Summary
Infection des tissus humains avec le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) ex vivo fournit un précieux modèle 3D de la pathogenèse du virus. Nous décrivons ici un protocole pour traiter et infecter des échantillons de tissus d’amygdales humaines et des muqueuses génitales femelles avec le VIH-1 et les maintenir en culture à l’interface air-liquide.
Abstract
Histocultures permet d’étudier les interactions intercellulaires dans les tissus humains, et ils peuvent être employés à des interactions hôte-pathogène modèle dans des conditions contrôlées en laboratoire. Ex vivo l’infection des tissus humains avec le virus d’immunodéficience (HIV), parmi d’autres virus, a été utilisée avec succès pour enquêter sur la pathogenèse précoce de la maladie, mais aussi une plateforme pour tester l’efficacité et la toxicité des médicaments antiviraux. Dans le présent protocole, nous expliquons comment traiter et infecter avec le VIH-1 des explants de tissus d’amygdales humaines et de la muqueuse du col utérin et leur maintien en culture sur le dessus de gélatine éponges à l’interface liquide-air pendant environ deux semaines. Ce paramètre de culture non polarisé maximise l’accès aux nutriments dans le milieu de culture et de l’oxygène, même si une perte progressive de l’intégrité des tissus et des architectures fonctionnelles reste sa principale limitation. Cette méthode permet de surveiller la réplication du VIH-1 et pathogenèse en utilisant plusieurs techniques, y compris les immunoessais, qPCR et cytométrie en flux. D’importance, la variabilité physiologique entre donneurs de tissus, ainsi qu’entre les explants provenant de régions différentes du même spécimen, peut affecter significativement les résultats expérimentaux. Afin d’assurer la reproductibilité du résultat, il est essentiel d’utiliser un nombre suffisant d’explants, répétitions techniques et des conditions de témoins du même donneur pour normaliser les résultats des traitements expérimentaux lors de la compilation des données provenant de multiples expériences (par exemple ., menée à l’aide de tissus de donneurs différents) pour l’analyse statistique.
Introduction
Les cultures de cellules bidimensionnels monotypique, référencés ici sous le nom conventionnel, n’expliquent pas la communication spatiale et fonctionnelle entre la grande variété de types de cellules qui composent les tissus et organes. Cet aspect revêt une importance primordiale pour les modèles expérimentaux de la maladie, comme interférence avec interactions intercellulaires homéostatiques est le facteur déterminant de toutes les pathologies. Des explants de tissus offrent des avantages majeurs pour la modélisation de la santé et la maladie chez les humains parce qu’ils conservent la cytoarchitecture et nombreux aspects fonctionnels des organes sont-ils en vivo, bien qu’une quantité limitée de temps1. Par exemple, après ex vivo provocation par des antigènes de rappel, tel que l’anatoxine diphtérique ou tétanique, tissu amygdalien répond avec une production vigoureuse des anticorps antigène-spécifiques2. Comme tout autre ex vivo modèle, histoculture a ses propres limites : variabilité inter-bailleurs de fonds, polarisation de tissu, la survie limitée des tissus et Difficulté dans le suivi des cellules au-delà de la profondeur de la microscopie confocale1. Des explants de tissus humains demeurent néanmoins, un modèle de choix pour étudier les processus immunologiques homéostatiques et pathogènes chez l’homme, y compris les interactions hôte-pathogène et les éventuelles interventions thérapeutiques3.
Les événements critiques de la pathogénèse du VIH-1 ont lieu dans les tissus. Infection de la muqueuse génitale représente la majorité de tous les VIH-1 transmission des événements dans le monde4. Tissu lymphoïde est le siège principal de la réplication du virus au cours de l’infection aiguë et héberge un bassin important de cellules infectées de façon latente5et leur persistance représente le principal obstacle pour parvenir à une guérison6. Le défi de la culture et ex vivo des tissus lymphoïdes et muqueuses humains offrent certains avantages par rapport aux systèmes conventionnels basés sur des cellules isolées pour l’étude du VIH-1. Par exemple, les cellules de tissu-résident peuvent prendre en charge HIV-1 infection en l’absence d’activation exogène, par opposition aux cellules mononucléaires de sang périphérique1. L’utilisation d’explants de tissu lymphoïde a permis une meilleure compréhension de certains mécanismes clés qui sous-tendent les lymphocytes T CD4 cell épuisementc'est-à-dire, le spectateur effet7, qui est la marque d’une infection aiguë. La préservation des structures telles que les follicules de lymphocytes B dans le tissu lymphoïde8 et de l’épithélium de la muqueuse génitale féminine des explants9 offre l’opportunité unique d’intégrer les caractéristiques spatiales et fonctionnelles de l’infection à VIH-1 sur ces sites. Enfin, les histocultures ont été utilisés avec succès au modèle et d’étude de10,la co-infection VIH-1 et herpèsvirus11, ainsi que pour les essais précliniques d’antirétroviraux et multitarget microbicides12, 13 , 14 , 15.
Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la culture des explants de tissus humains provenant des amygdales et les muqueuses de l’appareil génital féminin inférieur (col de l’utérus), couvrant la dissection des tissus pour explantation défi avec le VIH-1 de manière non polarisé. La culture d’explants de tissu à l’interface air-liquide, à l’aide d’éponges de gélatine comme support, optimise l’exposition à l’oxygène de l’air tout en fournissant un accès aux nutriments de milieu de culture par le biais de l’éponge capillaires, retardant ainsi leur désintégration naturelle. D’évaluer la réplication du VIH-1 dans notre système, la plus immédiate consiste à mesurer la quantité de virus libérés dans le milieu de culture des explants au fil du temps par dosage immunologique ou qPCR. Infection à VIH-1 et pathogénie (e.g., déplétion des cellules T CD4) aussi peut être évaluée dans des explants de tissus en vrac extraction ARN/ADN et qPCR, in situ de coloration ou seule cellule-analyse après digestion de tissus par cytométrie en flux.
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Protocol
Le protocole pour la collection de tissus humains peut-être exiger l’approbation éthique par les autorités compétentes locales. Dans le cas de chirurgies indiquées comme l’amygdalectomie et l’hystérectomie, les spécimens ne sont pas collectés spécifiquement aux fins de la recherche et l’étude n’est pas considéré comme recherche de sujets humains (National Institutes of Health. Recherche sur des sujets humains. https://humansubjects.nih.gov/Walkthrough-Investigator#tabpanel11). Cependant, obtenir des données personnelles et médicales des donneurs de tissus (p. ex.., sexe, âge, utilisation actuelle de médicaments, antécédents d’infections, etc.) qui peuvent aider à interpréter les résultats expérimentaux, remet en question sur le consentement éclairé et de la vie privée qui doit être abordées dans le protocole de prélèvement tissulaire.
ATTENTION : Toute la procédure doit être effectuée sous une hotte de sécurité biologique. Tous les échantillons humains, y compris ceux des individus « sains », pourraient contenir des agents infectieux. L’opérateur devrait recevoir une formation pour travailler avec les pathogènes à diffusion hématogène à gérer en toute sécurité des échantillons de tissus, même si les expériences n’impliquent pas l’utilisation du VIH. Une évaluation des risques de la procédure de la dissection des tissus et l’infection par le VIH devrait être effectuée par personnel qualifié pour assurer la sécurité de l’opérateur et les collègues de travail. L’utilisation du VIH infectieux nécessite dédié sur la biosécurité des environnements de niveau 2 ou 3 selon les pays et l’Institut des réglementations sur les produits biologiques dangereuses et des pathogènes à diffusion hématogène.
1. préparation des éponges de gélatine
Remarque : Bien qu’il ne soit pas strictement nécessaire préparer la gélatine éponges avant la dissection des tissus, il est plus facile de suivre l’ordre indiqué ici, surtout lorsque vous manipulez une grande quantité de tissu et/ou de nombreux donateurs.
- Préparer le milieu de culture (CM) et compléter avec une solution antibiotique (dépose-clavulanate mix) avant de l’utiliser pour faire CMT (Table des matières). Jeter toute solution antibiotique reste.
NOTE : Ticarcilline et clavulanate dans CMT sont peu stables. Si nécessaire, re-supplément CMT avec une solution antibiotique après environ 24 heures de préparation. Il n’est pas tenu d’ajouter une solution antibiotique pour explantation moyen toutes les 24 h au cours de la culture. - Remplir un 100 mm x 20 mm boîte de Pétri avec environ 20 à 30 mL de CMT.
Remarque : Ce paramètre est optimal pour préparer suffisamment éponges de gélatine pour deux plaques 6 puits ou une plaque de 12 puits dans le temps. Si plusieurs plaques sont requises, utilisez une boîte de Pétri plus large et plus grand volume CMT pour accélérer la préparation. - Transvaser la gélatine déposer dans la boîte de Pétri à l’aide d’une pince stérile. Mouillez l’éponge sur les deux côtés et laisser les éponges s’imprégner de moyen pour 1 min. sur les éponges contre le fond de la boîte de Pétri pendant environ 2 min à l’aide d’une spatule stérile.
Remarque : Cette étape est d’une importance cruciale car la présence de bulles d’air dans l’éponge permet de bloquer les capillaires à travers lequel nutriments du milieu de culture a atteindre le tissu. Éponges de gélatine sont extrêmement fragiles lorsque déshydraté. Pousser doucement vers le bas sur l’éponge avec la spatule, surtout au début, pour éviter de casser l’éponge. - Utilisation des ciseaux stériles pour couper les éponges de gélatine réhydratées en morceaux de taille égale d’environ 1 cm2. Transférer 1 morceau d’éponge à l’aide de pinces dans chaque puits d’une plaque de culture. Ajouter 3 à 4 mL de CMT dans chaque puits d’une plaque de 6 puits (amygdales) et 1 mL par puits dans une plaque de 12 puits (col de l’utérus). Placer les plaques dans l’incubateur, fixé à 37 ° C, 5 % de CO2, ≥ 90 % d’humidité, jusqu'à ce que les explants de tissu sont prêts à être chargés sur les éponges.
Remarque : Le volume de CMT à ajouter dans la plaque doit être ajusté à l’épaisseur de l’éponge pour garder les explants à l’interface air-liquide.
2. dissection du tissu amygdalien humain
Remarque : Les amygdales doivent être traités dès que possible après la chirurgie, idéalement le jour même de l’opération. Alternativement, des spécimens peuvent être laissés CMT immergé dans une nuit à 4 ° C.
- Laissez le CM suffisamment de temps pour atteindre la température ambiante (RT) ou mettez-le dans un bain d’eau préchauffée à 37 ° C. Compléter la CM avec une solution antibiotique (CMT) avant utilisation. Jeter toute solution antibiotique surplus. Versez la solution d’éthanol à 70 % dans un récipient propre pour faire tremper les forceps et bistouri chaque fois que nécessaire pendant la procédure de dissection. Nettoyer les outils et changer la lame de bistouri entre les dissections de spécimens provenant de différents donneurs.
- Transférer les amygdales dans le conteneur de transport dans un 100 mm-boîte de Pétri contenant 10-20 mL de CMT à l’aide d’une pince stérile.
NOTE : Les spécimens avec vastes zones de cautérisation, sanglante, ou les tissus nécrosés doivent être jetés. - Utiliser le couvercle de la boîte de Pétri comme une surface de coupe à disséquer les tissus. Tenant le tissu doucement avec une pince, coupez chaque amygdale en plusieurs gros morceaux à l’aide de la lame et bistouri stérile.
ATTENTION : Manipulation des outils tranchants à disséquer les prélèvements humains accroît le risque de blessures et de contamination. L’opérateur devrait envisager de porter métal, maille, des gants résistant aux coupures comme protection supplémentaire. - Remove cautérisés, sanglante et tissu fibrome et toutes les pièces contenant les tonsilloliths (matériau calcifiée) et/ou avec la couleur vert-brun à l’aide de forceps et bistouri.
Remarque : Lorsque vous travaillez sur un morceau de tissu, il est important de garder le reste du tissu immergé dans le milieu pour éviter le dessèchement des tissus. - Couper chaque morceau de tissu en tranches d’environ 2 mm d’épaisseur. Retirer toute partie indésirable comme dans l’étape précédente. Couper les tranches de tissus en lattes de 2 mm d’épaisseur. Couper les bandes de tissu en 2 blocs de mm d’épaisseur. Il devrait en résulter des explants de tissu d’environ 8 mm3.
- Transférer les explants dans un nouveau 100 mm boîte de Pétri contenant 10 à 20 mL de CMT pour éviter la dessiccation des tissus tout en instance avec la dissection. À la fin de la dissection, agiter la plaque pour randomiser la distribution de l’explant. 9 place tissus des explants sur le dessus de chaque éponge de gélatine dans une assiette de 6 puits avec une pincette, permettant l’espace entre eux. Remettez les plaques dans l’incubateur.
Remarque : En général, des explants sont cultivés pendant la nuit et inoculation des cultures avec le VIH-1 est exécutée le lendemain. Il s’agit de s’assurer qu’aucune contamination bactérienne ou fongique se développe dans la culture. En outre, les cellules ont tendance à sortir des explants de tissu amygdalien après dissection. Ce processus est en grande partie achevé durant le premières 24 h de culture1. - Éliminer tous les déchets biologiques dans des contenants pertinents conformément aux règlements de l’Institut sur la manipulation des produits biologiques dangereux et l’évaluation des risques spécifiques.
3. infection du tissu amygdalien Explants avec VIH-1
Remarque : Afin de réduire la variabilité du résultat entre expériences indépendantes, la préparation de virus même devrait être utilisée pour une étude d’ensemble. Virus peut se multiplier dans les cellules mononucléaires de sang périphérique exogène activés et puis le surnageant de culture peut être aliquoté pour le stockage à-80 ° C pour éviter répétés de gel et de dégel (Table des matières).
- Mettre la CM dans un bain d’eau préchauffé à 37 ° C. Compléter la CM avec une solution antibiotique (CMT) avant utilisation. Jeter toute solution antibiotique reste.
- Aspirer le milieu dans les plaques 6 puits avec une pipette et jetez-le dans un récipient avec une solution désinfectante. Inclinaison de la plaque et poussez doucement les éponges de gélatine pour la partie supérieure du puits pour permettre à moyen et à rassembler en bas et aspirer et jetez-le. Ajouter 3 à 4 mL de CMT dans chaque puits.
- Décongeler la préparation de virus VIH-1 dans le bain-marie à 37 ° C. Si nécessaire, diluer le stock de virus avec CM (tableau 1).
Remarque : Le stock de virus doit être dilué pour que l’inoculum sélectionné est contenue dans un volume de 5 à 8 µL (tableau 1). Pour une infection efficace, il est essentiel d’utiliser le temps minimum nécessaire entre le dégel de la préparation du VIH-1 et d’infecter des explants de tissu. - Pipetter l’inoculum de virus directement sur le dessus de chacun des 9 explants sur une éponge de gélatine. Remettez la plaque d’immatriculation dans l’incubateur, dès que l’infection est terminée. Jeter toute préparation de virus résiduel. Continuez à la Section 5.
Remarque : Pour exactement fournir l’inoculum de virus l’opérateur devrait envisager à l’aide d’une technique de pipetage inverse et changer d’embout pour chaque cupule. Il s’agit de pousser le piston de la pipette vers la position de la purge (le deuxième arrêt) d’élaborer l’inoculum de virus, et pousser jusqu’au premier cran pour fournir l’inoculum, qui contribue à la formation de soufflures de minimiser et de l’erreur associée à l’échantillonnage répété de petites volumes, c'est-à-dire, 5 – 8 µL.
4. dissection et l’Infection de la muqueuse du col utérine
Remarque : Pour des résultats optimaux, explants de la muqueuse du col utérin doivent être traitées et infectés dès que possible après la chirurgie, idéalement le jour même de l’opération. Alternativement, spécimens peuvent être entreposés immergé dans CMT à 4 ° C durant la nuit et infecté immédiatement après dissection.
- Laissez le CM suffisamment de temps pour atteindre RT ou mettez-le dans un bain d’eau préchauffée à 37 ° C. Compléter la CM avec une solution antibiotique (CMT) avant utilisation. Jeter toute solution antibiotique reste. Versez la solution d’éthanol à 70 % dans un récipient propre à tremper le forceps et bistouri chaque fois que nécessaire pendant la procédure de dissection. Nettoyer les outils et changer la lame de bistouri entre les dissections des échantillons provenant de donneurs multiples.
- À l’aide d’une pince stérile, transférer l’échantillon dans le conteneur de transport dans une boîte de Pétri contenant 10 à 20 mL de CMT de 100 mm.
- Utiliser le couvercle de la boîte de Pétri comme une surface de coupe à disséquer les tissus. Tenant le tissu doucement avec une pince, séparer la stromale sous la muqueuse de l’exocol et l’endocol et tissus musculaires (sous-muqueuse) avec un bistouri et lame pour obtenir des bandes de muqueuse.
Remarque : Lorsque vous travaillez sur un morceau de tissu, il est important de garder le reste du tissu immergé dans le milieu pour éviter le dessèchement des tissus. - Couper la muqueuse en lattes de 2 mm de largeur, retirez et jetez autant sous-muqueuse que possible, laissant seulement une couche de 2 mm d’épaisseur de tissu. Couper les bandes de 2 mm d’épaisseur en blocs. Il devrait en résulter des explants de tissu d’environ 8 mm3.
ATTENTION : Manipulation des outils tranchants à disséquer les prélèvements humains accroît le risque de blessures et de contamination. L’opérateur devrait envisager de porter métal, maille, des gants résistant aux coupures comme protection supplémentaire. - Transfert les explants de tissu dans une autre boite de Petri 100 mm contenant 10 à 20 mL de CMT pour éviter la dessiccation des tissus tout en instance avec la dissection. À la fin de la dissection, agiter la plaque pour randomiser la distribution de l’explant.
- Avec une pince stérile, transférer les explants dans stériles 1,5 mL tubes coniques (maximum 16 explants par tube). Supprimer n’importe quel support dans le tube à l’aide d’une pipette.
- Décongeler la VIH-1 préparation dans un bain-marie à 37 ° C. Si nécessaire, diluer le stock de virus avec CM. transfert du virus dans les tubes contenant les explants. Jeter toute préparation de virus résiduel.
Remarque : Le stock de virus doit être dilué pour que l’inoculum sélectionné est contenue dans un volume minimum 0,5 ml (tableau 1). Afin de réduire la variabilité du résultat entre expériences indépendantes, la préparation de virus même devrait être utilisée pour une étude complète (Table des matières). - Transférer les tubes dans un thermo-shaker et incuber pendant 2 h à 37 ° C, à bascule à 300 tr/min. Retourner doucement les tubes quelques fois toutes les 30 à 60 min.
Remarque : Pour une infection efficace, il est essentiel d’utiliser le temps minimum nécessaire entre le dégel de la préparation du VIH-1 et transférer les tubes à 37 ° C. - Remplir une plaque 6 puits de 3 – 4 mL / puits d’une solution saline tampon de phosphate stérile (PBS). À la de l’incubation avec le VIH-1, jetez toute la préparation du virus dans les tubes dans un récipient avec une solution désinfectante à l’aide d’une pipette. Transférer les explants dans la plaque de 6 puits contenant PBS avec une pincette.
- Permettre les explants reposer dans du PBS pendant 1 min à ta et puis lavez-les de pipetage doucement va-et-vient le PBS dans le puits 2 ou 3 fois. Jeter le PBS dans un récipient avec une solution désinfectante à l’aide d’une pipette. Ajouter 3 à 4 mL de PBS nouvelle à chaque puits. Répétez deux fois plus pour un total de trois lavages. Jeter le PBS juste avant de transférer les explants dans les éponges pour éviter le dessèchement des tissus.
NOTE : Explants de la muqueuse du col utérin et en particulier endocol, sortie grande quantité de mucus au cours de l’infection. Il est essentiel de se laver et retirer autant de mucus que possible parce que la rétention non-spécifique sur des explants et la libération subséquente de virus dans le surnageant de culture peut masquer la réplication du virus. - À l’aide de pinces, transfert des explants de 5-8 sur le dessus de chaque éponge de gélatine dans une assiette de 12 puits. Remettez la plaque dans l’incubateur.
- Éliminer tous les déchets biologiques dans des contenants pertinents conformément aux règlements de l’Institut sur la manipulation des produits biologiques dangereux et l’évaluation des risques spécifiques.
5. Histoculture
- Changer la CM tous les 3 jours à partir du moment de l’infection jusqu’au jour 12 – 15 après l’infection. Le CM et/ou des explants peuvent être dégustés à intervalles réguliers pendant toute la durée de la culture pour évaluer la réplication du VIH-1, entre autres paramètres.
- Mettre la CM dans un bain d’eau préchauffé à 37 ° C.
Remarque : Il n’est pas nécessaire de compléter la CM avec une solution antibiotique à ce stade. - Prélever un échantillon de CM avec une pipette et transférez-le dans stérile 1,5 ou 2 mL bouchon à vis ou les tubes pour le stockage à-80 ° C.
Remarque : Le CM de réplicat puits sont mis en commun à la collection. - Récolter les explants de tissu avec une pince stérile, enlever l’excès du milieu sur les explants en les plaçant sur un morceau de papier (en option) et transférer des explants dans stérile 1,5 ou 2 mL bouchon à vis ou les tubes. Traiter ou stocker les échantillons de tissus tel que requis par l’expérience.
NOTE : Pour la cytométrie en flux, les explants sont immédiatement digérées avec un cocktail enzymatique pour obtenir une suspension de cellules individuelles (pour plus de détails voir références 1, 9, 16 et 17). Pour l’extraction de l’ARN, les explants sont conservés dans une solution de stabilisation RNA à 4 ° C pendant la nuit avant leur stockage à-80 ° C. Pour l’extraction d’ADN ou in situ la coloration (col de l’utérus), des explants peuvent être snap-gelé dans la boue liquide, azote ou neige carbonique/éthanol et conservés à-80 ° C. Alternativement, des explants amygdales peuvent être fixés par une immersion dans une solution de PBS et 4 % de paraformaldéhyde pour in situ la souillure. - Aspirer le CM résiduel dans le puits avec une pipette et jetez-le dans un récipient avec une solution désinfectante. Inclinaison de la plaque et poussez doucement les éponges de gélatine pour la partie supérieure du puits afin de permettre le moyen de rassembler en bas et puis aspirer et jetez-le.
- Ajouter 3 à 4 mL de CM dans chaque puits. À l’aide d’une pince stérile, retourner que n’importe quel tissu explants qui est tombé dans le milieu de l’éponge de gélatine. Remettez la plaque dans l’incubateur.
- À la fin de la culture, éliminer tous les déchets biologiques dans des contenants pertinents conformément aux règlements de l’Institut sur la manipulation des produits biologiques dangereux et l’évaluation des risques spécifiques.
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Representative Results
Plusieurs techniques peuvent servir à évaluer la réplication du VIH-1 des explants de tissu. Notre lecture standard consiste à mesurer la quantité de VIH-1 p24gag sorti en CM au fil du temps avec un dosage immunologique18.
Des explants de tissus de différents donateurs, infectés par l’inoculum même de la même souche de VIH-1, peuvent produire des quantités différentes de virus (tableau 1). Cela est dû à plusieurs facteurs, tels que le nombre et statut des cellules cibles du VIH-1 et la présence d’infecter des agents pathogènes dans les tissus16,19. Dans la Figure 1, nous fournissons un exemple de l’infection à VIH-1 productive et avortée d’explants de la muqueuse cervicale tel que défini par la quantité de p24gag sorti en CM par rapport aux donneurs appariés des explants traités avec l’antirétroviraux médicament lamivudine (3TC) qui supprime totalement la réplication du VIH-1. Même si ce contrôle apparaît superflu pour infection des explants de tissus du donneur a, elle contribue à une discrimination avortée (B) d’infection productive (C) dans les explants qui génèrent de faibles niveaux de réplication du VIH-1.
L’utilisation d’un médicament antirétroviral comme une condition de contrôle peut être utile d’étudier l’infection à VIH-1 dans les tissus qui hébergent des cellules cibles, comme la muqueuse du col utérin et lorsque vous utilisez la réplication lente HIV-1 variantes, telles que certains isolats primaires en faibles effectifs. En outre, pour les tissus infectés par ces virus, il est important d’envisager d’utiliser des méthodes de détection plus sensibles, par exemple de qPCR.
Figure 1 : La réplication du VIH-1 dans la muqueuse du col utérin explants provenant de trois donneurs de tissus différents. Tissu cervical explants ont été infectés par l’inoculum même du VIH-1BaL par submersion en stock de virus et cultivées pendant 15 jours en présence ou en absence de l’antirétroviral médicament lamivudine (3TC) à une concentration de 10 µM. milieu de Culture a été échantillonné tous les 3 jours et échantillons de puits répétées ont été regroupées dans le prélèvement pour analyse de la réplication du VIH-1 par immunodosage degag p24 VIH-1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Type de tissu | Virus | Inoculum par explant (pg du VIH-1 p24gag) | Lol des explants | Milieu de culture volume (mL) | Lol des puits (technique réplique) | Production degag p24 VIH-1 (ng/mL) |
| Amygdales | Le VIH-1BaL | 350 – 500 | 9 | 3-4 | 2 – 3 | 1 – 10 |
| Le VIH-1LAI.04 | 9 | 3-4 | 2 – 3 | 1 – 100 | ||
| Col de l’utérus | Le VIH-1BaL | 1 500-2 000 | 8 | 1 | 2 | 1 – 5 |
| Le VIH-1LAI.04 | 8 | 1 | 2 | indétectable |
Tableau 1 : valeurs de l’inoculum de HIV-1 infection d’explants de tissu et de la production de virus de référence. La valeur de l’inoculum de VIH-1 par explant tissus individuels se réfère à des stocks de virus à une concentration de 50 à 70 ng/mL : un volume de 7 µL du stock de virus non dilué est utilisé pour infecter chaque amygdale explant sur le dessus une éponge de gélatine ; un volume de 500 µL de stock de virus non dilué est utilisé pour infecter les explants cervicales 16 par submersion dans un tube de 1,5 mL. Des explants cervicales sont abondamment lavés dans du PBS avant de les transférer sur gélatine éponges. La valeur de la production de VIH-1 par des explants de tissu se réfère au montant cumulé de p24gag sorti des 8 explants dans 1 mL (col de l’utérus), ou 9 explants dans 3-4 mL (amygdales) de milieu de culture (CM) échantillonné tous les 3 jours pendant 12 à 15 jours de culture. CM du puits répétées est mis en commun à la collection pour chaque point de temps avant de le remplacer avec frais CM. La valeur de p24gag concentration mesurée au jour 3 a été exclue de l’analyse parce qu’il représente partiellement absorption du virus sur des explants et la libération subséquente en CM, c'est-à-dire, Report de l’inoculum. En général, l’infection des tissus du col avec le VIH-1LAI.04 ne conduit pas à la réplication du VIH-1 détectable dans notre système expérimental16.
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Discussion
L’utilisation de tissus humains des explants pour l’étude de l’infection VIH-1 fournit des avantages par rapport aux traditionnels systèmes expérimentaux bidimensionnels et monotypiques, telles que les cellules primaires ou des lignées de cellules, due à leur capacité supérieure de reproduire les interactions intercellulaires et cellulaire fonctionne (par exemple, la production de cytokines) qu’ils sont en vivo. Néanmoins, tissu amygdalien et cervical diffèrent sur de nombreux aspects, notamment le nombre et les caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles des VIH cible les cellules1,16. Pour la même raison, variantes de VIH-1 à tropisme corécepteur différents (p. ex., VIH-1 de tropisme CCR5BaL vs CXCR4 tropisme du VIH-1LAI.04) effectuent différemment dans les amygdales et col de l’utérus (tableau 1). La distribution des corécepteurs du VIH sur les cellules cibles au immunitaire inductive et effectrices ne sites que partiellement responsable locale susceptibilité à l’infection : les cellules T CD4 transportant CXCR4 sont plus abondants que les cellules exprimant le CCR5 dans le tissu amygdalien, ainsi explication des niveaux plus élevés la réplication du VIH-1LAI.04 que le VIH-1BaL, mais les récepteurs sont également représentées dans la muqueuse du col utérin à16. Néanmoins, nous avons rarement détecté réplication virale productive dans les tissus du col utérin a contesté avec le VIH-1LAI.04, qui s’inscrit dans la transmission préférentielle des variantes de tropisme CCR5 HIV-1 individuelles observée in vivo20 . Ceci suggère que le statut de la différenciation et l’activation des cellules cibles du VIH-1 peut finalement déterminer leur capacité de charge de la réplication du VIH-116.
Éponges de gélatine sont hémostatiques dispositifs obtenus à partir de peau de porcine purifiée (collagène), qui sont conçues pour être complètement absorbé par le corps humain après quelques semaines. Nous recommandons d’utiliser les produits qui affichent des taux de lente dégradation dans la culture qu’ils conviennent mieux le but de maintenir des explants de tissu à l’interface air-liquide pendant 2-3 semaines. Nous vous recommandons également de tester différents lots du même produit pour évaluer une performance constante dans la culture de l’explant.
De même, le type et beaucoup de sérum fœtal (SVF) peuvent affecter des taux de réplication du VIH-1. Nous conseillons tester plusieurs lots de FBS pour l’optimisation de la CM et utiliser le même lot de FBS pour l’ensemble de l’étude. Régulièrement, nous testons FBS sur explants de tissu de 10 donneurs et sélectionnez le lot qui donne la réplication du VIH-1 plus haute.
Pour la plupart des expériences, nous regroupons des explants de l’endocol et l’exocol pour maximiser le nombre de conditions expérimentales. On peut considérer les garder séparées en raison de leurs différentes caractéristiques structurelles et immunologiques21. Aussi, endocervical explants sortie et continuer à produire une grande quantité de mucus dans la culture qui peut-être interférer avec l’analyse en aval. Voyant que la zone couverte par l’endocol est beaucoup plus petite que l’exocol, il est difficile de mener des expériences d’infection VIH exclusivement sur la muqueuse endocervicale en utilisant un numéro d’explants et technique réplique.
Exécution d’infection à VIH-1 par submersion des explants cervicales maximise les chances d’obtenir une infection productive en raison de la diminution du nombre de cellules CD4 T présents dans la muqueuse, comparée à celle des tissus lymphoïdes. Pour la même raison, le tissu du col est plus sensible au stockage pendant la nuit et les rendements plus élevée réplication du VIH-1 lorsque infectées peu de temps après la chirurgie et immédiatement après dissection. Bien que l’infection par submersion en stock de virus peut être effectuée également pour le tissu amygdalien afin d’assurer une exposition uniforme des explants au virus, cette approche implique des tissus manipulation et cellule des pertes plus élevées que l’infection des explants sur gélatine éponges comme décrit dans le protocole.
Systèmes polarisées du défi du VIH-1 et la culture des tissus muqueux existent et sont couramment utilisés dans les autres laboratoires3,22,23,24,25. Bien que ces systèmes sont un précieux modèle d’entrée de VIH-1 et de pénétration dans la muqueuse, leur mise en place est généralement plus de temps et peut nécessiter de manipulation des tissus vaste. Modèles non polarisés de la muqueuse transmission/pathogénèse encore offrent une plateforme valide afin d’étudier la régulation de la réplication du VIH-1 et la piscine locale des cellules infectées par des facteurs endogènes et exogènes9,17 , 26, y compris les médicaments12,13,14,15.
La variabilité inter-bailleurs de fonds peut représenter un enjeu majeur pour la reproductibilité des résultats entre les expériences indépendantes effectuées sur des échantillons provenant de donneurs multiples. Variabilité de la composition cellulaire peut-être également affecter les régions au sein du même spécimen, c'est-à-dire, la variabilité intra-donateurs. Afin de réduire la variabilité et interpréter correctement les résultats, il est essentiel de mettre en place toutes les conditions au sein d’une des expériences à l’aide d’un nombre suffisant d’explants provenant du même donneur (donneurs appariés selon conditions). Résultats peuvent être normalisées à un contrôle interne lors de la compilation des données provenant de multiples expériences pour l’analyse statistique. Afin de réduire la variabilité intra-donneur, nous vous recommandons d’y compris au moins 2 réplicats techniques pour chaque condition expérimentale, pour un total de 18 explants de tissu amygdalien (9/puits) et des explants de 10-16 de la muqueuse du col utérin (5-8/puits) (tableau 1). La disponibilité des dossiers médicaux et l’inclusion d’une analyse complémentaire du patient matériel et/ou des conditions expérimentales, par exemple à l’adresse l’état inflammatoire d’un spécimen, peuvent améliorer considérablement l’interprétation du résultat (voir référence 9 pour un exemple).
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), les médecins suédois de la Fondation contre le sida (http://www.aidsfond.se/, Réf. FOa2014-0006) et Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) d’Andrea Introini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
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