H2O2 di KGDHC. Allo stesso modo, CPI-613 completamente abolito il rilascio di H2O2 da PDHC (Figura 7). Collettivamente, questi risultati dimostrano che KMV e CPI-613 sono altamente efficaci inibitori per rilascio di H2O2 e quindi può essere applicato agli esperimenti con mitocondri isolati. Un schermo sarebbe altamente benefico per altri potenziali enzimi che formano ROS poiché permette una valutazione diretta dell'efficacia e selettività di diversi inibitori su purificata contenente flavina deidrogenasi. La misura simultanea del NADH ha anche il vantaggio di permettere l'identificazione preliminare della potenziale fonte di ROS all'interno di un enzima complesso. Figura 7 fornisce una rappresentazione del meccanismo catalitico per KGDHC, che è altamente omologa alla PDHC. L'osservazione che KMV e CPI-613, che bloccano la E1 e subunità2 E di KGDHC, quasi completamente abolita sia H2O2 e la produzione di NADH, conferma che la subunità3 E, probabilmente la FAD, è la fonte ROS 18. CPI-613 ha esercitato un effetto simile su PDHC confermando che il sito di principio per rilascio di H2O2 è la subunità di3 E18. Un approccio simile può essere utilizzato per altre deidrogenasi. Ciò richiederebbe l'identificazione di inibitori che bloccano il flusso di elettroni attraverso diverse parti di un complesso enzimatico.
Figura 1 : Scatti di rappresentativo dello schermo per la configurazione di test. (A) rappresentazione della procedura messa a punto per la misurazione cinetica dei cambiamenti in fluorescenza di NADH e Resorufina. (B) impostazione dei parametri di fluorescenza per l'analisi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Rappresentante curve standard per fluorescenza NADH e Resorufina. Le curve sono utilizzate per stimare il tasso di NADH e O2●-/ h2O2 produzione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Tracce rappresentante i dati grezzi RFU raccolti durante il test. (A) curve per ogni bene che è stato letto durante il dosaggio. Piastra Vedi curve sono generate tenendo premuto il pulsante CTL e facendo clic su ciascun pozzetto che viene letto. (B) per l'esportazione di dati, dati sono cliccati sotto Vista per generare una tabella contenente i valori rappresentativi di RFU. Quindi si sceglie il pulsante di esportazione di foglio di calcolo per esportare i risultati grezzi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Confronto di H2 diretto O 2 e i tassi che formanti NADH di KGDHC e PDHC. (A) misura simultanea di H2O2 e NADH formando potenziali di KGDHC e PDHC. (B) Calcolo del tasso di formazione di NADH di KGDHC e PDHC e H2O2 . Confronto diretto della produzione di NADH e ROS di entrambi gli enzimi contenenti flavina dimostra che KGDHC produce più H2O2 , che è legato alla sua superiore capacità enzimatica. n = 4, media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Misura simultanea di H 2 O 2 e NADH formando tariffe di KGDHC e PDHC ossidanti concentrazioni di substrato differenti. Cambiamenti in fluorescenza sono stati misurati come descritto in precedenza, tranne la concentrazione di substrato finale era varia da 0 mM a 10 mM. Questo approccio è stato usato per accertare la dipendenza di rilascio di H2O2 su proprietà cinetiche di KGDHC e PDHC. n = 4, media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : KGDHC e PDHC anche visualizzare diversi H2 O 2 e NADH formando proprietà quando NAD + livelli sono cambiati. Cambiamenti in fluorescenza sono stati misurati come descritto in precedenza, tranne la concentrazione finale di NAD+ è stata variata da 0 mM a 1 mM. Questo approccio è stato usato per accertare la dipendenza di rilascio di H2O2 su proprietà cinetiche di KGDHC e PDHC. n = 4, media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 : Screening di diversi inibitori site-specifici per NADH e H2 O 2 produzione. (A) Diagramma raffigurante il ciclo catalitico per KGDHC e i siti d'azione per KMV e CPI-613. Notare che PDHC ha un ciclo catalitico omologo, tranne che KMV non competono per il sito di legame del piruvato. E1: piruvato o α-chetoglutarato deidrogenasi, E2: dihydrolipoamide aciltransferasi, E3: deidrogenasi di dihydrolipoamide. (B) effetto di KMV e CPI-613 il NADH e H2O2 produzione di KGDHC e PDHC. I campioni sono stati preincubati in KMV (10 mM) o CPI-613 (150 µM) e poi analizzati per NADH e H2O2 produzione. n = 4, media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Reagente | Concentrazione d'archivio di lavoro | Volume aggiunto a bene | Concentrazione finale nel pozzo |
| KGDHC o PDHC | 1 unità/mL | 20 Μ l | 0,1 unità/mL |
| Superossido dismutasi | 250 unità/mL | 20 Μ l | 25 unità/mL |
| Perossidasi di rafano | 30 unità/mL | 20 Μ l | 3 unità/mL |
| Tiamina pirofosfato | 3 mM | 20 Μ l | 0,3 mM |
| Coenzima A | 1 mM | 20 Μ l | 0,1 mM |
| NAD+ | 10 mM | 20 Μ l | 1 mM |
| 10-acetile-3,7-dihydroxyphenoxazine | 100 ΜM | 20 Μ l | 10 ΜM |
| Substrato | 1-100 mM | 20 Μ l | 0,1-10 mM |
Tabella 1: Esempio di un protocollo di base impostato per la misurazione della O 2 ●– / H 2 O 2 e produzione di NADH di purificato PDH o KGDH. Poiché 20 µ l di ciascun reagente è aggiunto a ciascun pozzetto e il finale volume/reazione è 200 µ l, la concentrazione finale di ciascun reagente è 10 volte meno che la concentrazione d'archivio (ad esempio, la concentrazione finale di NAD+ nella miscela di reazione è di 1 mM ). Nota che i reagenti devono essere aggiunti al pozzo nell'ordine indicato nella tabella.
| Inibitore | Destinazione |
| 3-metil-2-oxo acido valerianico | Unità secondaria E1 del KGDHC |
| CPI-613 | Subunità E2 di oxo acido deidrogenasi |
Tabella 2: elenco di inibitori e ai loro obiettivi. Siti di azione sono anche rappresentati in Figura 8.
| NADH autofluorescenza | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Tempo | T ° 376.450 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:04 | 24.4 | 99 | 99 | 91 | 88 | 85 | 82 | 58 | 88 |
| 0:00:34 | 24.4 | 128 | 107 | 99 | 108 | 81 | 80 | 77 | 78 |
| 0:01:04 | 24.4 | 124 | 128 | 117 | 139 | 97 | 88 | 97 | 76 |
| 0:01:34 | 24.4 | 146 | 142 | 129 | 132 | 91 | 97 | 84 | 78 |
| 0:02:04 | 24.4 | 161 | 153 | 148 | 146 | 90 | 107 | 95 | 88 |
| 0:02:34 | 24.4 | 171 | 160 | 156 | 145 | 97 | 103 | 111 | 122 |
| 0:03:04 | 24.4 | 176 | 176 | 161 | 169 | 109 | 120 | 99 | 116 |
| 0:03:34 | 24.4 | 186 | 180 | 179 | 167 | 118 | 123 | 121 | 119 |
| 0:04:04 | 24.4 | 201 | 182 | 187 | 183 | 127 | 124 | 119 | 131 |
| 0:04:34 | 24.4 | 225 | 190 | 195 | 186 | 136 | 143 | 124 | 132 |
| 0:05:04 | 24.4 | 227 | 227 | 203 | 197 | 115 | 143 | 121 | 143 |
| Resorufina fluorescenza | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Tempo | T ° 565.600 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:00 | 24.4 | 204 | 178 | 169 | 152 | 148 | 113 | 107 | 90 |
| 0:00:30 | 24.4 | 224 | 188 | 167 | 152 | 144 | 116 | 124 | 112 |
| 0:01:00 | 24.4 | 212 | 186 | 178 | 161 | 153 | 114 | 122 | 120 |
| 0:01:30 | 24.4 | 212 | 188 | 165 | 164 | 160 | 132 | 127 | 116 |
| 0:02:00 | 24.4 | 222 | 203 | 190 | 169 | 154 | 128 | 133 | 127 |
| 0:02:30 | 24.4 | 217 | 198 | 193 | 179 | 165 | 129 | 147 | 130 |
| 0:03:00 | 24.4 | 223 | 218 | 202 | 179 | 183 | 142 | 145 | 137 |
| 0:03:30 | 24.4 | 239 | 223 | 208 | 188 | 179 | 150 | 155 | 148 |
| 0:04:00 | 24.4 | 236 | 219 | 202 | 183 | 180 | 163 | 156 | 153 |
| 0:04:30 | 24.4 | 249 | 220 | 214 | 177 | 199 | 149 | 150 | 167 |
| 0:05:00 | 24.4 | 251 | 232 | 225 | 196 | 211 | 170 | 169 | 161 |
Tabella 3: vista foglio di calcolo dei risultati raccolti dal set di esperimenti. Valori RFU RAW generati dall'esperimento vengono esportati in un foglio di calcolo per ulteriori analisi. Utilizzando le curve standard generate prima della sperimentazione, il tasso di NADH e H2O2 produzione può essere calcolato nel foglio di calcolo.
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Discussion
Questo protocollo è vantaggioso poiché, 1) Elimina eventuali reazioni concorrenti che altrimenti potrebbero interferire con il rilevamento di H2O2 (ad esempio, i sistemi antiossidanti o altre fonti di ROS), 2) fornisce una valutazione diretta del tasso nativo di ROS di rilascio di una deidrogenasi mitocondriale di flavin-contenente, 3) permette il confronto del nativo ROS rilasciare tariffe di due o più purificato basati su flavina deidrogenasi, 4) può consentire un confronto diretto del tasso di ROS rilascio e l'attività enzimatica e 5) permette lo screening degli inibitori selettivi competitivi per il rilascio ROS. Il nostro gruppo e altri hanno utilizzato questo metodo in precedenti pubblicazioni per esaminare il regolamento di ROS da allosterico e redox segnalazione meccanismi prima di svolgere esperimenti con i mitocondri o muscolo permeabilized14,16, 17,19,20.
Le modifiche e la risoluzione dei problemi:
Questa procedura utilizza attrezzature di base disponibili presso quasi tutte le istituzioni. L'approccio è anche basso costo e utilizza prodotti chimici comuni disponibili attraverso vari fornitori. La composizione di buffer può variare in base alle proprietà di enzima - anche se, abbiamo trovato che un buffer di reazione di base costituito da saccarosio, HEPES, mannitolo ed EGTA funziona bene nella maggior parte delle applicazioni. Valori non elaborati per fluorescenza Resorufina sono in genere intorno RFU 50-500 per un ROS rilasciando enzima diluito a 0,1 U/mL. Valori più alti di RFU possono indicare che il reagente AUR è stato auto-ossidato a causa di esposizione alla luce o ripetuti di congelamento-scongelamento. Di conseguenza, soluzioni di lavoro AUR devono essere regolarmente sostituiti ogni 2-3 settimane (a seconda della frequenza d'uso). Impurità nel preparato enzimatico o denaturazione può portare a inferiore a valori normali di ROS e NADH. Purezza di enzima deve essere monitorato regolarmente mediante elettroforesi in gel. Proprietà cinetiche (Km e Vmax per substrato e NAD+) dovrebbe inoltre essere valutata immediatamente dopo l'acquisto o la purificazione di un enzima e quindi controllati ordinariamente da allora in poi. La maggior parte dei reagenti utilizzati nel test sono stabile e possono essere sottoposti a più cicli di gelo-disgelo. Piruvato e α-chetoglutarato devono essere conservati in aliquote di 100 µ l a-80 ° C per evitare l'auto-ossidazione. Evitare l'uso di agenti riducenti come DTT quanto esso si forma O2●-/ h2O2 direttamente attraverso la formazione di radicali in PDHC e KGDHC (e potenzialmente altri flavoenzymes)17. Le analisi possono essere condotte a 37 ° C; Tuttavia, il nostro gruppo ha trovato che questi esperimenti a 25 ° C è ideale per fornire dati più coerenti.
Limiti della tecnica:
Un grande ostacolo connesso con questa tecnica è ad enzimi mitocondriali flavin-contenente purificati. Qui, abbiamo usato commercialmente disponibili KGDHC e PDHC per dimostrare che questa tecnica può essere utilizzata per confrontare direttamente i ROS rilascio capacità e l'attività enzimatica della deidrogenasi mitocondriale flavin-contenente. Tuttavia, la maggior parte delle ROS producendo flavin-contenente gli enzimi non sono commercialmente disponibili e devono essere purificati in laboratorio. Questo può essere difficile considerando che alcuni di questi enzimi sono membrana associato o assorbire alla membrana mitocondriale interna. Nuovi protocolli per la purificazione di successo della membrana-limitano flavin-contenente gli enzimi che producono ROS sono ora disponibili. Questo include metodi di purificazione per il complesso I, complesso II e sn-glicerolo-3-fosfato deidrogenasi21,22,23. Pertanto, anche se la maggior parte dei generatori ROS elencati potrebbero non essere disponibile in commercio, esistono protocolli per il loro isolamento e purificazione. La rilevanza fisiologica dei risultati raccolti utilizzando enzimi purificati flavina-base è anche una limitazione. Di conseguenza, i risultati raccolti con enzimi purificati dovrebbero essere continuati con le analisi usando mitocondri isolati o tessuto permeabilized. Cinque studi separati utilizzato questo approccio per studiare i meccanismi per la regolazione del rilascio ROS di KGDHC e PDHC14,16,17,19,20. Preliminare i risultati per il ruolo di interruttori redox in controllo ROS rilascio inizialmente sono stati testati utilizzando purificata KGDHC e PDHC e quindi meccanismi di regolamento sono stati ulteriormente analizzati nel fegato e mitocondri cardiaci e della fibra di muscolo14, 16,17,20.
Significato per quanto riguarda i metodi esistenti:
Misura ROS rilascio dai singoli siti di produzione in mitocondri può essere impegnativo a causa della presenza di reazioni collaterali concorrenti che producono anche O2●-/ h2O2 e antiossidante sistemi che altrimenti possono portare a la sottovalutazione delle tariffe native. Il potenziale di membrana può anche alterare i tassi di rilascio ROS da vari siti e l'uso di inibitori possa alterare il flusso di elettroni, O2●-/ h2O2 formazione misure di confondimento. Il metodo qui presentato consente la valutazione diretta della capacità di rilascio ROS da diversi enzimi mentre contemporaneamente valutare la relazione tra tassi di nativi di O2●-/ h2O2 e l'attività enzimatica. Questo metodo poco costoso può servire come uno strumento per confrontare le tariffe di rilascio ROS native per singoli enzimi mitocondriali flavin-contenente prima conducendo esperimenti più sofisticati con i mitocondri, cellule o tessuti. Inoltre, il metodo presentato qui può essere utilizzato per pre-schermo l'efficacia e la selettività degli inibitori per il rilascio ROS prima di svolgere analisi con i mitocondri isolati.
Future applicazioni:
Il metodo presentato qui è stato utilizzato in cinque distinti studi mirati a verificare il controllo sul rilascio ROS da PDHC e KGDHC14,16,17,19,20. In questi studi, inibitori sono stati schermati e rilascio di ROS e NADH producendo tassi sono stati valutati utilizzando enzimi purificati. I risultati raccolti con enzimi purificati sono stati quindi verificati utilizzando mitocondri isolati e permeabilizzate fibre muscolari14,16,17,20. Pertanto, questo metodo può essere applicato a un numero di futuri studi finalizzato allo studio nativi tassi di rilascio ROS da mitocondri, cellule e fibre muscolari.
Fasi critiche nel protocollo:
Enzima purezza e le proprietà cinetiche devono essere regolarmente monitorate. AUR lavorando reagente stock anche dovrebbe essere sostituito frequentemente. In tal modo risultati raccolti sono coerenti. L'ordine di aggiunta dei reagenti è di vitale importanza per l'esecuzione di un esperimento riuscito (tabella 1). Inibitori devono essere titolati per determinare la concentrazione richiesta per suscitare la massima inibizione del rilascio ROS. In questo studio, abbiamo scelto 10 mM KMV e 150 µM CPI-613 poiché abbiamo avevamo precedentemente determinato che queste concentrazioni inducono inibizione massima di rilascio ROS KGDHC e PDHC13.
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Disclosures
Non c'è niente di divulgare.
Acknowledgments
Quest'opera è stata finanziata dalle scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC). Produzione video è stato realizzato in collaborazione con il centro per l'innovazione nell'insegnamento e apprendimento (CITL) al Memorial University of Newfoundland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
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