Summary
Infezione dei tessuti umani con il virus di immunodeficenza umana (HIV) ex vivo fornisce un prezioso modello 3D della patogenesi del virus. Qui, descriviamo un protocollo per elaborare e infettare i campioni di tessuto da tonsille umane e delle mucose genitali femminile con HIV-1 e mantenerli nella cultura presso l'interfaccia liquido-aria.
Abstract
Histocultures permettono di studiare le interazioni intercellulari all'interno dei tessuti umani, e possono essere impiegati per interazioni ospite-patogeno modello in condizioni di laboratorio controllate. Ex vivo l'infezione dei tessuti umani con il virus di immunodeficenza umana (HIV), tra altri virus, è stato utilizzato con successo per studiare la patogenesi della malattia precoce, così come una piattaforma per testare l'efficacia e la tossicità dei farmaci antivirali. Nel presente protocollo, spieghiamo come elaborare e infettare con HIV-1 espianti di tessuto umane tonsille e mucose cervicali e mantenute in coltura in cima spugne di gelatina all'interfaccia liquido-aria per circa due settimane. Questa impostazione non polarizzato cultura massimizza accesso alle sostanze nutrienti nel terreno di coltura e di ossigeno, anche se la perdita progressiva di architetture funzionali e l'integrità del tessuto rimane il suo limite principale. Questo metodo consente il monitoraggio replica di HIV-1 e patogenesi utilizzando diverse tecniche, tra cui test immunologici, qPCR e citometria a flusso. Di importanza, la variabilità fisiologica tra donatori di tessuti, nonché tra espianti provenienti da diverse aree del campione stesso, può incidere significativamente i risultati sperimentali. Per garantire la riproducibilità dei risultati, è fondamentale utilizzare un adeguato numero di espianti, replicati tecnici e controllo di donatore-pari condizioni per normalizzare i risultati dei trattamenti sperimentali durante la compilazione di dati provenienti da esperimenti multipli (cioè ., condotto utilizzando tessuti da donatori diversi) per l'analisi statistica.
Introduction
Colture cellulari di bi-dimensionale monotipico, cui qui come convenzionale, non tengono conto la comunicazione spaziale e funzionale tra la grande varietà di tipi di cellule che compongono i tessuti e organi. Questo aspetto è di fondamentale importanza per modelli sperimentali della malattia, come interferenze con interazioni intercellulari omeostatici sono il fattore trainante di tutte le patologie. Espianti di tessuto offrono importanti vantaggi per la modellazione di salute e malattia in esseri umani perché mantengono la citoarchitettura e molti importanti aspetti funzionali degli organi come sono in vivo, anche se per un periodo limitato di tempo1. Ad esempio, all'ex vivo sfida con antigeni di richiamo, come il tossoide difterico o tossoide tetanico, tessuto tonsillar risponde con una vigorosa produzione di anticorpi specifici per l'antigene2. Come qualsiasi altro ex vivo modello, histoculture ha le proprie limitazioni: variabilità inter-donatore, polarizzazione di tessuto, sopravvivenza limitata del tessuto e la difficoltà nel monitoraggio celle oltre la profondità di microscopia confocale1. Espianti di tessuto umano rimangono comunque, un modello di scelta per lo studio dei processi immunologici omeostatici e patogeni in esseri umani, tra cui interazioni ospite-patogeno e potenziali interventi terapeutici3.
Gli eventi critici della patogenesi di HIV-1 si svolgono nei tessuti. Infezione della mucosa genitale rappresenta la maggior parte di tutti gli eventi trasmissione HIV-1 in tutto il mondo4. Tessuto linfoide è il sito principale di replicazione del virus durante l'infezione acuta e porti un significativo pool di cellule latente infettate5, e la loro persistenza rappresenta il principale ostacolo per ottenere una cura6. La sfida di cultura ed ex vivo dei tessuti mucosi e linfoidi umani forniscono alcuni vantaggi rispetto ai sistemi convenzionali basati su cellule isolate per lo studio del virus HIV-1. Per esempio, le cellule tessuto-residente possono supportare l'infezione HIV-1 in assenza di attivazione esogena, al contrario di cellule mononucleari di anima periferica1. L'utilizzo di espianti di tessuto linfoide ha permesso una migliore comprensione di alcuni meccanismi chiave alla base CD4 T cell lo svuotamentocioè, l' effetto bystander7, che è il segno dell'infezione acuta. Il mantenimento delle strutture come follicoli di cellule B del tessuto linfoide8 e l'epitelio in espianti di mucosa genitale femminile9 offre l'opportunità unica di integrare funzionalità spaziale e funzionale dell'infezione da HIV-1 in questi siti. Infine, histocultures sono stati usati con successo per modello e studio co-infezione da HIV-1 e herpesvirus10,11, così come per i test preclinici di antiretrovirali e multitarget microbicidi12, 13 , 14 , 15.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la cultura degli espianti di tessuto umano ottenuto da tonsille e tessuto mucoso dal tratto genitale femminile più basso (cervice), che copre la dissezione del tessuto per explant sfida con HIV-1 in un modo non polarizzato. La cultura degli espianti di tessuto all'interfaccia liquido-aria, utilizzando spugne di gelatina come supporto, massimizza l'esposizione ad aria ossigeno garantendo accesso alle sostanze nutrienti del terreno di coltura attraverso la spugna capillari, ritardando così il loro decadimento naturale. Il modo più immediato di valutazione replica di HIV-1 nel nostro sistema è quello di misurare la quantità di virus rilasciati nel terreno di coltura explant nel tempo di dosaggio immunologico o qPCR. Infezione da HIV-1 e la patogenesi (ad es., deplezione delle cellule T CD4 +) possono anche essere valutati in espianti di tessuto dalla mole estrazione di RNA/DNA e qPCR, in situ macchiatura o singola cellula-analisi sulla digestione del tessuto tramite flusso cytometry.
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Protocol
Il protocollo per la raccolta di tessuti umani può richiedere approvazione etica dalle autorità locali competenti. In caso di interventi chirurgici indicati come la tonsillectomia e l'isterectomia, i campioni non sono raccolti specificamente per scopi di ricerca e lo studio non è ricerca di soggetti umani (National Institutes of Health. Ricerca su soggetti umani. https://humansubjects.nih.gov/Walkthrough-Investigator#tabpanel11). Tuttavia, ottenere dati personali e medici donatori di tessuti (ad es., sesso, età, attuale uso di droga, storia di infezioni, ecc.) che possono aiutare a interpretare i risultati sperimentali, pone preoccupazioni circa il consenso informato e privacy che devono essere affrontati nel protocollo per la raccolta del tessuto.
Attenzione: L'intera procedura deve essere effettuata in una cappa di sicurezza biologica. Tutti i campioni umani, compresi quelli da individui 'sani', possono harbor agenti infettivi. L'operatore deve ricevere formazione al lavoro con agenti patogeni anima-sopportati per gestire in sicurezza i campioni di tessuto, anche se gli esperimenti non implicano l'uso di HIV. Una valutazione dei rischi della procedura di dissezione del tessuto e dell'infezione da HIV deve avvenire da personale qualificato per garantire la sicurezza dell'operatore e colleghe. L'uso di infettive HIV richiede biosicurezza dedicato tra gli ambienti di livello 2 o 3 a seconda del paese e Istituto specifici regolamenti su biologicals pericolosi e patogeni presenti nel sangue.
1. preparazione di spugne di gelatina
Nota: Sebbene non sia strettamente necessario preparare le spugne di gelatina prima dissezione del tessuto, è più comodo seguire l'ordine indicato qui, soprattutto quando si gestisce una grande quantità di tessuto e/o da molti donatori.
- Preparare il terreno di coltura (CM) e integrarli con soluzione antibiotica (Tircacillin-clavulanate mix) prima dell'uso per rendere CMT (Tabella materiali). Eliminare la soluzione antibiotica avanzi.
Nota: Ticarcillin e clavulanate in CMT sono scarsamente stabili. Se necessario, ri-supplemento CMT con soluzione antibiotica dopo circa 24 ore dalla preparazione. Non è necessario aggiungere soluzione antibiotica per explant medio ogni 24 h durante la coltura. - Riempire un 100 x 20 mm di Petri con circa 20 – 30 mL di CMT.
Nota: Questa impostazione è ottima per preparare abbastanza spugne di gelatina per due piastre da 6 pozzetti o una piastra 12-pozzetti al momento. Se molti piatti sono necessari, è possibile utilizzare un più ampio di Petri e più CMT per velocizzare la preparazione. - Trasferire le spugne di gelatina in di Petri utilizzando pinze sterili. Bagnare le spugne su entrambi i lati e consentire le spugne assorbire medio per 1 minuto premere le spugne contro il fondo del piatto Petri per circa 2 minuti con una spatola sterile.
Nota: Questo passaggio è di fondamentale importanza perché la presenza di bolle d'aria nella spugna bloccherà i capillari attraverso cui le sostanze nutrienti del terreno di coltura raggiungono il tessuto. Spugne di gelatina sono estremamente fragili quando disidratato. Spingere delicatamente verso il basso la spugna con la spatola, soprattutto all'inizio, per evitare di rompere la spugna. - Uso sterile forbici per tagliare le spugne di gelatina reidratato in pezzi di uguali dimensioni di circa 1 cm2. Trasferire 1 pezzo di spugna usando il forcipe in ciascun pozzetto di una piastra di coltura. Aggiungere 3-4 mL di CMT in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti (tonsille) e 1 mL per pozzetto in una piastra 12-pozzetti (cervice). Posizionare le piastre nell'incubatore, fissato a 37 ° C, 5% CO2, ≥ 90% umidità, finché non gli espianti di tessuto pronti essere caricati sulle spugne.
Nota: Il volume di CMT per aggiungere nella piastra deve essere regolato per lo spessore della spugna per mantenere gli espianti all'interfaccia liquido-aria.
2. dissezione del tessuto Tonsillar umano
Nota: Le tonsille devono essere elaborate più presto dopo la chirurgia, idealmente il giorno stesso dell'intervento. In alternativa, i campioni possono essere lasciati CMT sommerso in una notte a 4 ° C.
- Consentire il CM abbastanza tempo per raggiungere la temperatura ambiente (RT) o metterlo in un bagno d'acqua pre-riscaldata a 37 ° C. Integrare i CM con soluzione antibiotica (CMT) prima dell'uso. Eliminare la soluzione antibiotica sinistra sopra. Versare la soluzione di etanolo 70% in un contenitore pulito in ammollo forcipe e bisturi quando necessario durante la procedura di dissezione. Pulire gli attrezzi e cambiare la lama del bisturi tra le dissezioni di esemplari provenienti da diversi donatori.
- Trasferire le tonsille dal contenitore del trasporto in un piatto di 100 mm-Petri contenente 10-20 mL di CMT utilizzando pinze sterili.
Nota: Gli esemplari con diffuse aree di cauterizzato, sanguinosa, o tessuto necrotico deve essere eliminata. - Utilizzare il coperchio del piatto Petri come una superficie di taglio per sezionare il tessuto. Tenendo delicatamente il tessuto con il forcipe, tagliare ogni tonsilla in diversi pezzi di grandi dimensioni utilizzando la lama e bisturi sterile.
Attenzione: Gestione strumenti taglienti per dissecare esemplari umani aumenta il rischio di lesioni e di contaminazione. L'operatore dovrebbe considerare indossando metallo, maglia, guanti resistenti al taglio come ulteriore protezione. - Remove cauterizzato, Cruento e tessuto del fibroid e tutte le parti contenenti tonsilloliths (materiale calcificato) e/o con colore verde-brunastro con pinze e bisturi.
Nota: Mentre si lavora su un pezzo di tessuto, è importante mantenere il resto del tessuto sommerso in mezzo per evitare l'essiccazione dei tessuti. - Tagliare ogni pezzo di tessuto in fette di circa 2 mm di spessore. Rimuovere le parti indesiderate come nel passaggio precedente. Tagliate le fette di tessuto a strisce di 2 mm di spessore. Tagliare le strisce di tessuto in blocchi di 2 mm di spessore. Ciò dovrebbe comportare espianti di tessuto di circa 8 mm3.
- Trasferire gli espianti in una capsula di Petri 100mm nuovo contenente 10 – 20 mL di CMT per evitare il disseccamento del tessuto mentre si sta procedendo con la dissezione. Alla fine della dissezione, roteare la piastra per la distribuzione di espianto casuale. Posto 9 tessuto espianti in cima a ogni spugna di gelatina in una piastra a 6 pozzetti usando il forcipe, permettendo lo spazio tra di loro. Riporre le piastre nell'incubatore.
Nota: In genere, espianti sono coltivate durante la notte e inoculazione di colture con HIV-1 viene eseguita il giorno successivo. Questo è per assicurarsi che nessuna contaminazione batterica o fungina si sviluppa nella cultura. Inoltre, le cellule tendono ad uscita espianti di tessuto tonsillar dopo la dissezione. Questo processo viene in gran parte entro le prime 24 ore di coltura1. - Smaltire tutti i rifiuti biologici in appositi contenitori secondo le normative dell'Istituto sulla gestione di biologicals pericolose e la valutazione del rischio specifico.
3. infezione del tessuto Tonsillar espianti con HIV-1
Nota: Per ridurre la variabilità di risultato tra esperimenti indipendenti, la stessa preparazione di virus dovrebbe essere usata per un intero studio. Virus può essere propagato in cellule mononucleari del sangue periferico esogenicamente attivato e quindi surnatante della cultura può essere aliquotati per conservazione a-80 ° C per evitare ripetuti di congelamento e scongelamento (Tabella materiali).
- Mettere i CM in un bagno di acqua pre-riscaldato a 37 ° C. Integrare i CM con soluzione antibiotica (CMT) prima dell'uso. Eliminare la soluzione antibiotica avanzi.
- Aspirare il mezzo alle piastre 6 pozzetti con una pipetta e gettarlo in un contenitore con soluzione disinfettante. Inclinare il piatto e spingere delicatamente le spugne di gelatina alla parte superiore del pozzo per consentire il mezzo raccogliere nella parte inferiore e aspirare e scartare. Aggiungere 3-4 mL di CMT in ciascun pozzetto.
- Scongelare la preparazione di virus HIV-1 nel bagno d'acqua a 37 ° C. Se necessario, diluire lo stock di virus con CM (tabella 1).
Nota: Lo stock di virus deve essere diluito in modo che l'inoculo selezionato è contenuto in un volume di 5 – 8 µ l (tabella 1). Per un'efficiente infezione, è fondamentale utilizzare il tempo minimo necessario tra la preparazione di HIV-1 di scioglimento e di infettare espianti di tessuto. - Pipettare l'inoculo di virus direttamente in cima a ciascuna dei 9 espianti su una spugna di gelatina. Riporre le piastre nell'incubatore, non appena l'infezione è stata completata. Scartare qualsiasi preparazione di virus residuo. Continuare a sezione 5.
Nota: Per erogazione accurata l'inoculo di virus l'operatore dovrebbe considerare utilizzando una tecnica di pipettaggio inversa e cambiando la punta per ogni pozzetto. Questo comporta che spinge il pistone della pipetta fino alla posizione di spurgo (seconda fermata) a redigere l'inoculo di virus, e spingendo fino alla fermata prima di consegnare l'inoculo, che aiuta a minimizzare la formazione di bolle e l'errore associato a ripetuti campionamenti di piccole volumi, cioè, 5 – 8 µ l.
4. dissezione e infezione della Mucosa cervicale uterina
Nota: Per risultati ottimali, espianti di mucosa cervicale dovrebbero essere elaborate e infettati appena possibile dopo la chirurgia, idealmente il giorno stesso dell'intervento. In alternativa, i campioni possono essere memorizzati sommerso in CMT a 4 ° C durante la notte e infetta immediatamente dopo la dissezione.
- Consentire il CM abbastanza tempo per raggiungere RT o metterlo in un bagno d'acqua pre-riscaldata a 37 ° C. Integrare i CM con soluzione antibiotica (CMT) prima dell'uso. Eliminare la soluzione antibiotica avanzi. Versare la soluzione di etanolo 70% in un contenitore pulito in ammollo il forcipe e bisturi quando necessario durante la procedura di dissezione. Pulire gli attrezzi e cambiare la lama del bisturi tra le dissezioni di campioni provenienti da donatori multipli.
- Utilizzando pinze sterili, trasferire il campione dal contenitore del trasporto in un 100mm di Petri contenente 10 – 20 mL di CMT.
- Utilizzare il coperchio del piatto Petri come una superficie di taglio per sezionare il tessuto. Tenendo delicatamente il tessuto con il forcipe, separare la mucosa dell'esocervice e/o endocervice dal sottostante stromal e tessuto muscolare (sottomucosa) con un bisturi e lama per ottenere strisce di mucosa.
Nota: Mentre si lavora su un pezzo di tessuto, è importante mantenere il resto del tessuto sommerso in mezzo per evitare l'essiccazione dei tessuti. - Tagliare la mucosa a 2 mm di larghezza strisce, rimuovere ed eliminare quanto più sottomucosa possibile, lasciando solo uno strato di spessore mm 2 di tessuto. Tagliare le strisce in blocchi di 2 mm di spessore. Ciò dovrebbe comportare espianti di tessuto di circa 8 mm3.
Attenzione: Gestione strumenti taglienti per dissecare esemplari umani aumenta il rischio di lesioni e di contaminazione. L'operatore dovrebbe considerare indossando metallo, maglia, guanti resistenti al taglio come ulteriore protezione. - Espianti di tessuto di trasferimento in una nuova piastra di Petri 100 mm contenente 10 – 20 mL di CMT per evitare il disseccamento del tessuto mentre si sta procedendo con la dissezione. Alla fine della dissezione, roteare la piastra per la distribuzione di espianto casuale.
- Con pinze sterili, trasferire gli espianti in sterile 1,5 mL provette coniche (massimi 16 espianti per provetta). Rimuovere qualsiasi supporto in tubo usando una pipetta.
- Scongelare la preparazione di HIV-1 in un bagno di acqua a 37 ° C. Se necessario, è possibile diluire lo stock di virus con CM. trasferimento del virus nelle provette contenenti gli espianti. Scartare qualsiasi preparazione di virus residuo.
Nota: Lo stock di virus deve essere diluito in modo che l'inoculo selezionato è contenuto in un volume di minimo 0,5 mL (tabella 1). Per ridurre la variabilità di risultato tra esperimenti indipendenti, la stessa preparazione di virus deve essere utilizzata per un intero studio (Tabella materiali). - Trasferire i tubi in thermo-shaker e incubare per 2 ore a 37 ° C a dondolo a 300 giri/min. Capovolgere delicatamente le provette un paio di volte ogni 30-60 min.
Nota: Per un'infezione efficiente, è fondamentale per utilizzare il tempo minimo necessario tra la preparazione di HIV-1 di scioglimento e trasferire le provette a 37 ° C. - Riempire una piastra a 6 pozzetti con 3 – 4 mL per pozzetto di soluzione fisiologica di tampone fosfato sterile (PBS). Presso dell'incubazione con HIV-1, scartare tutte le preparazione di virus nelle provette in un contenitore con soluzione disinfettante utilizzando una pipetta. Trasferire gli espianti nella piastra 6 pozzetti contenenti PBS usando il forcipe.
- Consentire gli espianti riposare in PBS per 1 min a RT e quindi lavarli pipettando delicatamente altalenante il PBS nel pozzo 2 - 3 volte. Scartare il PBS in un contenitore con soluzione disinfettante utilizzando una pipetta. Aggiungere 3-4 mL di PBS nuova ad ogni pozzetto. Ripetere altre due volte per un totale di tre lavaggi. Scartare il PBS appena prima di trasferire gli espianti le spugne per evitare l'essiccazione dei tessuti.
Nota: Espianti di mucosa cervicale e in particolare endocervice, rilasciano grandi quantità di muco durante l'infezione. È fondamentale lavare e rimuovere tanto muco come possibile perché aspecifici ritenzione su espianti e successiva liberazione del virus nel surnatante della cultura può mascherare la replicazione del virus. - Usando il forcipe, trasferire 5-8 espianti in cima a ogni spugna di gelatina in un piatto di 12-pozzetti. Riporre la piastra nell'incubatore.
- Smaltire tutti i rifiuti biologici in appositi contenitori secondo le normative dell'Istituto sulla gestione di biologicals pericolose e la valutazione del rischio specifico.
5. Histoculture
- Cambiare il CM ogni 3 giorni a partire dal momento dell'infezione fino al giorno 12 – 15 post-infezione. CM e/o espianti possono essere campionati ad intervalli regolari per tutto il tempo di coltura per valutare la replicazione di HIV-1, tra altri parametri.
- Mettere i CM in un bagno di acqua pre-riscaldato a 37 ° C.
Nota: Non è richiesto di completare il CM con soluzione antibiotica in questa fase. - Raccogliere un campione di CM con una pipetta e trasferirlo in provette sterili 1,5 o 2 mL tappo a vite per conservazione a-80 ° C.
Nota: Il CM da replicare pozzi sono riuniti alla collezione. - Raccogliere gli espianti di tessuto con pinze sterili, rimuovere il supporto in eccesso su espianti mettendoli su un pezzo di carta (opzionale) e trasferire espianti in provette a tappo a vite sterile 1,5 o 2 mL. Elaborare o conservare i campioni di tessuto come richiesto dall'esperimento.
Nota: Per citometria a flusso, espianti sono digeriti immediatamente con un cocktail enzimatico per ottenere una sospensione di singola cellula (per ulteriori dettagli vedi riferimenti 1, 9, 16 e 17). Per l'estrazione di RNA, espianti sono tenuti in una soluzione di stabilizzazione di RNA a 4 ° C durante la notte prima di riporli a-80 ° C. Per estrazione del DNA o in situ (cervice) la macchiatura, espianti possono essere snap-congelato nel liquame liquido azoto o ghiaccio secco/etanolo e conservati a-80 ° C. In alternativa, espianti tonsillar possono essere fissati da immersione in una soluzione di PBS e 4% paraformaldeide per in situ di colorazione. - Aspirare i residui CM nel pozzo con una pipetta e gettarlo in un contenitore con soluzione disinfettante. La piastra di inclinazione e spingere delicatamente le spugne di gelatina alla parte superiore del pozzo per consentire il mezzo raccogliere nella parte inferiore e quindi aspirare ed eliminare.
- Aggiungere mL 3 – 4 cm ad ogni pozzetto. Utilizzando pinze sterili, restituire che qualsiasi tessuto espianti che è sceso nel mezzo per la spugna di gelatina. Riporre la piastra nell'incubatore.
- Alla fine della cultura, smaltire tutti i rifiuti biologici in appositi contenitori secondo le normative dell'Istituto sulla gestione di biologicals pericolose e la valutazione del rischio specifico.
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Representative Results
Diverse tecniche possono essere utilizzati per valutare la replica di HIV-1 in espianti di tessuto. La nostra lettura standard è di misurare la quantità di HIV-1 p24gag rilasciati in CM nel tempo con un immunoassay18.
Espianti di tessuto da diversi donatori, infettati con l'inoculo stesso dello stesso stock, HIV-1, possono produrre diverse quantità di virus (tabella 1). Questo è dovuto a diversi fattori, quali il numero e lo stato delle cellule bersaglio dell'HIV-1 e la presenza di co-infettare agenti patogeni a tessuto16,19. In Figura 1, forniamo un esempio di infezione di HIV-1 abortita e produttivo degli espianti di mucosa cervicale come definito dalla quantità di p24gag rilasciato in CM rispetto al donatore-abbinato espianti trattati con lamivudina del farmaco antiretrovirale (3TC) che completamente sopprime la replicazione di HIV-1. Anche se questo controllo appare superfluo per l'infezione di espianti di tessuto del donatore nella A, aiuta nel discriminare abortivo (B) da infezione produttiva (C) in espianti che producono bassi livelli di replicazione di HIV-1.
L'uso di un farmaco antiretrovirale come una condizione di controllo può essere utile per lo studio di infezione da HIV-1 nei tessuti che porto basso numero di cellule bersaglio, come la mucosa cervicale e quando si utilizzano varianti di HIV-1 lento-replicante, come alcuni isolati primari. Inoltre, per i tessuti infettati con tale virus, è importante considerare l'utilizzo di metodi di rilevazione più sensibile, ad esempio qPCR.
Figura 1 : Replica di HIV-1 nel mucosa cervicale espianti da tre donatori di tessuti differenti. Tessuto cervicale espianti sono stati infettati con l'inoculo stesso di HIV-1BaL da immersione in magazzino di virus e coltivate per 15 giorni in presenza o assenza di lamivudina del farmaco antiretrovirale (3TC) alla concentrazione di 10 µM. terreno di coltura è stata campionata ogni 3 giorni e campioni da replicare pozzi sono stati riuniti a raccolta per l'analisi della replica di HIV-1 da HIV-1 p24gag immunoassay. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tipo del tessuto | Virus | Inoculo per espianto (pg di HIV-1 p24gag) | Lol di espianti | Terreno di coltura volume (mL) | Lol pozzi (tecnico replica) | Produzione di HIV-1 p24gag (ng/mL) |
| Tonsillar | HIV-1BaL | 350-500 | 9 | 3-4 | 2 – 3 | 1 – 10 |
| HIV-1LAI.04 | 9 | 3-4 | 2 – 3 | 1 – 100 | ||
| Cervicale | HIV-1BaL | 1.500 – 2.000 | 8 | 1 | 2 | 1 – 5 |
| HIV-1LAI.04 | 8 | 1 | 2 | non rilevabile |
Tabella 1: valori di inoculo di HIV-1 per l'infezione del tessuto espianti e produzione del virus di riferimento. Il valore di inoculo di HIV-1 per espianto tessuto individuale si riferisce agli stock di virus alla concentrazione di 50 – 70 ng/mL: un volume di 7 µ l di brodo di virus non diluito è usato per infettare ogni espianto tonsillar in cima una spugna di gelatina; un volume di 500 µ l di brodo di virus non diluito viene utilizzato per infettare 16 espianti cervicale da immersione in una provetta da 1,5 mL. Espianti cervicale sono ampiamente lavate in PBS prima di trasferirli su spugne di gelatina. Il valore della produzione di HIV-1 da espianti di tessuto si riferisce alla quantità cumulativa di p24gag rilasciato da 8 espianti in 1 mL (cervice) o 9 espianti in 3-4 mL (tonsille) di terreno di coltura (CM) campionamento ogni 3 giorni oltre 12-15 giorni di cultura. CM da replicare pozzi viene raccolto alla collezione per ogni punto di tempo prima di sostituirla con fresco CM. Il valore di p24gag concentrazione misurata al giorno 3 è stato escluso dall'analisi perché parzialmente rappresenta per l'assorbimento del virus su espianti e successiva liberazione in CM, vale a dire, riporto di inoculo. In genere, l'infezione del tessuto cervicale con HIV-1LAI.04 non comporta la replica di HIV-1 rilevabile nel nostro sistema sperimentale16.
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Discussion
L'uso di tessuti umani espianti per lo studio dell'infezione da HIV-1 fornisce vantaggi rispetto ai tradizionali sistemi sperimentali bi-dimensionale e l'unica specie, quali cellule primarie o linee cellulari, grazie alla loro capacità superiore di riprodurre interazioni intercellulari e cellulare (per esempio, la produzione di citochine) funzioni così come sono nel vivo. Tuttavia, tessuto tonsillar e cervicale differiscono per molti aspetti, tra cui il numero e le caratteristiche fenotipiche e funzionali di HIV bersaglio cellule1,16. Per lo stesso motivo, varianti di HIV-1 con tropismo di diversi co-recettore (ad es., di HIV-1 CCR5-tropicoBaL vs CXCR4-tropico HIV-1LAI.04) eseguono in modo diverso sia nelle tonsille e cervice (tabella 1). La distribuzione di corecettori HIV sulle cellule bersaglio al sistema immunitario induttivo ed effettrici siti solo parzialmente conti per locali suscettibilità all'infezione: le cellule T CD4 CXCR4 sono più abbondanti che CCR5-esprimendo le cellule nel tessuto tonsillar, così spiegando i livelli più alti a replica di HIV-1LAI.04 che HIV-1BaL, ma i recettori sono ugualmente rappresentati nella mucosa cervicale16. Tuttavia, abbiamo rilevato raramente replica produttiva del virus nel tessuto cervicale sfidato con HIV-1LAI.04, che è in linea con la trasmissione preferenziale delle singole varianti di HIV-1 CCR5-tropico osservate in vivo20 . Ciò suggerisce che lo stato di attivazione e differenziazione delle cellule bersaglio dell'HIV-1 in ultima analisi può determinare la loro capacità di supportare la replica di HIV-116.
Spugne di gelatina sono dispositivi emostatici ottenute da pelle porcina purificata (collagene), che sono progettati per essere completamente assorbita dal corpo umano dopo un paio di settimane. Si consiglia di utilizzare prodotti che mostrano il tasso di degradazione lenta nella cultura come essi soddisfare meglio lo scopo di mantenere espianti di tessuto all'interfaccia liquido-aria per 2-3 settimane. Si consiglia inoltre di test diversi lotti dello stesso prodotto per valutare le prestazioni coerenti nella cultura explant.
Allo stesso modo, il tipo e il sacco di siero bovino fetale (FBS) possono influenzare i livelli di replica di HIV-1. Consigliamo di testare diversi terreni di FBS per ottimizzazione CM e utilizzare uno stesso lotto di FBS per un intero studio. Abbiamo regolarmente test FBS su espianti di tessuto da 10 donatori e selezionare il lotto che dà la replicazione di HIV-1 più alta.
Per la maggior parte degli esperimenti, mettiamo in comune espianti di endocervice ed ectocervix per massimizzare il numero di condizioni sperimentali. Si può considerare tenendoli separati a causa delle loro diverse caratteristiche strutturali ed immunologiche21. Inoltre, endocervicali espianti rilascio e continuare a produrre una grande quantità di muco nella cultura che potrebbe interferire con l'analisi a valle. Visto che l'area coperta da endocervice è molto più piccola di Portio, è difficile per condurre esperimenti di infezione HIV esclusivamente sulla mucosa endocervicale utilizzando un adeguato numero di espianti e tecnico replica.
Esecuzione di infezione da HIV-1 da immersione degli espianti cervicale massimizza le possibilità di ottenere un'infezione produttiva a causa del minor numero di cellule T CD4 presenti nella mucosa rispetto al tessuto linfoide. Per lo stesso motivo, il tessuto cervicale è più sensibile al deposito notturno e rendimenti più alta replica di HIV-1 quando infettati poco tempo dopo chirurgia e immediatamente dopo la dissezione. Sebbene l'infezione da immersione in magazzino di virus possa essere eseguito anche per tessuto tonsillar garantire un'esposizione uniforme degli espianti al virus, questo approccio comporta maggiore perdita di manipolazione e delle cellule del tessuto di infezione degli espianti di spugne di gelatina, come descritto nel protocollo.
Sistemi polarizzati di sfida di HIV-1 e la cultura dei tessuti mucosi esistono e sono attualmente utilizzati in altri laboratori3,22,23,24,25. Anche se questi sistemi sono un prezioso modello di HIV-1 ingresso e penetrazione nella mucosa, loro set up è generalmente più che richiede tempo e può richiedere manipolazione del tessuto del vasto. Modelli non-polarizzato della mucosa trasmissione/patogenesi ancora offrono una piattaforma valida per studiare la regolazione della replicazione di HIV-1 e la piscina locale delle cellule HIV-infettate da fattori endogeni ed esogeni9,17 , 26, tra cui farmaci12,13,14,15.
Variabilità inter-donatore può rappresentare un grosso problema per la riproducibilità dei risultati tra esperimenti indipendenti condotti utilizzando campioni provenienti da donatori multipli. Variabilità nella composizione cellulare possono anche interessare aree all'interno del campione stesso, vale a dire, variabilità intra-donatore. Per ridurre la variabilità e interpretare correttamente i risultati, è fondamentale per impostare tutte le condizioni all'interno di un esperimento utilizzando un adeguato numero di espianti ottenuti dallo stesso donatore (donatore pari condizioni). Risultati possono essere normalizzati in un controllo interno durante la compilazione di dati provenienti da esperimenti multipli per l'analisi statistica. Per ridurre la variabilità intra-donatore, si consiglia tra cui tecnici almeno 2 repliche per ogni condizione sperimentale, per un totale di 18 espianti di tessuto tonsillar (9/pozzetto) e 10-16 espianti di mucosa cervicale (5-8/pozzetto) (tabella 1). La disponibilità della documentazione medica e l'inclusione di ulteriore analisi di materiale paziente e/o condizioni sperimentali, ad esempio all'indirizzo lo stato infiammatorio di un esemplare, può migliorare significativamente la interpretazione dei risultati (Vedi riferimento 9 per un esempio).
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni da parte della Fondazione Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), i medici svedesi di Fondazione contro l'AIDS (http://www.aidsfond.se/, Rif. FOa2014-0006) e Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) a Andrea Introini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
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