Summary
ב פרוטוקול זה, baculovirus המיוצר על ידי תרביות תאים ארעית של baculovirus פלסמיד לתאים Sf9, הגביר בתרבות ללא סרום ההשעיה. תגובת שיקוע מטוהרת על-ידי הפארין כרומטוגרפיית זיקה, עוד יותר מרוכז על-ידי ultracentrifugation. פרוטוקול זה שימושי עבור ייצור וטיהור של baculovirus עבור יישום טיפול גנטי.
Abstract
Baculovirus באופן מסורתי שימש לייצור חלבון רקומביננטי, חיסון. עם זאת, לאחרונה, baculovirus מתגלה כמו וקטור המבטיח ליישום טיפול גנטי. כאן, baculovirus מופק על ידי תרביות תאים ארעית של פלסמיד baculovirus ה-DNA (bacmid) ב תרבות חסיד של תאים Sf9. Baculovirus לאחר מכן מורחב בתאים Sf9 תרבות ללא סרום השעיה עד לנפח הרצוי מתקבל. זה לאחר מכן מטוהרים מתרבות supernatant באמצעות כרומטוגרפיית זיקה הפארין. וירוס supernatant הוא טעון על גבי העמודה הפארין אשר נקשר baculovirus חלקיקים ב תגובת שיקוע עקב בזיקה של הפארין עבור baculovirus אופפים גליקופרוטאין. העמודה נשטף עם מאגר כדי להסיר מזהמים, baculovirus היא eluted מן העמודה עם מאגר מלח גבוהה. Eluate הוא מדולל ריכוז מלח מול, baculovirus חלקיקים הם הרבה יותר מרוכז באמצעות ultracentrifugation. באמצעות שיטה זו, baculovirus יכול להיות מרוכז עד 500-fold עם החלמה 25% של חלקיקים זיהומיות. אף על פי הפרוטוקול המתואר כאן מדגים את הייצור ואת טיהור של baculovirus מתרבויות עד 1 L, השיטה יכול להיות קנה המידה להמציא בתרבות סגור-מערכת המתלים לייצר וקטור קליני-כיתה ליישום טיפול גנטי.
Introduction
Baculovirus משמשת בעיקר לייצור של חומרים וחיסונים ב lepidopteran זחל כנימה fugiperda (Sf) 9 תאים חרקים באמצעות רקומביננטי קליפורניה Autographa וירוס multicapsid polyhedrosis הגרעין (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. לאחרונה, זה מתגלה כמו וקטור מבטיח עבור ג'ין טיפול יישום5. זה ידוע tropism רחב של המארח ורקמות, מדביק פריט שקט וגם מתרבים תאים, פתוגניים שאינם, לא לשלב המארח כרומוזום4,5,6. יתר על כן, baculovirus יכול להיות מיוצר בתרבות ללא סרום ההשעיה היא מדרגית ומאפשר למערכת סגורה, עיבוד ייצור קליניים עתידיים1.
הטוהר של חלקיקים baculovirus חשוב להשגת התמרה חושית יעילה תוך מזעור cytotoxicity-7,-8,-9. להיות מרוכזת Baculovirus על ידי ultracentrifugation או זרימה וצורניים סינון (TFF) עם השפעה מוגבלת על infectivity שלה. עם זאת, נהלים אלה לא רק להתרכז חלקיקי וירוס אבל גם פסולת הסלולר וחלבונים מן Sf9 תרבות, אשר יכול להיות רעיל במבחנה (תצפית אישי), עלול לגרום לדלקת או תגובה חיסונית כאשר נעשה שימוש ב- vivo. כדי להימנע מכך, במיוחד בעת שימוש מאוד מרוכז וירוס מניות, baculovirus זיהומית צריך להיות מטוהרים הופרדו מזהמות חלקיקים.
דווחו מספר שיטות לטיהור ודה-ריכוז של baculovirus וקטורים10,11,12. גישות זמין, הפארין כרומטוגרפיית זיקה מאפשר צעד אחר צעד רמה גבוהה של טיהור עם ריכוז נמוך של מזהם חלבונים12. השיטה מבוססת על זיהוי הפאראן גופרתי כמו רצפטור baculovirus13,14. לאחר טעינת תגובת שיקוע תא Sf9 עמודה ועל הכריכה של baculovirus, ניתן לשטוף את העמודה עם הפיזיולוגיות מאגר (מול) כדי להסיר חלקיקים מזהמים באופן רופף מאוגד או לא מאוגד. מאז האיגוד כדי הפארין הוא הפיך, חלקיקי baculovirus יכול להיות eluted עם מאגר מלח גבוהה, אשר הוא מדולל מיד כדי הפיזיולוגיות ריכוז המלחים (מול) כדי למנוע איון-שוק אוסמוטי12. יתר על כן, הייצור של baculovirus, כמו גם לוכדים במחשבים ואת • תנאי מן העמודה כרומטוגרפיה, ניתן לבצע באמצעות תהליך מערכת סגורה אשר תואמת נוהלי ייצור טוב הנוכחי (cGMP).
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור ייצור, היטהרות, ריכוז של baculovirus זיהומיות באמצעות כרומטוגרפיית זיקה צנטריפוגה. בקצרה, אנו מייצרים baculovirus על ידי תרביות תאים תאים Sf9 עם פלסמיד baculovirus DNA בתרבות חסיד, להרחבה נוספת של baculovirus זיהומיות בתרבות ללא סרום ההשעיה. אנחנו לטהר baculovirus באמצעות כרומטוגרפיית זיקה הפארין ועושים שימוש ultracentrifugation השלב הסופי להתרכז מאוד הווקטור ליישום טיפול גנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ראה איור 1 איור המסכמת את הפרוטוקול.
1. טיהור של פלסמיד Baculovirus דנ א
- לגדול התרבות חיידקי המכיל baculoviral פלסמיד דנ א (bacmid)14 ב 200 מ ל מרק ליברות עם אנטיביוטיקה; kanamycin (50 µg/mL), טטרציקלין (10 µg/mL) ו gentamycin (7 µg/mL), עבור 16 h ב- 37 מעלות צלזיוס על הגדרה של חומרים מסוכנים-300 סל ד.
- לטהר את bacmid ה-DNA של התרבות חיידקי באמצעות פרוטוקול סטנדרטי פירוק אלקליין15, לפזר את bacmid במאגר טה.
2. הפקה של Baculovirus
- התרבות התאים Sf9 בתוך אינקובטור חומרים מסוכנים-135 סל ד ו- 28 מעלות צלזיוס פוליקרבונט הבקבוק Erlenmeyer המכיל סרום ללא חרקים בינוני תרבות1,2,3.
הערה: אם תאים Sf9 הם הקרת במלאי קפואים, אפשר לפחות שבועיים עבור התאים לשחזר ולהזין השלב מעריכית של צמיחה. - לספור את התאים Sf9 שנקטפו בשלב מעריכית של צמיחה עם hemocytometer לאחר צביעת עם Trypan blue. זרע עונה 1 פרק 106 Sf9 התאים קיימא לכל טוב בצלחת 6-ובכן תרביות רקמה שטופלו ב- mL 2 בינוני. לאפשר את התא לצרף עבור 1 h ב- 28 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור.
- החלף את מדיום הגידול 1 מ"ל של מדיום תרבות חרקים ללא סרום unsupplemented של גרייס.
- Transfect את bacmid DNA לתוך התאים Sf9 באמצעות ריאגנט תרביות תאים תאים חרקים.
- מיקס 8 µL תא חרקים תרביות תאים מגיב עם 100 µL של גרייס חרקים בינוני.
- למהול 2 µg של bacmid ה-DNA לתוך µL 100 unsupplemented חרקים בינוני ומערבבים בעדינות על-ידי vortexing.
- לשלב את ה-DNA מדולל עם הכימית תרביות תאים תאים חרקים מדולל, ומערבבים בעדינות. תקופת דגירה של 15 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- להוסיף את התערובת DNA-השומנים dropwise על התאים. דגירה-28 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור במשך כ- 5 שעות.
- הסר את התערובת תרביות תאים מתאי ולשטוף את התאים עם 2 מ"ל ל- PBS.
- להוסיף 2 מ של חרקים בינוני תרבות ולהמשיך לתרבות ב 28 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור מבלי לשנות את המדיה.
הערה: אם bacmid מכיל חלבון פלואורסצנטי, הביטוי שלה ניתן להבחין ב תאים תקנים לאחר 48 שעות. Baculovirus מיוצר על ידי תאים Sf9 transfected, ומופרש אל המדיום תרבות אשר לאחר מכן מדביק את התאים untransfected. האוכלוסייה התא כולו הופך להיות נגוע baculovirus תוך 5 ימים, מראה סימנים של זיהום ויראלי, הנקרא גם אפקט ציטופתי. אלה כוללים תאים מוגברת קוטר, וקואלות/granules ציטופלזמה, הפסקת צמיחת תאים, התאים מתים או lysed קיימים תרבית תאים. עם זאת, אם תרביות תאים או זיהום היעילות אינה אופטימלית, התרבות עשוי להציג לא ציטופתי ברור. ניתן לאבחן את אפקט ציטופתי עם מיקרוסקופ שלב הפוך ב- 200-400 X הגדלה. תא Baculovirus נגוע יכול יזוהו על-ידי מכתימה עם נוגדן anti-gp6411. - הקציר baculovirus supernatant 5 ימים לאחר תרביות תאים ותווית כמו P1 וירוס המניה.
- לאחסן את baculovirus supernatant, אשר הוא רגיש אור, בחושך עם 0.5% אלבומין שור (BSA) ב- PBS. לאחסן ב 4 ° C לטווח קצר (עד 90 יום) או ב- 80 ° C לטווח הארוך.
- זרע 6 × 10 תאים6 Sf9 בצלחת ס מ-10 תרביות רקמה שטופלו ב- 10 מ"ל של חרקים בינוני תרבות. להוסיף 1 מ"ל של הראשונית baculovirus supernatant (P1) לתאים.
- הקציר baculovirus supernatant (P2) ב-th 5 יום לאחר הפגיעה.
- זרע 50 מ של תאים Sf9 (3 x 106 תאים/mL) בתרבות השעיה בתוך תרבות חרקים, במדיום 250-mL פוליקרבונט הבקבוק Erlenmeyer ומקום הבקבוק בתוך אינקובטור חומרים מסוכנים. להוסיף 2 מ"ל של P2 מניות לתאים וללחוץ על סל ד 135 תוך שמירה על טמפרטורת חום קבועה של 28 מעלות צלזיוס.
הערה: שלושה או ארבעה ימים לאחר ההדבקה, כלל האוכלוסיה תא Sf9 יראה ציטופתי, דבר שמעיד על ייצור גבוהה-כייל נוגדנים baculovirus. - ברצף להגביר את supernatants baculovirus עד לנפח הרצוי מתקבל (P3, P4,...) על-ידי הגדלת 10 לנפח 50-fold של תרבית תאים בתוך כל זיהום לאחר מכן.
הערה: P3 הוא 3rd עגול של זיהום באיזה 500 מ"ל לליטר 1 Sf9 תרבית תאים יכול להיות נגוע עם 10 עד 20 מ ל P2 baculovirus supernatant; P4 הוא 4th עגול של זיהום ב L איזה 5-10 של Sf9 תרבית תאים יכול להיות נגוע עם 100 עד 200 מ ל P3 baculovirus תגובת שיקוע, וכן הלאה. בדרך כלל, Sf9 תאים הם נזרע-3 × 106 תאים למ"ל בתקשורת תרבות סרום ללא חרקים. - Centrifuge את baculovirus supernatant ב 1,000 x g למשך 30 דקות ב 4 ° C הסרת לכלוך הסלולר ולטפל baculovirus את supernatant עם 50 יחידות/mL נוקלאז (250 יחידות/µL של מניות) עבור 2 h ב 37 מעלות צלזיוס לעכל את ה-DNA ו RNA הגנומי. לסנן את supernatants דרך יחידת סינון 0.45 μm.
3. הכנת המערכת כרומטוגרפיה
- להכין את המערכת כרומטוגרפיה בשטיפת ברצף לדוגמה ומאגר הקווים כל במים סטריליים, 1 N נתרן הידרוקסידי, מים, לשטוף את מאגר (20 מ מ סודיום פוספט מאגר המכיל 150 מ מ כלוריד הנתרן, pH 7.0) בקצב זרימה ליניארי של 50 mL/min.
- להכין עמודה מיקרומטר הפארין 50 (10 × 10 ס מ, 7.9 מ"ל נפח עמודה (CV)) על-ידי הפעלת ברצף עמודה ניקוי מאגר (5 CV 20 מ מ סטרילי סודיום פוספט מאגר המכיל 2 מ' נתרן כלורי, pH 7.0) 5 חיץ שטיפת קורות חיים בקצב זרימה ליניארי של 7 mL/min.
4. טיהור של וקטור Baculovirus
- להגדיר את המערכת כרומטוגרפיה כדלקמן:
- השתמש המדגם טעינת כניסת יציאת עבור טעינת את baculovirus supernatant.
- השתמש הנמל כניסת מאגר A1 עבור טעינת מאגר לשטוף. להכין בקבוק לפחות 500 מ של מאגר לשטוף ולהניח הקו מאגר שטיפת לתוך הבקבוק.
- השתמש הנמל כניסת מאגר A2 עבור טעינת המאגר • תנאי (20 מ מ סודיום פוספט 1.5 M נתרן כלוריד, pH 8.0). להכין בקבוק עם פחות 500 מ"ל • תנאי מאגר ולמקם את הקו מאגר • תנאי לתוך הבקבוק.
- הכנס מספר 50 מ ל צינורות חרוט האספן שבר כדי לאסוף את העמודה baculovirus pass-through supernatant, המאגר לשטוף את baculovirus eluted.
- Equilibrate את העמודה הפארין בחמישה כרכים עמודה 7.9 מ ל (CVs) שטיפת מאגר (40 מ ל)-קצב זרימה ליניארי של 7.0 mL/min.
- לטעון 250 מ של baculovirus supernatant אל העמודה הפארין באמצעות המשאבה מדגם (כניסת דוגמת יציאת) של מערכת כרומטוגרפיה בקצב זרימה ליניארי של 2.0 mL/min.
- לרוץ 10 CVs (80 מ ל) שטיפת המאגר דרך העמודה הפארין בקצב זרימה ליניארי של 2.0 mL/min ועד העיקול ספיגת אולטרה סגול (UV) (280 ננומטר) חזר בסיסית והופך להיות יציב.
- Elute החלקיקים baculovirus מן העמודה הפארין 7.9 מ עם CVs 5 (40 מ ל) • תנאי מאגר בקצב זרימה ליניארי של 4.0 מ"ל לדקה Watch לשיא • תנאי חדה של חלבון-chromatogram כאשר החלקיקים baculovirus מביצועם מן העמודה הפארין.
- • תנאי שלאחר, מיד לדלל את תגובת שיקוע eluted baculovirus 10-fold שימוש 20 מ מ סודיום פוספט של מאגר מים כדי למנוע איון של חלקיקים baculovirus מהלם אוסמוטי במהלך צנטריפוגה עוקבות.
- מאגר µL 100 של כל אחד השברים, כולל הזרימה עמודה את דרך שנאספו במהלך הטעינה של תגובת שיקוע של baculovirus, המאגר לשטוף את eluate. להדביק את השברים baculovirus האלה כדי HT1080 כדי להעריך את תהליך החיטוי (ראו סעיף 6).
- נקה את העמודה עם עמודה ניקוי מאגר ומאגר לשטוף. לבסוף, יש לשטוף את העמודה עם 5 CV סטרילי 20% אתנול במים בקצב זרימה ליניארי של 7.0 mL/min ולאחסן ב 4 º C.
- שתנקה את המערכת בקבוקים עם מים, 1 N נתרן הידרוקסידי, שוב עם מים, 20% אתנול במים בקצב זרימה ליניארי של 50.0 mL/min ולאחסן את המערכת ב- 20% אתנול.
5. ריכוז של Baculovirus
- מראש לעקר את צינורות צנטריפוגה באמצעות החיטוי. להוסיף אמצעי שווה של baculovirus supernatant כל צינורות ultracentrifuge בשכונה תרביות רקמה. למדוד את המשקל של הצינורית על ידי איזון ולהתאים את המשקל של התוכן של הצינורות ultracentrifuge עם PBS סטרילי.
- מקם כל אחד הצינורות ultracentrifuge מנוגדים דלי של הרוטור SW 32 Ti.
- הפעל את ultracentrifuge ב 80,000 × g במשך 90 דקות ב 4 º C.
- פתח הצינורות ultracentrifuge בשכונה תרביות רקמה, גילוח ורחיצה כירורגית וארוקן את הנוזל מבלי להסיר בגדר baculovirus.
- Resuspend בגדר של כל שפופרת מאת נמרצות pipetting למעלה ולמטה עם 200 µL PBS המכילה 0.5% (w/כרך) BSA.
- להעביר את baculovirus מרוכז cryovials (50 עד 100 µL לכל מבחנה) ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
6. טיטור של Baculovirus
- יום לפני זיהום, לספור תאים HT1080 באמצעות hemocytometer לאחר צביעת תאים עם Trypan blue. 5 HT1080 זרע עונה 1 פרק 10 תאים לכל טוב בצלחת. ובכן 6 ב 2 מ"ל בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS). זרעי כמה בארות נוספות כדי לקבוע את המספר המדויק של תאים המצויים בזמן זיהום. התרבות התאים בתוך אינקובטור-CO 37 ° C ו-5%2.
הערה: HT1080 תאים משמשים עבור טיטור כפי שהן מבטאות רמה גבוהה יותר של הפאראן גופרתי לעומת ה שאר תא שורות16. מאחר HT1080 תאים חסיד, טיטור הוא פשוט יותר וצורכת פחות זמן לעומת באמצעות טיטור מבוססי Sf9 המסורתי. - ביום של זיהום, לקבוע את מספר התאים לכל טוב על ידי ספירת תאים מבארות. להדביק את התאים על-ידי הוספת את baculovirus המקורי מדולל אשר נקבעו הצידה לפני עמודה טיהור, ועם דוגמאות מן העמודה זרימה דרך, לשטוף, • תנאי שברים. עבור כל דגימה, לקבוע את דילול ואת נפח מדעית המבוססת על חלקיקים baculovirus זיהומית, להדביק כל טוב דולר.
- יומיים לאחר זיהום, לנתח את התאים עבור הביטוי של הגן עניין. התאים ניתן לנתח באמצעות cytometer זרימה אם הם מבטאים חלבון פלואורסצנטי (למשל GFP)17.
- לחשב את titers (זיהומיות יחידה לכל mL) מבוסס על מספר התאים המצויים בזמן של זיהום, גורם לדילול, אחוזי חלבון פלואורסצנטי בתאים תוך שימוש בנוסחה: (מספר תאים במהלך זיהום × אחוז חלבון פלואורסצנטי תאים חיוביים × דילול פקטור) / נפח של baculovirus ב mL.
הערה: לדוגמה, אם המספר הכולל של תאים לכל טוב בזמנו של זיהום × 10 1.25, אחוז החלבון הניאון הוא 5%, הגורם דילול הוא 100, הנפח של baculovirus מדולל הוסיף 10 µL, כייל הוא 6 × 107 זיהומיות יחידות (IU) /mL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול שהוצג הוא בדיאגרמת זרימה (איור 1). השלבים כוללים את תרביות תאים ארעית של תאים Sf9 עם bacmid דנ א כדי לייצר baculovirus בתרבות חסיד בצלחת, הגברה עוקבות ב תרבות ללא סרום ההשעיה, נוקלאז טיפול הבהרה על-ידי צנטריפוגה ולאחר סינון, ואחריו טיהור באמצעות כרומטוגרפיית זיקה של הפארין ריכוז עם ultracentrifugation.
אחרי מפשיר, Sf9 תאים צריך לפחות שבועיים כדי לשחזר ולחתימה על השלב מעריכית של צמיחה. פעיל גדל Sf9 תאים הם transfected עם bacmid DNA בתרבות חסיד. יומיים לאחר תרביות תאים, ביטוי של המעטפה baculovirus glycoproteins, gp64 מזוהה, לאחר מכן, baculovirus הייצור הוא יזם11. מאחר baculovirus הוא שכפול המוסמכת, מספר התאים הנגועים עולה בהדרגה עקב זיהום פרוגרסיבי של תאים עם baculovirus החדש מיוצר המופרש לתוך מדיום הגידול. Baculovirus המכיל תא supernatants הם שנקטפו 5 ימים לאחר תרביות תאים כאשר האוכלוסייה התא כולו יש להידבק. זה וירוס הראשונית supernatant מיועדת כמו המעבר מניות (P1) 1. המניה1 P משמש הזיהום עוקבות של תרבות חסיד לאחרונה הזריעה של תאים Sf9 בצלחת גדולה יותר. האוכלוסייה התא כולו מראה סימן לזיהום תוך 5 ימים אשר נקרא אפקט ציטופתי (איור 2). תגובת שיקוע של התרבות תאים חסיד השני האיסוף, מיועדת כמו P2 מניות. תגובת שיקוע Baculovirus עוד יותר מוגבר בתרבות הבולם Sf9 דרך זיהום מתמשך של תאים Sf9 טרי הוסיף בבקבוקון בשייקר עם סרום ללא חרקים תא תרבות בינוני. בסופו של כל מחזור זיהום, רוב התאים הראה אפקט ציטופתי ועם קוטר הסלולר מוגברת של תאים מתים או lysed, אשר הם סימנים עבור השלמת לזיהום baculovirus. Baculovirus מניות ברצף מוגבר עד לנפח הרצוי מתקבל (P3, P4,...). תגובת שיקוע מופרדת מן התאים Sf9 על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה, שטופלו של נוקלאז להפחתת צמיגות, מסונן דרך קרום 0.45 μm, לפני שימוש בריכוז וטיהור והשלבים הבאים.
לטהר baculovirus, תגובת שיקוע מתאי Sf9 הנגוע נטען לתוך עמודה הפארין. העמודה הפארין בהדרגה הופך רווי baculovirus חריפה מאוגד, חלבון מאוגדים באופן רופף מזהמים. העמודה הפארין שוטפים עם מאגר לשטוף כדי להסיר לכלוך ועד העיקול ספיגת אולטרה סגול (UV) (280 ננומטר) מחזירה בסיסית והופך להיות יציב, המציינת את הסרת חומרים באופן רופף המאוגדים והלא מאוגדים מן העמודה. Baculovirus חלקיקים מצד בחוזקה לאגד העמודה הפארין. לכן, אין כמות משמעותית של וירוס מזוהה במאגר שטיפת העמודה. הפארין מכורך baculovirus חלקיקים הם eluted עם 1.5 מ' של נתרן כלורי ב- pH 8.0, 10-fold מדולל עם מאגר כדי להשיג isotonicity למנוע וירוס איון. לשיא חדה של חלבון הוא ציין במהלך • תנאי התואם השבר baculovirus (איור 3). התנאים ממוטב עבור טעינה הדגימה, כביסה • תנאי בשימוש כרומטוגרפיה פרוטוקול השיקום תשואה יותר מ-50% של חלקיקים baculovirus זיהומיות מטוהרים. Supernatants מדולל יותר מרוכז עד 500-fold עם ultracentrifugation, ניסח ב- PBS המכילה 0.5% BSA, אשר מניב של 25% התאוששות נטו11.
איור 1 . תרשים סכמטי על ההפקה ועל טיהור של baculovirus. Sf9 התאים הם נזרע בצלחת תא שטופלו תרבות transfected עם bacmid דנ א. תגובת שיקוע Baculovirus שנקטפו ומשמשת להדביק תאים חדשים Sf9 בתרבות חסיד. תאים נגועים מופצים לאחר מכן בתרבות ללא סרום ההשעיה. תגובת שיקוע Baculovirus שטופלו של נוקלאז, centrifuged, מסוננים. Baculovirus היא מטוהרת על-ידי הפארין כרומטוגרפיית עמודה, מדולל במאגר, מרוכז גילוח ורחיצה כירורגית על-ידי ultracentrifugation. לבסוף, baculovirus supernatant מאוחסן ב- 80 ° c (הדמות כבר ממאמרו של Nasimuzzaman. et al., 2016, מול שם שיטות קלינט ופיתוח 2016; 3: 16071 עם הרשאה.) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . Cytopathic השפעות baculovirus נגוע תאים Sf9. תגובת שיקוע Baculovirus שימש מדביק את התאים Sf9 בצלחת מטופלים תרביות רקמה. חמישה ימים לאחר ההדבקה, התאים היו דמיינו במיקרוסקופ שלב הפוכה. A) תאים Sf9 נגוע פקד. B) Baculovirus נגוע תאים Sf9 מציג ציטופתי. והתאים מוצגים בהגדלה X 200. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . מספר baculovirus זיהומיות ב זרימה דרך במהלך כרומטוגרפיית זיקה הפארין. Baculovirus titers הוערך על ידי זיהום של תאים HT1080. הדגימות שנבדקו היו כולל עמודה. הרצה, לשטוף, eluate. הדגימות היו מדולל לפי הצורך. הקו (כהים יהלומים) מציג יחידות זיהומיות הכולל (IU) baculovirus כל שבר. גודל השבר עמודה זרימה דרך הדגימה ואת שטיפת מאגר היו 40 מ ל כל שפופרת, eluate היה 10 מ ל כל שפופרת. (הדמות כבר ממאמרו של Nasimuzzaman. et al., 2016, מול שם שיטות קלינט ופיתוח 2016; 3: 16071 עם הרשאה.) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול המובאת כאן מתאר את הייצור של baculovirus בתאים Sf9 בתרבות ההשעיה ולטיהור baculovirus באמצעות כרומטוגרפיית זיקה של הפארין. הפרמטרים המשמשים פרוטוקול זה למקסם את התשואה ולצמצם את איון של baculovirus זיהומית. פרוטוקול שסופק כאן מראה שהחלמה משופרת באופן משמעותי של חלקיקים baculovirus לעומת ושחזורים מושגת על-ידי אחרים9.
עקב המארחת רחב טווח ורקמות tropism, נערכו מספר מחקרים ב מערכת העצבים המרכזית, הכבד, עין, השחלה, הערמונית, ו testis עם baculovirus בתיווך גן משלוח5,6,7,8 . וקטורים Baculovirus המכיל גנים טיפוליים, כגון התאבדות גנים, גנים משתיק קול של גידול גנים קידוד אנטיגנים סרטניים ספציפי בהצלחה נערכו בפרה חיה מודלים18,19. למרות baculovirus יכול מגלי תאים אנושיים, זה רק יכול להיות מופצות בתאי חרקים, כתוצאה מכך, אינם מהווים סיכון למחוסנים אנושיים.
Baculovirus מיוצר בתאי חרקים על ידי תרביות תאים ארעית של bacmid ה-DNA. האיכות של bacmid חיוני לייצור כייל גבוה baculovirus. בדרך כלל, bacmid טרייה מבצע יותר טוב אלה מאוחסנים במקרר לתקופה ארוכה של זמן... פעיל גדל Sf9 תאים הם transfected ביעילות המפיקות כייל גבוה baculovirus. במהלך שלב הגברה, זה חשוב למטב את הריכוז תא בתרבות ההשעיה, הנפח של baculovirus supernatant משמש זיהום. אם היחס של baculovirus חלקיקים לתאים אינה אופטימלית, התשואה של baculovirus עשוי להיות נמוך יותר מאשר הצפוי (אישי התצפית, MN).
בעת טעינת את baculovirus supernatant אל העמודה הפארין, חשוב לבדוק את הזרימה דרך עבור חלקיקי וירוס זה עשוי להיות עובר דרך העמודה. במקרה כזה, עמודה התחתון לפעול במהירות עשוי להיות נחוץ או נפח קטן יותר של תגובת שיקוע ייטען לתוך העמודה. רוב מזהמים נוכח supernatants baculovirus הם נשטף במהלך השלב כביסה המרוץ כרומטוגרפיה. הערכנו את הטוהר של baculovirus על ידי צביעת כסף של נתרן dodecyl סולפט (מרחביות)-ג'ל אלקטרופורזה (עמוד) לזיהוי ג'ל, אלקטרון מיקרוסקופיות וללמוד, נמצא כי baculoviruses מטוהרים שלנו הם באיכות טובה12.
יש בקפידה ממוטב התנאים המחייבים ואנו מצא כי המדיום הפארין פורוס הוא מעולה למדיה הפארין אחרים (למשל. HiTrap או האוקספורד הפארין) ביכולתה ללכוד חלקיקים baculovirus (תצפית אישי). היכולת של הפארין לאגד baculovirus-לדוגמה מהירות וקיבולת גבוהה יותר חשוב למזער את זמן העיבוד במורד הזרם תהליך ייצור בקנה מידה גדול. חוץ baculovirus, הפארין בינוני גם נקשר לחלבונים מזהמים אחרים שיש להם זיקה הפארין. רוב לזיהום נמוך משקל מולקולרי ניתן לסלק על-ידי הכללת זרימה וצורניים סינון (TFF) צעד במורד הזרם של כרומטוגרפיה הפארין לרוץ. TFF משמש גם כחלופה צנטריפוגה לרכז את המוצר20.
פרוטוקול זה יכול לשמש ולטיהור חלבונים שיש להם זיקה הפארין ווירוסים אחרים. עם זאת, שינויים בהרכב מאגר רוחצים את • תנאי, קצב הזרימה ייתכן שתידרש.
ייצור חלבון רקומביננטי עובד היטב באמצעות supernatants baculovirus ולזרימה ישירות. לכן, baculovirus גסה יכול לשמש לייצור חלבון רקומביננטי. עם זאת, אם baculoviruses משמשים כמו וקטור ויוו העברה גנטית, או כמו חיסון, טיהור נוספים כגון גזים, סינון ג'ל ו/או ultracentrifugation נדרשות פעולות להשיג baculovirus טהור ומרוכז חלקיקים ולצמצם את המפיק תא, תרבות המדיה-נגזר זיהומים כדי למנוע רעילות, דלקת, תגובה חיסונית.
לסיכום, תארנו פרוטוקול פשוט על ההפקה ועל טיהור של baculovirus אשר יכול להיות קנה המידה-up עבור ייצור חומרים, חיסונים, טיפול גנטי וקטורים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי סטארט-אפ המימון של קרן המחקר (CCRF סינסינטי ילדים) ועד M.N. נתמך על ידי המרכז הלאומי עבור קידום מדעי Translational של מכוני הבריאות הלאומיים תחת גרנט הליבה החדשנית (ICG) פרס TR001425 UL1 מספר. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
- Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
- Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
- Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
- Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
- Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
- Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
- Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
- Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
- Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
- Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
- Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).
