Summary
Infektion med humant væv med human immundefekt virus (HIV) ex vivo giver en værdifuld 3D model af virus patogenese. Her, beskriver vi en protokol for at behandle og inficere væv prøver fra menneskelige tonsiller og kvindelige kønsorganer mucosae med HIV-1 og fastholde dem i kultur på grænsefladen væske-luft.
Abstract
Histocultures giver mulighed for at studere intercellulære interaktioner inden for humane væv, og de kan blive ansat til model vært-patogen interaktioner under kontrollerede laboratorieforhold. Ex vivo infektion af væv med human immundefekt virus (HIV), blandt andre vira, har held været anvendt til at undersøge tidlig sygdom patogenese, samt en platform til at teste effekten og toksicitet af antivirale lægemidler. I denne protokol forklare vi, hvordan til at behandle og smitte med HIV-1 væv explants fra menneskelige tonsiller og cervikal mucosae, og bevare dem i kultur på toppen af gelatine svampe på grænsefladen væske-luft for omkring to uger. Indstillingen ikke-polariseret kultur maksimerer adgang til næringsstoffer i substratet og ilt, selv om fremadskridende tab af væv integritet og funktionelle arkitekturer er dens vigtigste begrænsning. Denne metode giver mulighed for overvågning af HIV-1 replikation og patogenesen ved hjælp af flere teknikker, herunder immunassays, qPCR og flowcytometri. Af betydning, kan fysiologisk variabiliteten mellem væv donorer samt mellem explants fra forskellige områder af det samme prøvemateriale, påvirke eksperimentelle resultater. For at sikre resultatet reproducerbarhed, det er afgørende for at bruge et passende antal explants, tekniske replikater og donor-matchede kontrol betingelser til at normalisere resultater af de eksperimentelle behandlinger, når indsamling af data fra flere eksperimenter (dvs. ., gennemføres ved hjælp af væv fra forskellige donorer) til statistiske analyser.
Introduction
Monotypisk bi-dimensionel cellekulturer, her henvises til som konventionelle, ikke højde for fysisk og funktionel kommunikationen mellem en lang række celletyper, at komponerer væv og organer. Dette aspekt er af afgørende betydning for eksperimentelle modeller af sygdommen, som interferens med homeostatiske intercellulære interaktioner er den drivende faktor af alle patologier. Væv explants tilbyder store fordele for modellering sundhed og sygdom i mennesker, fordi de bevarer cytoarchitecture og mange vigtige funktionelle aspekter af organer, som de er i vivo, men for en begrænset mængde tid1. For eksempel, på ex vivo udfordring med recall antigener, såsom difteri toxoid eller tetanustoksoid, reagerer tonsillar væv med en kraftig produktion af antigen-specifikke antistoffer2. Ligesom enhver anden ex vivo model, histoculture har sine egne begrænsninger: Inter donor variabilitet, væv polarisering, begrænset væv overlevelse og vanskeligheder i overvågning celler ud over dybden af konfokalmikroskopi1. Humant væv explants er dog fortsat en model af valg at studere homeostatiske og patogene immunologiske processer hos mennesker, herunder vært-patogen interaktioner og potentielle terapeutiske indgreb3.
De kritiske begivenheder af HIV-1 patogenese finder sted i væv. Infektion af genital slimhinden tegner sig for størstedelen af alle HIV-1 transmission begivenheder worldwide4. Lymfoide væv er den største site af virus replikering under akut infektion og havne en stor pulje af latent inficerede celler5, og deres persistens repræsenterer den vigtigste hindring for at opnå en kur6. Kultur og ex vivo udfordringen at menneskelige lymfoide og slimhinden væv giver nogle fordele i forhold til konventionelle systemer baseret på isolerede celler for studier af HIV-1. For eksempel, kan væv-resident celler støtte HIV-1 infektion i mangel af eksogene aktivering, i stedet for perifert blod mononukleære celler1. Den lymfoide væv explants har tilladt en bedre forståelse af nogle vigtige mekanismer bag CD4 T celle nedbrydningendet vil sige, tilskuer effekt7, som er kendetegnende for akut infektion. Bevarelse af strukturer som B-celle follikler i lymfoide væv8 og epitel i kvindelige kønsorganer mucosa explants9 tilbyder en unik mulighed for at integrere fysisk og funktionel funktioner af HIV-1 infektion på disse websteder. Endelig, histocultures blev med succes brugt til model og studere HIV-1 og herpesvirus Co infektion10,11, samt for præklinisk afprøvning af antiretrovirale lægemidler og multitarget mikrobicider12, 13 , 14 , 15.
Her beskriver vi en detaljeret protokol for kulturen i humant væv explants fremstillet af mandler og slimhinden væv fra den nedre kvindelige kønsorganer (livmoderhalsen), der dækker væv dissektion at explant udfordring med HIV-1 i en ikke-polariseret måde. Kulturen af væv explants på væske-luft grænseflade, ved hjælp af gelatine svampe som en støtte, maksimerer eksponering til air ilt samtidig give adgang til næringssubstratet næringsstoffer gennem svampen kapillærer, således at forskyde deres naturlige forfald. Den mest umiddelbare måde i vurderingen af HIV-1 replikation i vores system er at måle mængden af virus udgivet i dyrkningsmediet eksplantat over tid af immunassay eller qPCR. HIV-1 infektion og patogenese (fx., CD4 T celle nedbrydningen) kan også vurderes i væv explants af bulk RNA/DNA-ekstraktion og qPCR, i situ farvning eller enkelt celle-analyse på væv fordøjelsen ved flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol for indsamling af humane væv kan kræve etisk godkendelse af de lokale myndigheder. I tilfælde af angivne operationer såsom tonsillektomi og hysterektomi, modellerne er ikke indsamlet specifikt til forskning formål og undersøgelsen betragtes ikke som forsøgspersoner forskning (National Institutes of Health. Forskning på forsøgspersoner. https://humansubjects.NIH.gov/walkthrough-investigator#tabpanel11). Men, at opnå væv donorernes personlige og medicinske data (fx., køn, alder, nuværende stofbrug, historie af infektioner, osv.) der kan hjælpe med at fortolke eksperimentelle resultater, udgør bekymringer om informeret samtykke og fortrolighed, skal der rettet i protokollen til væv samling.
Advarsel: Hele proceduren bør være foretaget i en biologisk sikkerhed kabinet. Alle menneskelige enheder, herunder dem fra 'sunde' individer, kan havnen smitstoffer. Operatøren skal uddannes til at arbejde med blodbårne patogener man sikkert håndterer væv prøver, selvom eksperimenter ikke indebærer brug af HIV. En risikovurdering af procedure af væv dissektion og infektion med HIV skal foretages af uddannet personale til at sikre sikkerheden for de erhvervsdrivende og kolleger. Brugen af smitsomme HIV kræver dedikeret biosikkerhed niveau 2 eller 3 miljøer afhængig af land og Institut-specifikke forordninger om farlige biologicals og blodbårne patogener.
1. fremstilling af gelatine svampe
Bemærk: Selv om det ikke er strengt nødvendige for at forberede gelatine svampe før væv dissektion, det er mere bekvemt at følge ordren skitseret her, især når håndtering af en stor mængde af væv og/eller fra mange donorer.
- Forberede næringssubstratet (CM) og supplere det med antibiotika løsning (Tircacillin-clavulanat mix) før brugen for at gøre CMT (Tabel af materialer). Kassér eventuelle sidesten antibiotika løsning.
Bemærk: Ticarcillin og clavulanat i CMT er dårligt stabil. Hvis det er nødvendigt, igen supplere CMT med antibiotika løsning efter ca 24 h fra forberedelse. Det er ikke forpligtet til at tilføje antibiotika løsning for at explant medium hver 24 h under kultur. - Fylde et 100 mm x 20 mm petriskål med omkring 20-30 mL af CMT.
Bemærk: Denne indstilling er optimal til at forberede nok gelatine svampe til to 6-godt plader eller en 12-godt plade på tidspunktet. Hvis mange plader er påkrævet, skal du bruge en bredere petriskål og større CMT volumen til at fremskynde forberedelsen. - Overføre gelatine sponge(s) i petriskålen ved hjælp af steril pincet. Våd svampe på begge sider og tillade svampe til at opsuge medium for 1 min. Tryk svampe mod bunden af petriskålen for ca. 2 min. med en steril spatel.
Bemærk: Dette trin er af afgørende betydning, fordi tilstedeværelsen af luftbobler i svampen vil blokere kapillærerne hvorigennem næringssubstratet næringsstoffer nå væv. Gelatine svampe er ekstremt skør når dehydreret. Tryk forsigtigt på svamp med spatel, især i begyndelsen, at undgå at bryde svampen. - Brug steril saks til at klippe rehydreret gelatine svampe i stykker af samme størrelse af ca. 1 cm2. Overføre 1 svamp stykke med pincet i hver brønd med en kultur plade. Der tilsættes 3-4 mL CMT i hver brønd med en 6-godt plade (tonsiller) og 1 mL pr. brønd i en 12-godt plade (livmoderhalsen). Læg pladerne i inkubator, indstillet på 37 ° C, 5% CO2, ≥ 90% fugtighed, indtil væv explants er klar til at blive lastet på svampe.
Bemærk: Lydstyrken på CMT tilføjes i pladen bør justeres med tykkelsen af svamp til at holde explants væske-luft grænseflade.
2. dissektion af menneskelige Tonsillar væv
Bemærk: Mandler skal behandles så hurtigt som muligt efter operation, ideelt den samme dag i kirurgi. Alternativt, prøver kan stå natten neddykket i CMT ved 4 ° C.
- Tillader CM tid nok til at nå stuetemperatur (RT) eller sætte det i et vandbad pre varmes ved 37 ° C. Supplere CM med antibiotika løsning (CMT) før brug. Kassér alle antibiotika løsning tilovers. Hæld 70% ethanol opløsning i en ren beholder at suge pincet og skalpel når nødvendigt under proceduren dissektion. Ren redskaberne og ændre skalpel bladet mellem dissektioner af prøver fra forskellige donorer.
- Overføre tonsiller fra objektbeholderen transport til en 100 mm-petriskål indeholdende 10-20 mL af CMT ved hjælp af steril pincet.
Bemærk: Prøver med vidtstrakte områder af cauterized, blodig eller nekrotisk væv skal kasseres. - Brug låget af petriskålen som en skærefladen for at dissekere væv. Holde væv blidt med pincet, skær hver tonsil i flere store stykker ved hjælp af steril skalpel og blade.
Forsigtig: Håndtering skarpe værktøjer til at dissekere humant prøvemateriale øger risikoen for skade og forurening. Operatøren bør overveje iført metal, mesh, snitbestandige handskers som ekstra beskyttelse. - Fjern svitse, blodig, og fibroid væv og dele der indeholder tonsilloliths (forkalkede materiale) og/eller med grøn-brunlig farve ved hjælp af pincet og skalpel.
Bemærk: Mens du arbejder på et stykke væv, er det vigtigt at holde resten af det væv, nedsænket i medium at undgå væv udtørring. - Skær hver væv stykke i skiver på ca. 2 mm i tykkelsen. Fjerne uønskede dele som i det forrige trin. Skær skiverne er væv i 2 mm tyk strimler. Skær væv strimler i 2 mm tyk blokke. Dette bør resultere i væv explants af ca 8 mm3.
- Overføre explants ind i en ny 100 mm petriskål indeholdende 10-20 mL af CMT at undgå væv udtørring mens proceduren med dissektion. For enden af dissektion swirl plade for at randomisere eksplantat distribution. Sted 9 væv explants på toppen af hver gelatine svamp i en 6-godt plade med pincet, så afstanden mellem dem. Returnere pladerne til rugemaskine.
Bemærk: Typisk explants er kulturperler natten over og podning af kulturer med HIV-1 udføres den næste dag. Dette er at sørge for, at nogen bakterie- eller svampeinfektion forurening udvikler sig i kulturen. Derudover celler har tendens til at egress tonsillar væv explants efter dissektion. Denne proces er stort set afsluttet inden for de første 24 timer af kultur1. - Bortskaf alle biologisk affald i rammende beholdere efter instituttets forordninger om håndtering af farlige biologicals og specifik risikovurderingen.
3. infektion af Tonsillar væv Explants med HIV-1
Bemærk: For at reducere resultatet variabiliteten mellem uafhængige forsøg, den samme virus forberedelse bør anvendes til et hele undersøgelsen. Virus kan overføres i eksogent aktiveret perifert blod mononukleære celler og derefter kultur supernatanten kan være aliquoted til opbevaring på-80 ° C at undgå gentagen nedfrysning og optøning (Tabel af materialer).
- Sætte CM i vandbad pre varmes ved 37 ° C. Supplere CM med antibiotika løsning (CMT) før brug. Kassér eventuelle sidesten antibiotika løsning.
- Opsug medium i 6-godt skilte med en pipette og smid det i en container med desinficerende løsning. VIP pladen og forsigtigt skubbe gelatine svampe til den øverste del af godt tillade medium at samle i bunden, og Opsug og kassér den. Tilsæt 3-4 mL af CMT til hver brønd.
- Tø HIV-1 virus forberedelse i et vandbad ved 37 ° C. Om nødvendigt, fortyndes virus bestanden med CM (tabel 1).
Bemærk: Virus bestanden bør fortyndes, således at den valgte inokulum er indeholdt i et volumen på 5 – 8 µL (tabel 1). For en effektiv infektion er det kritisk at bruge mindst tid kræves mellem optøning HIV-1 forberedelse og inficere væv explants. - Der afpipetteres virus inokulum direkte oven på hver af de 9 explants på en gelatine svamp. Returnere skilte til rugemaskinen, så snart infektionen er afsluttet. Kassér eventuelle resterende virus forberedelse. Fortsætte til afsnit 5.
Bemærk: For at præcist levere virus inokulum operatøren bør overveje ved hjælp af en reverse pipettering teknik og ændre tip til hver brønd. Dette indebærer, at skubbe pipette stemplet ned til purge position (det andet stop) til at udarbejde virus inokulum, og skubber til den første stop til at levere podningsmængde hjælper med at minimere boble dannelse og fejlen forbundet med gentagne prøveudtagninger af små mængder, dvs., 5 – 8 µL.
4. dissektion og infektion i livmoder livmoderhalskræft slimhinde
Bemærk: Optimale resultater, explants af cervikal mucosae bør behandles og inficeret hurtigst muligt efter kirurgi, ideelt den samme dag af kirurgi. Alternativt, prøver kan opbevares, nedsænket i CMT ved 4 ° C natten over, og inficerede umiddelbart efter dissektion.
- Tillader CM tid nok til at nå RT eller sætte det i et vandbad pre varmes ved 37 ° C. Supplere CM med antibiotika løsning (CMT) før brug. Kassér eventuelle sidesten antibiotika løsning. Hæld 70% ethanol opløsning i en ren beholder at suge pincet og skalpel når nødvendigt under proceduren dissektion. Ren redskaberne og ændre skalpel bladet mellem dissektioner af prøver fra flere donorer.
- Brug steril pincet, overføre prøven fra objektbeholderen transport til en 100 mm petriskål indeholdende 10-20 mL af CMT.
- Brug låget af petriskålen som en skærefladen for at dissekere vævet. Holde væv blidt med pincet, adskille slimhinden i ectocervix og/eller endocervix fra nedenunder stromale og muskelvæv (submucosa) med en skalpel og blade til at opnå strimler af slimhinde.
Bemærk: Mens du arbejder på et stykke væv, er det vigtigt at holde resten af det væv, nedsænket i medium at undgå væv udtørring. - Skær slimhinden i 2 mm bred strimler, Fjern og kassér så meget submucosa som muligt, forlader kun en 2 mm tykke lag af væv. Skær strimler i 2 mm tyk blokke. Dette bør resultere i væv explants af ca 8 mm3.
Forsigtig: Håndtering skarpe værktøjer til at dissekere humant prøvemateriale øger risikoen for skade og forurening. Operatøren bør overveje iført metal, mesh, snitbestandige handskers som ekstra beskyttelse. - Overførsel væv explants ind i en ny 100 mm petriskål indeholdende 10-20 mL af CMT at undgå væv udtørring mens proceduren med dissektion. For enden af dissektion swirl plade for at randomisere eksplantat distribution.
- Med steril pincet, skal du overføre explants i sterile 1,5 mL konisk røret (maksimalt 16 explants pr tube). Fjerne ethvert medie i røret ved hjælp af en pipette.
- Tø HIV-1 forberedelse i et vandbad ved 37 ° C. Om nødvendigt, fortyndes virus bestanden med CM. overførsel af virus ind i røret, der indeholder explants. Kassér eventuelle resterende virus forberedelse.
Bemærk: Virus bestanden bør fortyndes, således at den valgte inokulum er indeholdt i et volumen på minimum 0,5 mL (tabel 1). For at reducere resultatet variabiliteten mellem uafhængige forsøg, bør den samme virus forberedelse anvendes til et hele undersøgelse (Tabel af materialer). - Overføre rør ind i en thermo-shaker og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C vuggende på 300 rpm. Forsigtigt invertere rør et par gange hver 30-60 min.
Bemærk: For en effektiv infektion er det kritisk at bruge mindst tid kræves mellem optøning HIV-1 forberedelse og overføre rør til 37 ° C. - Fyld en 6-godt plade med 3-4 mL pr. brønd af sterile fosfat buffer saltvand (PBS). På de af inkubationen med HIV-1 kassere alle virus forberedelse i røret i en beholder med desinficerende løsning ved hjælp af en pipette. Overførsel af explants i 6-godt pladen som indeholder PBS ved hjælp af pincet.
- Tillade explants at hvile i PBS for 1 min på RT, og derefter vaske dem af forsigtigt pipettering up-and-down PBS i brønden 2 - 3 gange. Kassér PBS i en beholder med desinficerende løsning ved hjælp af en pipette. Tilsæt 3-4 mL af nye PBS til hver brønd. Gentag to gange mere i alt tre vasker. Kassér PBS lige før overførsel af explants til svampe at undgå væv udtørring.
Bemærk: Explants af cervikal slimhinde, og i særlige endocervix, frigive store mængder af slim i løbet af infektion. Det er afgørende at vaske og fjerner så meget Slim som muligt, fordi uspecifik opbevaring på explants og efterfølgende frigivelse af virus i cellekultur supernatant kan maskere virus replikering. - Brug af pincet, overføre 5-8 explants på toppen af hver gelatine svamp i en 12-godt plade. Returnere pladen til rugemaskine.
- Bortskaf alle biologisk affald i rammende beholdere efter instituttets forordninger om håndtering af farlige biologicals og specifik risikovurderingen.
5. Histoculture
- Ændre CM hver 3 dage fra tidspunktet for infektion indtil dag 12 – 15 efter infektionen. CM og/eller explants kan udtages med jævne mellemrum gennem hele kultur at vurdere HIV-1 replikation, blandt andre parametre.
- Sætte CM i vandbad pre varmes ved 37 ° C.
Bemærk: Det er ikke påkrævet at supplere CM med antibiotika løsning på dette stadium. - Indsamle en prøve af CM med en pipette og overføre det til sterile 1,5 eller 2 mL skruelåg røret for opbevaring ved-80 ° C.
Bemærk: CM fra Repliker wells sammenlægges på samling. - Høste væv explants med steril pincet, Fjern den overskydende medium på explants ved at placere dem på et stykke papir (valgfrit), og overføre explants til sterile 1,5 eller 2 mL skruelåg røret. Behandle eller opbevare vævsprøver som krævet i eksperimentet.
Bemærk: Til flowcytometri fordøjes explants straks med en enzymatisk cocktail til at opnå en enkelt celle suspension (for flere detaljer se referencer til 1, 9, 16 og 17). For RNA udvinding, er explants opbevares i en RNA stabilisering ved 4 ° C natten over før gemme dem ved-80 ° C. For DNA-ekstraktion og i situ farvning (livmoderhalsen), kan explants snap-frosset i flydende nitrogen eller tøris/ethanol gylle og opbevares ved-80 ° C. Alternativt, tonsillar explants kan fastgøres ved nedsænkning i en opløsning af PBS og 4% PARAFORMALDEHYD for i situ farvning. - Opsug den resterende CM i godt med en pipette og smid det i en beholder med desinficerende løsning. VIP pladen og forsigtigt skubbe gelatine svampe til den øverste del af godt tillade medium at samle i bunden, og derefter Aspirér og kassere det.
- Tilsæt 3-4 mL af CM til hver brønd. Brug steril pincet, returnere væv explants, faldt i medium til gelatine svamp. Returnere pladen til rugemaskine.
- I slutningen af kultur, afhænde alt biologisk affald i rammende beholdere efter instituttets forordninger om håndtering af farlige biologicals og specifik risikovurderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flere teknikker kan bruges til at vurdere HIV-1 replikation i væv explants. Vores standard udlæsning er at måle mængden af HIV-1 p24gag udgivet i CM over tid med en immunassay18.
Væv explants fra forskellige donorer, inficeret med den samme inokulum af den samme HIV-1 bestand, kan give forskellige mængder af virus (tabel 1). Dette skyldes flere faktorer, såsom antallet og status af HIV-1 målcellerne og tilstedeværelsen af co inficerer patogener i væv16,19. I figur 1giver vi et eksempel på produktivt og forfejlede HIV-1 infektion af cervikal mucosa explants som defineret af mængden af p24gag udgivet i CM i forhold til donor-matchede explants behandlet med antiretroviral medicin lamivudin (3TC) der undertrykker helt HIV-1 replikation. Selv om denne kontrol synes overflødige for infektion af væv explants fra donor i A, hjælper det i at diskriminere mislykkede b fra produktive infektion (C) i explants, der giver lave niveauer af HIV-1 replikation.
Brugen af en antiretroviral medicin som en kontrol tilstand kan være nyttige at studere HIV-1 infektion i væv, havnen lavt antal målceller, ligesom den cervikale slimhinde, og når du bruger langsom-replikering af HIV-1 varianter, såsom nogle primære isolater. Derudover for væv inficeret med denne virus, er det vigtigt at overveje at bruge mere følsomme detektionsmetoder, for eksempel qPCR.
Figur 1 : HIV-1 replikation i cervikal mucosa explants fra tre forskellige væv donorer. Cervikal væv explants var inficeret med den samme inokulum af HIV-1BaL ved neddykning i virus lager og kulturperler i 15 dage i tilstedeværelse eller fravær af antiretroviral medicin lamivudin (3TC) ved koncentration på 10 µM. næringssubstratet stikprøven hver 3 dage og prøver fra Repliker wells var samlet på samling for analyse af HIV-1 replikation af HIV-1 p24gag immunassay. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Vævstype | Virus | Inokulum pr. eksplantat (pg af HIV-1 p24gag) | Lol af explants | Næringssubstratet volumen (mL) | Lol af brønde (tekniske replikater) | HIV-1 p24gag produktion (ng/mL) |
| Tonsillar | HIV-1BaL | 350-500 | 9 | 3-4 | 2-3 | 1 – 10 |
| HIV-1LAI.04 | 9 | 3-4 | 2-3 | 1 – 100 | ||
| Livmoderhalskræft | HIV-1BaL | 1.500 – 2.000 | 8 | 1 | 2 | 1 – 5 |
| HIV-1LAI.04 | 8 | 1 | 2 | målbart |
Tabel 1: referenceværdier af HIV-1 inokulum for infektion af væv explants og virus produktion. Værdien af HIV-1 inokulum pr. enkelte væv eksplantat refererer til viruslagrene i koncentration på 50 – 70 ng/mL: et volumen på 7 µL af ufortyndet virus stock bruges til at inficere hver tonsillar eksplantat oven på en gelatine svamp; et volumen på 500 µL af ufortyndet virus stock bruges til at inficere 16 cervikal explants ved nedsænkning i en 1,5 mL tube. Cervikal explants vaskes grundigt i PBS før du overfører dem på gelatine svampe. Værdien af HIV-1 produktion af væv explants henviser til det samlede beløb af p24gag udgivet af 8 explants i 1 mL (livmoderhalsen) eller 9 explants i 3-4 mL (tonsiller) af næringssubstratet (CM) stikprøven hver 3 dage over 12-15 dage af kultur. CM fra Repliker brønde er samlet på samling for hvert tidspunkt før du udskifter det med friske CM. Værdien af p24gag koncentration målt på dag 3 var udelukket fra analyse, fordi det delvist konti for virus absorption på explants og efterfølgende frigivelse i CM, dvs., inokulum fremførsel. Typisk, infektion af cervikal væv med HIV-1LAI.04 ikke fører til påviselige HIV-1 replikation i vores eksperimentel system16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brugen af menneskelige væv explants for undersøgelsen af HIV-1 infektion giver fordele frem for traditionelle bi-dimensionel og monotypisk eksperimentelle systemer, såsom primærelementer eller cellelinjer, grund af deres overlegne evne til at reproducere intercellulære interaktioner og cellulære funktioner (f.eks.cytokin produktion) som de er i vivo. Ikke desto mindre tonsillar og cervikal væv er forskellige i mange aspekter, herunder antallet og fænotypiske og funktionelle egenskaber af HIV target celler1,16. Af samme grund udføre HIV-1 varianter med forskellige co receptor tropisme (fxCCR5-tropic HIV-1BaL vs CXCR4-tropic HIV-1LAI.04) anderledes både i mandlerne og livmoderhalsen (tabel 1). Fordelingen af HIV coreceptors på target-cellerne på immun induktive og effektor sites kun delvist konti for lokale modtagelighed for infektion: CD4 T celler transporterer CXCR4 er mere rigelige end udtryk for CCR5 celler i tonsillar væv, således forklarer højere replikering niveauer af HIV-1LAI.04 end HIV-1BaL, men receptorer er ligeligt repræsenteret i de cervikale slimhinde16. Ikke desto mindre, vi sjældent opdaget produktive virus replikering i livmoderhalsen væv udfordret med HIV-1LAI.04, som er i overensstemmelse med den præferentielle transmission af individuelle HIV-1 CCR5-tropic varianter observeret i vivo20 . Dette tyder på, at HIV-1 målceller differentiering og aktivisering status i sidste ende kan afgøre deres evne til at støtte HIV-1 replikation16.
Gelatine svampe er hæmostatisk enheder fremstillet af renset svin huden (kollagen), som er designet til at være fuldstændig absorberet af den menneskelige krop efter et par uger. Vi anbefaler at bruge produkter, der viser langsomme nedbrydning sats i kultur, så de passer bedre til formålet at opretholde væv explants på grænsefladen væske-luft for 2-3 uger. Vi anbefaler også teste forskellige partier af det samme produkt til at vurdere ensartet ydelse i eksplantat kultur.
Ligeledes, den type og masse føtal bovint serum (FBS) kan påvirke HIV-1 replikation niveauer. Vi rådgiver test flere masser af FBS for CM optimering og bruge den samme masse FBS for en hele undersøgelsen. Vi rutinemæssigt teste FBS på væv explants fra 10 donorer og vælg det parti, der giver den højeste HIV-1 replikation.
For de fleste af eksperimenterne samler vi explants fra endocervix og ectocervix til at maksimere antallet af forsøgsbetingelser. Man kan overveje at holde dem adskilt på grund af deres forskellige strukturelle og immunologiske funktioner21. Også, endocervikale explants frigivelse og fortsætte med at producere store mængder af slim i kultur, der kan forstyrre downstream analyse. Eftersom området er omfattet af endocervix er meget mindre end ectocervix, det er en udfordring at gennemføre HIV infektion eksperimenter udelukkende på endocervikale slimhinde replikater ved hjælp af et passende antal af explants og tekniske.
Udfører HIV-1 infektion ved neddykning af cervikal explants maksimerer mulighederne for at opnå en produktiv infektion på grund af det lavere antal CD4 T-celler i mucosa i forhold til lymfoid væv. Af samme grund, de cervikale væv er mere følsomme over for natten opbevaring og giver højere HIV-1 replikation når inficeret kort efter operationen og umiddelbart efter dissektion. Selv om infektion ved neddykning i virus materiel kan udføres også for tonsillar væv til at sikre ensartet udsættelse af explants for virus, medfører denne tilgang højere væv manipulation og celle tab end infektion af explants på gelatine svampe som beskrevet i protokollen.
Polariseret systemer af HIV-1 udfordring og kultur af slimhinden væv findes og er i øjeblikket anvendes i andre laboratorier3,22,23,24,25. Selv om disse systemer er en værdifuld model af HIV-1 løsning og indtrængen i slimhinden, deres opsætning er generelt mere tidskrævende og kan kræve omfattende væv manipulation. Ikke-polariseret modeller af slimhinde transmission/patogenese stadig tilbyde en gyldig platform til at undersøge regulering af HIV-1 replikation og den lokale pulje af HIV-inficerede celler af endogene og eksogene faktorer9,17 , 26, herunder narkotika12,13,14,15.
Mellem donor variation kan udgøre et stort problem for resultatet reproducerbarhed mellem uafhængige forsøg foretaget ved hjælp af prøver fra flere donorer. Variation i cellulære sammensætning kan også påvirke områder inden for samme prøvemateriale, dvs, intra-donor variabilitet. For at reducere variation og korrekt fortolke resultaterne, er det kritisk at konfigurere alle betingelser i et eksperiment ved hjælp af et passende antal explants fra den samme donor (donor-matchede betingelser). Resultater kan normaliseres en intern kontrol, når indsamling af data fra flere eksperimenter til statistiske analyser. For at reducere intra-donor variabilitet, anbefales det, herunder mindst 2 tekniske flergangsbestemmelser for hver eksperimentelle betingelse, for i alt 18 explants af tonsillar væv (9/brønd), og 10-16 explants af cervikal slimhinde (5-8/brønd) (tabel 1). Tilgængeligheden af medicinske journaler og medtagelse af yderligere analyse af patientens materiale og/eller eksperimentelle betingelser, for eksempel til adresse inflammatoriske status af modellen, kan markant forbedre resultatet fortolkning (Se reference 9 for et eksempel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra fonden Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), Foundation svenske læger mod AIDS (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006) og Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) til Andrea Introini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency. Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).
- Dezzutti, C. S. Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success. J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).
- Global epidemic Update 2016. UNAIDS. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/documents/2016/Global-AIDS-update-2016 (2016).
- Lederman, M. M., Margolis, L. The lymph node in HIV pathogenesis. Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).
- Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).
- Biancotto, A., et al. HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood. 111 (2), 699-704 (2008).
- Van Laar, J. M., et al. Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells. Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).
- Introini, A., et al. Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants. PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).
- Grivel, J. C., et al. Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6. Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).
- Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides. Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).
- Lisco, A., et al. Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues. Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).
- Vanpouille, C., et al. A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo. AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).
- Andrei, G., et al. Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication. Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).
- Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).
- Saba, E., et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).
- Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo. PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).
- Biancotto, A., et al. A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24. J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).
- Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses. Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).
- Keele, B. F., et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).
- Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone. Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).
- Ganor, Y., et al. Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates. Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).
- Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5. EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection. J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).
