Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Interactome-Seq: En protokoll for Domainome biblioteket konstruksjon, validering og utvalg av Phage Display og neste generasjons sekvensering

Published: October 3, 2018 doi: 10.3791/56981
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 3, 4, 1, 4, 5,6
1Department of Health Sciences, Università del Piemonte Orientale & IRCAD, Novara, Italy, 2Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Segrate, Milan, Italy, 3Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Bari, Italy, 4Department of Life Sciences, University of Trieste, Italy, 5Institute of Genetic and Biomedical Research, National Research Council, Rozzano, Milan, Italy, 6Humanitas Clinical and Research Center, Rozzano, Milan, Italy

Summary

Protokollene beskrevet tillater bygging, karakterisering og utvalg (mot målet valgfrihet) av et "domainome" bibliotek laget av noen DNA-kilde. Dette oppnås ved en forskning rørledningen som kombinerer forskjellige teknologier: phage skjerm, folding journalist og neste generasjons sekvensering med en web-verktøy for dataanalyse.

Abstract

Sammenleggbar journalister er proteiner med lett identifiserbare fenotyper, som antibiotikaresistens, som folding og funksjonen settes da smeltet til dårlig folding proteiner eller tilfeldig åpent lesing rammer. Vi har utviklet en strategi der bruker TEM-1 β-lactamase (enzymet overdragelse ampicillin motstand) på en genomisk skala, vi kan velge samlinger av riktig foldet protein domener fra koding delen av DNA av alle intronless genom. Proteinfragmenter innhentet av denne tilnærmingen, den såkalte "domainome", vil være godt uttrykt og løselig, noe som gjør dem velegnet for strukturelle/funksjonelle studier.

Kloning og viser "domainome" direkte i et phage display system, har vi viste at det er mulig å velge bestemt protein domener med ønsket bindingsegenskapene (f.eks andre proteiner eller antistoffer) gir viktig eksperimentell informasjon for genet merknaden eller antigen identifikasjon.

Identifikasjon av de mest beriket Klonene i en valgt polyklonale befolkning kan oppnås ved hjelp av romanen neste generasjons sekvensering teknologi (NGS). For disse grunner introduserer vi dypt sekvensering analyse av biblioteket selv og utvalg-utganger for å gi fullstendig informasjon om mangfold, overflod og presis kartlegging av hver av valgte fragment. Protokollene presenteres her viser de viktigste trinnene for biblioteket konstruksjon, karakterisering og validering.

Introduction

Her beskriver vi en høy gjennomstrømming metode og utvalg av biblioteker av brettet og løselig protein domener fra alle genic/genomisk Start kilde. Tilnærmingen kombinerer tre ulike teknologier: phage display, bruk av folding journalist og neste generasjons sekvensering (NGS) med en bestemt web-verktøy for dataanalyse. Metoder kan brukes i mange forskjellige sammenhenger protein-basert forskning, for identifikasjon og merknad av nye proteiner/protein domener, karakterisering av strukturelle og funksjonelle egenskaper kjent proteiner, samt definisjon av protein-interaksjon nettverk.

Mange åpne spørsmål er fremdeles på protein-basert forskning og utviklingen av metoder for optimal protein produksjon er et viktig behov for flere felt for undersøkelse. Til tross for at tusenvis av prokaryotic og eukaryotic genomer1er for eksempel et tilsvarende kart over den relative proteomes med en direkte merknad kodet proteiner og peptider fremdeles mangler det store flertallet av organismer. Katalogen komplett proteomes fremstår som et utfordrende mål krever en stor innsats i form av tid og ressurser. Gullstandarden for eksperimentell merknaden forblir kloning av alle åpne lesing rammer (ORFs) av et genom, bygge den såkalte "ORFeome". Gen funksjon tilordnet vanligvis basert på homologi til beslektede gener kjent aktivitet men denne tilnærmingen er dårlig nøyaktig på grunn av tilstedeværelsen av mange feil merknader i referanse databaser2,3,4, 5. Videre selv for proteiner som er identifisert og kommentert, ytterligere studier er nødvendig for å oppnå karakteristikk i overflod, uttrykk mønstre i forskjellige sammenhenger, inkludert strukturelle og funksjonelle egenskaper samt samhandling nettverk.

Videre siden proteiner er sammensatt av forskjellige domener, hver av dem viser bestemte funksjoner og annerledes bidrar til protein funksjoner, studien og den nøyaktige definisjonen av disse domenene kan tillate en mer helhetlig bilde, både på singelen Gene og på full genomet nivå. Alle opplysningene nødvendig gjør protein-basert forskning et bredt og utfordrende felt.

I dette perspektivet, kan et viktig bidrag gis av objektivt og høy gjennomstrømming metoder for protein produksjon. Imidlertid er suksessen til slike tilnærminger, foruten den betydelig investeringen som kreves, avhengig av evnen til å produsere løselig/stabil protein konstruksjoner. Dette er en begrensende faktor siden det har blitt anslått at bare ca 30% av protein kan være uttrykt og produsert på tilstrekkelige nivåer skal eksperimentelt nyttig6,7,8. En tilnærming for å overkomme denne begrensningen er basert på bruk av tilfeldig fragmentert DNA til å produsere ulike polypeptides, som sammen gir overlappende fragment representasjon av enkelte gener. Bare en liten prosentandel av tilfeldig generert DNA fragmenter er funksjonelle ORFs mens det store flertallet av dem er ikke-fungerende (av stopp kodon inne deres sekvenser) eller kode for fjern naturlig (ORF i en annen ramme enn opprinnelige) polypeptides uten biologiske mening.

Hvis du vil løse alle disse problemene, har vår gruppe utviklet en høy gjennomstrømming protein uttrykk og samhandling analyse plattform som kan brukes på en genomisk skala9,10,11,12. Denne plattformen integrerer følgende teknikker: 1) en metode for å velge samlinger av riktig foldet protein domener fra koding delen av DNA fra noen organismer; 2) den phage teknologien for å velge partnere samhandlinger; 3) NGS helt karakterisere det hele interactome under studien og identifisere kloner steder. og 4) en web-verktøy for dataanalyse for brukere uten bioinformatikk eller programmering ferdigheter til å utføre Interactome-Seq analyse på en enkel og brukervennlig måte.

Bruk av denne plattformen har viktige fordeler over alternative strategier for undersøkelse; fremfor alt er metoden fullstendig upartiske høy gjennomstrømming og modulære studie fra ett gen til et hele genom. Det første trinnet i rørledningen er etableringen av et bibliotek fra tilfeldig fragmentert DNA under studien, som er så dypt preget av NGS. Dette biblioteket er generert ved hjelp en konstruert vektor der gener/fragmenter av interesse er klonet mellom en signal sekvens for protein sekresjon i periplasmic plass (dvs., sek leder) og TEM1 β-lactamase genet. Fusion protein vil tildele ampicillin motstand og evne til å overleve under ampicillin press hvis klonet fragmenter er i-ramme med både disse elementene og resulterende fusion protein er riktig brettet10,13 ,14. Alle kloner reddet etter antibiotikumet utvalg, den såkalte "filtrerte kloner", er ORFs og et stort flertall av dem (mer enn 80%), er avledet fra virkelige gener9. Dessuten ligger kraften i denne strategien i funnene at alle ORF filtrert kloner er koding for riktig kastet/løselig proteiner/domener15. Som mange kloner, finnes i biblioteket og kartlegging i samme område/domene, har ulike start- og sluttpunkt, gjør dette objektiv, enkeltsteg identifikasjon av minimum fragmenter som gir løselig produkter.

En ytterligere bedring i teknologien er gitt ved bruk av NGS å karakterisere biblioteket. Kombinasjonen av denne plattformen og en bestemt web-verktøy for dataanalyse gir viktig upartisk informasjon på den eksakte nukleotid sekvenser og plasseringen av valgte ORFs på referansen DNA under studien uten behov for ytterligere omfattende analyser eller eksperimentell innsats.

Domainome biblioteker kan overføres til en utvalg sammenheng og brukes som en universell instrument til å utføre funksjonelle studier. Høy gjennomstrømming protein uttrykk og samhandling analyse plattformen at vi integrert og at vi kalt Interactome-Seq drar fordel av den phage teknologien ved å overføre den filtrerte ORF til en phagemid vektor og opprette en phage-ORF bibliotek. En gang re klonet til en phage visning sammenheng, protein domener vises på overflaten av M13 partikler; på denne måten kan domainome biblioteker være direkte valgt for genet fragmenter koding domener med bestemt enzymatisk aktiviteter eller bindende egenskaper, slik at interactome nettverk profilering. Denne tilnærmingen ble først beskrevet av Zacchi et al. 16 og senere brukt i flere andre sammenheng13,17,18.

Sammenlignet med andre teknologier som brukes til å studere protein-protein interaksjon (inkludert gjær to hybrid systemet og massespektrometri19,20), er en stor fordel forsterkning av bindende partneren som oppstår under phage vise flere runder med valg. Dette øker utvalg følsomhet dermed gir IDen til lav rikelig bindende proteiner domener i biblioteket. Effektiviteten av utvalget med ORF-filtrert biblioteket er ytterligere økt av ikke-fungerende kloner. Til slutt, teknologien tillater valg skal utføres mot både protein og ikke-protein agn21,22,23,24,25.

Phage valg ved hjelp av domainome-phage-biblioteket kan utføres ved hjelp av antistoffer kommer fra sera av pasienter med ulike pathological betingelser, f.eks autoimmune sykdommer13, kreft eller infeksjon sykdommer som agn. Denne tilnærmingen til å oppnå den såkalte "antistoff signaturen" av sykdom under studien tillater massivt identifisere og karakterisere antigener/epitopes spesielt gjenkjennes av pasientens antistoffer samtidig. Sammenlignet med andre metoder for bruk av phage kan identifikasjon av både lineære og conformational antigenic epitopes. Identifikasjon av en bestemt signatur potensielt kan ha en betydelig innvirkning på forståelse patogenesen, ny vaksine design, identifisering av nye terapeutiske mål og utvikling av nye og spesifikke diagnostiske og prognostiske verktøy. Videre når studien er fokusert på smittsomme sykdommer, er en stor fordel at oppdagelsen av immunogenic proteiner er uavhengig av patogen dyrking.

Vår tilnærming bekrefter at folding reporterne kan brukes i genomisk skala velge "domainome": en samling av riktig brettet, vel uttrykt, løselig protein domener fra koding delen av DNA og/eller cDNA fra en organisme. Når isolerte proteinfragmenter er nyttig for mange formål, gir viktig eksperimentelle informasjon for genet merknaden samt for strukturelle studier, antistoff epitope kartlegging, antigen identifikasjon, etc. Fullstendigheten av høy gjennomstrømming data NGS gir analyse av komplekse utvalgene, for eksempel phage skjerm biblioteker, og har potensial til å omgå den tradisjonelle arbeidskrevende plukkingen og testing på individuelle phage reddet kloner.

Samtidig takket være funksjonene av filtrerte biblioteket og ekstreme følsomhet og makt NGS analysen er det mulig å identifisere protein domenet ansvarlig av hver interaksjon direkte i en første skjermen, uten å måtte opprette flere biblioteker for hver bundet protein. NGS kan få en omfattende definisjon av hele domainome av alle genic/genomisk Start kilder og data analyse web verktøyet gjør det mulig for obtainment av svært spesifikke karakteristikk både fra en kvalitativ og kvantitativ synspunkt av den interactome proteiner domener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bygging av ORF biblioteket (figur 1)

  1. Utarbeidelse av sett inn DNA
    1. Fragmenter forberedelse fra syntetisk eller genomisk DNA
      1. Pakke/rense DNA bruker standard metoder26.
      2. Fragment DNA av sonication. Hvis bruker en standard sonicator, som en generell forslag start med 30 s pulser på 100% utgangseffekt.
        Merk: Piloten eksperimenter bør gjøres med forskjellige og sonication ganger for å angi optimale forhold for DNA utarbeidelse. Etter hver test bestemme størrelsen på DNA fragmenter av agarose gel geleelektroforese.
      3. Last sonicated DNA på 1,5% agarose gel, sammen med en 100 bp DNA stige. Utføre en kort geleelektroforese kjøre på 5 V/cm i 15 min og kutte delen av gel inneholder smear av fragmentert DNA.
      4. Rense sett inn en kolonne-basert gel utvinning Kit og måle konsentrasjonen med en UV spektrofotometeret.
        Merk: minst 500 ng av renset innstikk skal oppnås etter dette trinnet å være samskrevet med 1 µg av fordøyd vektor, som beskrevet i trinn 1.3. Sjekk kvaliteten på fragmenter forberedelse ved å evaluere en260nm/A280nm og en260nm/A230nm forhold siden lav kvalitet av utvalget vil påvirke ligation effektiviteten.
      5. Behandle opptil 5 μg av skivene med 1 μL rask Blunting Kit enzym miksen, i henhold til produsentens instruksjoner. Deaktiver enzymer ved oppvarming til 70 ° C for 10 min. prøver kan lagres på 20 ° C før bruk.
    2. Fragmenter forberedelse fra cDNA
      1. Ekstra RNA med standard metoder (f.eks TRizol eller lignende reagenser).
      2. Fragment mRNA ved oppvarming før du utfører omvendt transkripsjon. DNA fragment fast styres av mRNA kokende tid og tilfeldig primer konsentrasjon. For eksempel varme utvalg for 6 min på 95 ° C.
      3. Forberede cDNA bruke tilfeldig primere med alle tilgjengelige kit etter produsentens protokoll.
      4. Tømmer cDNA av poly-dT haler av hybridisering med biotinylated poly-dA for 3t på 37 ° C, og skille på streptavidin magnetiske perler som beskrevet av Carninci et al. 13
      5. Gjenopprette ubundet materiale og renser med en kolonne-baserte DNA rensing kit følge instruksjonene fra produsenten. Måle konsentrasjonen med en UV spektrofotometeret. Se merknad i trinn 1.1.1.4.
  2. Utarbeidelse av filtrering vektoren
    1. Digest 5 µg renset måte vektor pFILTER312 med 10 U av EcoRV begrensning enzym, følgende produsentens protokollen.
    2. Laste 2 µL (200 ng) av fordøyd vektoren, sammen med 100 ng ufordøyd vektoren og 1 k bp molekylær markør, på en 1% agarose gel, etter riktig fordøyelse. Varme Deaktiver begrensingen enzymet.
    3. Legg til 1/10 volumet av 10 x fosfatase buffer og 1 µL (5 U) av fosfatase og ruge på 37 ° C for 15 min. varme deaktivere i 5 min på 65 ° C.
    4. Rense fordøyd plasmider ved utvinning fra agarose gel og måle konsentrasjonen med en UV spektrofotometeret. Eksempler kan lagres på 20 ° C før bruk.
  3. Hemorroider og transformasjon
    1. Utføre ligation som følger: 1 µg av fordøyd plasmider legge 400 ng av fosforylert innstikk (plasmider: Sett inn molar forholdet 1:5), 10 µL av 10 x bufferen for T4 DNA Ligase, 2 µL av høy konsentrasjon T4 DNA ligase i et siste volum på 100 µL. ruge reaksjonen på 16 ° C overni til høyre. Varme Deaktiver ved 65 ° C i 10 min.
    2. Utløse ligation produktet ved å legge til 1/10 volumet av natrium acetate løsning (3 M, pH 5.2) og 2,5 volum av 100% etanol. Bland og fryse-80 ° c for 20 min.
    3. Sentrifuge med maksimal hastighet for 20 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
    4. Legg til 500 µL av kaldt 70% etanol pellets og sentrifuge med maksimal hastighet for 20 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
    5. Lufttørke pellet. Resuspend utfelt DNA i 10 µL av vann.
    6. Utføre bakteriell celle electroporation.
      Merk: Bruk av høy effektivitet celler (over 5 x 109 transformants per µg DNA) er nødvendig. Vi foreslår at du bruker Escherichia coli DH5αF' (F'/ endA1 hsd17 (rK − mK +) supE44 thi-1recA1 gyrA (Nalr) relA1 (lacZYA-argF) U169 deoR (F80dlacD-(lacZ)M15) produsert i huset eller kjøpt fra flere produsenter.
      1. Sett riktig antall microcentrifuge rør og 0,1 cm-electroporation cuvettes på is. Legge 1 µL av renset ligation løsning (i DI vann) til 25 µL av cellene og flick røret noen ganger.
      2. Overføre DNA-celle blandingen til den kalde cuvette, trykk på benken 2 x, tørke vann fra utsiden av cuvette, sett i electroporation modul og trykk pulsen.
      3. Utføre electroporation med en standard electroporator maskinen med 25 µF, 200 Ω og 1,8 kV. Tiden konstant må være 4-5 ms.
    7. Straks legge 1 mL av flytende 2xYT medium uten noen antibiotika, overføre til en 10 mL tube og tillater for å vokse på 37 ° C, rister på 220 rpm 1t.
    8. Plate forvandlet DH5αF' på 15 cm 2xYT agar plater supplert med 34 µg/mL chloramphenicol (pFILTER motstand) og 25 µg/mL ampicillin (selektiv markør for ORFs) og ruge over natten på 30 ° C.
    9. Plate fortynninger av biblioteket på 10 cm 2xYT agar plater supplert med chloramphenicol + ampicillin og chloramphenicol, utføre biblioteket titrering. Ruge over natten på 30 ° C.
  4. pFILTER-ORF biblioteket validering
    1. Teste 15-20 kolonier fra begge chloramphenicol og chloramphenicol/ampicillin plater å anslå sett størrelsesDistribusjon. Velg enkelt kolonier med tips og fortynne dem separat i 100 µL av 2xYT medium uten antibiotika. Bruke 0,5 µL av denne løsningen som DNA mal for en PCR reaksjon, med alle standard TaqDNA utvalg etter produsentens protokoll.
    2. Utføre 25 sykluser av forsterkning med en T annealing 55 ° C og en utvidelse av 40 s ved 72 ° C. Primer sekvenser er gitt i Tabellen for materiale.
    3. Last PCR produktene på 1,5% agarose gel, sammen med en 100 bp DNA stigen og løpe.
  5. pFILTER-ORF biblioteksamlingen
    1. Samle bakterier fra 150 mm plater ved å legge til 3 mL frisk 2xYT medium og høsting dem med en bakteriefri skraper, bland godt, supplere dem med 20% sterilt glyserol og lagre på-80 ° C i små dele.
    2. Plasmider rense fra en aliquot av biblioteket (før tillegg av glyserol) bruker en kolonne-baserte plasmider utvinning kit, følg produsentens instruksjoner.
    3. Mål konsentrasjonen med UV spektrofotometeret. Eksempler kan lagres på 20 ° C til brukes for phagemid biblioteket forberedelse og/eller karakterisering av NGS.

2. subcloning av filtrerte ORFs i en Phagemid vektor (figur 2)

  1. Utarbeidelse av ORF filtrert DNA fragmenter
    1. Definer begrensning enzym fordøyelsen av 5 µg av renset vektor fra pFILTER-ORF biblioteket vektoren legger 10 U av BssHII og rugende etter produsentens protokollen. Deaktiver enzym og fordøye med 10 U av NheI.
    2. Last fordøyd DNA på 1,5% agarose gel, sammen med en 100 bp DNA stige. Utføre en kort geleelektroforese kjøre på 5 V/cm i 15 min eller akkurat nok til å skille smear av forbrukeravgift fragmenter og kutte delen av gel som inneholder dem.
    3. Rense sett inn en kolonne-base gel utvinning Kit og måle konsentrasjonen med en UV spektrofotometeret.
  2. Utarbeidelse av phagemid DNA
    1. Angi begrensning enzym fordøyelsen av 5 µg renset pDAN527 for skivene.
    2. Rense fordøyd plasmider av kjører fordøyd DNA på en 0,75% agarose gel og utdrag fra gel med en kolonne-baserte kit.
    3. Måle konsentrasjonen med en UV spektrofotometeret. Eksempler kan lagres på 20 ° C før bruk.
  3. Biblioteket hemorroider, transformasjon og samling
    1. Utføre ligatur og transformasjon som pFILTER vektor.
    2. Plate forvandlet DH5αF' på 150 mm 2xYT agar plater supplert med 100 µg/mL ampicillin og ruge over natten på 30 ° C.
    3. Plate fortynninger av biblioteket på 100 mm 2xYT agar plater med 100 µg/mL ampicillin å finne biblioteket størrelse.
    4. Utfør biblioteket validering av PCR tilfeldig plukket kloner som beskrevet i trinn 1.4.
    5. Samle inn phagemid-ORF biblioteket ved høsting bakterier fra 150 mm plater, bland godt, supplere dem med 20% sterilt glyserol og butikk på-80 ° C i små dele.
    6. Rense plasmider DNA fra en aliquot av biblioteket bruker en kolonne-baserte plasmider utvinning kit, følg produsentens instruksjoner.
    7. Måle konsentrasjonen for UV spektrofotometeret. Eksempler kan lagres på 20 ° C til brukes for karakterisering av NGS.

3. phage biblioteket forberedelse og utvalg prosedyre

  1. Phage produksjon
    1. Fortynne en lager aliquot av phagemid biblioteket i 10 mL av 2xYT flytende kjøttkraft supplert med 100 µg/mL ampicillin for å ha et OD600nm = 0,05.
    2. Vokse utvannet biblioteket i et sterilt kolbe 5 - 10 ganger større enn det opprinnelige volumet, på 37 ° C med skjelvende på 220 rpm til når OD600nm = 0,5.
    3. Infisere bakterier med hjelperen phage (f.eks M13K07) på et mangfold av infeksjon 20:1. La på 37 ° C i 45 min med sporadiske agitasjon (hvert 10 min).
    4. Sentrifuge bakterier på 4000 x g i 10 min ved romtemperatur. Forkaste nedbryting, nytt avbryte bakterier pellet 40 mL 2xYT flytende kjøttkraft supplert med 100 µg/mL ampicillin og 50 µg/mL kanamycin og vokse på 28 ° C med skjelvende på 220 rpm for overnatting.
    5. Dagen etter, sentrifuger bakterier på 4000 x g for 20 min på 4 ° C. Samle nedbryting som inneholder phages.
  2. PEG-utfelling av phages.
    1. Legg 1/5-volum på en 0.22 µm filtrert PEG/NaCl løsning (20% w/v pinne 6000, 2,5 M NaCl) de ryddet phages og ruge på is 30-60 minutter.
      Merk: Løsning ble røykfylt etter noen minutter, indikerer vellykket phage nedbør. Cloudiness av løsningen vil øke over tid inkubasjon.
    2. Sentrifuger 4000 x g i 15 min på 4 ° C. Hvit liten pellets av phages vil danne.
    3. Resuspend det i 1 mL steril PBS. Overføre til 1,5 mL tube og sentrifuge ved 4 ° C i 10 min for topphastigheten fjerne miljøgifter bakterier. Brun pellets vil danne.
    4. Overføre nedbryting som inneholder phages til en ny tube. Hold phages på is påfølgende titrering og phage utvalg.
  3. Phage titrering
    1. Klargjør fortsettelsene fortynninger av phage løsningen. Innlegge 10 µL phage løsningen 990 µL av PBS å få 10-2 fortynning. Fortynne igjen dette preparatet å gjøre 10-4 og fra dette få en 10-6 fortynning.
    2. Vokse DH5αF' bakterier celler i 2xYT flytende medium på 37 ° C med skjelvende til OD600nm = 0,5 er nådd. Overføre 1 mL av forberedt bakterier til 1,5 mL tube og umiddelbart infisere med 1 µL av 10-4 phage fortynning. Inkuber uten riste på 37 ° C i 45 min. gjenta den samme fremgangsmåten for 10-6 fortynning.
    3. Plate fortynninger av infiserte bakterier inn 100 mm 2xYT plate. Sette platen på 30 ° C over natten.
    4. Plate 100 µL av infisert DH5αF' på en 2xYT agar plate supplert med 100 µg/mL ampicillin sjekke fravær av forurensning i forberedelsene.
    5. Dagen etter antall kolonier og beregne phage titer. Uttrykke titer som antall phages/mL. Forventet titer er 1012-13 phages/mL.
  4. Phage utvalg
    1. Phage utvalg bruke som agn renset antistoffer
      1. Mette phages ved utvannende 200 µL phage forberedelser til en lik mengde PBS - 4% skummet melk og ruge 1t ved romtemperatur i langsomme rotasjon. Dette trinnet kan blokkering av phages for uspesifikke bindingen. Overføring 30 µL av protein-G belagt magnetiske perler til en 1,5 mL tube.
      2. Vask to ganger som følger: legge til 500 µL av PBS, ruge på et hjul på langsomme rotasjon i 2 minutter ved romtemperatur, tegne perler til den ene siden av røret ved hjelp av en magnet og fjerne nedbryting.
      3. Inkuber mettet phages med vasket perler i 30 min ved romtemperatur med langsomme rotasjon.
      4. Tegne perler til side ved hjelp av et magnetfelt. Samle nedbryting som inneholder phages som skal brukes for utvalg trinn.
      5. Forberede magnetiske perler ved utføring forrige trinn, av bøye renset antistoffer. Vask 30 µL av protein-G belagt magnetiske perler som beskrevet ovenfor. Fortynne 10 µg av renset antistoffer i 500 µL av PBS, Legg til vasket perler og ruge i langsomme rotasjon ved romtemperatur for 45 min. vask to ganger med PBS.
        Merk: Utføre to forskjellige preparater av magnetiske perler: en med antistoffer rundt og en kontroll antistoffer, f.eks antistoffer renset fra friske blodgivere. En rekke antigener valgt kontroll antistoffer trekkes under analyse trinnet av utgangene. Alternativt, magnetiske perler lastet med kontroll antistoffer kan brukes til å utføre en pre clearing trinn i phages (følger protokollen for inkubasjon med un konjugert perler).
      6. Phage utvalg: tegne perler til den ene siden av røret med en magnet, fjerne siste vask, legge til phages og ruge med langsomme rotasjon ved romtemperatur for 90 min. Vask 5 ganger med 500 µL av PBS-0.1% mellom-20 og 5 ganger med PBS.
      7. Elute bundet phages, som representerer resultatet av valget, ved å blande perler med 1 mL av DH5αF' celler dyrket på OD600 = 0,5. Inkuber bakterier med perler for 45 min ved 37 ° C med sporadisk riste (hvert 10 min). Plate utdata på en 150 mm 2xYT agar plate med 100 µg/mL ampicillin.
      8. Plate 100 µL av ufortynnet og ulike fortynninger av utdataene (10-1 til 10-5) for å utføre titrering. Dagen etter samle bakterier fra 150 mm plater ved å legge til 3 mL frisk 2xYT medium og fangst dem med en bakteriefri skraper, bland godt, supplere dem med 20% sterilt glyserol og lagre på-80 ° C i små dele.
      9. Vokse en aliquot igjen for å utføre en andre runde av valg. Gjenta alle panorering idet beskrevet over bortsett fra vask betingelsene. I dette tilfellet vask 10 ganger med PBS - 1% Tween-20 (hell løsning i røret og utøse igjen umiddelbart). Deretter legger 500 µL av PBS og ruge på rotasjon ved romtemperatur for 10 min. utføre andre 10 vasker med PBS. Fortsette elueringsrør trinn for første runde av valg.
      10. Pakk ut plasmider DNA fra en aliquot av produksjonen ved hjelp av en kolonne-baserte kit, følger produsentens instruksjoner. Lagre plasmider på 20 ° C før det skal brukes for dype sekvensering.
    2. Phage utvalg som agn rekombinante proteinene
      1. Mette phages ved utvannende 200 µL phage forberedelser til en lik mengde PBS - 4% skummet melk og ruge 1t ved romtemperatur i langsomme rotasjon.
      2. Legg 100 µL av streptavidin magnetiske perler. Inkuber 1t ved romtemperatur å velge streptavidin bindende phages. Fjern streptavidin-bundet phages ved å tegne perler til side ved hjelp av en magnet. Ta supernatant fra forrige trinn og legge biotinylated protein (i en konsentrasjon av 100-550 nM) og ruge på en rotor ved romtemperatur i 30 minutter til 1 time.
      3. Forberede magnetiske perler: mens du utfører det forrige trinnet, vaske 100 µL av streptavidin-magnetiske perler med PBS, resuspend i PBS 2% skummet melk og ruge med rotasjon i romtemperatur i 30 minutter til 1 time.
      4. Phage utvalg: tegne perler til den ene siden av røret med en magnet, fjerne PBS - 2% melk og resuspend perler med phage protein blanding. Inkuber med langsomme rotasjon ved romtemperatur for 90 min.
      5. Tegne perler til den ene siden av røret med en magnet, forkaste nedbryting og vaske dem nøye fem ganger med 500 µL av PBS 0,1% Tween-20. Utføre elueringsrør som beskrevet i forrige økt.

4. phage biblioteket dyp sekvensering plattform (Figur 3)

  1. DNA setter utvinning fra pFILTER-ORF-bibliotek, pDAN5-ORF-biblioteket eller valgt-phage-biblioteker
    1. Tine en aliquot av biblioteket, Kvantifisere det ved hjelp av et spektrofotometer, gjenopprette DNA setter forsterkning med bestemte primere.
      Merk: Primere brukt å redde skivene er koblet på deres 5' slutt adaptere sekvenser, slik at etterfølgende indeksering av amplicon bassengene innhentet og den direkte sekvensering av DNA skivene gjenopprettet med sequencere. Sekvensen er i Tabellen for materiale. Adaptere angis i fet, og de bestemte primerne i kursiv.
    2. Bruke 2,5 µL av (pFILTER/phagemid/valgt-phage) biblioteket som DNA mal for en PCR reaksjon.
    3. Bruk følgende program: 95 ° C i 3 min; 25 sykluser av 95 ° C for 30 s, 55 ° C for 30 s, 72 ° C for 30 s; 72 ° C 5 min. Hold på 4 ° C.
      Merk: på dette punktet det anbefales å kjøre 1 µL av PCR produktet på en Bioanalyzer eller TapeStation for å kontrollere størrelsen på amplicons og sjekke at de er i området riktig.
  2. PCR opprydding
    1. Bringe de magnetiske perlene (f.eks AMPure) til romtemperatur. Overføre hele PCR produktet fra PCR røret til en 1,5 mL tube. Vortex magnetiske perler for 30 å sørge for at perlene er jevnt spredt. Legge til 20 µL av magnetiske perler hver rør som inneholder PCR produktet blanding av forsiktig pipettering. Inkuber ved romtemperatur uten risting i 5 min.
    2. Plass platen på en magnetisk stå i 2 minutter, eller til nedbryting avklart. PCR produktene på magnetiske standen, fjerne og forkaste nedbryting.
    3. Vask perler med nylagede 80% etanol, med PCR produkter på magnetiske standen, som følger: legge til 200 µL av nylagde 80% etanol hvert utvalg bra; Inkuber plate magnetiske stativet for 3 s; nøye fjerne og slette nedbryting.
    4. Utføre en andre etanol vask, med PCR produkter på magnetiske stand; på slutten av andre vask forsiktig fjerne alle etanol og tillate perler å air-dry i 10 min.
    5. Fjerne PCR produktene fra magnetiske stativet, Legg 17,5 µL av 10 mM Tris pH 8.5 til hver rør, Pipetter forsiktig opp og ned 10 ganger, kontroller at perler er fullt resuspended. Inkuber ved romtemperatur i 2 minutter.
    6. Sett røret på magnetiske står i 2 minutter, eller til nedbryting avklart, nøye overføre 15 µL av nedbryting som inneholder renset PCR produktene til en ny 1,5 mL tube. Lagre renset PCR produktene-15 ° C til-25 ° C i opptil en uke hvis du ikke umiddelbart Fortsett til indeks PCR.
  3. Indeks PCR
    Merk: Når PCR rydde opp, utføre indeks PCR. Bruke Nextera XT indeks kit; Dermed vil det være mulig å sekvens resulterende dobbel indekserte bibliotekene i multiplex Illumina kjører.
    1. Overføre alle 15 μL som inneholder hvert produkt renset inn i et nytt PCR-rør og definere følgende reaksjon inneholder: 15 µL av renset amplicon produkt, 5 µL indeks Primer 1 og 5 µL av indeks Primer 2, 25 µL av 2 x PCR; siste bind i 50 µL.
    2. Utføre PCR på en termisk cycler bruker følgende program: 95 ° C i 3 minutter, 8 sykluser av 95 ° C for 30 s, 55 ° C for 30 s, 72 ° C for 30 s; 72° C i 5 min, hold på 4 ° C.
  4. PCR rydde opp 2
    1. Følg samme protokoll beskrevet i delen 4.2 for PCR rydde opp med følgende endringer: i det første trinnet legge 56 µL av magnetiske perler til hver 50 µL av PCR produkt.
    2. Resuspend perler i 27.5 µL av 10 mM Tris pH 8.5 i det siste trinnet av rensing og overføre 25 µL til en ny tube (dette er renset siste biblioteket klar for kvantifisering og deretter sekvensering).
    3. Lagre platen på-15 ° C til-25 ° C i opptil en uke hvis ikke fortsetter biblioteket kvantifisering.
  5. Kvalitativ og kvantitativ vurdering av sekvensering biblioteket
    1. Etter rensing, kjøre 1 µL av en 1:10 fortynning av siste biblioteket på en bioanalyzer å bekrefte størrelsen og Kvantifisere det velge regionen siste biblioteket sporingen.
    2. Parallelt utføre biblioteket kvantifisering av sanntid PCR ved hjelp av et bibliotek kvantifisering kit per produsentens protokollen.
  6. Biblioteker sekvensering
    1. Basseng dobbelt indekserte bibliotekene produseres sammen med andre dual indekserte sekvensering biblioteker. Rekkefølgen denne typen bibliotek ved å generere lenge leser, minst 250 bp sammenkoblede slutten ved hjelp av både Hiseq2500 eller MiSeq instrumenter i de første tilfellet 250bp PE leser og i andre tilfelle 300 bp PE leser.

5. Bioinformatic dataanalyse ved hjelp av verktøyet Interactome-Seq Web

  1. Analysere lest stammer fra pFILTER/phagemid/valgt-phage biblioteket sekvensering med rørledningen Interactome-seq data analyse. Web-verktøyet er fritt tilgjengelig på følgende adresse: http://interactomeseq.ba.itb.cnr.it/

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Filtrering tilnærming er schematized i figur 1. Hver type intronless DNA kan brukes. Den første delen av filtrering tilnærming representeres i figur 1A : etter lasting på en agarose gel eller en bioanalyzer, en god fragmentering av DNA av interesse vises som en smear av fragmenter med en lengde distribusjon i ønsket størrelse 150-750 bp. En representant virtuelle gel bilde av fragmentert DNA innhentet er gitt. Fragmenter lastet på agarose gel er da tilbake slutten-reparert og fosforylert og deretter klonet i en tidligere avstumpet pFILTER vektor å opprette et bibliotek av tilfeldige DNA. Hver grepet av kloning prosedyren under optimale forhold er nødvendig for å få god kvalitet bibliotek med en total dekning av DNA under studien.

Figur 1B filtrering tilnærming er representert: biblioteket er dyrket i nærvær av chloramphenicol (pFILTER motstand) alene eller chloramphenicol og ampicillin velge for ORF inneholder kolonier. Bare kolonier har et DNA fragment tilsvarer en ORF produsere en funksjonell β-lactamase og overleve når det antibiotikumet utvalg. Figur 1 c viser hvordan øke seleksjonspress innrømmer utvalg av gode mappen ORFs mot dårlig mappen de. Det forventede resultatet er en reduksjon av bibliotek med 20-fold. Høyere antall gjenlevende kloner angir utilstrekkelig seleksjonspress.

ORF fragmenter kan lett gjenopprettes fra den filtrerte biblioteket for påfølgende programmet; for samhandling studier bruker vår strategi phage teknologien. I figur 2, representeres de viktigste trinnene i phage bibliotek bygging: en tilstrekkelig biblioteket er utarbeidet av kutte ut filtrerte fragmenter fra pFILTER vektoren og re kloning i en phagemid plasmider i fusion med sekvensen koding for den phage capside protein g3p. En gang infisert med hjelper phage, kan tilstedeværelse av vektoren i bakterier celler produksjonen av phage partikler vise ORF-g3p fusion produkter på overflaten deres dermed filtrerte biblioteket phage visning velges og videre analyse.

Alle biblioteker analyseres dypt av NGS, samt resultatene av phage valg, som vist i den andre delen av Figur 3. DNA fragmenter er reddet fra voksende kolonier av PCR forsterkning med bestemte oligonucleotides annealing på plasmider ryggraden og bære bestemte adaptere for sekvensering. NGS utføres og leser analyseres da Interactome-Seq data analyse web-verktøyet.

I Figur 4 rapportert vi en skjematisk fremstilling av valget prosedyren ORF filtrerte phage skjerm bibliotek. Valget i dette eksemplet utføres ved hjelp av antistoffer tilstede i sera fra pasienter som lider av ulike patologi (i.e. infeksiøs patologi, autoimmune patologi, kreft). I dette tilfellet samhandler phage biblioteket direkte med antistoffer i pasientenes sera og på denne måten antatte bestemt antigener kan bli beriket fordi de gjenkjennes av sykdommen spesifikke antistoffer. I denne typen eksperiment velges vanligvis biblioteket også bruke kontrollsera fra sunn pasienter for å ha en bakgrunn signal skal brukes for påfølgende sammenligning og normalisering prosedyrer.

Valgene er utført ved hjelp av sera fra samme type pasienter vanligvis gruppert i ulike bassenger for å redusere Inter-individuelle variasjon av sera antistoff titer. Hver Pulje brukes uavhengig for to til tre påfølgende runder med valget for å berike biblioteket for immun-reaktive kloner spesifikke for patologi under studien. Test set antistoffer er ruges med bibliotek phages og immun-komplekser gjenopprettes av protein A belagt magnetics-perler, bundet phages er elut av standard prosedyrer. Valget sykluser utføres med økende vask og bindende stringens.

Lest generert av NGS kan analyseres ved hjelp av verktøyet for Interactome-Seq-web spesielt utviklet for å håndtere denne typen data. Interactome-Seq data analyse arbeidsflyt består av fire sammenhengende trinn som fra rå sekvensering leser, genererer listen over mulige domener med genomisk merknader (figur 5A). I det første trinnet inndata (figur 5A - rød boks) kontrollerer Interactome-Seq om inndatafiler (lese rådata, referanse Genova orden, merknad liste) er riktig formatert. I det andre trinnet FORBEHANDLING (figur 5A - oransje boks), lav kvalitet sekvensering data fjernes først med Cutadapt28 avhengig av kvalitetspoeng og leser med mindre enn 100 baser i lengde forkastes. I et senere lese justering trinn (figur 5A - grønne boksen) viser den gjenværende lest blastn29 å det Genova orden tillater opptil 5% av uoverensstemmelser. En SAM filen genereres og leser bare med kvalitetspoengene som er større enn 30 (Q > 30) behandles med SAMtools30 og omgjort til en BAM fil. Etter justering Interactome-Seq utfører domener påvisning (figur 5A - blå boks), påkalle Bedtools31 filtrere leser overlappende minst 80% av sin lengde i transkripsjoner; dekning, max dybde og fokus verdiene beregnes deretter for hver ORF del dekkes av kartlegging leser. Dekningen representerer totalt antall lesninger tilordnet et gen; dybden er maksimalt antall leser dekker en bestemt genic del; fokus er en indeks fra forholdet mellom max dybde og dekning, og det kan være mellom 0 og 1. Når fokus er høyere enn 0,8 og er høyere enn den gjennomsnittlige observert for alle kartlegging regioner i filen BAM, er delen CDer klassifisert som en antatte domene/epitope. Det siste trinnet i Interactome-Seq rørledningen er utdata (figur 5A - violet-boksen), en liste over mulige domener genereres i atskilt tabellformat. Interactome-Seq rørledningen er inkludert i en web-verktøyet slik at brukere uten bioinformatikk eller programmering Interactome-Seq analysere gjennom det grafiske grensesnittet og vise resultatene i en enkel og brukervennlig format. Som vist i figur 5B, vises produksjon resultatene av en analyse med JBrowse32 aktivere visualisering og utforsking. Interactome-Seq genererer spor i genomet leseren tilsvarer antatte domener oppdaget og gir også klassisk diagram for å vise skjæringspunktet mellom antatte domenene beriket for eksempel forskjellige valg eksperimenter.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over de viktigste trinnene for bygging av biblioteket ORF-filtrering
A) DNA fra annen kilde er sonicated og fragmentert i tilfeldig fragmenter av 150-750 bp lengde. Fragmenter gjenopprettes fra gel og klonet som sløv inn pFILTER vektor; B) Filtreringstrinnet bruker β-lactamase som folding reporter. Vektor inneholder ikke ORF fragmenter velges negativt på ampicillin mens ORF klonet fragmenter tillate kolonier å vokse; C) bruk av en økende seleksjonspress (ampicillin konsentrasjon i solid vekst medier fra 0 til > 100 μg/mL) tillate valg av bedre foldet fragmenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk oversikt over de viktigste trinnene for bygging av phage biblioteket
A) ORF-filtrert fragmenter er kuttet ut angrepsvektorene i filtrert ved hjelp av spesielle begrensning enzymer. Etter utvinning og rensing, er fragmenter klonet inn phagemid vektor og forvandlet; B) phagemid bakteriell biblioteket er infisert med hjelper phage og etter overnatting vekst, phages er PEG-igangsatte og samlet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: ORF biblioteker sekvensering
Sekvensering utføres på både det opprinnelige ORF valgte biblioteket og phage vise biblioteket; 1) på begge tilfeller kolonier vokst gjenopprettes og DNA utdraget; 2) DNA fragmenter er gjenopprettet med forsterkning med bestemte primere knyttet til adaptere for sekvensering; 3-4) fragmenter er gjenopprettet og dyp sekvensielt med NGS; 5) data er analysert ved hjelp av Interactome-Seq rørledningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Skjematisk oversikt over biblioteket utvalg med pasienter antistoffer
Phage bibliotek brukes til valg mot antistoffer fra pasienter sera. Antistoffer er immobilized på magnetiske perler, phage biblioteket fange/valget er utført, tre sykluser av vasker utføres og etterpå valgte phages gjenopprettes og brukes til å re-infisere E. coli. Re-infisert E. coli celler er belagt i seleksjonspress (ampicillin 100 μg/mL). ORF fragmenter er gjenopprettet med forsterkning og amplicon bassenger er deretter sekvensert av NGS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Skjematisk oversikt over biblioteket analyse
A) representasjon av data analyse arbeidsflyten fra FASTQ råfiler til listene siste kommenterte domener; B) skjematisk fremstilling av innganger og utganger av Interactome-Seq web-verktøyet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Etableringen av et høykvalitets svært variert ORFs filtrert bibliotek er første viktige skritt i hele prosedyren siden det vil påvirke alle påfølgende trinnene i rørledningen.

En viktig fordel funksjon i vår metode er at noen kilde (intronless) DNA (cDNA, genomisk DNA, PCR avledet eller syntetiske DNA) er egnet for biblioteket konstruksjon. Den første parameteren som bør tas i betraktning er at lengden på DNA fragmenter klonet inn pFILTER vektor bør gi en representasjon av hele samlingen av domener av et genom eller en transcriptome, den såkalte "domainome". Vi har vist at protein kan være er fullført, merket og endelig identifisert starter fra DNA fragmenter med en lengde distribusjon spenner fra 150 til 750 bp33,34, og dette er i tråd med hva rapporteres i litteraturen at de fleste protein-domener er 100 aa lengde (med et utvalg fra 50 til 200 aa)15.

DNA starter materiale må fragmenteres i størrelse rekkevidde valgfrihet og senere klonet i filtrering (pFILTER)12 vektoren. Under disse trinnene, kan potensielle skjevhet unngås maksimere effektiviteten i alle kloning trinn reaksjoner inkludert i protokollen bestemt fragment slutten-reparasjon og fosforylering. Vector forberedelsene er utfordrende og gjøres under optimale forhold også, å unngå både plasmider fornedrelse og/eller forurensning av ufordøyd vektor.

Når biblioteket er opprettet, bør det "filtrert" for å beholde bare ORFs foldet fragmenter. En viktig parameter å modulere dette trinnet er selektiv press påføres som kan endres i henhold til stringens av filtreringen ønsket. Utvalg utføres ved hjelp av ampicillin: Jo høyere konsentrasjon brukes, jo lavere antall transformert bakterier kolonier kunne overleve. Dette gjenspeiler evne til filtrering metoden du velger for god-mot fattige-mappen ORFs34. Denne reduksjonen i antall kloner er balansert av økningen i folding egenskapene for valgte fragmenter. Vanligvis bør ampicillin konsentrasjonen være nok til å redusere til ca 1/20 antall bakteriell koloniene forhold som kan hente voksende biblioteket på chloramphenicol bare.

Biblioteket Godkjenningen utføres vanligvis av PCR forsterkning av tilfeldig plukket kolonier og deres sekvensering. PCR forsterkning av noen koloniene er foreslått for å få en rask estimering av kvaliteten på biblioteket: skivene bør bli i forventet størrelsesorden 150-750 bp og forskjellige koloniene bør presentere setter inn med forskjellige størrelse angir god biblioteket forberedelse inne frist av variasjon. Denne konvensjonelle strategi for screening, når den brukes som eneste metode for biblioteket validering, er ikke omfattende og tidkrevende, slik at analyse av bare et begrenset antall kolonier og har en stor sjanse for mangler de fleste viktige kloner. Vår tilnærming er basert på dyp sekvensering av biblioteket, dette gir fullstendig informasjon på biblioteket mangfold og overflod og presis kartlegging av hver av de valgte fragmentene.

Gjennomføringen av NGS teknologi med filtrering tilnærming øker deepness analyse ved flere størrelsesordener. Vi har nylig optimalisert protokollen for sekvensering ORF bibliotekene ved hjelp av Illumina plattformen og utviklet en bestemt web-verktøy for dataanalyse som gjør analysen av disse typer data for hver bruker uten noen bioinformatikk programmering.

Biblioteket "per se" er en "universell instrument" og kan utnyttes i ulike sammenhenger for protein uttrykk og/eller utvalg. Vår metodologiske tilnærming er basert på overføring av produsert ORFeome inn i en phage visning sammenheng. Proteinfragmenter uttrykkes på phage overflaten og ble egnet for senere valg.

Dette gjøres ved å redde de filtrerte ORFs fra pFILTER biblioteket av fordøyelse med bestemte restriksjoner enzymer og re kloning dem til en kompatibel phagemid vektor slik at deres sammensmelting med phage protein g3p.

Når phagemid-ORF biblioteket er opprettet, kan det brukes til markeringen mot forskjellige mål, for eksempel antatte bindende protein10 eller renset antistoffer35,36 som beskrevet her. Siden phage partikler vises på overflaten deres de filtrerte ORFs, dette resulterer i en mye mer effektiv utvalg prosedyre på grunn av fravær av ikke-vise kloner som vanligvis kjøre forbi den.

Etter at phage skjerm ORF biblioteket, kan produksjonen kloner sekvensert og analyseres med den samme rørledningen. NGS gir en fullstendig og statistisk signifikant rangeringen av mest ofte valgt ORFs og dette gir identifikasjon av proteiner hovedsakelig samspill med agnet brukes. Overlappingen mellom forskjellige sekvensert kloner gitt tilstedeværelsen av mange forskjellige versjoner av hvert domene forskjellig med noen aminosyrer, og identifiserer også minimum fragment/domenet viser bindingsegenskapene. Til slutt, takk til koblingen av genotype og fenotypen informasjon inn i phage biblioteket, når domener av valget har blitt identifisert, DNA sekvensen kan lett reddes fra biblioteket for videre studier i vitro og i vivo validering og karakterisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra den italienske utdannings- og University (2010P3S8BR_002 til CP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sonopuls ultrasonic homogenizer Bandelin HD2070 or equivalent
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder Thermo Scientific SM0321 or equivalent
GeneRuler 1 kb DNA Ladder Thermo Fisher Scientific SM0311 or equivalent
Molecular Biology Agarose BioRad 161-3102 or equivalent
Green Gel Plus Fisher Molecular Biology FS-GEL01 or equivalent
6x DNA Loading Dye Thermo Fisher Scientific R0611 or equivalent
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 or equivalent
Quick Blunting Kit New England Biolabs E1201S
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific 4368813
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs S1420S or equivalent
QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 or equivalent
EcoRV New England Biolabs R0195L
Antarctic Phosphatase New England Biolabs M0289S
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202T
Sodium Acetate 3M pH5.2 general lab supplier
Ethanol for molecular biology Sigma-Aldrich E7023 or equivalent
DH5aF' bacteria cells Thermo Fisher Scientific
0,2 ml tubes general lab supplier
1,5 ml tubes general lab supplier
0,1 cm electroporation cuvettes Biosigma 4905020
Electroporator 2510 Eppendorf
2x YT medium Sigma-Aldrich Y1003
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
DreamTaq DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific EP0702
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix New England Biolabs N0447S
96-well thermal cycler (with heated lid) general lab supplier
150 mm plates general lab supplier
100 mm plates general lab supplier
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
BssHII New England Biolabs R0199L
NheI New England Biolabs R0131L
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 or equivalent
M13KO7 Helper Phage GE Healthcare Life Sciences 27-1524-01 
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma-Aldrich K1377
Polyethylene glycol (PEG) Sigma-Aldrich P5413
Sodium Cloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
PBS general lab supplier
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Thermo Fisher Scientific 10003D or equivalent
MagnaRack Magnetic Separation Rack Thermo Fisher Scientific CS15000 or equivalent
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Nonfat dried milk powder EuroClone EMR180500
KAPA HiFi HotStart ReadyMix  Kapa Biosystems, Fisher Scientific 7958935001
AMPure XP beads Agencourt, Beckman Coulter A63881
Nextera XT dual Index Primers Illumina FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004
MiSeq or Hiseq2500 Illumina
Spectrophotomer Nanodrop
Agilent Bioanalyzer or TapeStation Agilent
Forward PCR primer general lab supplier 5’ TACCTATTGCCTACGGCA
GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3’
Reverse PCR primer general lab supplier 5’ TGGTGATGGTGAGTACTA
TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3’
Forward primer for NGS general lab supplier 5’ TCGTCGGCAGCGTCAGA
TGTGTATAAGAGACAGGCA
GCAAGCGGCGCGCATGC 3’;
Reverse primer for NGS general lab supplier 5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGA
TGTGTATAAGAGACAGGGG
ATTGGTTTGCCGCTAGC 3’;

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Loman, N. J., Pallen, M. J. Twenty years of bacterial genome sequencing. Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).
  2. Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations. BMC Bioinformatics. 8 (1), 170 (2007).
  3. Andorf, C., Dobbs, D., Honavar, V. Exploring inconsistencies in genome-wide protein function annotations: a machine learning approach. BMC Bioinformatics. 8 (1), 284 (2007).
  4. Wong, W. -C., Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. More Than 1,001 Problems with Protein Domain Databases: Transmembrane Regions, Signal Peptides and the Issue of Sequence Homology. PLoS Comput Biol. 6 (7), e1000867 (2010).
  5. Bioinformatics, B., et al. Identification and correction of abnormal, incomplete and mispredicted proteins in public databases. BMC Bioinformatics. 9 (9), (2008).
  6. Phizicky, E., Bastiaens, P. I. H., Zhu, H., Snyder, M., Fields, S. Protein analysis on a proteomic scale. Nature. 422 (6928), 208-215 (2003).
  7. DiDonato, M., Deacon, A. M., Klock, H. E., McMullan, D., Lesley, S. A. A scaleable and integrated crystallization pipeline applied to mining the Thermotoga maritima proteome. J Struct Funct Genomics. 5 (1-2), 133-146 (2004).
  8. Nordlund, P., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  9. Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. Selecting open reading frames from DNA. Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).
  10. Di Niro, R., et al. Rapid interactome profiling by massive sequencing. Nucleic Acids Res. 38 (9), e110 (2010).
  11. Gourlay, L. J., et al. Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).
  12. D'Angelo, S., et al. Filtering "genic" open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation. BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).
  13. D'Angelo, S., et al. Profiling celiac disease antibody repertoire. Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).
  14. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).
  15. Heger, A., Holm, L. Exhaustive enumeration of protein domain families. J Mol Biol. 328 (3), 749-767 (2003).
  16. Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. Selecting open reading frames from DNA. Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).
  17. Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection. Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).
  18. Patrucco, L., et al. Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome). RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).
  19. Collins, M. O., Choudhary, J. S. Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry. Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).
  20. Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).
  21. Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif. J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).
  22. Deng, S. J., et al. Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display. J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).
  23. Danner, S., Belasco, J. G. T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries. Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).
  24. Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).
  25. Patrucco, L., et al. Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome). RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).
  26. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. Mol Biol. 1 (2), 146 (2003).
  27. Sblattero, D., Bradbury, A. Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries. Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).
  28. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  29. Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10 (1), 421 (2009).
  30. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  31. Quinlan, A. R. BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis. Curr Protoc Bioinforma. , (2014).
  32. Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. JBrowse: A next-generation genome browser. Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).
  33. Gourlay, L. J., et al. Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).
  34. D'Angelo, S., et al. Filtering "genic" open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation. BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).
  35. Di Niro, R., et al. Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display. Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).
  36. D'Angelo, S., et al. Profiling celiac disease antibody repertoire. Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).

Tags

Biologi problemet 140 Phage skjerm neste generasjons sekvensering Interactome Protein domene web-verktøy folding reporter proteinstruktur.
Interactome-Seq: En protokoll for Domainome biblioteket konstruksjon, validering og utvalg av Phage Display og neste generasjons sekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soluri, M. F., Puccio, S., Caredda,… More

Soluri, M. F., Puccio, S., Caredda, G., Grillo, G., Licciulli, V. F., Consiglio, A., Edomi, P., Santoro, C., Sblattero, D., Peano, C. Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e56981, doi:10.3791/56981 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter