Summary
Infectie van menselijke weefsels met humaan immunodeficiëntie virus (HIV) ex vivo biedt een waardevolle 3D-model van virus pathogenese. Hier beschrijven we een protocol voor het verwerken en infecteren van weefsel monsters van menselijke amandelen en vrouwelijke genitale mucosae met HIV-1 en onderhouden ze in cultuur in de vloeistof-lucht-interface.
Abstract
Histocultures laten studeren intercellulaire interacties binnen de menselijke weefsels, en ze kunnen worden ingezet om model gastheer-pathogeen interacties onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden. Ex vivo infectie van menselijke weefsels met humaan immunodeficiëntie virus (HIV), onder andere virussen, is met succes gebruikt om het onderzoeken van de vroege pathogenese van de ziekte, alsook een platform voor het testen van de werkzaamheid en de toxiciteit van antivirale middelen. In het huidige protocol, wij leggen uit hoe te verwerken en te infecteren met HIV-1 weefsel explantaten van menselijke amandelen en cervicale mucosae, hen cultuur op de top van gelatine sponzen op de vloeibare-lucht-interface voor gedurende ongeveer twee weken. Deze instelling niet-gepolariseerd cultuur maximaliseert toegang tot voedingsstoffen in cultuurmedium en zuurstof, hoewel progressief verlies van weefsel integriteit en functionele platforms haar belangrijkste beperking blijft. Deze methode zorgt voor de opvolging van HIV-1 replicatie en pathogenese met behulp van diverse technieken, waaronder immunoassay, qPCR en stroom cytometry. Van belang is, kan de fysiologische variabiliteit tussen weefsel donoren, alsmede tussen explantaten uit verschillende gebieden van het hetzelfde model, grote invloed op experimentele resultaten. Om ervoor te zorgen de reproduceerbaarheid van het resultaat, is het van cruciaal belang met een voldoende aantal explantaten, technische wordt gerepliceerd en donor-matched controlevoorwaarden te normaliseren van de resultaten van de experimentele behandelingen bij het opstellen van de gegevens uit meerdere experimenten (dwz ., uitgevoerd met behulp van weefsels van verschillende donoren) voor statistische analyse.
Introduction
Monotypisch bi-dimensionale celculturen, aangeduid als conventionele, geen rekening met de ruimtelijke en functionele communicatie tussen de grote verscheidenheid aan celtypes waaruit weefsels en organen. Dit aspect is van het allergrootste belang voor experimentele modellen van ziekte, zoals interferentie met homeostatische intercellulaire interacties de drijvende factor van alle pathologieën is. Weefsel explantaten bieden grote voordelen voor de modellering van gezondheid en ziekte bij de mens, omdat zij behouden de cytoarchitecture en veel belangrijke functionele aspecten van organen zoals ze zijn in vivo, hoewel het voor een beperkte hoeveelheid tijd1. Bijvoorbeeld bij ex vivo challenge met terugroepen antigenen, zoals difterie tetanustoxoïd of tetanus tetanustoxoïd, reageert tonsillar weefsel met een krachtige productie van antigeen-specifieke antilichamen2. Net als ieder ander ex vivo model, histoculture heeft zijn eigen beperkingen: Inter donor variabiliteit, weefsel polarisatie, beperkte weefsel overleven en moeilijkheden bij de controle op cellen buiten de diepte van de confocal microscopie1. Niettemin blijven de menselijk weefsel explantaten een model van keuze om homeostatische en pathogene immunologische processen bij de mens, met inbegrip van gastheer-pathogeen interacties en potentiële therapeutische interventies3te bestuderen.
De kritieke gebeurtenissen van de pathogenese van HIV-1 plaatsvinden in weefsels. Infecties van de genitale mucosa rekeningen voor de meerderheid van alle HIV-1 transmissie evenementen wereldwijd4. Lymfoïde weefsel is de belangrijkste site voor replicatie van het virus tijdens de acute infectie en herbergt een grote pool van latent geïnfecteerde cellen5, en hun persistentie vertegenwoordigt de voornaamste hinderpaal voor het bereiken van een genezing6. De cultuur en ex vivo uitdaging van menselijke lymfe en mucosal weefsels bieden een aantal voordelen ten opzichte van conventionele systemen op basis van geïsoleerde cellen voor de studie van HIV-1. Weefsel-ingezeten cellen kunnen bijvoorbeeld, HIV-1 infectie ondersteunen bij gebrek aan exogene activering, in tegenstelling tot perifere bloed mononucleaire cellen1. Het gebruik van lymfoïde weefsel explantaten heeft toegestaan een beter begrip van sommige belangrijke mechanismen die ten grondslag liggen aan CD4 T-cel uitputtingdat wil zeggen, de omstander effect7, dat is het kenmerk van een acute infectie. Het behoud van structuren zoals B cel follikels in de lymfoïde weefsel8 en het epithelium in vrouwelijke genitale mucosa explantaten9 biedt de unieke mogelijkheid om ruimtelijke en functionele eigenschappen van HIV-1 infectie op deze sites te integreren. Tot slot werden histocultures met succes gebruikt voor model en studie van HIV-1 en herpesvirus co-infectie10,11, alsmede voor preklinische testen van antiretrovirale en multitarget microbiciden12, 13 , 14 , 15.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de cultuur van menselijk weefsel explantaten verkregen van amandelen en mucosale weefsel van de lagere vrouwelijke genitale landstreek (baarmoederhals), die betrekking hebben op weefsel dissectie om explant challenge met HIV-1 in een niet-gepolariseerde manier. De cultuur van weefsel explantaten op de vloeibare-lucht-interface, met behulp van gelatine sponzen als ondersteuning, maximaliseert blootstelling aan zuurstof lucht terwijl het verstrekken van toegang tot kweekmedium voedingsstoffen via de spons haarvaten, dus vertragen hun natuurlijke verval. De meest directe manier van het evalueren van HIV-1 replicatie in ons systeem is voor het meten van de hoeveelheid virus in het kweekmedium explant vrijgegeven na verloop van tijd door immunoassay of qPCR. HIV-1 infectie en pathogenese (bv., CD4 T-cel depletie) kan ook worden geëvalueerd in weefsel explantaten door bulk RNA/DNA-extractie en qPCR, in situ kleuring, of één cel-analyse op weefsel vertering door stroom cytometry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol voor collectie van menselijke weefsels kan ethische goedkeuring vereist door de plaatselijke bevoegde autoriteiten. In het geval van aangegeven operaties zoals tonsillectomie en hysterectomie, de specimens zijn niet verzameld speciaal voor doel van het onderzoek en de studie wordt niet beschouwd als proefpersonen onderzoek (National Institutes of Health. Onderzoek op menselijke proefpersonen. https://humansubjects.NIH.gov/walkthrough-Investigator#tabpanel11). Echter, het verkrijgen van weefsel donoren persoonlijke en medische gegevens (bv., geslacht, leeftijd, huidige drugsgebruik, geschiedenis van infecties, enz) dat kan helpen met het interpreteren van de experimentele resultaten, poses bezorgdheid over de geïnformeerde toestemming en privacy die moet worden aan de orde in het protocol voor weefsel-collectie.
Let op: De hele procedure moet worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast. Alle menselijke specimens, met inbegrip van die van de 'gezonde' individuen, kunnen haven infectieuze agentia. De exploitant moet krijgen een opleiding om te werken met bloed overgedragen ziekteverwekkers veilig om weefsel monsters, zelfs als experimenten hebben geen betrekking op het gebruik van HIV. Een risico-evaluatie van de procedure van weefsel dissectie en infectie met HIV moet worden uitgevoerd door daartoe opgeleide personeelsleden om de veiligheid van de operator en collega's. Het gebruik van besmettelijke HIV vereist speciale bioveiligheid niveau 2 of 3 omgevingen afhankelijk van het land en het Instituut-specifieke verordeningen betreffende gevaarlijke biologicals en door bloed overgedragen ziekteverwekkers.
1. bereiding van gelatine sponzen
Opmerking: Hoewel het niet strikt noodzakelijk is om het bereiden van gelatine sponzen voor weefsel dissectie, is het handiger in dezelfde volgorde als beschreven hier, vooral bij het verwerken van een groot bedrag van weefsel en/of uit vele donoren.
- Bereiden kweekmedium (CM) en vullen met antibiotische oplossing (Tircacillin-clavulanate mix) vóór gebruik te maken van CMT (Tabel van materialen). Gooi een restje antibiotische oplossing.
Opmerking: Ticarcillin en clavulanate in CMT zijn slecht stabiel. Indien nodig, opnieuw CMT te vullen met antibiotische oplossing na ongeveer 24 uur van bereiding. Het is niet verplicht om toe te voegen antibiotische oplossing explant medium elke 24 h tijdens cultuur. - Vul een 100 mm x 20 mm petrischaal met ongeveer 20 tot 30 mL van CMT.
Opmerking: Deze instelling is optimaal voor te bereiden op genoeg gelatine sponzen twee 6-Wells-platen of een 12-well plaat op het moment. Als veel platen nodig zijn, gebruiken een breder petrischaal en grotere CMT volume om de voorbereiding te versnellen. - Breng de sponge(s) van de gelatine in de petrischaal met steriel pincet. NAT de sponzen aan beide zijden en laat de sponzen te genieten van medium voor 1 min. dringen de sponzen tegen de onderkant van de petrischaal op ongeveer 2 minuten met behulp van een steriele spatel.
Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang omdat de aanwezigheid van luchtbellen in de spons blokkeert de haarvaten waardoor kweekmedium voedingsstoffen het weefsel bereiken. Gelatine sponzen zijn uiterst broos als uitgedroogd. Duw voorzichtig naar beneden op de spons met de spatel, met name aan het begin, om te voorkomen dat het breken van de spons. - Gebruik steriele schaar te knippen de sponzen gerehydrateerd gelatine in stukjes van gelijke grootte van ongeveer 1 cm2. Overdracht van 1 stuk van de spons met pincet in elk putje van de plaat van een cultuur. Voeg 3-4 mL CMT in elk putje van de plaat van een 6-well (tonsillen) en 1 mL per putje in een 12-well plaat (cervix). Plaats de platen in de incubator, vastgesteld op 37 ° C, 5% CO2, ≥ 90% vochtigheid, totdat het weefsel explantaten klaar om te worden geladen op de sponzen.
Opmerking: Het volume van de CMT toe te voegen in de plaat moet worden aangepast aan de dikte van de spons de explantaten om op te houden de vloeistof-lucht-interface.
2. dissectie van menselijke Tonsillar weefsel
Opmerking: Amandelen moeten worden verwerkt zo snel mogelijk na de operatie, idealiter dezelfde dag van de operatie. U kunt ook kunnen exemplaren worden overgelaten overnachting verzonken in CMT bij 4 ° C.
- Toestaan dat de CM genoeg tijd om te bereiken kamertemperatuur (RT) of zet het in een waterbad verwarmd vooraf bij 37 ° C. Aanvulling van de CM met antibiotische oplossing (CMT) vóór gebruik. Gooi een antibiotische oplossing overblijft. Giet 70% ethanol oplossing in een schone container te doorweken pincet en scalpel wanneer nodig tijdens de dissectie-procedure. Schoon de hulpmiddelen en het wijzigen van het scalpel blad tussen ontledingen van specimens van verschillende donoren.
- Breng de amandelen uit de container transport in een 100 mm-petrischaal met 10-20 mL CMT steriel pincet gebruiken.
Opmerking: Specimens met brede gebied van dichtgeschroeid, bloedige of necrotisch weefsel moet worden weggegooid. - Gebruik de deksel van de petrischaal als een snijvlak te ontleden van weefsel. Houd het weefsel voorzichtig met een tang en snijd elke tonsillen in verschillende grote stukken met behulp van steriel scalpel en blade.
Let op: Behandeling van scherpe instrumenten om te ontleden menselijke specimens verhoogt het risico van schade en verontreiniging. De exploitant moet overwegen het dragen van metaal, mesh, snijweerstand handschoenen als extra bescherming. - Verwijderen dichtgeschroeid, bloedend, en fibroid weefsel, en delen die tonsilloliths (kalkhoudend materiaal) en/of met groen-bruine kleur met behulp van Tang en scalpel.
Opmerking: Tijdens het werken aan een stukje weefsel, is het belangrijk om te houden van de rest van het weefsel ondergedompeld in middellange tot het vermijden van uitdroging van de weefsels. - Snijd elk stuk weefsel in plakjes van ongeveer 2 mm in dikte. Verwijder alle ongewenste deel zoals in de vorige stap. Snijd de plakjes weefsel in 2 mm dik reepjes. Snijd de weefsel strips in blokken van 2 mm dik. Dit moet resulteren in weefsel explantaten van ongeveer 8 mm3.
- Breng de explantaten in een nieuwe 100 mm petrischaal met 10-20 mL CMT te vermijden weefsel uitdroging terwijl u doorgaat met de dissectie. Aan het einde van de dissectie, swirl de plaat om randomize de explant verdeling. Plaats 9 weefsel explants op de top van elke gelatine spons in een 6-well plaat met pincet, waardoor ruimte tussen hen. De platen terugkomen in de incubator.
Opmerking: Doorgaans, explantaten worden gekweekt 's nachts en enten van culturen met HIV-1 wordt de volgende dag uitgevoerd. Dit is om ervoor te zorgen dat geen bacteriële of schimmel besmetting in de cultuur ontwikkelt. Daarnaast vaak cellen egress tonsillar weefsel explantaten na dissectie. Dit proces is grotendeels voltooid binnen de eerste 24 uur van cultuur1. - Beschikken over alle biologisch afval in passende recipiënten op de verwerking van gevaarlijke biologicals en het specifieke risico-evaluatie reglementeringen van het Instituut.
3. infectie van Tonsillar weefsel Explants met HIV-1
Opmerking: Verklein resultaat variabiliteit tussen onafhankelijke experimenten en het hetzelfde virus voorbereiding moet worden gebruikt voor een volledige studie. Virus kan worden gekweekt in exogenously geactiveerd perifere bloed mononucleaire cellen en vervolgens de cultuur supernatant kan aliquoted voor opslag bij-80 ° C herhaalde bevriezen en ontdooien (Tabel van materialen) te voorkomen.
- Zet de CM in een waterbad vooraf opgewarmd bij 37 ° C. Aanvulling van de CM met antibiotische oplossing (CMT) vóór gebruik. Gooi een restje antibiotische oplossing.
- Het medium in de 6-well-plate(s) met een pipet gecombineerd en gooi het in een container met desinfecterende oplossing. Kantelen van de plaat en duw voorzichtig het bovenste gedeelte van het goed dat het medium om te verzamelen aan de onderkant, en gecombineerd en gooi het sponzen van de gelatine. Voeg 3-4 mL CMT aan elk putje.
- Ontdooien van de HIV-1 virus voorbereiding in het waterbad bij 37 ° C. Eventueel verdunnen het virus materieel met CM (tabel 1).
Opmerking: De voorraad van het virus moet worden verdund zodat de geselecteerde entmateriaal is opgenomen in een volume van 5 – 8 µL (tabel 1). Voor een efficiënte infectie is het essentieel te gebruiken de minimale tijd die nodig is tussen de HIV-1 voorbereiding ontdooien en weefsel explantaten infecteren. - Pipetteer het entmateriaal virus direct op de top van elk van de 9 explantaten op een spons gelatine. Terug de plate(s) naar de incubator zodra de infectie is voltooid. Gooi een residuele virus-preparaat. Sectie 5 blijven.
Opmerking: Om nauwkeurig het entmateriaal virus de exploitant moet overwegen een omgekeerde pipetting techniek gebruiken en de tip voor elke goed te wijzigen. Dit houdt de pipet zuiger te duwen tot de purge-positie (de tweede halte) op te stellen van het entmateriaal virus, en herhaalde monstertrekking voor small duwen tot de eerste halte te leveren van het entmateriaal, die minimaliseren luchtbel vorming en de fout helpt is gekoppeld volumes, dat wil zeggen, 5 – 8 µL.
4. dissectie en infectie van de baarmoeder cervicale Mucosa
Opmerking: Voor een optimaal resultaat explantaten van cervicale mucosae moeten worden verwerkt en besmette zo spoedig mogelijk na de operatie, idealiter dezelfde dag van de operatie. Anderzijds kunnen exemplaren worden opgeslagen verzonken in CMT bij 4 ° C's nachts, en besmette onmiddellijk na dissectie.
- Toestaan dat de CM genoeg tijd om te bereiken RT of zet het in een waterbad verwarmd vooraf bij 37 ° C. Aanvulling van de CM met antibiotische oplossing (CMT) vóór gebruik. Gooi een restje antibiotische oplossing. Giet 70% ethanol oplossing in een schone container om te genieten van de verlostang en de scalpel wanneer nodig tijdens de dissectie-procedure. Schoon de hulpmiddelen en het wijzigen van het scalpel blad tussen ontledingen van specimens van meerdere donoren.
- Met behulp van steriele pincet, breng het monster uit de container transport in een 100 mm petrischaal met 10-20 mL CMT.
- Gebruik de deksel van de petrischaal als een snijvlak te ontleden van het weefsel. De mucosa van de ectocervix en/of endocervix zachtjes houden van het weefsel met een tang, scheiden van de onderzijde stromale en gespierde weefsel (submucosa) met een scalpel en blade te verkrijgen reepjes mucosa.
Opmerking: Tijdens het werken aan een stukje weefsel, is het belangrijk om te houden van de rest van het weefsel ondergedompeld in middellange tot het vermijden van uitdroging van de weefsels. - Mucosa in 2 mm brede repen gesneden, verwijderen en weggooien zoveel submucosa mogelijk, waardoor alleen een 2 mm dikke laag van weefsel. Snijd de strips in blokken van 2 mm dik. Dit moet resulteren in weefsel explantaten van ongeveer 8 mm3.
Let op: Behandeling van scherpe instrumenten om te ontleden menselijke specimens verhoogt het risico van schade en verontreiniging. De exploitant moet overwegen het dragen van metaal, mesh, snijweerstand handschoenen als extra bescherming. - Overdracht weefsel explantaten in een nieuwe 100 mm petrischaal met 10-20 mL CMT te vermijden weefsel uitdroging terwijl u doorgaat met de dissectie. Aan het einde van de dissectie, swirl de plaat om randomize de explant verdeling.
- Met een steriele Tang, breng u de explantaten in steriele 1.5-mL conische sproeibuis(-buizen) (maximaal 16 explantaten per buis). Verwijder elk medium in de buis met behulp van een precisiepipet.
- Ontdooien van de voorbereiding van de HIV-1 in een waterbad bij 37 ° C. Eventueel verdunnen het virus voorraad met de CM. overdracht van het virus in de sproeibuis(-buizen) met de explantaten. Gooi een residuele virus-preparaat.
Opmerking: De voorraad van het virus moet worden verdund zodat de geselecteerde entmateriaal is opgenomen in een volume van minimaal 0,5 mL (tabel 1). Verklein resultaat variabiliteit tussen onafhankelijke experimenten en het hetzelfde virus voorbereiding dient voor een volledige studie (Tabel van materialen). - Breng de buizen in een thermo-shaker en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C schommelen bij 300 omwentelingen per minuut. Voorzichtig omkeren de buizen een paar keer elke 30-60 min.
Opmerking: Voor een efficiënte infectie is het essentieel te gebruiken de minimale tijd die nodig is tussen het ontdooien van de voorbereiding van de HIV-1 en de overdracht van de buizen tot 37 ° C. - Vul een 6-well plaat met 3-4 mL per putje steriele fosfaat buffer zoutoplossing (PBS). Bij het verwijderen van de incubatie met HIV-1, alle virus voorbereiding in de sproeibuis(-buizen) in een container met desinfecterende oplossing met behulp van een precisiepipet. Breng de explantaten in de 6-well plaat met PBS met pincet.
- De explantaten rusten in PBS 1 min op RT toestaan, en daarna wassen hen door zachtjes pipetteren en neergaande de PBS in de put 2 - 3 keer. Gooi de PBS in een container met desinfecterende oplossing met behulp van een precisiepipet. Voeg 3-4 mL nieuwe PBS aan elk putje. Herhaal nog tweemaal voor een totaal van drie wast. Gooi de PBS net vóór de overbrenging van de explantaten tot de sponzen te voorkomen uitdroging van het weefsel.
Opmerking: Explantaten van cervicale mucosa, en met name endocervix, vrij grote hoeveelheden slijm tijdens infectie. Het is essentieel om te wassen en verwijder zoveel slijm mogelijk omdat aspecifieke inhoudingen op explantaten en latere introductie van virus in cultuur supernatant virus replicatie kan maskeren. - Met behulp van Tang, overdracht van 5-8 explantaten bovenop elke gelatine spons in een 12-well-plate. De plaat terugkomen in de incubator.
- Beschikken over alle biologisch afval in passende recipiënten op de verwerking van gevaarlijke biologicals en het specifieke risico-evaluatie reglementeringen van het Instituut.
5. Histoculture
- Wijzig de CM om de 3 dagen vanaf het moment van infectie tot dag 12-15 na infectie. De CM en/of explantaten kunnen bemonsteren met regelmatige tussenpozen gedurende de tijd van de cultuur te beoordelen van HIV-1 replicatie, onder andere parameters.
- Zet de CM in een waterbad vooraf opgewarmd bij 37 ° C.
Opmerking: Het is niet vereist ter aanvulling van de CM met antibiotische oplossing in dit stadium. - Een monster van CM met een pipet verzameld en breng dit in steriele 1.5 of 2 mL schroefdop sproeibuis(-buizen) voor opslag bij-80 ° C.
Opmerking: De CM repliceren putjes zijn gebundeld in de collectie. - Oogst de weefsel explantaten met steriel pincet, het overtollige medium op explantaten verwijderen door ze te plaatsen op een stuk papier (optioneel) en Pipetteer explantaten in steriele 1.5 of 2 mL schroefdop sproeibuis(-buizen). Verwerken of opslaan van de weefselmonsters zoals vereist door het experiment.
Opmerking: Voor stroom cytometry, explantaten zijn onmiddellijk verteerd met een enzymatische cocktail te verkrijgen van een eencellige schorsing (voor meer details zie referenties 1, 9, 16 en 17). Voor RNA extractie, worden explantaten bewaard in een RNA stabilisatie oplossing bij 4 ° C's nachts voordat ze op te slaan bij-80 ° C. Voor DNA-extractie of in situ kleuring (baarmoederhals), kunnen explantaten worden module-ingevroren in vloeibare stikstof of droog ijs/ethanol drijfmest en opgeslagen bij-80 ° C. Anderzijds kunnen tonsillar explantaten gecorrigeerd worden door onderdompeling in een oplossing van PBS en 4% paraformaldehyde voor in situ kleuring. - De residuele CM in de put met een pipet gecombineerd en gooi het in een container met desinfecterende oplossing. Kantelen van de plaat en duw voorzichtig het bovenste gedeelte van het goed dat het medium om te verzamelen aan de onderkant, de gelatine sponzen en vervolgens gecombineerd en verwerpen.
- 3-4 CM milliliters toevoegen aan elk putje. Met behulp van steriele pincet, retourneren dat weefsel explants die verloren zijn gegaan in het medium om de gelatine spons De plaat terugkomen in de incubator.
- Aan het einde van de cultuur, de verwijdering van alle biologische afval in passende recipiënten op de verwerking van gevaarlijke biologicals en het specifieke risico-evaluatie reglementeringen van het Instituut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verschillende technieken kunnen worden gebruikt om te beoordelen van HIV-1 replicatie in weefsel explantaten. Onze standaard uitlezing is voor het meten van de hoeveelheid HIV-1 p24gag uitgebracht in CM na verloop van tijd met een immunoassay18.
Weefsel explantaten van verschillende donoren, besmet met de dezelfde entmateriaal van hetzelfde HIV-1 bestand, kunnen het opleveren van verschillende hoeveelheden virus (tabel 1). Dit is te wijten aan verschillende factoren, zoals het nummer en de status van doelcellen van HIV-1 en de aanwezigheid van co infecteren ziekteverwekkers in het weefsel16,19. In Figuur 1bieden wij een voorbeeld van productieve en vruchteloos HIV-1 infectie van cervicale mucosa explantaten zoals gedefinieerd door de hoeveelheid p24gag uitgebracht in CM t.o.v. donor-matched explantaten behandeld met de antiretrovirale drug lamivudine (3TC) die onderdrukt volledig met HIV-1 replicatie. Hoewel deze optie overbodig voor infectie van weefsel explantaten van de donor a verschijnt, helpt het bij het discrimineren mislukte (B) van productieve infectie (C) in explantaten dat de opbrengst van de lage niveaus van HIV-1 replicatie.
Het gebruik van een drug antiretrovirale als voorwaarde controle kunnen nuttig zijn te onderzoeken van HIV-1 infectie in weefsels die haven van lage aantallen van doelcellen, zoals de cervicale mucosa, en bij het gebruik van slow-repliceren van HIV-1 varianten, zoals sommige primaire isolaten. Daarnaast voor weefsels besmet met dergelijke virussen, is het belangrijk te overwegen met behulp van de meer gevoelige detectiemethoden, bijvoorbeeld qPCR.
Figuur 1 : HIV-1 replicatie in cervicale mucosa explants uit drie verschillende weefsel donoren. Cervicale weefsel explantaten waren besmet met de dezelfde entmateriaal van HIV-1BaL door onderdompeling in virus voorraad en gekweekte gedurende 15 dagen in de aanwezigheid of afwezigheid van de antiretrovirale drug lamivudine (3TC) bij de concentratie van 10 µM. kweekmedium werd bemonsterd elke 3 dagen en monsters uit repliceren putten werden gebundeld op collectie voor analyse van HIV-1 replicatie door HIV-1 p24gag immunoassay. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Weefseltype | Virus | Entmateriaal per explant (pg van HIV-1 p24gag) | Nr. van explantaten | Kweekmedium volume (mL) | Nr. van putten (technische wordt gerepliceerd) | HIV-1 p24gag productie (ng/mL) |
| Tonsillar | HIV-1BaL | 350-500 | 9 | 3-4 | 2-3 | 1 – 10 |
| HIV-1LAI.04 | 9 | 3-4 | 2-3 | 1-100 | ||
| Cervicale | HIV-1BaL | 1500-2000 | 8 | 1 | 2 | 1 – 5 |
| HIV-1LAI.04 | 8 | 1 | 2 | niet aantoonbaar |
Tabel 1: verwijzen naar waarden van HIV-1 entmateriaal voor besmetting van het weefsel explantaten en virus productie. De waarde van HIV-1 entmateriaal per individuele weefsel explant verwijst naar virusvoorraden op de concentratie van 50 – 70 ng/mL: een volume van 7 µL van onverdunde virus materieel wordt gebruikt voor het infecteren van elke tonsillar explant op de top van een spons van gelatine; een volume van 500 µL van onverdunde virus materieel wordt gebruikt te infecteren 16 cervicale explantaten door onderdompeling in een 1,5 mL-buis. Cervicale explantaten zijn uitgebreid in PBS gewassen voordat u ze overbrengt naar gelatine sponzen. De waarde van HIV-1 productie door weefsel explantaten verwijst naar de cumulatieve hoeveelheid p24gag uitgebracht door 8 explantaten in 1 mL (baarmoederhals) of 9 explantaten in 3-4 mL gestolde voedingsbodem (CM) om de 3 dagen meer dan 12-15 dagen cultuur bemonsterd (tonsillen). CM uit repliceren putten is gebundeld op collectie voor elk punt van de tijd vóór vervangen door verse CM. De waarde van p24gag -concentratie gemeten op dag 3 was uitgesloten van analyse, omdat het gedeeltelijk verantwoordelijk voor virus absorptie op explantaten en latere introductie in CM, dat wil zeggen, entmateriaal "Carry-over". De besmetting van cervicale weefsel met HIV-1LAI.04 leidt doorgaans niet tot aantoonbaar HIV-1 replicatie in onze experimenteel systeem16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van menselijk weefsel explants voor de studie van HIV-1 infectie voordelen ten opzichte van de traditionele bi-dimensionale en monotypisch experimentele systemen, zoals primaire cellen of cellijnen, vanwege hun superieure vermogen biedt te reproduceren intercellulaire interacties en cellulaire functies (b.v.cytokine productie) zoals ze in vivo zijn. Niettemin, tonsillar en cervicale weefsel verschillen in vele aspecten, met inbegrip van het aantal, en de fenotypische en functionele kenmerken van HIV target cellen1,16. Om dezelfde reden, is het uitvoeren van HIV-1 varianten met verschillende co receptor tropisme (bijvoorbeeldCCR5-tropic HIV-1BaL vs. CXCR4-tropic HIV-1LAI.04) anders zowel in amandelen en baarmoederhals (tabel 1). De verdeling van HIV coreceptors op doelcellen immuun inductieve en effector sites slechts gedeeltelijk rekeningen voor lokale gevoeligheid voor infectie: CD4 T-cellen uitvoering CXCR4 zijn meer overvloedig dan CCR5-uiten cellen in tonsillar weefsel, dus hogere replicatie niveaus van HIV-1LAI.04 dan HIV-1BaL, maar de receptoren zijn evenredig vertegenwoordigd in de cervicale mucosa16uit te leggen. Niettemin, we zelden productief virus replicatie gedetecteerd in cervicale weefsel uitgedaagd met HIV-1LAI.04, dat strookt met de preferentiële overdracht van individuele CCR5-tropic HIV-1 varianten waargenomen in vivo20 . Dit wijst erop dat de differentiatie en activering status van HIV-1 doelcellen uiteindelijk hun vermogen ter ondersteuning van HIV-1 replicatie16kan bepalen.
Gelatine sponzen zijn hemostatische apparaten verkregen uit gezuiverde varkens huid (collageen), die zijn ontworpen om te worden na een paar weken volledig geabsorbeerd door het menselijk lichaam. Het is raadzaam om met behulp van producten die langzame afbraak tarief in cultuur weergeven zoals ze beter past bij het doel van het behoud van weefsel explantaten op de vloeibare-lucht-interface voor 2-3 weken. We raden ook aan het testen van verschillende partijen van hetzelfde product te beoordelen van consistente prestaties in explant cultuur.
Ook het type en de heleboel foetale runderserum (FBS) kunnen invloed hebben op HIV-1 replicatie niveaus. Wij adviseren verschillende percelen van FBS voor CM optimalisatie testen en gebruik van de dezelfde heleboel FBS voor een volledige studie. We routinematig FBS testen op weefsel explantaten van 10 donoren en selecteer het lot dat de hoogste HIV-1-replicatie geeft.
Voor de meeste van de experimenten bundelen we explantaten uit endocervix en ectocervix te maximaliseren van het aantal experimentele omstandigheden. Men kan overwegen houden van hen gescheiden vanwege hun verschillende structurele en immunologische functies21. Ook endocervical explants release en blijven produceren een grote hoeveelheid slijm in cultuur die met de downstream-analyse interfereren kan. Aangezien het endocervix vallende gebied veel kleiner dan de ectocervix, het is uitdagend is om te voeren HIV infectie experimenten uitsluitend op de mucosa van de endocervical repliceert met behulp van een voldoende aantal explantaten en technische.
Uitvoeren van HIV-1 infectie door onderdompeling van cervicale explantaten maximaliseert de kans op het verkrijgen van een productieve infectie als gevolg van het lagere aantal CD4 T-cellen aanwezig in de mucosa vergeleken met lymfoïde weefsel. Om dezelfde reden, de cervicale weefsel is gevoeliger voor overnachting opslag en levert hogere HIV-1 replicatie wanneer kort na de operatie en direct na de dissectie besmet. Hoewel de besmetting door onderdompeling in voorraad van het virus kan ook worden uitgevoerd voor tonsillar weefsel om uniforme Gasbedwelming met behulp van explantaten het virus, deze aanpak leidt tot hogere weefsel manipulatie en cel verlies dan infectie van explantaten op gelatine sponzen zoals beschreven in het protocol.
Gepolariseerde systemen van HIV-1 uitdaging en cultuur van mucosal weefsels bestaan en worden momenteel gebruikt in andere laboratoria3,22,23,24,25. Hoewel deze systemen een waardevol model van HIV-1 ingang en penetratie in de mucosa, hun instellen is over het algemeen meer tijd in beslag en moet u mogelijk uitgebreide weefsel manipulatie. Niet-gepolariseerd modellen van mucosal transmissie/pathogenese bieden nog steeds een geldige platform om te onderzoeken van de regulering van HIV-1 replicatie en het lokale zwembad van HIV-geïnfecteerde cellen door endogene en exogene factoren9,17 , 26, met inbegrip van drugs12,13,14,15.
Variabiliteit tussen donor kan een groot probleem voor resultaat reproduceerbaarheid tussen onafhankelijke experimenten uitgevoerd met gebruikmaking van monsters van meerdere donoren vertegenwoordigen. Variabiliteit in cellulaire samenstelling kan ook van invloed op de gebieden binnen de dezelfde specimen, dat wil zeggen, intra-donor variabiliteit. Om te reduceren van variabiliteit en resultaten correct te interpreteren, is het van cruciaal belang om in te stellen van alle voorwaarden binnen een experiment met behulp van een voldoende aantal explantaten verkregen van dezelfde donor (donor-matched voorwaarden). Resultaten kunnen worden genormaliseerd naar een interne controle tijdens het compileren van gegevens uit meerdere experimenten voor statistische analyse. Verklein intra-donor variabiliteit en raden we je ten minste 2 technische replicatieonderzoeken voor elke experimentele voorwaarde, voor een totaal van 18 explantaten tonsillar weefsel (9 per putje) en 10-16 explantaten van cervicale mucosa (5-8 per putje) (tabel 1). De beschikbaarheid van medische dossiers en de opneming van aanvullende analyse van patiënt materiaal en/of experimentele omstandigheden, bijvoorbeeld naar adres de inflammatoire status van een exemplaar kunnen een aanzienlijke verbetering van resultaat interpretatie (zie referentie 9 voor een voorbeeld).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van de Foundation Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), de Stichting Zweedse artsen tegen AIDS (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006) en Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) naar Andrea Introini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency. Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).
- Dezzutti, C. S. Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success. J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).
- Global epidemic Update 2016. UNAIDS. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/documents/2016/Global-AIDS-update-2016 (2016).
- Lederman, M. M., Margolis, L. The lymph node in HIV pathogenesis. Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).
- Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).
- Biancotto, A., et al. HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood. 111 (2), 699-704 (2008).
- Van Laar, J. M., et al. Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells. Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).
- Introini, A., et al. Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants. PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).
- Grivel, J. C., et al. Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6. Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).
- Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides. Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).
- Lisco, A., et al. Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues. Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).
- Vanpouille, C., et al. A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo. AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).
- Andrei, G., et al. Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication. Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).
- Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).
- Saba, E., et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).
- Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo. PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).
- Biancotto, A., et al. A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24. J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).
- Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses. Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).
- Keele, B. F., et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).
- Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone. Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).
- Ganor, Y., et al. Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates. Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).
- Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5. EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection. J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).
