Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Interactome-Seq: Domainome kitaplığı inşaat, doğrulama ve seçim fajının görüntü ve sonraki nesil sıralama için bir protokol

Published: October 3, 2018 doi: 10.3791/56981
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 3, 4, 1, 4, 5,6
1Department of Health Sciences, Università del Piemonte Orientale & IRCAD, Novara, Italy, 2Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Segrate, Milan, Italy, 3Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Bari, Italy, 4Department of Life Sciences, University of Trieste, Italy, 5Institute of Genetic and Biomedical Research, National Research Council, Rozzano, Milan, Italy, 6Humanitas Clinical and Research Center, Rozzano, Milan, Italy

Summary

Açıklanan protokollere izin ver inşaat, karakterizasyonu ve DNA, herhangi bir kaynaktan yapılan bir "domainome" kitaplığının (karşı seçim hedef) seçimi. Bu farklı teknolojileri bir araya getiren bir araştırma boru hattı tarafından sağlanır: faj ekran, katlama muhabir ve sonraki nesil sıralama veri analizi için bir web aracı ile.

Abstract

Katlama gazetecilere olan katlama ve işlev tehlikeye kötü proteinler veya rasgele açık okuma çerçevesi katlama için erimiş zaman antibiyotik direnci gibi kolayca tanımlanabilen fenotipleri ile proteinlerdir. Biz nerede, TEM-1 β-lactamase (ampisilin direnci veriyor enzim) genomik bir ölçekte kullanarak, biz koleksiyonları doğru katlanmış protein etki alanlarının herhangi bir intronless genom DNA kodlama bölümünden seçebilirsiniz bir strateji geliştirdik. "Domainome" olarak adlandırılan, bir yaklaşım elde edilen protein parçaları de ifade ve çözünür, yapısal/fonksiyonel çalışmalar için uygundur.

Klonlama ve "domainome" bir fajının görüntüleme sistemi içinde görüntüleyerek, biz böylece temel sağlamak istediğiniz bağlama özellikleri (Örneğin, diğer proteinler veya antikor), ile belirli protein etki alanlarını seçmek mümkün olduğunu göstermiştir deneysel bilgi için gen ek açıklama ya da antijen tanıma.

Seçili poliklonal popülasyonda en zenginleştirilmiş klonlar kimliği roman yeni nesil sıralama teknolojileri (NGS) kullanarak elde edilebilir. Bu nedenlerden dolayı biz derin sıralama Analizi kitaplığın kendisi ve çeşitlilik, bereket ve kesin haritalama her seçili parçasının üzerinde tam bilgi sağlamak için seçim çıkışlarını tanıtmak. Burada sunulan protokolleri Kütüphane inşaat, karakterizasyonu ve doğrulama için anahtar adımlar gösterir.

Introduction

Burada, inşaat ve kütüphanelerin katlanmış ve çözünür protein etki alanlarından herhangi bir genetik/genomik başlangıç kaynak yelpazesi için yüksek üretilen iş yöntemi açıklanmaktadır. Yaklaşım üç farklı teknolojileri birleştirir: faj ekran, bir katlama muhabir ve sonraki nesil sıralama (NGS) belirli web aracı ile kullanımı veri analizi için. Yöntemleri protein bazlı araştırma, birçok farklı bağlamlarda kullanılan kimlik ve ek açıklama yeni proteinler/protein etki alanlarının, yapısal ve işlevsel özellikleri bilinen proteinlerin yanı sıra tanımını karakterizasyonu için protein-etkileşim ağı.

Birçok açık sorular protein bazlı araştırma hala mevcut ve en iyi protein üretimi için yöntemler geliştirilmesi araştırma çeşitli alanları için önemli bir ihtiyaç. Örneğin, prokaryotik ve ökaryotik genleri1binlerce durumu rağmen göreli proteomes ilgili bir harita kodlu proteinleri ve peptidler doğrudan bir ek açıklama ile canlıların büyük çoğunluğu için yok. Tam proteomes kataloğu zaman ve kaynak açısından büyük bir çaba gerektiren zorlu bir hedef olarak ortaya çıkıyor. Deneysel ek açıklama için altın standart tüm açık okuma sözde "ORFeome" Bina çerçeveleri (ORFs) bir genomunun klonlama kalır. Homoloji bilinen faaliyet ilgili genlerle bağlı gen işlevi genellikle atanır ama bu yaklaşım birçok yanlış ek açıklamaları başvuru veritabanları2,3,4varlığı nedeniyle kötü doğru 5. Ayrıca, tespit ve açıklamalı bile için ek çalışmalar karakterizasyonu bolluk, yapısal ve işlevsel özellikleri de dahil olmak üzere farklı bağlamlarda ifade desen açısından elde etmek için gerekli proteinlerdir yanı sıra etkileşim ağları.

Ayrıca, farklı etki, her biri proteinler oluşur bu yana farklı protein işlevleri için katkı ve belirli özellikleri gösteren, çalışma ve bu etki alanlarının tam anlamını daha kapsamlı bir resim, her ikisi de tek izin verebilirsiniz Gen ve tam genom düzeyinde. Bu gerekli tüm bilgileri bir zorlu ve geniş alan protein bazlı araştırma yapar.

Bu açıdan tarafsız ve yüksek işlem hacmi yöntemlerle protein üretimi için önemli bir destek verilebilir. Ancak, bu tür yaklaşımlar, gerekli, önemli yatırım yanında başarısı yeteneği çözünür/stable protein yapıları üretmek için kullanır. Bu büyük bir sınırlayıcı faktör beri bu proteinlerin sadece yaklaşık % 30 başarılı bir şekilde dile getirdi ve deneysel olarak yararlı6,7,8olmak yeterli düzeylerde üretilen olduğunu tahmin ediyor. Bu sınırlamayı aşmak için bir yaklaşım birlikte bireysel genler örtüşen parçası gösterimini sağlar farklı polipeptitler üretmek için rasgele parçalanmış DNA kullanımına dayanır. Rasgele oluşturulmuş DNA parçalarının sadece küçük bir yüzdesi vardır fonksiyonel ORFs ederken bunların büyük çoğunluğu non-görev (stop kodon onların dizileri içinde varlığı) nedeniyle veya orijinal dışında bir çerçeve içinde un doğal (ORF) için kodlar polipeptitler biyolojik anlamı ile.

Bu sorunlara yönelik olarak bizim grup üzerinde genomik ölçek9,10,11,12-ebilmek var olmak kullanılmış bir yüksek-den geçerek protein ifade ve etkileşim analizi platform geliştirmiştir. Aşağıdaki teknikler bu platforma entegre: 1) koleksiyonları doğru katlanmış protein etki alanlarının herhangi bir organizma; kodlama DNA kısmından seçmek için bir yöntem 2) Ortaklar etkileşimlerin seçmek için fajının ekran teknolojisi; 3) NGS tamamen altında eğitim bütün interactome karakterize ve klonlar ilgi tanımlamak için; ve 4) veri analizi için kolay ve Kullanıcı dostu bir şekilde Interactome-Seq analizi yapmak herhangi bir Biyoinformatik veya programlama bilgisi olmayan kullanıcılar için bir web aracıdır.

Bu platform kullanımı araştırma alternatif stratejileri önemli avantaj sunar; Her şeyden önce tamamen tarafsız, yüksek-den geçerek ve sıra--dan tüm genom kadar tek bir gen çalışma için modüler bir yöntemdir. Boru hattı ilk adım altında eğitim, sonra derin NGS tarafından karakterize rastgele parçalanmış DNA kitaplıktan oluşturulmasıdır. Bu Kütüphane nerede genler/parçaları ilgi için protein salgılanması (yani, sn lideri) periplasmic uzaya bir sinyal serisi ve TEM1 β-lactamase gen arasında klonlanır mühendislik bir vektör kullanılarak oluşturulur. Füzyon proteini ampisilin direnç ve klonlanmış parçaları çerçeve varsa ampisilin baskı altında hayatta yeteneği görüşmek bu öğeleri ve elde edilen füzyon protein ile doğru katlanmış10,13 olduğunu ,14. Tüm klonlar klonlar sözde "filtre" antibiyotik seçimden sonra kurtarıldı, ORFs ve onları (% 80'den fazla) büyük bir çoğunluğu, gerçek genler9' dan türetilmiştir. Ayrıca, bu strateji gücünü tüm filtre ORF klonlar için doğru katlanmış/çözünür protein/etki alanları15Kodladığınız bulgular yer almaktadır. Gibi birçok klonlar, mevcut Kütüphane ve eşleme aynı bölge/etki alanında, farklı başlangıç ve bitiş noktaları, bu tarafsız, tek adım kimlik çözünür ürünlerinde sonuçlanması olası en küçük parçalar sağlar.

Teknoloji daha fazla bir düzelme NGS kullanımı ile Kütüphane karakterize etmek için verilir. Kombinasyonu bu platform ve veri analizi için belirli web aracının altında eğitim daha geniş analizleri, gerek kalmadan başvuru DNA üzerinde önemli tarafsız bilgi tam nükleotit dizileri ve seçili ORFs konumunu verir veya Deneysel çaba.

Domainome kütüphaneler bir seçim bağlam içine transfer ve fonksiyonel çalışmalar gerçekleştirmek için evrensel bir araç olarak kullanılan. Biz entegre ve Interactome-Seq aradık fajının ekran teknolojisi süzülmüş ORF phagemid vektör aktarmak ve faj ORF oluşturma yararlanır yüksek üretilen iş protein ifade ve etkileşim analizi platformu Kütüphane. Bir kez bir fajının görüntü içeriği, etki alanları M13 parçacıklar; yüzeyinde görüntülenir protein içine yeniden klonlanmış Bu şekilde domainome kütüphaneler doğrudan etki alanları belirli enzimatik faaliyetleri ile kodlama veya bağlama özellikleri, interactome ağlar profil oluşturma sağlayan gen parçaları için seçilebilir. Bu yaklaşım başlangıçta Zacchi vd tarafından tanımlanmıştır 16 ve daha sonra birkaç diğer içerik13,17,18içinde kullanılır.

Protein-protein etkileşim (Maya iki hibrid sistemi ve kütle spektrometresi19,20dahil) çalışma için kullanılan diğer teknolojileri ile karşılaştırıldığında, bir büyük avantaj sağlıyor fajının sırasında oluşur bağlama ortak amplifikasyon birden fazla mermi seçimi görüntüler. Bu böylece düşük bol bağlayıcı proteinler etki alanları Kitaplığı'nda tanımlaması izin seçim hassasiyeti artar. ORF filtre kitaplığı ile yapılan seleksiyonun verimini daha da işlevsel olmayan klonlar yokluğu nedeniyle artar. Son olarak, teknoloji protein ve protein yemler21,22,23,24,25karşı gerçekleştirilecek seçim sağlar.

Domainome-fajının kütüphaneyi kullanan fajının seçimleri farklı patolojik koşulları olan hastalarda, Örneğin otoimmün hastalıklar13, kanser ya da enfeksiyon hastalıkları sera yem olarak gelen antikorlar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım altında ağır tanımlamak ve özellikle aynı anda hastaların antikorlar tarafından tanınan antijenleri/epitopları karakterize etmek için izin vererek eğitim hastalığının sözde "antikor imza" elde etmek için kullanılır. Kullanımı diğer yöntemlerine göre faj doğrusal ve konformasyon antijenik epitopları tanımlaması görüntülenmesine izin verir. Belirli bir imza tanımlaması potansiyel olarak anlayış Patogenez, yeni aşı tasarım, yeni tedavi hedefleri tanımlaması ve belirli tanılama ve prognostik araçları gelişimi için önemli bir etkisi olabilir. Ayrıca, çalışma bulaşıcı hastalıklar üzerinde odaklanmış zaman immünojenik proteinler keşfi patojen ekimi bağımsızdır bir büyük avantaj sağlıyor.

Yaklaşımımız katlama gazetecilere genomik bir ölçekte "domainome" seçmek için kullanılabilir onaylar: doğru katlanmış, iyi ifade, çözünür protein etki DNA'ın kodlama bölümünden ve/veya herhangi bir organizmadan cDNA topluluğudur. Bir kez izole protein parçaları gen ek açıklama için de yapısal çalışmalar, antikor epitope eşleme, antijen tanıma, vbgelince gerekli deneysel bilgi veren birçok amaç için yararlıdır. NGS tarafından sağlanan yüksek üretilen iş veri bütünlüğü analiz fajının görüntü kitaplıkları gibi son derece karmaşık örnekleri sağlar ve geleneksel zahmetli malzeme çekme ve bireysel fajının kurtarıldı klonları test kaçınmak için potansiyele sahiptir.

Filtre uygulanmış Kütüphanesi ve aşırı duyarlılık ve güç NGS analiz özellikleri sayesinde aynı anda her etkileşimi doğrudan oluşturmak zorunda kalmadan bir başlangıç ekranı, sorumlu protein etki alanını tanımlamak mümkündür her biri için ek kütüphaneler protein bağlı. NGS sağlar herhangi bir genetik/genomik başlangıç kaynak tüm domainome kapsamlı bir tanımını almak için ve veri çözümleme web aracı çok özel alan nitelik özellikleri her iki açıdan bir nitel ve nicel elde sağlar interactome protein etki alanları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. İnşaat ORF Kütüphanesi (Şekil 1)

  1. INSERT DNA hazırlanması
    1. Sentetik veya genomik DNA parçaları hazırlık
      1. Özü/standart yöntemleri26kullanarak DNA arındırmak.
      2. DNA tarafından sonication parçası. Genel öneri başlangıç ile 30 s bakliyat % 100 olarak standart bir sonicator kullanarak güç çıkış.
        Not: Farklı güç ve sonication kez DNA hazırlık için en uygun koşulları ayarlama için Pilot deneyler yapılmalıdır. Her test sonra özel jel elektroforez tarafından DNA parçalarının boyutunu belirler.
      3. Sonicated DNA ile birlikte 100 bp DNA merdivenle % 1.5 özel jel üzerine yükleyin. 5 V/cm 15 dakika çalıştırın ve parçalanmış DNA smear içeren jel kısmını kesip kısa bir elektroforez gerçekleştirin.
      4. Sütunlara göre jel ekstraksiyon kiti ile INSERT DNA arındırmak ve konsantrasyon bir UV spektrofotometre kullanarak ölçün.
        Not: en az 500 ng arıtılmış ekler sindirilir vektör 1 µg ile 1.3 adımda anlatıldığı gibi bakmaksızın için bu adımı sonra elde. Parçaları hazırlık kalitesini260nm/A280nm ve260nm/A230nm oranları düşük kaliteli örnek ligasyonu verimliliği etkileyecek bu yana değerlendirerek kontrol edin.
      5. Ekler 5 μg 1 μL hızlı Blunting Kit enzim karışımı ile üretici yönergelerine göre tedavi. Enzimler için 10 dk. örnekleri-20 ° C kadar kullanmak saklanabilir 70 ° C'de Isıtma tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.
    2. CDNA gelen parçaları hazırlık
      1. RNA (TRizol veya benzer reaktifler kullanarakÖrneğin, ) standart yöntemlerle ayıklayın.
      2. Ters transkripsiyon gerçekleştirmeden önce Isıtma tarafından mRNA parçası. Son DNA parçası uzunluğu mRNA kaynar zaman ve rasgele astar konsantrasyon tarafından kontrol edilir. Örneğin, örnek için 6 min 95 ° C'de ısı
      3. Üreticinin protokol sonrası herhangi bir kullanılabilir kiti ile Random primerler kullanılarak cDNA hazırlayın.
      4. Hibridizasyon biotinylated poli-dA 37 ° C'de 3 h için ile tarafından poly-dT kuyrukları cDNA tüketmek ve streptavidin manyetik boncuklar Carninci vd tarafından açıklandığı gibi ayrı 13
      5. İlişkisiz malzeme yeniden elde etmek ve üreticinin yönergeleri izleyerek sütunlara göre DNA arıtma ile bir kit arındırmak. Bir UV spektrofotometre kullanarak toplama ölçmek. Not Adım 1.1.1.4 bakın.
  2. Filtreleme vektör hazırlanması
    1. Saf klonlama Özeti 5 µg pFILTER312 10 U EcoRV Restriksiyon enzimi, aşağıdaki üreticinin iletişim kuralı ile vektör.
    2. 2 µL yük (200 ng) ile birlikte 100 sindirilir vektörünün ng sindirilmemiş vektör ve 1 k bp moleküler marker, doğru sindirim için kontrol etmek bir % 1'özel jel üzerinde. Isı Restriksiyon enzimi devre dışı bırakabilirsiniz.
    3. 1/10 birim x fosfataz arabellek ve 1 µL (5 U) fosfataz 10 ekleme ve 37 ° C'de 15 dk. ısı devre dışı bırakabilirsiniz için 65 ° C'de 5 min için kuluçkaya
    4. Özel jel çıkarma tarafından sindirilmiş plazmid arındırmak ve konsantrasyon bir UV spektrofotometre kullanarak ölçün. Örnekleri-20 ° C kadar kullanmak depolanabilir.
  3. Tüp ligasyonu ve dönüştürme
    1. Tüp ligasyonu aşağıdaki gibi yapın: 400 sindirilir plazmid 1 µg için eklemek ng fosforile ekler (plazmid: INSERT molar oranı 1:5), 10 x 10 µL T4 DNA ligaz, yüksek konsantrasyon T4 DNA ligaz 100 µL. son bir hacim içinde 2 µL için arabellek kuluçkaya 16 ° C overni tepki sağı gösterir. Isı 65 ° c 10 min için devre dışı.
    2. Sodyum asetat çözüm (3 M, pH 5.2) hacmi 1/10 ekleyerek ligasyonu ürün çökelti ve %2.5 100 etanol hacimleri. Mix ve 20 dk-80 ° C'de dondurmak.
    3. 4 ° C'de 20 dk için maksimum hızda santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
    4. Pelet ve 4 ° C'de 20 dk için maksimum hızda santrifüj soğuk % 70 etanol 500 µL ekleyin Süpernatant atmak.
    5. Hava kuru Pelet. Çöktürülmüş DNA su 10 µL resuspend.
    6. Bakteri Hücre çoğalmasıyla gerçekleştirin.
      Not: Yüksek verimli hücreleri (yukarıda µg DNA'ın başına 5 x 109 transformants) kullanımı gereklidir. Biz Escherichia coli DH5αF kullanmanızı öneririz ' (F'/ endA1 hsd17 (rK − mK +) supE44 thi 1recA1 gyrA (Nalr) relA1 (lacZYA-argF) U169 deoR (F80dlacD-(lacZ)M15) içinde ev veya satın alınan çeşitli üreticilerin üretilen.
      1. Microcentrifuge boru ve 0.1 cm-Elektroporasyon cuvettes uygun sayıda buza koyun. 1 µL arıtılmış ligasyonu çözüm (DI suda) hücrelerin 25 µL ekleyin ve tüp birkaç kere vur.
      2. DNA hücre karışımı soğuk küvet aktarmak, tezgah üzerinde 2 x dokunun, dış küvet su silin, Elektroporasyon modülü ve basın darbe yerleştirin.
      3. Elektroporasyon 25 µF, 200 Ω ve 1.8 kullanarak standart electroporator makina ile gerçekleştirmek kV. 4-5 ms zaman sabiti olmalıdır.
    7. 1 mL sıvı 2xYT orta herhangi bir antibiyotik olmadan hemen ekleyin, 10 mL tüp aktarmak ve 1 h için 220 rpm'de sallayarak 37 ° C'de büyümeye izin.
    8. Plaka dönüştürülmüş DH5αF' 15 cm 2xYT ağar kaplamalar 34 µg/mL kloramfenikol (pFILTER direnç) ve 25 µg/mL ampisilin (ORFs için seçici marker) ile desteklenmiş ve gecede 30 ° C'de kuluçkaya
    9. Dilutions, 10 cm 2xYT ağar kaplamalar kloramfenikol + ampisilin ve Kütüphane titrasyon gerçekleştirmek için yalnızca, kloramfenikol ile desteklenmiş İnternet üzerinde plaka. Bir gecede 30 ° C'de kuluçkaya
  4. pFILTER-ORF Kütüphane doğrulama
    1. 15-20 kolonileri Ekle boyutu dağıtım tahmin etmek için kloramfenikol ve kloramfenikol/ampisilin plakalar üzerinden sınayın. Bir ipucu ile tek kolonileri almak ve onları ayrı olarak 2xYT orta antibiyotikler olmadan 100 µL içinde oranında seyreltin. Bu çözümün 0.5 µL PCR reaksiyon için üreticinin protokol sonrası herhangi bir standart TaqDNA polimeraz ile DNA şablon olarak kullanın.
    2. Bir besleme-T 55 ° C ve 40 bir uzatma süresi kullanarak amplifikasyon 25 döngüleri gerçekleştirmek 72 ° C'de s Astar dizileri Tablo malzemeleritemin edilmektedir.
    3. PCR ürünleri ile birlikte bir 100 bp DNA merdiven ve Çalıştır % 1.5 özel jel üzerinde yük.
  5. pFILTER-ORF Kütüphane koleksiyonu
    1. Taze 2xYT orta 3 mL ekleyerek 150 mm plakalar bakteri toplamak ve onları steril bir sıyırıcı toplamaktan, iyice karıştırın, onları % 20 steril Gliserin ile ek ve küçük aliquots içinde-80 ° C'de depolayın.
    2. Bir aliquot (önce gliserol ilavesi) Kütüphanesi plazmid DNA arındırmak üreticisinin yönergeleri izleyerek bir sütun tabanlı plazmid ekstraksiyon kiti kullanarak.
    3. Konsantrasyonu UV Spektrofotometre ile ölçmek. Örnekleri-20 ° c kadar saklı olmak phagemid Kütüphane hazırlık ve/veya karakterizasyonu için NGS tarafından kullanılmış.

2. bir Phagemid vektör (Şekil 2) filtre uygulanmış ORFs, subcloning

  1. ORF hazırlanması DNA parçalarının filtre
    1. 10 U BssHII ekleme ve üreticinin iletişim kuralı göre kuluçka pFILTER-ORF Kütüphane vektöründen arıtılmış vektörünün 5 µg Restriksiyon enzimi sindirim kadar ayarla. Enzim ve Özet 10 U NheI ile devre dışı bırakabilirsiniz.
    2. Sindirilir DNA ile birlikte 100 bp DNA merdivenle % 1.5 özel jel üzerine yükleyin. 5 V/cm 15 dakika koşmak ya da yeterli çıkarılan parçaları smear ayırt etmek ve bunları içeren jel kısmını kesmek bir kısa Elektroforez gerçekleştirin.
    3. Bir sütun bazlı jel ekstraksiyon kiti ile INSERT DNA arındırmak ve bir UV spektrofotometre kullanarak toplama ölçün.
  2. Phagemid DNA hazırlanması
    1. 5 µg / saf pDAN527 ekler gelince Restriksiyon enzimi hazım ayarlayın.
    2. % 0.75 özel jel üzerinde çalışan sindirilir DNA tarafından sindirilmiş plazmid arındırmak ve jel sütunlara göre kiti ile ayıklamak.
    3. Bir UV spektrofotometre kullanarak toplama ölçmek. Örnekleri-20 ° C kadar kullanmak depolanabilir.
  3. Kütüphane ligasyonu, dönüştürme ve koleksiyon
    1. Tüp ligasyonu ve pFILTER vektör için açıklandığı gibi dönüştürme gerçekleştirmek.
    2. Plaka dönüştürülmüş DH5αF' 150 mm 2xYT ağar kaplamalar 100 µg/mL ampisilin ile desteklenmiş ve gecede 30 ° C'de kuluçkaya
    3. Dilutions, 100 mm 2xYT ağar kaplamalar Kütüphane boyutu belirlemek için 100 µg/mL ampisilin ile desteklenmiş İnternet üzerinde plaka.
    4. PCR Kütüphane doğrulanması rastgele çekilen klonların 1.4 adımda anlatıldığı gibi gerçekleştirin.
    5. Phagemid-ORF Kütüphane 150 mm plakalar bakterilerden hasat tarafından toplamak, iyice karıştırın, onları % 20 steril gliserol ve mağaza içinde küçük aliquots-80 ° C'de ek.
    6. Plazmid DNA'dan üreticisinin yönergeleri izleyerek bir aliquot kullanarak bir sütun tabanlı plazmid ekstraksiyon kiti Kütüphanesi arındırmak.
    7. UV spektrofotometre konsantrasyonu ölçmek. Örnekleri-20 ° c kadar saklanabilir NGS tarafından karakterizasyonu için kullanılır.

3. fajının Kütüphane hazırlık ve seçim prosedürü

  1. Feyc üretim
    1. Hisse senedi aliquot phagemid Kütüphane 2xYT sıvı suyu bir OD600nm için 100 µg/mL ampisilin ile desteklenmiş 10 mL seyreltik 0,05 =.
    2. Steril bir şişesi seyreltilmiş kütüphanede 5 - 10 kat özgün birimi daha büyük büyümek, 37 ° C'de ulaştığı600nm OD kadar 220 devir / dakikada sallayarak ile 0,5 =.
    3. Bakteri enfeksiyonu 20:1 çokluğu, yardımcı phage (Örneğin M13K07) ile enfekte. Ara sıra ajitasyon (her 10 min) ile 45 dk 37 ° C'de bırakın.
    4. Bakteri, 4000 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak, bakteri Pelet 40 ml 2xYT sıvı suyu 100 µg/mL ampisilin ve 50 µg/mL sefaloridin ile yeniden askıya alma ve 28 ° C'de gece için 220 devir / dakikada sallayarak ile büyümek.
    5. Sonra santrifüj bakteri 4000 x g de gün için 4 ° C'de 20 dk Phages içeren süpernatant toplamak.
  2. PEG-yağış, phages.
    1. 0,22 µm hacmi 1/5 PEG/NaCl çözüm (w % 20/6000 PEG, v 2.5 M NaCl) temizlenen phages için filtre ekleyin ve 30-60 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
      Not: Çözüm birkaç dakika sonra başarılı fajının yağış gösteren dumanlı oldu. Çözüm yoğunluğunun kuluçka zamanla artacaktır.
    2. 4 ° C'de 15 dakika 4000 x g, santrifüj Phages bir beyaz küçük Pelet oluşturacak.
    3. 1 mL steril PBS resuspend. 1.5 mL tüp aktarmak ve 4 ° c kirletici bakteri kaldırmak için maksimum hızda 10 dk santrifüj kapasitesi. Kahverengi bir Pelet oluşturacak.
    4. Phages için yeni bir tüp içeren transfer süpernatant. Phages birbirini izleyen titrasyon ve faj seçimi için buz üzerinde tutun.
  3. Feyc titrasyon
    1. Feyc çözüm seri dilutions hazırlayın. Feyc çözüm 10 µL 10-2 seyreltme elde etmek için PBS 990 µL içinde koymak. Tekrar 10-4 yapmak ve bundan 10-6 seyreltme elde etmek için bu hazırlık oranında seyreltin.
    2. DH5αF büyümek ' 2xYT sıvı orta 37 ° C'de OD600nm kadar sallayarak ile bakteri hücreleri = 0,5 ulaşıldığında. 1 mL hazırlanmış bakterilerin 1,5 mL tüp içine aktarmak ve hemen 10-4 fajının seyreltme 1 µL ile enfekte. 45 dk. tekrar 10-6 seyreltme için aynı yordamı için 37 ° C'de sallayarak olmadan kuluçkaya.
    3. 100 mm 2xYT levha içine plaka dilutions enfekte bakteri. Plaka gecede 30 ° C'de koymak.
    4. Hastalık bulaşmamış tek DH5αF 100 µL plaka ' 2xYT agar tabağa takıma kirlenme hazırlık yokluğu kontrol etmek için 100 µg/mL ampisilin ile.
    5. Bir gün sonra kolonileri saymak ve faj titresi hesaplayın. Titresi sayısı phages/mL olarak hızlı. Beklenen titresi 1012-13 phages/ml'dir.
  4. Feyc seçimi
    1. Feyc seçimini arıtılmış antikorlar yem olarak kullanarak
      1. Feyc hazırlık PBS - %4 yağsız süt eşit bir hacmi içine 200 µL sulandrarak tarafından phages doyurmak ve yavaş dönüşümlü olarak oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. Bu adımı phages belirsiz bağlama için engellenmesini sağlar. Protein-G kaplamalı manyetik boncuklar 30 µL 1,5 mL tüp aktarın.
      2. Aşağıdaki gibi iki kez yıkayın: PBS 500 µL ekleme, oda sıcaklığında 2 min için yavaş dönme bir tekerlek üzerinde kuluçkaya, boncuklar bir mıknatıs kullanarak tüp bir yana çizmek ve süpernatant kaldırma.
      3. Yıkanmış boncuk yavaş rotasyon ile Oda sıcaklığında 30 dakika ile doymuş phages kuluçkaya.
      4. Boncuk manyetik alanını kullanarak bir yana çizin. Phages seçim adım için kullanılacak içeren süpernatant toplamak.
      5. Manyetik boncuklar arıtılmış antikorlar conjugating tarafından önceki adımı gerçekleştirirken hazırlayın. Protein-G kaplamalı manyetik boncuklar 30 µL yukarıda açıklandığı gibi yıkayın. PBS 500 µL arıtılmış antikorların 10 µg sulandırmak, yıkanmış boncuk ekleyin ve yavaş rotasyon 45 dk. PBS ile iki kez yıkama için oda sıcaklığında kuluçkaya.
        Not: manyetik boncuklar iki farklı hazırlıkları gerçekleştirme: bir antikor ilgi ile ve bir denetim antikorlar, örneğin, antikorlar ile saf sağlıklı bağış. Antikorlar çıkışlarını analiz adımı sırasında çıkarılan kontrolü ile seçilen antijenleri sırası. Alternatif olarak, manyetik boncuklar denetim antikorlar ile yüklenen (un konjuge boncuk ile kuluçka için iletişim kuralı izleyin) phages ön temizleme adımında gerçekleştirmek için kullanılabilir.
      6. Feyc seçimi: boncuk bir yana bir mıknatıs kullanarak tüp çizmek, son yıkama kaldırmak, phages ekleyin ve yavaş döndürme 90 dk. 5 kere ile 500 µL PBS-0.1% ara-20 ve PBS ile 5 kez yıkama için oda sıcaklığında kuluçkaya.
      7. İlişkili phages, boncuk DH5αF 1 mL ile karıştırılarak seçimi, çıkışını temsil eden elute' OD600 yetiştirilen hücrelerin 0,5 =. 37 ° C'de (her 10 min) ara sıra sallayarak ile 45 dk boncuk ile bakteri kuluçkaya. Çıkış 100 µg/mL ampisilin ile desteklenmiş bir tabakta 150 mm 2xYT agar plaka.
      8. Titrasyon gerçekleştirmek için 100 µL su katılmamış ve farklı dilutions (10-1 10-5) çıktının plaka. Ertesi gün 3 mL taze 2xYT orta ekleyerek 150 mm plakalar bakteri toplamak ve onları steril bir sıyırıcı toplamaktan iyice karıştırın, onları % 20 steril Gliserin ile ek ve küçük aliquots içinde-80 ° C'de depolayın.
      9. Bir saniye daha gerçekleştirmek için bir aliquot seçim yuvarlak büyümek. Çamaşır koşullar hariç yukarıda açıklandığı gibi tüm kaydırma yordamı yineleyin. Bu durumda yıkama 10 kez PBS - %1 ara-20 ile (çözüm tüpe dökün ve hemen yeniden dökmek). Daha sonra PBS 500 µL ekleyin ve 10 dk. gerçekleştirmek için PBS ile 10 diğer yıkar döndürme oda sıcaklığında üzerinde kuluçkaya. Seçimi ilk turunda gelince elüsyon adımla devam edin.
      10. Plazmid DNA üreticilerin yönergeleri izleyerek bir sütun tabanlı kit kullanarak çıktı bir aliquot ayıklayın. Derin sıralama için kullanılacak kadar plazmid-20 ° C'de depolayın.
    2. Yem rekombinant proteinler kullanarak fajının seçimi
      1. Feyc hazırlık PBS - %4 yağsız süt eşit bir hacmi içine 200 µL sulandrarak tarafından phages doyurmak ve yavaş dönüşümlü olarak oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
      2. Streptavidin manyetik boncuklar 100 µL ekleyin. Streptavidin bağlama phages seçmek için oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. Streptavidin bağlı phages bir yana bir mıknatıs kullanarak boncuk çizerek kaldırın. Önceki adımından süpernatant alıp biotinylated protein (içinde bir konsantrasyon 100-550 nm) ekleyin ve 1 h 30 dk için oda sıcaklığında bir rotor üzerinde kuluçkaya.
      3. Manyetik boncuklar hazırlamak: önceki adımı gerçekleştirirken, PBS ile streptavidin manyetik boncuklar 100 µL yıkama, PBS % 2 yağsız süt resuspend ve döndürme, oda sıcaklığında 30 dk 1 h için kuluçkaya.
      4. Feyc seçimi: çizmek boncuk bir mıknatıs kullanarak tüp bir yana, PBS - %2 süt çıkarmak ve boncuk faj-protein karışımı ile resuspend. 90 dakika oda sıcaklığında yavaş döndürme kuluçkaya.
      5. Boncuk bir mıknatıs kullanarak tüp bir yana çizmek, süpernatant atmak ve dikkatle %0,1 500 µL PBS ile beş kez yıkayın ara-20. Elüsyon önceki oturumda açıklandığı gibi gerçekleştirin.

4. fajının Kütüphane derin sıralama platformu (Şekil 3)

  1. DNA pFILTER-ORF-Kütüphane, pDAN5-ORF-Kütüphane veya seçili fajının kitaplıkları kurtarma ekler
    1. Kitaplığın bir aliquot tezcan, bir spektrofotometre kullanarak ölçmek, DNA ekler tarafından amplifikasyon belirli astar ile yeniden elde etmek.
      Not: ekler kurtarmak için kullanılan astar onların 5' için sonunda adaptörleri dizileri, böylece amplicon havuzları, dizin oluşturma ardışık elde edilen ve DNA ekler doğrudan sıralama Sequencer kullanarak kurtarıldı izin bağlıdır. Onların Malzemeleri tablosırasıdır. Adaptörler gösterilir içinde kalın, ve belirli astar italik olarak gösterilir.
    2. (PFILTER/phagemid/seçili-fajının) kitaplığının 2.5 µL PCR reaksiyon için DNA şablon olarak kullanın.
    3. Aşağıdaki programı kullanın: 95 ° C 3 dakika; 25 95 ° C devredir 30 s, 30 55 ° C s, 30 72 ° C s; 5 dk. tutun 4 ° C'de 72 ° C
      Not: Bu noktada bir Bioanalyzer veya TapeStation amplicons boyutunu doğrulayın ve doğru aralıkta olup olmadığını kontrol için 1 µL PCR ürünü çalıştırmak için önerilir.
  2. PCR temizlik
    1. Manyetik boncuklar (Örneğin, AMPure) Oda sıcaklığına getirmek. Tüm PCR ürünü 1,5 mL tüp PCR tüpünden aktarın. Girdap manyetik boncuklar için 30 s boncuk eşit dağınık emin olmak için. Manyetik boncuklar 20 µL PCR ürünü, yavaşça pipetting tarafından karışımı içeren her tüpün ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dk'ya sallayarak olmadan kuluçkaya.
    2. Plaka bir manyetik stand 2 dk ya kadar süpernatant temizledi üzerine yerleştirin. Manyetik stand PCR ürünlerle kaldırmak ve süpernatant atın.
    3. Boncuk manyetik standında PCR ürünleri ile taze hazırlanmış %80 etanol ile aşağıdaki gibi yıkayın: taze hazırlanmış %80 etanol 200 µL eklemek her örnek için iyi; Plaka 3 için manyetik stand üzerinde kuluçkaya s; dikkatle kaldırmak ve süpernatant.
    4. Manyetik stand PCR ürünleri ile ikinci bir etanol yıkama gerçekleştirmek; İkinci yıkama sonunda dikkatle tüm etanol kaldırmak ve boncuk 10 dakikadır kurumasını sağlar.
    5. Manyetik standından PCR ürünleri kaldırmak, 10 mM Tris pH 8,5 17,5 µL her tüpün ekleyin, pipet yavaşça ve aşağı 10 kat, boncuk tam olarak resuspended emin olun. 2 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    6. 2 min için manyetik stand tüpü yerleştirin veya süpernatant temizledi kadar dikkatli bir şekilde yeni bir 1,5 mL tüp için saflaştırılmış PCR ürünleri içeren süpernatant ile 15 µL aktarmak. Hemen Dizin PCR için devam etmeyin arıtılmış PCR ürünleri-15 ° c-25 ° c için bir hafta kadar saklayabilirsiniz.
  3. Dizin PCR
    Not: PCR temizledikten sonra Dizin PCR gerçekleştirin. Nextera XT Dizin setini kullanın; Böylece elde edilen Çift Kişilik Dizin oluşturulmuş kitaplıklar çoğaltılmış Illumina ishal içinde sıralamak mümkün olacaktır.
    1. Tüm 15 μL her ürün içeren yeni bir PCR tüpüne saflaştırılmış ve küme aşağıdaki reaksiyon içeren kadar transfer: saf amplicon ürün, 5 µL Dizin astar 1 ve 5 µL Dizin astar 2, 2 x PCR Mix; 25 µL 15 µL 50 µL son hacmi.
    2. PCR aşağıdaki programı kullanarak bir termal cycler üzerinde gerçekleştirmek: 3 dk, 8 devredir 30 95 ° c için 95 ° C s, 30 55 ° C s, 30 72 ° C s; 72° C 5 dk, sonra 4 ° C'de tutun
  4. PCR temizlik 2
    1. Bölümünde 4.2 PCR için temiz kadar aşağıdaki değişikliklerle açıklanan aynı iletişim kuralını uygulayın: ilk adımda manyetik boncuklar 56 µL PCR ürünü her 50 µL için ekleyin.
    2. 10 mM Tris pH 8,5 arıtma son adımında 27,5 µL boncuk resuspend ve (Bu arıtılmış son Kütüphane miktar ve sonra sıralama için hazır olduğunu) yeni bir tüp 25 µL aktarmak.
    3. Kütüphane miktar için devam değil plaka-15 ° c-25 ° c için bir hafta kadar saklayabilirsiniz.
  5. Sıralama kitaplığı kalitatif ve kantitatif değerlendirilmesi
    1. 1:10 1 µL arıtma sonra çalıştırmak, boyutu doğrulamak ve bu son Kütüphane izleme bölge seçerek ölçmek için bir bioanalyzer İnternet üzerinde son seyreltme.
    2. Paralel olarak gerçek zamanlı PCR tarafından Kütüphane miktar bir kütüphane miktar kit başına üreticinin iletişim kuralı kullanarak gerçekleştirin.
  6. Sıralama kitaplıkları
    1. Diğer ikili dizin oluşturulmuş sıralama kütüphaneleri ile birlikte üretilen ikili dizin oluşturulmuş kitaplıklar havuz. Bu tür kitaplığı oluşturarak uzun okur, sıra ilk büyük 250bp PE okuma ve ikinci durumda 300 bp PE elde etmek için Hiseq2500 veya MiSeq aletleri kullanarak en az 250 bp eşleştirilmiş sonunda okur.

5. Interactome-Seq Web aracını kullanarak Bioinformatic veri analizi

  1. PFILTER/phagemid/seçili-fajının kütüphane sıralama Interactome seq veri analiz boru hattı ile kökenli okuma analiz. Web Araç serbestçe aşağıdaki adresten edinilebilir: http://interactomeseq.ba.itb.cnr.it/

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Filtreleme yaklaşım Şekil 1' de kapsamlıdır. İntronless DNA her tür-ebilmek var olmak kullanılmış. Şekil 1A ' filtreleme yaklaşım ilk bölümünü temsil edilir: 150-750 BP istenen boyutunda bir uzunluğu dağıtım ile parçalarının bir smear olarak ilgi DNA'ın iyi bir parçalanma bir özel jel veya bir bioanalyzer yükledikten sonra görünür. Elde parçalanmış DNA'ın bir temsilcisi sanal jel görüntüsü verilir. Üzerinde özel jel dolu parçaları sonra iyileşti, sonunda tamir ve fosforile ve rasgele DNA parçalarının bir kütüphane oluşturmak için daha önce körelmenin pFILTER vektör klonlanmış. Her adım en uygun koşullarda klonlama prosedürünün performans kaliteli kütüphane altında eğitim DNA'ın toplam kapsama elde etmek için gereklidir.

Şekil 1B adımında filtreleme yaklaşım gösterilir: kloramfenikol (pFILTER direnci) tek başına veya kloramfenikol ve ampisilin ORF içeren colonies için seçmek için yetiştirilen kütüphanesidir. Tek kolonileri bir ORF için karşılık gelen bir DNA parçası olan fonksiyonel bir β-lactamase üretmek ve antibiyotik seçimi mevcut ise hayatta kalmak. Şekil 1 c nasıl artan seçici basınç seçimi iyi klasör ORFs zavallı klasör olanlar karşı sağlar gösterir. Beklenen sonuç Kütüphane boyutu yaklaşık 20-fold bir azalmadır. Hayatta kalan klonlar yüksek sayı yetersiz seçici basınç gösterir.

ORF parçaları kolayca sonraki uygulama için filtre uygulanmış kitaplığından elde edilebilir; etkileşim çalışmaları için bizim strateji fajının ekran teknolojisi yararlanır. Şekil 2' de, asıl adımları fajının Kütüphane inşaat temsil edilir: yeterli bir kütüphane pFILTER vektöründen süzülmüş parçaları kesmek ve yeniden phagemid plazmid dizi için kodlama ile Fusion içine klonlama tarafından hazırlanan Feyc capside protein g3p. Bir kez yardımcı phage ile enfekte, vektör varlığı bakteri hücrelerine fajının parçacıkları filtre uygulanmış Kütüphane bu fajının ekran seçim için kullanılabilir ve daha fazla işlem yapar onların yüzeyinde ORF-g3p füzyon ürünleri görüntüleme üretimini bırakmak analiz.

Tüm kitaplıkları derinden NGS tarafından yanı sıra çıkışlarına fajının seçimlerinizin Şekil 3ikinci bölümünde gösterildiği gibi analiz edilir. DNA parçalarının kurtarıldı kolonileri büyümesini PCR güçlendirme ile plazmid omurga üzerinde tavlama ve nasıl yapılacağını için belirli bağdaştırıcıların taşıyan belirli oligonucleotides tarafından. NGS gerçekleştirilir ve okuma sonra Interactome-Seq veri çözümleme web aracı ile analiz edilir.

Şekil 4 ' te seçim prosedürü bir ORF süzülmüş fajının görüntü kitaplığı şematik gösterimi bildirdi. Bu örnekte seçimi antikorlar sera içinde mevcut farklı patolojiler (yani infektif patolojiler, otoimmün patolojiler, kanser) tarafından etkilenen hastaların kullanarak gerçekleştirilir. Bu durumda fajının Kütüphane doğrudan mevcut hastaların sera ve hastalık belirli antikorlar tarafından tanındığından sözde belirli antijenleri zenginleştirilmiş bu şekilde antikorlar ile etkileşime girer. Bu tür deneme genellikle Kütüphane da birbirini izleyen karşılaştırma ve normalleştirme yordamlar için kullanılacak arka plan sinyal için denetim sera sağlıklı hastaların kullanarak seçilir.

Seçimleri hastalar genellikle birlikte gruplandırılmış farklı havuzları aynı tür gelen sera sera antikor titresi arası bireysel değişkenliği azaltmak için kullanarak gerçekleştirilir. Her havuzu bağımsız olarak bağışıklık reaktif klonlar patoloji altında eğitim için belirli kitaplığının zenginleştirmek için seçim, iki ya da üç ardışık tur için kullanılır. Test kümesi antikorlar Kütüphane phages ile inkübe, bağışıklık kompleksleri protein kaplı A manyetik-boncuk tarafından kurtarıldı ve ilişkili phages standart yordamlar tarafından eluted. Seçim döngüsü yıkama ve sıkılık bağlama artan ile gerçekleştirilir.

NGS tarafından oluşturulan okuma bu tür verileri yönetmek için özel olarak geliştirilen Interactome-Seq web aracını kullanarak analiz edilebilir. Interactome-Seq veri analizi iş akışı, ham sıralama okur, başlangıç genomik ek açıklamalar (Şekil 5A) ile sözde etki alanlarının listesini oluşturur dört sıralı adımlar oluşur. Girdi dosyası (ham okuma, başvuru genom dizisi, ek açıklama listesi) düzgün biçimlendirilmiş ilk adımda giriş (Şekil 5A - kırmızı kutu), Interactome-Seq denetler. İkinci adımda ÖNİŞLEME (Şekil 5A - turuncu kutu), düşük kaliteli sıralama veri ilk Cutadapt28 bağlı olarak Kalite Puanlarını kullanarak kesilmiş ve okuma uzunluğu 100 üsleri ile atılır. Bir sonraki okumak hizalama adımda (Şekil 5A - yeşil kutu), kalan okuma blastn29 eşleşmeme durumu % 5'e kadar izin genom sıra ile hizalanır. SAM dosyası oluşturulur ve sadece Kalite Puanı 30'dan büyük olan okur (Q > 30) SAMtools30 kullanarak ve BAM dosyasına dönüştürülür işlenir. Hizalama sonra Interactome-Seq etki alanları algılama (Şekil 5A - mavi kutu) gerçekleştirir, Bedtools çağırarak filtre uygulamak için31 uzunlukları tutanaklar içinde % 80'i için en azından örtüşen okur; kapsama alanı, maksimum derinlik ve odak değerleri daha sonra okuma eşleme tarafından kapsanan her ORF bölümü için hesaplanır. Kapsama bir gen atanan okuma toplam sayısını temsil eder; belirli bir genetik bölümü kapsayan okuma en fazla sayısı derinliğidir; odak kapsamı arasındaki maksimum derinlik oranı elde edilen dizinidir ve 0 ile 1 arasında değişebilir. Odağı 0,8 yüksek ve kapsama BAM dosyasındaki tüm eşleme bölgelerin gözlenen ortalama kapsamı daha yüksek olduğunda, CD bölümü bir sözde etki alanı/epitope sınıflandırılır. Interactome-Seq boru hattı son adım çıktı (Şekil 5A - menekşe kutusu), sözde etki alanlarının bir listesini ayrılmış sekmeli biçimde oluşturulur. Interactome-Seq boru hattı aracında bir web-Interactome-Seq analizi grafik arayüzü ile gerçekleştirmek için ve kolay ve Kullanıcı dostu bir biçimde onların sonuçları elde etmek için kullanıcıların herhangi bir Biyoinformatik veya programlama bilgisi olmadan sağlamak için dahil edilmiştir. Şekil 5Biçinde gösterildiği gibi analiz çıktı sonuçları görselleştirme ve keşif etkinleştirmek için JBrowse32 kullanarak görüntülenir. Interactome-Seq parça tespit sözde etki alanlarına karşılık gelen genom tarayıcı oluşturur ve örneğin farklı seçimler deneylerde zenginleştirilmiş ortak sözde etki alanları arasında kesişme noktalarında göstermek için klasik Venn diyagramları sağlar.

Figure 1
Resim 1: ORF filtreleme Kütüphane inşaatı için ana adımları şematik bakış
A) farklı kaynak DNA'dan sonicated ve 150-750 bp uzunlukta rasgele parçalara parçalanmış. Parçaları jel yeniden elde etmek ve künt pFILTER vektör klonlanmış; B) filtre uygulama adımında β-lactamase katlanır muhabir olarak kullanarak. ORF parçaları içeren vektör olumsuz seçili ampisilin ise ORF klonlanmış parçaları izin kolonileri büyümeye; C) artan bir seçici basınç uygulanması (ampisilin konsantrasyonu katı büyüme medya 0-> 100 μg/mL) daha iyi katlanmış parçaları seçime izin ver. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Şematik bakış fajının Kütüphane inşaatı için ana adımları
A) ORF filtre parçaları belirli enzimleri kullanarak filtre uygulanmış vektör kesilir. Kurtarma ve arıtma sonra parçaları phagemid vektör klonlanmış ve dönüştürülmüş; B) phagemid bakteriyel Kütüphane yardımcı phage ile enfekte ve PEG çöktürülmüş ve toplanan phages gecede büyüme sonra. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: sıralama ORF kitaplıkları
Sıralama her iki özgün ORF seçili kütüphane yanı sıra fajının görüntü kitaplığı gerçekleştirilir; 1) her iki durumda üzerinde yetiştirilen kolonileri kurtarılmasını ve DNA elde; 2) DNA parçalarının sıralama için adaptörleri bağlantılı belirli primerler kullanılarak amplifikasyon tarafından kurtarıldı; 3-4) parçaları kurtarılan ve derin NGS; kullanarak sıralı 5) veri Interactome-Seq boru hattı kullanılarak analiz edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Hastaların antikorları kullanarak Kütüphane seçim şematik bakış
Feyc kitaplığı seçim karşı antikorlar gelen hastaların sera için kullanılır. Antikorlar manyetik boncuklar immobilize, fajının Kütüphane yakalama/seçim gerçekleştirilir, yıkar, üç devir yapılma ve seçili phages daha sonra iyileşti ve yeniden bulaştırmak için kullanılan E. coli. E. coli yeniden enfekte hücreleri seçici basınç (ampisilin 100 μg/mL) kaplama. ORF parçaları amplifikasyon tarafından kurtarıldı ve amplicon havuzları sonra NGS tarafından sıralanamadı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Şematik Kütüphane analiz genel bakış
A) veri analizi iş akışı gösterimi raw FASTQ dosyaları son ek açıklama eklenen etki alanları listelerine başlayan; B) giriş ve çıkışlarını Interactome Seq web aracı şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Boru hattı tüm sonraki adımları etkileyecek bu yana, bir yüksek kaliteli son derece çeşitli ORFs filtre uygulanmış Kütüphane tüm prosedürü içinde belgili tanımlık ilk kritik adım oluşturulmasıdır.

Bizim Yöntem önemli bir avantajlı özelliği herhangi bir kaynak (intronless) DNA (cDNA, genomik DNA, elde edilen PCR veya sentetik DNA) kütüphane yapımı için uygun olmasıdır. Dikkate alınması gereken ilk pFILTER vektör klonlanmış DNA parçalarının uzunluğu genom veya bir transcriptome, sözde "domainome" etki alanı genelinde topluluğu bir gösterimini sağlamalıdır parametresidir. Protein etki alanları başarıyla klonlanmış, seçili ve DNA parçalarının bir uzunluğu dağıtım 150 için 750 bp33,34kapsayan ile başlayan son olarak tanımlanan ve bu ne paralel olarak bildirilen olduğunu göstermiştir Çoğu protein etki alanları 100 aa uzunluğunu gösteren edebiyat (200 ile 50 arasındadır ile aa)15.

Malzeme başlayan DNA boyutu aralığı seçim ve daha sonra filtreleme (pFILTER)12 vektör içine klonlanmış birleştirilmesi gerekir. Bu adımları uyguladığınızda, tüm klonlama reaksiyonlar protokol, belirli parçası sonu-tamir ve fosforilasyon dahil adımlar verimliliğini en üst düzeye çıkarma olası önyargı kaçınılması. Vektör hazırlık meydan okuyor ve sindirilmemiş vektör tarafından hem plazmid yıkımı ve/veya kontaminasyonu önlemek için de, optimal koşullar altında yapılmalıdır.

Kitaplığı oluşturulduktan sonra bu "sadece ORFs katlanmış parçaları korumak için filtre". Bu adımı modüle için önemli bir parametre seçicidir istenen filtre uygulama sıkılık göre değiştirilebilir uygulanan basınç. Seçim ampisilin kullanarak gerçekleştirilir: yüksek konsantrasyon kullanılan, dönüştürülmüş bakteri kolonileri hayatta kalmak mümkün düşük sayısı. Bu filtreleme yöntemi için iyi-kötü-klasör ORFs34karşı seçme olanağını yansıtır. Bu azalma klonlar sayısı seçili parçaları özelliklerini katlama artış tarafından dengelenir. Genellikle, ampisilin konsantrasyonu yaklaşık 1/20 için bu belge kitaplığını kloramfenikol sadece üzerinde büyüyen elde ile ilgili olarak bakteri kolonileri sayısını azaltmak için yeterli olmalıdır.

Kitaplık doğrulama genellikle rasgele çekilen kolonileri ve onların sıralamanın PCR amplifikasyon tarafından yapılır. PCR güçlendirme bazı kolonileri kalite Kütüphane hızlı bir tahmini için önerilen: ekler uzunluğu 150-750 bp ve farklı koloniler beklenen aralıkta mevcut ekler ile farklı boyutu gösteren iyi olmalıdır içinde dönem-in değişkenliği Kütüphane hazırlık. Tarama Kitaplık doğrulama için tek yöntem olarak uygulandığında, bu geleneksel strateji kapsamlı değildir ve zaman sınırlı sayıda kolonileri analiz izin ve en önemli klonların eksik yüksek bir şans sahip alan. Yaklaşımımız kütüphanede derin sıralama üzerinde dayanır, bu kütüphane çeşitlilik ve bereket ve her birinin seçili parçaları kesin haritalama tam bilgiler sağlar.

NGS teknoloji filtreleme yaklaşımla uygulanması derinlik analizi büyüklükte birkaç emir tarafından artırır. Son zamanlarda, biz Protokolü ORF kütüphaneler Illumina platformu kullanarak sıralama için en iyi duruma getirilmiş ve bu tür veri analizini yapar her kullanıcı için herhangi bir Biyoinformatik programlama bilgisi veri analizi için belirli web araç geliştirdi.

Kütüphane "başına" bir "evrensel enstrüman" ve protein ifade ve/veya seçim için farklı bağlamlarda yararlanılabilir. Bizim metodolojik yaklaşım üretilen ORFeome fajının ekran bağlam içine aktarılması üzerinde temel alır. Protein parçaları fajının yüzeyde ifade edilir ve sonraki seçim için uygun oldu.

Bu belirli enzimleri ile sindirim tarafından filtre uygulanmış ORFs pFILTER kitaplığından tahlisiye ve onları yeniden fajının protein g3p ile onların fusion sağlayan bir uyumlu phagemid vektör içine klonlama tarafından yapılır.

Phagemid-ORF kitaplığı oluşturulduktan sonra sözde bağlayıcı protein10 veya burada açıklandığı şekilde arıtılmış antikorlar35,36 gibi farklı hedeflere karşı seçim için kullanılabilir. Feyc parçacıkları filtre uygulanmış ORFs, çok daha etkili bir seçim prosedürü olmaması nedeniyle bu sonuçlarında sigara görüntüleme klonlar genellikle onların yüzeyinde görüntülenir bu yana sollamak.

Feyc ekran ORF Kütüphane seçimden sonra çıkış klonlar sıralı ve aynı boru hattı ile analiz. NGS tam bir sağlayabilir ve istatistiksel olarak anlamlı sıralamasını en sık ORFs seçilen ve bu çoğunlukla kullanılan yem ile etkileşim proteinler tanımlamasını sağlar. Birçok farklı sürümleri birkaç amino asitler tarafından farklı her etki alanının varlığı göz önüne alındığında, farklı sıralı klonlar arasındaki çakışmayı aynı zamanda en az parçası/bağlama özellikleri gösterilen etki alanını tanımlar. Bir kez seçtiğiniz etki alanları tespit edilmiştir, son olarak, genotip ve fenotip bilgi fajının kitaplığa bağlantı sayesinde, DNA dizisi kolayca daha fazla çalışmalar, vitro ve içinde vivo kitaplığından kurtarıldı doğrulama ve karakterizasyonu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser İtalyan Milli Eğitim Bakanlığı ve üniversite bir hibe tarafından desteklenmiştir (CP için 2010P3S8BR_002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sonopuls ultrasonic homogenizer Bandelin HD2070 or equivalent
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder Thermo Scientific SM0321 or equivalent
GeneRuler 1 kb DNA Ladder Thermo Fisher Scientific SM0311 or equivalent
Molecular Biology Agarose BioRad 161-3102 or equivalent
Green Gel Plus Fisher Molecular Biology FS-GEL01 or equivalent
6x DNA Loading Dye Thermo Fisher Scientific R0611 or equivalent
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 or equivalent
Quick Blunting Kit New England Biolabs E1201S
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific 4368813
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs S1420S or equivalent
QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 or equivalent
EcoRV New England Biolabs R0195L
Antarctic Phosphatase New England Biolabs M0289S
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202T
Sodium Acetate 3M pH5.2 general lab supplier
Ethanol for molecular biology Sigma-Aldrich E7023 or equivalent
DH5aF' bacteria cells Thermo Fisher Scientific
0,2 ml tubes general lab supplier
1,5 ml tubes general lab supplier
0,1 cm electroporation cuvettes Biosigma 4905020
Electroporator 2510 Eppendorf
2x YT medium Sigma-Aldrich Y1003
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
DreamTaq DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific EP0702
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix New England Biolabs N0447S
96-well thermal cycler (with heated lid) general lab supplier
150 mm plates general lab supplier
100 mm plates general lab supplier
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
BssHII New England Biolabs R0199L
NheI New England Biolabs R0131L
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 or equivalent
M13KO7 Helper Phage GE Healthcare Life Sciences 27-1524-01 
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma-Aldrich K1377
Polyethylene glycol (PEG) Sigma-Aldrich P5413
Sodium Cloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
PBS general lab supplier
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Thermo Fisher Scientific 10003D or equivalent
MagnaRack Magnetic Separation Rack Thermo Fisher Scientific CS15000 or equivalent
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Nonfat dried milk powder EuroClone EMR180500
KAPA HiFi HotStart ReadyMix  Kapa Biosystems, Fisher Scientific 7958935001
AMPure XP beads Agencourt, Beckman Coulter A63881
Nextera XT dual Index Primers Illumina FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004
MiSeq or Hiseq2500 Illumina
Spectrophotomer Nanodrop
Agilent Bioanalyzer or TapeStation Agilent
Forward PCR primer general lab supplier 5’ TACCTATTGCCTACGGCA
GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3’
Reverse PCR primer general lab supplier 5’ TGGTGATGGTGAGTACTA
TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3’
Forward primer for NGS general lab supplier 5’ TCGTCGGCAGCGTCAGA
TGTGTATAAGAGACAGGCA
GCAAGCGGCGCGCATGC 3’;
Reverse primer for NGS general lab supplier 5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGA
TGTGTATAAGAGACAGGGG
ATTGGTTTGCCGCTAGC 3’;

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Loman, N. J., Pallen, M. J. Twenty years of bacterial genome sequencing. Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).
  2. Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations. BMC Bioinformatics. 8 (1), 170 (2007).
  3. Andorf, C., Dobbs, D., Honavar, V. Exploring inconsistencies in genome-wide protein function annotations: a machine learning approach. BMC Bioinformatics. 8 (1), 284 (2007).
  4. Wong, W. -C., Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. More Than 1,001 Problems with Protein Domain Databases: Transmembrane Regions, Signal Peptides and the Issue of Sequence Homology. PLoS Comput Biol. 6 (7), e1000867 (2010).
  5. Bioinformatics, B., et al. Identification and correction of abnormal, incomplete and mispredicted proteins in public databases. BMC Bioinformatics. 9 (9), (2008).
  6. Phizicky, E., Bastiaens, P. I. H., Zhu, H., Snyder, M., Fields, S. Protein analysis on a proteomic scale. Nature. 422 (6928), 208-215 (2003).
  7. DiDonato, M., Deacon, A. M., Klock, H. E., McMullan, D., Lesley, S. A. A scaleable and integrated crystallization pipeline applied to mining the Thermotoga maritima proteome. J Struct Funct Genomics. 5 (1-2), 133-146 (2004).
  8. Nordlund, P., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  9. Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. Selecting open reading frames from DNA. Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).
  10. Di Niro, R., et al. Rapid interactome profiling by massive sequencing. Nucleic Acids Res. 38 (9), e110 (2010).
  11. Gourlay, L. J., et al. Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).
  12. D'Angelo, S., et al. Filtering "genic" open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation. BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).
  13. D'Angelo, S., et al. Profiling celiac disease antibody repertoire. Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).
  14. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).
  15. Heger, A., Holm, L. Exhaustive enumeration of protein domain families. J Mol Biol. 328 (3), 749-767 (2003).
  16. Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. Selecting open reading frames from DNA. Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).
  17. Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection. Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).
  18. Patrucco, L., et al. Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome). RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).
  19. Collins, M. O., Choudhary, J. S. Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry. Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).
  20. Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).
  21. Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif. J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).
  22. Deng, S. J., et al. Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display. J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).
  23. Danner, S., Belasco, J. G. T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries. Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).
  24. Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).
  25. Patrucco, L., et al. Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome). RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).
  26. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. Mol Biol. 1 (2), 146 (2003).
  27. Sblattero, D., Bradbury, A. Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries. Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).
  28. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  29. Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10 (1), 421 (2009).
  30. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  31. Quinlan, A. R. BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis. Curr Protoc Bioinforma. , (2014).
  32. Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. JBrowse: A next-generation genome browser. Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).
  33. Gourlay, L. J., et al. Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).
  34. D'Angelo, S., et al. Filtering "genic" open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation. BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).
  35. Di Niro, R., et al. Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display. Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).
  36. D'Angelo, S., et al. Profiling celiac disease antibody repertoire. Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).

Tags

Biyoloji sayı: 140 Phage görüntülemek sonraki nesil sekanslama Interactome Protein etki alanı web aracı katlama muhabir protein yapısı.
Interactome-Seq: Domainome kitaplığı inşaat, doğrulama ve seçim fajının görüntü ve sonraki nesil sıralama için bir protokol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soluri, M. F., Puccio, S., Caredda,… More

Soluri, M. F., Puccio, S., Caredda, G., Grillo, G., Licciulli, V. F., Consiglio, A., Edomi, P., Santoro, C., Sblattero, D., Peano, C. Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e56981, doi:10.3791/56981 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter