Biology

Interactome-Seq: En protokol til Domainome bibliotek konstruktion, validering og udvælgelse af Phage Display og næste Generation Sequencing

Published: October 3, 2018 doi: 10.3791/56981

Maria Felicia Soluri¹, Simone Puccio², Giada Caredda², Giorgio Grillo³, Vito Flavio Licciulli³, Arianna Consiglio³, Paolo Edomi⁴, Claudio Santoro¹, Daniele Sblattero⁴, Clelia Peano^5,6

¹Department of Health Sciences, Università del Piemonte Orientale & IRCAD, Novara, Italy, ²Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Segrate, Milan, Italy, ³Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Bari, Italy, ⁴Department of Life Sciences, University of Trieste, Italy, ⁵Institute of Genetic and Biomedical Research, National Research Council, Rozzano, Milan, Italy, ⁶Humanitas Clinical and Research Center, Rozzano, Milan, Italy

Summary

De protokoller er beskrevet tillader opbygning, karakterisering og udvælgelse (mod mål på valg) af en "domainome" bibliotek fra DNA-kilder. Dette opnås ved en forskning rørledning, der kombinerer forskellige teknologier: phage display, en falsning reporter og næste generation sequencing med en web-værktøj til dataanalyse.

Abstract

Folde reportere er proteiner med let identificerbare fænotyper, såsom antibiotikaresistens, hvis folde og funktion er kompromitteret når smeltet til dårligt folde proteiner eller tilfældige åbne læserammer. Vi har udviklet en strategi hvor, ved hjælp af TEM-1 β-lactamase (det enzym der giver ampicillin-resistensen) på en genomisk skala, kan vi vælge samlinger af korrekt foldet protein domæner fra den kodende del af DNA af enhver intronless genom. Protein fragmenter opnået ved denne tilgang, den såkaldte "domainome", vil være udtrykt og opløselig, hvilket gør dem egnet til strukturelle/funktionelle studier.

Ved kloning og viser "domainome" direkte i en phage displaysystem, har vi viste, at det er muligt at vælge bestemte protein domæner med de ønskede bindende egenskaber (f.eks., at andre proteiner eller antistoffer), hvilket giver væsentlig eksperimentelle information til gen annotation eller antigen identifikation.

Identifikation af de mest beriget kloner i valgte polyklonale indbyggere kan opnås ved hjælp af nye næste generation sequencing teknologier (NGS). Af disse grunde har indføre vi dyb sekventering analyse af selve biblioteket og udvalg udgange til at give komplette oplysninger om mangfoldighed, tæthed og præcis kortlægning af hver af de valgte fragment. Protokollerne præsenteres her viser de vigtigste skridt for bibliotek opbygning, karakterisering og validering.

Introduction

Her, beskriver vi en høj overførselshastighed metode for byggeri og udvælgelse af biblioteker af foldede og opløseligt protein domæner fra enhver genic/genomisk start kilde. Metoden kombinerer tre forskellige teknologier: phage display, brug af folde reporter og næste generation sequencing (NGS) med en bestemt web-værktøj til dataanalyse. Metoderne, der kan bruges i mange forskellige sammenhænge af protein-baseret forskning, til identifikation og anmærkning af nye proteiner/protein domæner, karakterisering af strukturelle og funktionelle egenskaber af kendte proteiner samt definitionen af protein-interaktion netværk.

Mange åbne spørgsmål er stadig til stede i protein-baseret forskning og udvikling af metoder til optimal protein produktion er et vigtigt behov for flere områder af undersøgelsen. For eksempel, på trods af tilgængeligheden af tusindvis af prokaryote og eukaryote genomer¹er en tilsvarende kort over den relative proteomes med en direkte kommentering af kodede proteiner og peptider stadig mangler for de fleste organismer. Katalog af komplet proteomes fremstår som et udfordrende mål, der kræver en stor indsats med hensyn til tid og ressourcer. Guldstandarden for eksperimenterende anmærkningen forbliver kloning af alle de åbne læserammer (ORFs) af en genom, opbygning af den såkaldte "ORFeome". Genfunktion tildeles normalt baseret på homologi relaterede gener kendt aktivitet, men denne fremgangsmåde er dårligt præcis på grund af tilstedeværelsen af mange forkerte anmærkninger i reference databaser²^,³^,⁴^, ⁵. Desuden, selv for proteiner, der er blevet identificeret og kommenteret, yderligere undersøgelser er nødvendige at opnå karakterisering med hensyn til overflod, udtryk mønstre i forskellige sammenhænge, herunder strukturelle og funktionelle egenskaber som interaktion netværk.

Desuden, da proteiner er sammensat af forskellige domæner, hver af dem viser specifikke funktioner og anderledes bidrager til protein funktioner, undersøgelsen og den nøjagtige definition af disse domæner kan tillade en mere omfattende billede, både på indre gen og i fuld genom. Alle disse nødvendige oplysninger gør protein-baseret forskning en bred og udfordrende område.

I dette perspektiv er kunne et vigtigt bidrag gives af uvildige og høj overførselshastighed metoder til protein produktion. Men succesen af sådanne fremgangsmåder, ved siden af de betydelige investeringer, bygger på evnen til at producere opløselige/stabil protein konstruktioner. Dette er en stor begrænsende faktor, da det er blevet anslået, at kun omkring 30% af proteiner kan udtrykkes med succes og produceret på et tilstrækkeligt niveau være eksperimentelt nyttige⁶^,⁷^,⁸. En metode til at overvinde denne begrænsning er baseret på brugen af tilfældigt fragmenterede DNA til at producere forskellige polypeptider, som tilsammen udgør overlappende fragment repræsentation af enkelte gener. Kun en lille procentdel af tilfældigt genererede DNA fragmenter er funktionelle ORFs, mens det store flertal af dem er ikke-funktionelle (på grund af tilstedeværelsen af stop kodon inde deres sekvenser) eller indkode for un-naturlige (ORF i en ramme end oprindelige) polypeptider med ingen biologiske betydning.

For at løse alle disse problemer, har vores gruppe udviklet en høj overførselshastighed protein udtryk og interaktion analyse platform, der kan bruges på en genomisk skala⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Denne platform integrerer de følgende teknikker: 1) en metode til at vælge samlinger af korrekt foldet protein domæner fra den kodende del af DNA fra enhver organisme; 2) phage display-teknologi til at vælge partnere af interaktioner; 3) NGS helt karakterisere den hele interactome under undersøgelse og identificere kloner af interesse; og 4) en web-værktøj til analyse af data for brugere uden Bioinformatik eller programmering færdigheder til at udføre Interactome-Seq analyse på en nem og brugervenlig måde.

Brugen af denne platform tilbyder vigtige fordele i forhold til alternative strategier af undersøgelsen; først og fremmest er metoden helt objektiv, høj overførselshastighed og modulære for undersøgelse spænder fra et enkelt gen op til en samlede genom. Det første trin af rørledningen er oprettelsen af et bibliotek fra tilfældigt fragmenterede DNA under undersøgelsen, som er så dybt præget af NGS. Dette bibliotek er genereret ved hjælp af en manipuleret vektor hvor gener/fragmenter af interesse er klonet mellem et signal sekvensen for protein sekretion i periplasmic plads (dvs., Sec førende) og TEM1 β-lactamase-gen. Fusion protein vil tillægge ampicillin-resistens og evnen til at overleve under ampicillin pres kun hvis klonede fragmenter er i-frame med både disse elementer og den heraf følgende fusion protein er korrekt foldet¹⁰^,¹³ ^,¹⁴. Alle kloner reddet efter antibiotika valg, den såkaldte "filtreret kloner", er ORFs og et stort flertal af dem (mere end 80%), stammer fra virkelige gener⁹. Desuden ligger kraften i denne strategi i de resultater, at alle ORF filtreret kloner kodning for korrekt foldet/opløselige proteiner/domæner¹⁵. Som mange kloner, findes i den bibliotek og kortlægning i den samme region/domæne, har forskellige udgangspunkt og slutpunkt, giver dette uvildig, trinvis identifikation af minimum fragmenter, der er tilbøjelige til at resultere i opløselige produkter.

En yderligere forbedring af teknologien, der er givet ved brug af NGS at karakterisere biblioteket. Kombinationen af denne platform og af en bestemt web-værktøj til analyse af data giver vigtige upartiske oplysninger om de nøjagtige nukleotidsekvenser og placeringen af udvalgte ORFs på reference DNA under undersøgelsen uden behov for yderligere omfattende analyser eller eksperimentelle forsøg.

Domainome biblioteker kan overføres til et udvalg sammenhæng og anvendes som et universelt instrument til at udføre funktionelle studier. Høj overførselshastighed protein udtryk og interaktion analyse platformen, vi integreret, og som vi kaldte Interactome-Seq udnytter phage display teknologi ved at overføre de filtrerede ORF i en phagemid vektor og skabe en phage-ORF bibliotek. En gang igen klonet i forbindelse phage display, protein domæner vises på overfladen af M13 partikler; på denne måde kan domainome biblioteker vælges direkte for gen fragmenter kodning domæner med specifikke enzymaktiviteter eller bindende egenskaber, så interactome netværk profilering. Denne tilgang blev først beskrevet af Zacchi et al. ¹⁶ og senere brugt i flere andre sammenhæng¹³^,¹⁷^,¹⁸.

Sammenlignet med andre teknologier, der anvendes til at undersøge protein-protein interaktion (herunder gær to hybridsystem og massespektrometri¹⁹^,²⁰), er en stor fordel forstærkning af den bindende partner, der opstår under phage vise flere runder af udvalg. Dette øger udvalg følsomheden således identifikation af lav rigelige bindende proteiner domæner i biblioteket. Effektiviteten af valget udført med ORF-filtreret bibliotek er yderligere steget på grund af manglen på ikke-funktionelle kloner. Endelig tillader teknologien udvalg skal udføres mod både protein og ikke-protein lokkemad²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵.

Phage valg ved hjælp af domainome-phage biblioteket kan udføres ved hjælp af antistoffer kommer fra sera af patienter med forskellige patologiske tilstande, fx autoimmune sygdomme¹³, kræft eller infektion sygdomme som madding. Denne fremgangsmåde anvendes til at opnå den såkaldte "antistof signatur" af sygdom under undersøgelsen gør det muligt at massivt identificere og karakterisere antigener/epitoper specifikt anerkendt af patienternes antistoffer på samme tid. Sammenlignet med andre metoder til brug af phage display giver mulighed for identifikation af både lineære og konformationelle antigene epitoper. Identifikation af en bestemt signatur kunne potentielt har stor betydning for forståelse patogenese, ny vaccine design, identifikation af nye terapeutiske mål og udvikling af nye og specifikke diagnostiske og prognostiske værktøjer. Desuden, når undersøgelsen er fokuseret på smitsomme sygdomme, en stor fordel er, at opdagelsen af immunogen proteiner er uafhængig af patogenet dyrkning.

Vores tilgang bekræfter at folde journalister kan bruges på en genomisk skala for at vælge "domainome": en samling af korrekt foldet, godt udtryk, opløseligt protein domæner fra den kodende del af DNA og/eller cDNA fra enhver organisme. En gang isolerede protein fragmenter er nyttige til mange formål, vigtige eksperimentelle oplysning til gen anmærkning samt med hensyn til strukturelle studier, antistof epitop kortlægning, antigen identifikation, osv. Fuldstændigheden af høj overførselshastighed data fra NGS muliggør analysen af meget komplekse prøver, såsom phage display biblioteker, og rummer potentiale til at omgå den traditionelle møjsommeligt picking og testning af individuelle phage reddet kloner.

På samme tid takket være funktioner af filtrerede biblioteket og til den ekstreme følsomhed og kraft af NGS analyse er det muligt at identificere det protein domæne ansvarlig for hver interaktion direkte i en indledende skærm, uden at skulle oprette ekstra biblioteker for hver bundet protein. NGS giver mulighed for at opnå en omfattende definition af den hele domainome af enhver genic/genomisk start kilde og data analyse web tool muliggør opnåelse af en meget specifik Karakteristik fra et kvalitativt og kvantitativt synspunkt af de interactome proteiner domæner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. opførelse af ORF bibliotek (figur 1)

Forberedelse af Indsæt DNA
1. Fragmenter forberedelse fra syntetisk eller genomisk DNA
  1. Uddrag/rense DNA ved hjælp af standard metoder²⁶.
  2. Fragment DNA ved hjælp af sonikering. Hvis ved hjælp af en standard sonikator, som en generel henstilling start med 30 s pulser på 100% power output.
    Bemærk: Pilot forsøg bør gøres med forskellige power og sonikering gange for at indstille de optimale betingelser for DNA forberedelse. Efter hver test bestemme størrelsen af DNA-fragmenter ved agarosegelelektroforese gelelektroforese.
  3. Indlæse sonicated DNA på 1,5% agarosegel, sammen med en 100 bp DNA ladder. Udføre en kort elektroforese køre på 5 V/cm til 15 min og skære del af gel med smear af fragmenterede DNA.
  4. Rense Indsæt DNA med en kolonne-baseret gel udvinding kit og måle koncentrationen ved hjælp af en UV Spektrofotometer.
    Bemærk: mindst 500 ng af renset skær bør opnås efter dette trin, at være forbundet med 1 µg af fordøjet vektor, som beskrevet i trin 1.3. Kontrollere kvaliteten af fragmenter forberedelse ved at evaluere en_260nm/A_280nm og en_260nm/A_230nm nøgletal da lav kvalitet af prøven vil påvirke ligatur effektivitet.
  5. Behandle op til 5 μg af skærene med 1 μL af hurtig forfladige Kit enzym mix, ifølge producentens anvisninger. Inaktivere enzymer ved opvarmning på 70 ° C i 10 min. prøver kan opbevares ved-20 ° C indtil brug.
2. Fragmenter forberedelse fra cDNA
  1. Uddrag RNA med standard metoder (f.eks. ved hjælp af TRizol eller lignende reagenser).
  2. Fragment mRNA ved opvarmning inden du udfører reverse transkription. Den endelige DNA fragment længde styres af mRNA kogende tid og tilfældig primer koncentration. For eksempel, varme prøve i 6 min. ved 95 ° C.
  3. Forberede cDNA ved hjælp af tilfældige primere med enhver tilgængelig kit efter producentens protokol.
  4. Nedbryder cDNA af poly-dT haler ved hybridisering med biotinylated poly-dA i 3 timer ved 37 ° C, og Adskil på streptavidin magnetiske perler, som beskrevet af Carninci et al. ¹³
  5. Genskab ubundne materiale og rense med en kolonne-baseret DNA rensning kit efter fabrikantens anvisninger. Måle koncentrationen ved hjælp af en UV Spektrofotometer. Se Note taktfast 1.1.1.4.
Forberedelse af den filtrering vektor
1. Digest 5 µg renset kloning af vektor pFILTER3¹² med 10 U af EcoRV begrænsning enzym, følgende producentens protokol.
2. Indlæse 2 µL (200 ng) af fordøjet vektoren, sammen med 100 ng af ufordøjet vektor og 1 k bp Molekylær markør, på en 1% agarosegel, skal kontrolleres for korrekt fordøjelse. Varme inaktivere begrænsning enzym.
3. Tilføj 1/10 bind 10 x fosfatase buffer og 1 µL (5 U) af fosfatase og inkuberes ved 37 ° C i 15 min. varme inaktivere i 5 min. ved 65 ° C.
4. Rense fordøjet plasmid ved ekstraktion fra agarosegel, og måle koncentrationen ved hjælp af en UV Spektrofotometer. Prøver kan opbevares ved-20 ° C indtil brug.
Ligatur og transformation
1. Udføre ligatur som følger: for 1 µg af fordøjet plasmid tilføje 400 ng af fosforyleres skær (plasmid: Indsæt molære forhold 1:5), 10 µL af 10 x Buffer for T4 DNA Ligase, 2 µL af høj koncentration T4 DNA ligase i en endelige rumfang af 100 µL. Inkuber reaktion på 16 ° C overni GHT. Varme inaktivere ved 65 ° C i 10 min.
2. Bundfald ligatur produkt ved at tilføje 1/10 bind natriumacetatopløsning (3 M, pH 5,2) og 2,5 mængder af 100% ethanol. Bland og fryse ved-80 ° C i 20 min.
3. Der centrifugeres ved tophastighed i 20 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
4. Tilsæt 500 µL koldt 70% ethanol til pellet og centrifugeres ved maksimal hastighed i 20 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
5. Luft tørre pellet. Resuspend udfældet DNA i 10 µL vand.
6. Udføre bakteriel celle elektroporation.
  Bemærk: Brugen af højeffektiv celler (over 5 x 10⁹ transformants pr. µg DNA) er påkrævet. Vi foreslår at bruge Escherichia coli DH5αF' (F'/ endA1 hsd17 (rK − mK +) supE44 thi-1recA1 gyrA (Nalr) relA1 (lacZYA-argF) U169 deoR (F80dlacD-(lacZ)M15) produceret i hus eller købt fra flere producenter.
  1. Placere passende antal microcentrifuge rør og 0,1 cm-elektroporation kuvetter på is. Tilføje 1 µL af renset ligatur løsning (i DI vand) til 25 µL af cellerne og svirp rør et par gange.
  2. Overføre DNA-celle blandingen til den kolde kuvette, tryk på køkkenbordet 2 x, tørre vand fra ydersiden af kuvette, sted i elektroporation modul og presse pulsen.
  3. Udføre elektroporation med en standard electroporator maskine ved hjælp af 25 µF, 200 Ω og 1,8 kV. Tid konstant skal være 4-5 ms.
7. Straks tilsættes 1 mL flydende 2xYT medium uden nogen antibiotikum, overføre til en 10 mL rør og giver mulighed for at vokse ved 37 ° C, rysten på 220 rpm i 1 h.
8. Plade forvandlet DH5αF' på 15 cm 2xYT agar plader suppleret med 34 µg/mL chloramphenicol (pFILTER modstand) og 25 µg/mL ampicillin (selektiv markør for ORFs), og der inkuberes natten over ved 30 ° C.
9. Plade fortyndinger af bibliotek på 10 cm 2xYT agar plader suppleret med chloramphenicol + ampicillin og chloramphenicol kun, at udføre bibliotek titrering. Der inkuberes natten over ved 30 ° C.
pFILTER-ORF bibliotek validering
1. Test 15-20 kolonier fra både chloramphenicol og chloramphenicol/ampicillin plader til at anslå Indsæt størrelse distribution. Vælge enkelt kolonier med en spids og udvande dem separat i 100 µL af 2xYT medium uden antibiotika. Bruge 0,5 µL af denne løsning som DNA skabelon for en PCR reaktion, med enhver standard TaqDNA polymerase efter producentens protokol.
2. Udføre 25 cyklusser af forstærkning ved hjælp af en T Udglødning af 55 ° C og en udvidelse af 40 s på 72 ° C. Primer sekvenser er givet i Tabel af materialer.
3. Indlæse PCR produkter på 1,5% agarosegel, sammen med en 100 bp DNA ladder og køre.
pFILTER-ORF bibliotekssamlingen
1. Indsamle bakterier fra 150 mm plader ved tilsætning af 3 mL af friske 2xYT medium og høst dem med en steril skraber, blandes grundigt, supplere dem med 20% steril glycerol og opbevares ved-80 ° C i små prøver.
2. Rense plasmid DNA fra en alikvot af bibliotek (før tilsætning af glycerol) ved hjælp af en kolonne-baserede plasmid udvinding kit, efter fabrikantens anvisninger.
3. Måle koncentrationen med UV Spektrofotometer. Prøver kan opbevares ved-20 ° C indtil bruges til phagemid bibliotek forberedelse og/eller karakterisering af NGS.

2. subcloning af filtrerede ORFs i en Phagemid vektor (figur 2)

Forberedelse af ORF filtreret DNA fragmenter
1. Oprette begrænsning enzym fordøjelsen af 5 µg af renset vektor fra pFILTER-ORF bibliotek vector tilføjer 10 U i BssHII og inkubere som pr fabrikantens protokol. Inaktivere det enzym og fordøje med 10 U i NheI.
2. Indlæse fordøjet DNA på 1,5% agarosegel, sammen med en 100 bp DNA ladder. Udføre en kort elektroforese køre på 5 V/cm til 15 min eller bare nok at skelne udstrygningspræparat af skåret fragmenter og skære del af gelen indeholdende dem.
3. Rense Indsæt DNA med en kolonne-base gel udvinding kit og måle koncentrationen ved hjælp af en UV Spektrofotometer.
Forberedelse af phagemid DNA
1. Oprette begrænsning enzym fordøjelsen af 5 µg renset pDAN5²⁷ som indsætter.
2. Rense fordøjet plasmid af kører fordøjet DNA på en 0,75%-agarosegel og uddrag fra gel med en kolonne-baserede kit.
3. Måle koncentrationen ved hjælp af en UV Spektrofotometer. Prøver kan opbevares ved-20 ° C indtil brug.
Biblioteket ligatur, transformation og samling
1. Udføre ligatur og transformation som beskrevet for pFILTER vektor.
2. Plade forvandlet DH5αF' på 150 mm 2xYT agar plader suppleret med 100 µg/mL ampicillin og inkuberes natten over ved 30 ° C.
3. Plade fortyndinger af bibliotek på 100 mm 2xYT agar plader suppleret med 100 µg/mL ampicillin at afgøre størrelsen bibliotek.
4. Udføre bibliotek validering af PCR af tilfældigt plukkede kloner, som beskrevet i trin 1.4.
5. Indsamle phagemid-ORF bibliotek ved høst bakterier fra 150 mm plader, blandes grundigt, supplere dem med 20% steril glycerol og opbevares ved-80 ° C i små prøver.
6. Rense plasmid DNA fra en alikvot af biblioteket ved hjælp af en kolonne-baserede plasmid udvinding kit, efter fabrikantens anvisninger.
7. Måle koncentrationen på UV Spektrofotometer. Prøver kan opbevares ved-20 ° C indtil anvendes til karakterisering af NGS.

3. phage bibliotek forberedelse og udvælgelsesprocedure

Phage produktion
1. Fortynde en stock alikvot af biblioteket phagemid til 10 mL af 2xYT flydende bouillon suppleret med 100 µg/mL ampicillin for at have en OD_600nm = 0,05.
2. Vokser den fortyndede bibliotek i en steril kolbe 5 - 10 gange større end den oprindelige mængde, ved 37 ° C under omrystning på 220 rpm, indtil når OD_600nm = 0,5.
3. Inficere bakterier med helper phage (f.eks. M13K07) på en mangfoldighed af infektion 20:1. Forlade ved 37 ° C i 45 min med lejlighedsvise agitation (hver 10 min).
4. Der centrifugeres bakterier på 4000 x g i 10 min. ved stuetemperatur. Kassér supernatanten, genopslæmmes bakterier pellet i 40 mL 2xYT flydende bouillon suppleret med 100 µg/mL ampicillin og 50 µg/mL kanamycin og vokse ved 28 ° C under omrystning på 220 rpm for natten.
5. Dagen efter, centrifuge bakterier på 4000 x g i 20 min. ved 4 ° C. Indsamle supernatanten indeholdende phages.
PIND-udfældning af phages.
1. Tilføj 1/5 volumen af et 0,22 µm filtreret PIND/NaCl løsning (20% w/v PLØK 6000, 2,5 M NaCl) de ryddet phages og inkuberes i isbad i 30-60 min.
  Bemærk: Løsningen blev røget efter få minutter, der angiver en vellykket phage nedbør. Uklarhed af løsningen vil øge tiden inkubation.
2. Der centrifugeres ved 4000 x g i 15 min. ved 4 ° C. En hvid lille pellet af phages vil danne.
3. Resuspend det i 1 mL steril PBS. Overføre til 1,5 mL tube og centrifugeres ved 4 ° C i 10 min ved maksimal hastighed til at fjerne forurenende bakterier. En brun pellet vil danne.
4. Overføre supernatanten indeholdende phages til en ny tube. Holde phages på isen for successive titrering og phage udvalg.
Phage titrering
1. Forberede serielle fortyndinger af phage løsning. Sat 10 µL af opløsningen phage i 990 µL af PBS til at få 10^-2 fortynding. Fortynd igen denne forberedelse at gøre 10^-4 og dette får en 10^-6 fortynding.
2. Vokse DH5αF' bakterieceller i 2xYT flydende medium ved 37 ° C under omrystning indtil OD_600nm = 0,5 er nået. Der overføres 1 mL af de forberedte bakterier i 1,5 mL tube og straks inficere med 1 µL af 10^-4 phage fortynding. Inkuber uden rystelser ved 37 ° C i 45 min. Gentag den samme procedure for den 10^-6 fortynding.
3. Plade fortyndinger af inficerede bakterier i 100 mm 2xYT plade. Sætte pladen på 30 ° C natten over.
4. Plade 100 µL af ikke-inficerede DH5αF' på en 2xYT agar plade suppleret med 100 µg/mL ampicillin at kontrollere fraværet af forurening i forberedelsen.
5. Dagen efter tæller antallet af kolonier og beregne phage titer. Express titer som antallet af phages/mL. Forventede titer er 10^12-13 phages/mL.
Phage udvalg
1. Phage markering med madding renset antistoffer
  1. Mætte phages ved at fortynde 200 µL af phage forberedelse til et lige saa stort volumen af PBS - 4% skummetmælk og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur i langsom rotation. Dette trin giver mulighed for blokering af phages for uspecifik bindende. Overføre 30 µL af protein-G belagt magnetiske perler til en 1,5 mL tube.
  2. Vaskes to gange som følger: tilføje 500 µL af PBS, Ruger på et hjul i langsom rotation i 2 min. ved stuetemperatur, tegne perlerne til den ene side af røret ved hjælp af en magnet og Fjern supernatanten.
  3. Inkuber mættede phages med vasket perler i 30 min. ved stuetemperatur med langsom rotation.
  4. Tegne perlerne til den ene side ved hjælp af et magnetfelt. Indsamle supernatanten indeholdende phages skal bruges til valg af trin.
  5. Forberede magnetiske perler mens de udfører de forrige trin, af de tråddannende renset antistoffer. Vask 30 µL af protein-G belagt magnetiske perler, som beskrevet ovenfor. Fortyndet 10 µg renset antistoffer i 500 µL af PBS, føje til de vasket perler og Inkuber i langsom rotation ved stuetemperatur i 45 min. Skyl to gange med PBS.
    Bemærk: Udføre to forskellige præparater af magnetiske perler: en med antistoffer af interesse og en med kontrol antistoffer, fx antistoffer renset fra raske donorer. Sekvens af antigener markeret med antistoffer trækkes under trinnet analyse af output-kontrol. Alternativt, magnetiske perler fyldt med kontrol antistoffer kan bruges til at udføre en pre clearing trin af phages (følge protokollen til udrugning med un-konjugeret perler).
  6. Phage udvalg: tegne perler til den ene side af røret ved hjælp af en magnet, fjerne den sidste vask, tilføje phages og inkuberes med langsom rotation ved stuetemperatur i 90 min. Skyl 5 gange med 500 µL af PBS-0.1% Tween-20 og 5 gange med PBS.
  7. Elueres bundne phages, der repræsenterer output i valget, ved at blande perlerne med 1 mL af DH5αF' celler dyrkes i OD₆₀₀ = 0,5. Inkuber bakterier med perler i 45 min. ved 37 ° C under lejlighedsvis omrystning (hver 10 min). Plade output på en 150 mm 2xYT agar plade suppleret med 100 µg/mL ampicillin.
  8. Plade 100 µL af ufortyndet og af forskellige fortyndinger af output (10^-1 til 10^-5) for at udføre titrering. Dagen efter indsamle bakterier fra 150 mm plader ved tilsætning af 3 mL af friske 2xYT medium og høst dem med en steril skraber, blandes grundigt, supplere dem med 20% steril glycerol og opbevares ved-80 ° C i små prøver.
  9. Vokse en alikvot igen for at udføre en anden runde af valg. Gentag alle panorering fremgangsmåden, som beskrevet ovenfor med undtagelse af vask betingelser. I dette tilfælde vaske 10 gange med PBS - 1% Tween-20 (hæld løsning i glasset og hæld igen straks). Derefter tilsættes 500 µL af PBS og inkuberes på rotation ved stuetemperatur for 10 min. udføre andre 10 vasker med PBS. Fortsætte med eluering skridt med hensyn til den første runde af valg.
  10. Uddrag plasmid DNA fra en alikvot del af produktionen ved hjælp af en kolonne-baserede kit, efter fabrikantens anvisninger. Gemme plasmid ved-20 ° C, indtil det skal bruges til dybe sekvensering.
2. Phage markering med som agn rekombinante proteiner
  1. Mætte phages ved at fortynde 200 µL af phage forberedelse til et lige saa stort volumen af PBS - 4% skummetmælk og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur i langsom rotation.
  2. Tilsæt 100 µL af streptavidin magnetiske perler. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur til at vælge streptavidin-bindende phages. Fjerne streptavidin-bundet phages ved at trække perlerne til den ene side ved hjælp af en magnet. Tage supernatanten fra det forrige trin og tilføje biotinylated protein (i en koncentration på 100-550 nM) og Ruger på en rotor ved stuetemperatur i 30 min. til 1 time.
  3. Forberede magnetiske perler: mens de udfører de forrige trin, vaske 100 µL af streptavidin-magnetiske perler med PBS, resuspend i PBS 2% skummetmælk og inkuberes med rotation ved stuetemperatur i 30 min. til 1 time.
  4. Phage udvalg: tegne perler til den ene side af røret ved hjælp af en magnet, fjerne PBS - 2% mælk og resuspend perler med phage-protein mix. Inkuber med langsom rotation ved stuetemperatur i 90 min.
  5. Gøre perler til den ene side af røret ved hjælp af en magnet, supernatanten og vask dem grundigt fem gange med 500 µL af PBS 0,1% Tween-20. Udføre eluering, som beskrevet i den foregående mødeperiode.

4. phage bibliotek dyb sekventering Platform (figur 3)

DNA indsætter recovery fra pFILTER-ORF-bibliotek, pDAN5-ORF-bibliotek eller valgt-phage-biblioteker
1. Tø en alikvot af biblioteket, kvantificere det ved hjælp af et spektrofotometer, inddrive DNA skær af forstærkning med specifikke primere.
  Bemærk: Primere bruges til at redde skærene er forbundet på deres 5' enden at adaptere sekvenser, således at den efterfølgende indeksering af amplikon pools fremstillet og den direkte sekventering af DNA skær inddrives ved hjælp af sequencere. Deres sekvens er i Tabel af materialer. Adaptere er angivet i fed, og de specifikke primere er angivet i kursiv.
2. Bruge 2,5 µL af biblioteket (pFILTER/phagemid/valgt-phage) som DNA skabelon for en PCR reaktion.
3. Brug følgende program: 95 ° C i 3 min. 25 cykler på 95 ° C til 30 s, 55 ° C til 30 s, 72 ° C i 30 s; 72 ° C i 5 min. Hold ved 4 ° C.
  Bemærk: på dette tidspunkt er det anbefales at køre 1 µL af PCR-produktet på en Bioanalyzer eller TapeStation til at kontrollere størrelsen af amplikoner og kontrollere, at de er i det korrekte område.
PCR oprydning
1. Bringe de magnetiske perler (f.eks. AMPure) til stuetemperatur. Overføre hele PCR produktet fra PCR rør til en 1,5 mL tube. Vortex de magnetiske perler for 30 s til at sikre, at perlerne er jævnt spredt. Tilføj 20 µL af magnetiske perler til hver tube indeholder PCR produkt, mix af forsigtigt pipettering. Inkuber ved stuetemperatur uden omrøring i 5 min.
2. Pladen anbringes på en magnetisk stå i 2 min. eller indtil supernatanten er ryddet. Med PCR-produkter på den magnetiske stå, fjerne og supernatanten.
3. Vaske perler med frisklavede 80% ethanol, med PCR-produkter på magnetisk standen, som følger: tilføje 200 µL af frisklavede 80% ethanol til hver prøve godt; Inkuber plade på den magnetiske står for 3 s; forsigtigt fjerne og supernatanten.
4. Udføre en anden ethanol vask, med PCR-produkter på den magnetiske stand; i slutningen af anden vask omhyggeligt fjerne alle ethanol og lade perlerne til at lufttørre i 10 min.
5. Fjern PCR produkter fra den magnetiske stå, tilføje 17,5 µL af 10 mM Tris pH 8,5 til hver tube, forsigtigt pipetteres op og ned 10 gange, Sørg for, at perlerne er fuldt genopslemmes. Inkuber ved stuetemperatur i 2 min.
6. Røret anbringes på den magnetiske stå i 2 min. eller indtil supernatanten er ryddet, omhyggeligt overføre 15 µL af supernatanten indeholdende de renset PCR produkter til en ny 1,5 mL tube. Gemme de renset PCR produkter til-15 ° C til-25 ° C i op til en uge, hvis du ikke straks gå videre til indeks PCR.
Indeks PCR
Bemærk: Efter PCR rydde op, udføre indeks PCR. Brug Nextera XT indeks kit; således vil det være muligt at sekvens de resulterende dobbelt indekserede biblioteker i multipleksede Illumina kører.
1. Overføre alle de 15 μl hvert produkt indeholdende renset ind i en ny PCR rør og konfigurere følgende reaktion indeholdende: 15 µL af renset amplikon produkt, 5 µL af indeks Primer 1 og 5 µL af indeks Primer 2, 25 µL af 2 x PCR mix; endelige volumen af 50 µL.
2. Udføre PCR på en termisk cycler bruger følgende program: 95 ° C i 3 min, 8 cyklusser af 95 ° C til 30 s, 55 ° C til 30 s, 72 ° C i 30 s; 72° C i 5 min, derefter holde ved 4 ° C.
PCR clean-up 2
1. Følg den samme protokol, der er beskrevet i afsnit 4.2 for PCR rydde op med følgende ændringer: i det første trin tilsættes 56 µL af magnetiske perler til hver 50 µL PCR produkt.
2. Resuspend perlerne i 27,5 µL af 10 mM Tris pH 8,5 i det sidste trin i rensning og overføre 25 µL til en ny tube (dette er renset endelige biblioteket klar til kvantificering og derefter sekventering).
3. Gemme plade til-15 ° C til-25 ° C i op til en uge, hvis ikke fortsætter til biblioteket kvantificering.
Kvalitativ og kvantitativ evaluering af biblioteket sekventering
1. Efter rensning, køre 1 µL af en 1:10 fortynding af den endelige bibliotek på en bioanalyzer til at kontrollere størrelsen og kvantificere det at vælge region af det endelige bibliotek spor.
2. Udføre bibliotek kvantificering af Real Time PCR ved hjælp af et bibliotek kvantificering kit per producentens protokol parallelt.
Biblioteker sekventering
1. Pool dual indekserede bibliotekerne produceret sammen med andre dual indekserede sekventering biblioteker. Sekvens denne slags biblioteket ved at generere længe læser, mindst 250 bp parrede slutningen ved hjælp af både Hiseq2500 eller MiSeq instrumenter til at opnå i den første sag 250bp PE læser og i den anden sag 300 bp PE læser.

5. Bioinformatic dataanalyse ved hjælp af værktøjet Interactome-Seq Web

Analysere læsninger stammer fra pFILTER/phagemid/valgt-phage bibliotek sekventering med Interactome-seq data analyse pipeline. Værktøjet er frit tilgængelig på følgende adresse: http://interactomeseq.ba.itb.cnr.it/

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den filtrering tilgang er skematiserede i figur 1. Hver art af intronless DNA kan bruges. I figur 1A den første del af metoden filtrering er repræsenteret: efter indlæsning på en agarosegel eller en bioanalyzer, en god fragmentering af DNA af interesse vises som et udstrygningspræparat af fragmenter med en længde fordeling i den ønskede størrelse af 150-750 bp. En repræsentativ virtuelle gel billede af fragmenterede DNA opnået er givet. Fragmenter indlæst på agarosegel er derefter genoprettet, ende-repareret og fosforyleret og derefter klones til en tidligere afrundede pFILTER vektor til at skabe et bibliotek af tilfældige DNA-fragmenter. Udfører hvert trin af proceduren kloning under optimale forhold er nødvendigt at få god kvalitet bibliotek med en total dækning af DNA under undersøgelsen.

I figur 1B filtrering tilgang er repræsenteret: biblioteket er vokset chloramphenicol (pFILTER modstand) alene eller chloramphenicol og ampicillin vælge for ORF-holdige kolonier. Eneste kolonier har en DNA-fragment, der svarer til en ORF producere en funktionel β-lactamase og overleve når antibiotika valg er til stede. Figur 1 c viser, hvordan øgede selektiv pres tillader udvalg i gode mappe ORFs versus dårlige mappe ones. Det forventede resultat er et fald på bibliotek størrelse omkring 20-fold. Højere antal overlevende kloner angiver utilstrækkelig selektivt pres.

ORF fragmenter kan nemt inddrives fra de filtrerede bibliotek til senere anvendelse; for interaktion undersøgelser udnytter vores strategi phage display teknologi. I figur 2, de vigtigste trin af phage bibliotek opbygning er repræsenteret: en passende bibliotek er udarbejdet af udskæring filtrerede fragmenter fra pFILTER vektor og re kloning ind i en phagemid plasmid i fusion med den sekvens, der koder for den Phage capside protein g3p. Når inficeret med helper phage, tillader forekomst af vektoren i bakterieceller produktion af phage partikler viser ORF-g3p fusion produkter på deres overflade, hvilket gør den filtrerede bibliotek phage display vælges og yderligere analyse.

Alle biblioteker er dybt analyseret af NGS, samt udgange af phage markeringer, som vist i den anden del af figur 3. DNA fragmenter er reddet fra at dyrke kolonier af PCR-amplifikation med specifikke oligonukleotider udglødning på plasmidet rygraden og bærer specifikke adaptere til sekvenseringen. NGS udføres og læser herefter analyseres med Interactome-Seq data web analyseværktøj.

I figur 4 rapporterede vi en skematisk gengivelse af udvælgelsen af en ORF filtrerede phage display bibliotek. Udvalg i dette eksempel udføres ved hjælp af antistoffer til stede i seraene fra patienter, der lider af forskellige patologier (dvs. infektiøse sygdomme, autoimmune sygdomme, kræft). I dette tilfælde interagerer phage biblioteket direkte med antistoffer til stede i patienternes sera og på denne måde formodede gruppespecifikke antigener kan blive beriget, fordi de er anerkendt af specifikke antistoffer mod sygdom. I denne form for eksperiment, er normalt biblioteket også markeret ved hjælp af kontrol sera fra raske patienter for at have en baggrund signal skal bruges til efterfølgende sammenligning og normalisering procedurer.

Markeringer er udført ved hjælp af sera fra den samme type af patienter normalt grupperet i forskellige puljer for at begrænse indbyrdes individuelle variation af sera antistof titer. Hver pool bruges uafhængigt for to til tre runder i træk af udvalg, til at berige biblioteket for immun-reaktiv kloner specifikke for patologi under undersøgelsen. Test sæt antistoffer er inkuberes med biblioteket phages, immun-komplekser er inddrevet af protein A belagt magnetics-perler og bundne phages er elueret af standard procedurer. Udvalg cyklusser er udført med stigende vask og bindende strenghed.

Læser genereret af NGS kan analyseres ved hjælp af værktøjet Interactome-Seq web specielt udviklet til at håndtere denne type data. Interactome-Seq data analyse arbejdsgang er sammensat af fire sekventielle trin, der starter fra rå sekventering læser, genererer listen over formodede domæner med genomisk anmærkninger (figur 5A). I det første trin INPUT (figur 5A - rød boks) kontrollerer Interactome-Seq hvis inputfiler (rå læsninger, reference genomet sekvens, anmærkning liste) er korrekt formateret. I det andet trin FORBEHANDLER (figur 5A - orange box), lav kvalitet sequencing data er først trimmes ved hjælp af Cutadapt²⁸ afhængigt af kvalitetsresultater og læser med mindre end 100 baser i længden er kasseret. I en efterfølgende læse justering trin (figur 5A - grøn boks), er de resterende læsninger afstemt med blastn²⁹ til genomet sekvens tillader op til 5% af uoverensstemmelser. En SAM fil er genereret og kun læser med kvalitet score større end 30 (Q > 30) behandles ved hjælp af SAMtools³⁰ og omdannet til et BAM fil. Efter justering, Interactome-Seq udfører domæner påvisning (figur 5A - blå boks), påberåbe sig Bedtools³¹ filtrere læser overlappende mindst 80% af deres længde inde afskrifter; dækning, max dybde og fokus værdier beregnes derefter for hver ORF del dækket af kortlægning læser. Dækningen repræsenterer det samlede antal læsninger tildelt et gen; dybden er det maksimale antal læsninger dækker en bestemt genic del; fokus er et indeks, der er fremstillet af forholdet mellem max dybde og dækning, og det kan variere mellem 0 og 1. Når fokus er højere end 0,8, og dækningen er højere end den gennemsnitlige dækning observeret for alle kortlægning regioner i filen BAM er delen cd'er klassificeret som en formodede domæne/epitop. Det sidste trin i Interactome-Seq rørledningen er OUTPUT (figur 5A - violet box), en liste over formodede domæner er genereret i adskilte tabelformat. Interactome-Seq rørledningen er blevet medtaget i en web-værktøj til at give brugere uden Bioinformatik eller programmering færdigheder til at udføre Interactome-Seq analyse gennem den grafiske brugerflade og at opnå deres resultater i et let og brugervenligt format. Som vist i figur 5B, vises output resultaterne af en analyse ved hjælp af JBrowse³² aktivere visualisering og udforskning. Interactome-Seq genererer spor i genom browseren svarende til formodede domæner registreret og giver også klassisk Venn-diagrammer for at vise skæringspunkterne mellem fælles formodede domæner beriget f.eks i forskellige markeringer eksperimenter.

Figur 1: Skematisk oversigt over de vigtigste trin for opførelsen af biblioteket ORF-filtrering
A) DNA fra anden kilde er sonicated og opsplittet i tilfældige fragmenter af 150-750 bp længde. Fragmenter er inddrives fra gel og klonede som stumpe til pFILTER vektor; B) filtrering trin ved hjælp af β-lactamase som folde reporter. Vektor indeholdende ikke ORF fragmenter udvælges negativt på ampicillin mens ORF klonede fragmenter tillade kolonier til at vokse; C) anvendelse af en stigende selektivt pres (ampicillin koncentration i solid vækst medier fra 0 til > 100 μg/mL) tillader udvælgelse af bedre foldede fragmenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Skematisk oversigt over de vigtigste trin til opførelse af phage bibliotek
A) ORF-filtreret fragmenter er skåret ud fra den filtrerede vektor ved hjælp af specifikke restriktionsenzymer. Efter genopretning og rensning, er fragmenter klonet i phagemid vektor og omdannet; B) phagemid bakteriel bibliotek er inficeret med helper phage, og efter natten vækst, phages er PLØK-fældet og indsamlet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: ORF biblioteker sekventering
Sekventering udføres på begge de oprindelige ORF valgte bibliotek samt biblioteket phage display; 1) på begge tilfælde kolonier vokset inddrives og DNA ekstraheret; 2) DNA fragmenter er inddrevet af forstærkning ved hjælp af specifikke primere knyttet til adaptere til sekvensering; 3-4) fragmenter er genvundet og dyb sekventeret bruger NGS; 5) data er analyseret ved hjælp af Interactome-Seq-rørledningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Skematisk oversigt over biblioteket markering med patienternes antistoffer
Phage bibliotek bruges til markering af antistoffer fra patienternes sera. Antistoffer er immobiliseret på magnetiske perler, phage bibliotek capture eller markeringen udføres, tre cyklusser af vasker udføres og bagefter valgte phages er tilbagebetalt og anvendes til at re-inficere E. coli. Re inficeret E. coli celler er belagt i selektivt pres (ampicillin 100 μg/mL). ORF fragmenter er inddrevet af forstærkning og amplikon pools er derefter sekventeret af NGS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Skematisk oversigt over biblioteket analyse
A) repræsentation af data analyse arbejdsprocessen, startende fra rå FASTQ filer til de endelige kommenteret domæner lister; B) skematisk fremstilling af input og output af Interactome-Seq webværktøj. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Oprettelsen af en høj kvalitet meget forskelligartede ORFs filtreret bibliotek er det første vigtige skridt i hele proceduren, da det vil påvirke alle de efterfølgende trin i rørledningen.

Et vigtigt fordelagtige element i vores metode er, at enhver kilde (intronless) DNA (cDNA, genomisk DNA, PCR afledt eller syntetiske DNA) er egnet til biblioteket konstruktion. Den første parameter, der bør tages i betragtning er, at længden af DNA fragmenterne klonet i pFILTER vektor bør give en repræsentation af den hele samling af domæner i en genom eller en transkriptom, den såkaldte "domainome". Vi har bevist, at protein domæner med succes kan klones, valgt og endelig identificeret startende fra DNA fragmenter med en længde distribution spænder fra 150 til 750 bp³³^,³⁴, og dette er i tråd med hvad der er rapporteret i litteraturen viser, at de fleste protein domæner er 100 aa lange (intervallet fra 50 til 200 aa)¹⁵.

DNA starter materiale skal være opsplittet i størrelsesområde valg og senere klonede til filtrering (pFILTER)¹² vektor. Under disse trin, kunne potentiel bias undgås maksimere effektiviteten af alle kloning trin reaktioner medtaget i protokollen, i bestemt fragment ende-reparation og fosforylering. Vektor forberedelse er udfordrende og bør foretages under optimale forhold samt, at undgå både plasmid nedbrydning og/eller kontaminering af ufordøjet vektor.

Når biblioteket er blevet oprettet, bør det være "filtreret" for at bevare kun ORFs foldede fragmenter. En vigtig parameter at modulere dette trin er det selektive pres, som kan ændres ifølge strengheden af de filtrering ønskes. Valg udføres ved hjælp af ampicillin: jo højere koncentrationen anvendes, jo lavere antal af transformerede bakterier kolonier kan overleve. Dette afspejler den filtrering metodes evne til at vælge for god-versus fattige-mappe ORFs³⁴. Denne reduktion i antallet af kloner opvejes af stigningen i folde egenskaber af valgte fragmenter. Normalt, skal ampicillin koncentrationen nok til at reducere til ca 1/20 antallet af bakteriel kolonier med hensyn til dem, der kunne opnås voksende bibliotek på chloramphenicol kun.

Bibliotek validering sker normalt ved PCR-amplifikation af tilfældigt plukkede kolonier og deres rækkefølge. PCR-amplifikation af nogle kolonier er foreslået for at få en hurtig vurdering af kvaliteten af biblioteket: længden af skærene skal være i det forventede interval af 150-750 bp og forskellige kolonier bør nuværende skær med forskellige størrelse angiver godt biblioteket forberedelse på sigt variation. Denne konventionelle strategi for screening, når de anvendes som den eneste metode til validering af biblioteket, er ikke omfattende og tidskrævende, giver mulighed for analyse af kun et begrænset antal kolonier og har en høj chance for mangler de fleste af de vigtige kloner. Vores tilgang er baseret på dyb sekventering af biblioteket, indeholder det komplette oplysninger om bibliotek mangfoldighed og overflod og præcis kortlægning af hver af de valgte fragmenter.

Gennemførelsen af NGS teknologi med metoden filtrering øger deepness af analysen af flere størrelsesordener. Vi har for nylig, optimeret protokol for sekventering ORF biblioteker ved hjælp af Illumina platform og udviklet en bestemt web-værktøj til analyse af data, der gør analysen af disse slags data for hver bruger uden nogen Bioinformatik programmering færdigheder.

Biblioteket "per se" er en "universal instrument" og kan udnyttes i forskellige sammenhænge for protein udtryk og/eller udvalg. Vores metodiske tilgang er baseret på overførsel af den producerede ORFeome ind i en phage display kontekst. Protein fragmenter er udtrykt på phage overfladen og blev egnet til efterfølgende udvælgelse.

Dette er gjort ved redning de filtrerede ORFs fra pFILTER-bibliotek af fordøjelse med specifikke restriktionsenzymer og re kloning dem til en kompatibel phagemid vektor tillader deres fusion med phage protein g3p.

Efter phagemid-ORF bibliotek er oprettet, kan det bruges til valg mod forskellige mål, såsom en formodede bindende protein¹⁰ eller renset antistoffer³⁵^,³⁶ som beskrevet her. Da phage partikler vil vise på deres overflade, de filtrerede ORFs, dette resulterer i en langt mere effektiv udvælgelsesprocedure på grund af mangel af ikke-viser kloner der normalt overhale det.

Efter udvælgelsen af phage display ORF bibliotek, kan output kloner sekventeret og analyseret med den samme rørledning. NGS kan levere en komplet og statistisk signifikant rangordning af mest ofte vælges ORFs og dette giver mulighed for identifikation af proteiner for det meste interagere med agn bruges. I betragtning af tilstedeværelsen af mange forskellige versioner af hvert domæne afviger få aminosyrer, identificerer overlapning mellem forskellige sekventeret kloner også det mindste fragment/domæne viser bindende egenskaber. Endelig tak til kobling mellem genotype og fænotype oplysninger ind i phage biblioteket, kan når domæner af valg er blevet identificeret, DNA-sekvens blive let reddet fra biblioteket for yderligere undersøgelser, in vitro- og in vivo validering og karakterisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra italienske Undervisningsministeriet og universitetet (2010P3S8BR_002 til CP).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sonopuls ultrasonic homogenizer	Bandelin	HD2070	or equivalent
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0321	or equivalent
GeneRuler 1 kb DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM0311	or equivalent
Molecular Biology Agarose	BioRad	161-3102	or equivalent
Green Gel Plus	Fisher Molecular Biology	FS-GEL01	or equivalent
6x DNA Loading Dye	Thermo Fisher Scientific	R0611	or equivalent
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	or equivalent
Quick Blunting Kit	New England Biolabs	E1201S
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	4368813
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S	or equivalent
QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104	or equivalent
EcoRV	New England Biolabs	R0195L
Antarctic Phosphatase	New England Biolabs	M0289S
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202T
Sodium Acetate 3M pH5.2	general lab supplier
Ethanol for molecular biology	Sigma-Aldrich	E7023	or equivalent
DH5aF' bacteria cells	Thermo Fisher Scientific
0,2 ml tubes	general lab supplier
1,5 ml tubes	general lab supplier
0,1 cm electroporation cuvettes	Biosigma	4905020
Electroporator 2510	Eppendorf
2x YT medium	Sigma-Aldrich	Y1003
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
DreamTaq DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific	EP0702
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447S
96-well thermal cycler (with heated lid)	general lab supplier
150 mm plates	general lab supplier
100 mm plates	general lab supplier
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
BssHII	New England Biolabs	R0199L
NheI	New England Biolabs	R0131L
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	or equivalent
M13KO7 Helper Phage	GE Healthcare Life Sciences	27-1524-01
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus	Sigma-Aldrich	K1377
Polyethylene glycol (PEG)	Sigma-Aldrich	P5413
Sodium Cloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S3014
PBS	general lab supplier
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	Thermo Fisher Scientific	10003D	or equivalent
MagnaRack Magnetic Separation Rack	Thermo Fisher Scientific	CS15000	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Nonfat dried milk powder	EuroClone	EMR180500
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa Biosystems, Fisher Scientific	7958935001
AMPure XP beads	Agencourt, Beckman Coulter	A63881
Nextera XT dual Index Primers	Illumina	FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004
MiSeq or Hiseq2500	Illumina
Spectrophotomer	Nanodrop
Agilent Bioanalyzer or TapeStation	Agilent
Forward PCR primer	general lab supplier		5’ TACCTATTGCCTACGGCA GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3’
Reverse PCR primer	general lab supplier		5’ TGGTGATGGTGAGTACTA TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3’
Forward primer for NGS	general lab supplier		5’ TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGGCA GCAAGCGGCGCGCATGC 3’;
Reverse primer for NGS	general lab supplier		5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGA TGTGTATAAGAGACAGGGG ATTGGTTTGCCGCTAGC 3’;

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Loman, N. J., Pallen, M. J. Twenty years of bacterial genome sequencing. Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).
Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations. BMC Bioinformatics. 8 (1), 170 (2007).
Andorf, C., Dobbs, D., Honavar, V. Exploring inconsistencies in genome-wide protein function annotations: a machine learning approach. BMC Bioinformatics. 8 (1), 284 (2007).
Wong, W. -C., Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. More Than 1,001 Problems with Protein Domain Databases: Transmembrane Regions, Signal Peptides and the Issue of Sequence Homology. PLoS Comput Biol. 6 (7), e1000867 (2010).
Bioinformatics, B., et al. Identification and correction of abnormal, incomplete and mispredicted proteins in public databases. BMC Bioinformatics. 9 (9), (2008).
Phizicky, E., Bastiaens, P. I. H., Zhu, H., Snyder, M., Fields, S. Protein analysis on a proteomic scale. Nature. 422 (6928), 208-215 (2003).
DiDonato, M., Deacon, A. M., Klock, H. E., McMullan, D., Lesley, S. A. A scaleable and integrated crystallization pipeline applied to mining the Thermotoga maritima proteome. J Struct Funct Genomics. 5 (1-2), 133-146 (2004).
Nordlund, P., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. Selecting open reading frames from DNA. Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).
Di Niro, R., et al. Rapid interactome profiling by massive sequencing. Nucleic Acids Res. 38 (9), e110 (2010).
Gourlay, L. J., et al. Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).
D'Angelo, S., et al. Filtering "genic" open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation. BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).
D'Angelo, S., et al. Profiling celiac disease antibody repertoire. Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).
Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).
Heger, A., Holm, L. Exhaustive enumeration of protein domain families. J Mol Biol. 328 (3), 749-767 (2003).
Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. Selecting open reading frames from DNA. Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).
Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection. Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).
Patrucco, L., et al. Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome). RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).
Collins, M. O., Choudhary, J. S. Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry. Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).
Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).
Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif. J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).
Deng, S. J., et al. Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display. J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).
Danner, S., Belasco, J. G. T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries. Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).
Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).
Patrucco, L., et al. Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome). RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).
Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. Mol Biol. 1 (2), 146 (2003).
Sblattero, D., Bradbury, A. Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries. Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).
Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10 (1), 421 (2009).
Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
Quinlan, A. R. BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis. Curr Protoc Bioinforma. , (2014).
Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. JBrowse: A next-generation genome browser. Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).
Gourlay, L. J., et al. Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).
D'Angelo, S., et al. Filtering "genic" open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation. BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).
Di Niro, R., et al. Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display. Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).
D'Angelo, S., et al. Profiling celiac disease antibody repertoire. Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).

Biology

Interactome-Seq: En protokol til Domainome bibliotek konstruktion, validering og udvælgelse af Phage Display og næste Generation Sequencing

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.