Summary
In questo protocollo, baculovirus è prodotta dalla trasfezione transiente del baculovirus plasmide nelle cellule Sf9 e amplificato in una coltura di sospensione serum-free. Il supernatante è purificato mediante cromatografia di affinità di eparina e ulteriormente concentrato mediante ultracentrifugazione. Questo protocollo è utile per la produzione e purificazione di baculovirus per applicazione di terapia genica.
Abstract
Baculovirus è stato tradizionalmente utilizzato per la produzione di proteine ricombinanti e vaccino. Tuttavia, più recentemente, baculovirus sta emergendo come un vettore promettente per applicazioni di terapia genica. Qui, baculovirus è prodotto dalla trasfezione transiente del baculovirus plasmide DNA (bacmid) in una coltura aderente delle cellule Sf9. Baculovirus è successivamente ampliato in Sf9 cellule in una coltura di sospensione serum-free fino ad ottenuta il volume desiderato. Viene quindi purificata dal surnatante mediante cromatografia di affinità di eparina della cultura. Surnatante virus viene caricato sulla colonna di eparina che lega le particelle baculovirus nel surnatante a causa dell'affinità di eparina per baculovirus avvolgono glicoproteina. La colonna viene lavata con un tampone per rimuovere i contaminanti e baculovirus è eluiti dalla colonna con un buffer del alto-sale. L'eluato viene diluito ad una concentrazione salina isotonica e particelle di baculovirus sono ulteriormente concentrato mediante ultracentrifugazione. Utilizzando questo metodo, baculovirus può essere concentrato fino a 500-fold con un 25% di recupero di particelle infettive. Sebbene il protocollo descritto qui di seguito viene illustrato la produzione e purificazione del baculovirus da culture fino a 1 L, il metodo possa essere scalati fino in una cultura di sospensione sistema chiuso per la produzione di un vettore di uso clinico per applicazione di terapia genica.
Introduction
Baculovirus è utilizzata principalmente per la produzione di proteine ricombinanti e vaccini in lepidottero Spodoptera fugiperda (Sf) 9 cellule di insetto utilizzando ricombinante virus di virus della poliedrosi nucleare di Autographa californica (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. più di recente, sta emergendo come un vettore promettente per la terapia genica applicazione5. Esso è noto per avere un ampio tropismo host e tessuto, infetta le cellule proliferanti sia quiescente, è non patogeni e non integrare l'host del cromosoma4,5,6. Inoltre, baculovirus può essere prodotto nella coltura di sospensione serum-free che è scalabile e consente per sistema chiuso di elaborazione per la futura produzione clinica1.
La purezza del baculovirus particelle è importante per il raggiungimento di trasduzione efficace riducendo al minimo la citotossicità7,8,9. Baculovirus possono essere concentrati di ultracentrifugazione o filtrazione a flusso tangenziale (TFF) con impatto limitato sulla sua infettività. Tuttavia, queste procedure non solo concentrano le particelle del virus ma anche detriti cellulari e proteine da Sf9 cultura, che può essere tossico in vitro (osservazione personale) e possono indurre l'infiammazione o una risposta immunitaria quando utilizzato in vivo. Per evitare questo, soprattutto quando utilizzando altamente concentrato scorte di virus, baculovirus infettivi deve essere purificato e separati da particelle contaminanti.
Diversi metodi sono stati segnalati per la purificazione e la concentrazione di baculovirus vettori10,11,12. Degli approcci disponibili, cromatografia di affinità di eparina consente un elevato livello di singolo-passaggio di purificazione con la bassa concentrazione di contaminanti proteine12. Il metodo si basa sull'identificazione del solfato di heparan come il recettore per baculovirus13,14. Dopo il caricamento Sf9 surnatante di cella nella colonna e associazione di baculovirus, la colonna può essere lavata con fisiologica (isotonica) buffer per rimuovere particelle contaminanti vagamente associate o non associate. Poiché l'associazione di eparina è rovesciabile, baculovirus particelle possono essere eluite con un tampone salino elevato, che è immediatamente diluito alla concentrazione fisiologica di sale (isotonica) per evitare che l'inattivazione di shock osmotico12. Inoltre, la produzione di baculovirus, nonché acquisizione su e l'eluizione dalla colonna cromatografia, può essere eseguita utilizzando un processo di sistema chiuso che è compatibile con le attuali pratiche di buona fabbricazione (cGMP).
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per la fabbricazione, la purificazione e la concentrazione di baculovirus infettivi mediante centrifugazione e cromatografia di affinità. Brevemente, produciamo baculovirus mediante trasfezione di cellule Sf9 con un DNA plasmidico baculovirus nella cultura aderente e ampliare ulteriormente il baculovirus infettivi nella coltura di sospensione serum-free. Dobbiamo purificare baculovirus mediante cromatografia di affinità di eparina e usare ultracentrifugazione come il passaggio finale per altamente concentrato il vettore per applicazione di terapia genica.
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Protocol
Vedere la Figura 1 per un'illustrazione che riassume il protocollo.
1. purificazione di DNA plasmidico di Baculovirus
- Crescere la coltura batterica che contiene baculovirus plasmide DNA (bacmid)14 in 200 mL di brodo LB con antibiotici; kanamicina (50 µ g/mL), tetraciclina (10 µ g/mL) e gentamicina (7 µ g/mL), per 16 h a 37 ° C su un'impostazione di agitatore orbitale a 300 giri/min.
- Purificare il DNA bacmid dalla coltura batterica mediante Lisi alcalina standard protocollo15e sciogliere il bacmid nel buffer di TE.
2. produzione di Baculovirus
- Cellule di cultura Sf9 in un incubatore agitatore orbitale a 135 giri/min e 28 ° C in un matraccio di Erlenmeyer contenente terreno di coltura privo di siero insetto1,2,3di policarbonato.
Nota: Se le cellule Sf9 sono scongelate da azione congelate, consentire almeno due settimane per le cellule di recuperare e immettere la fase esponenziale di crescita. - Contare le celle Sf9 raccolte alla fase esponenziale di crescita con un emocitometro dopo colorazione con Trypan blue. Semi di 1 x 106 cellule Sf9 vitali per pozzetto di una piastra di coltura del tessuto-trattati di 6 pozzetti in 2 mL di terreno. Consentire la cella di allegare per 1 h a 28 ° C in un incubatore.
- Sostituire il mezzo di crescita con 1 mL di mezzo di coltura di privo di siero senza aggiunte Grace insetto.
- Transfect il bacmid del DNA nelle cellule Sf9 utilizzando il reagente di transfezione delle cellule di insetto.
- Mix 8 µ l di reagente transfezione delle cellule di insetto con 100 µ l di medium di insetto di grazia.
- Diluire 2 µ g di DNA di bacmid in 100 µ l di terreno di insetto senza aggiunte e mescolare delicatamente nel Vortex.
- Combinare il DNA diluito con il reagente di transfezione delle cellule di insetto diluito e mescolare delicatamente. Incubare per 15-30 min a temperatura ambiente.
- Aggiungere la miscela di DNA-lipidico goccia a goccia sulle celle. Incubare a 28 ° C in un incubatore per circa 5 h.
- Rimuovere la miscela di transfezione dalle cellule e lavare le cellule con 2 mL di PBS.
- Aggiungere 2 mL di terreno di coltura dell'insetto e continuare a cultura a 28 ° C in un incubatore senza modificare i media.
Nota: Se il bacmid contiene una proteina fluorescente, sua espressione può essere rilevato in cellule 48h post-di transfezione. Baculovirus è prodotto da cellule trasfettate Sf9 e secreta nel terreno di coltura che successivamente infetta le cellule untransfected. La popolazione intera cella si infetta con baculovirus in 5 giorni e mostra segni di infezione virale, chiamato anche effetto citopatico. Questi includono il diametro aumentato delle cellule, granuli di vacuoli nel citoplasma, cessazione della crescita delle cellule e cellule morte o lisate sono presenti nella coltura delle cellule. Tuttavia, se l'efficienza di trasfezione o infezione non è ottima, la cultura non produca un effetto citopatico ovvio. L'effetto citopatico può essere visualizzato con un microscopio invertito di fase a 200-400 ingrandimenti. Cellulare baculovirus infettata può essere rilevato mediante colorazione con anticorpo di anti-gp6411. - Vendemmia baculovirus surnatante 5 giorni dopo trasfezione ed etichetta come lo stock di virus1 P.
- Conservare il surnatante, baculovirus che è sensibile alla luce, al buio con 0,5% albumina di siero bovino (BSA) in PBS. Conservare a 4 ° C per a breve termine (fino a 90 giorni) o a-80 ° C per il lungo termine.
- 6 × 106 Sf9 celle in una piastra di coltura del tessuto-trattati di 10 cm in 10 mL di terreno di coltura dell'insetto del seme. Aggiungere 1 mL di surnatante di baculovirus iniziale (P1) per le cellule.
- Raccogliere il surnatante baculovirus (P2) alle 5th giorno dopo l'infezione.
- Seme 50ml di Sf9 cellule (3 x 106 cellule/mL) nella coltura di sospensione nel terreno di coltura dell'insetto in un policarbonato 250 mL flacone erlenmeyer e posto il matraccio in un incubatore agitatore orbitale. Aggiungere 2 mL di brodo2 P per le cellule e agitare a 135 giri/min, mantenendo una temperatura costante di 28 ° C.
Nota: Tre o quattro giorni dopo l'infezione, l'intera popolazione cellulare Sf9 mostrerà l'effetto citopatico, che è un'indicazione di produzione di alto-titolo baculovirus. - In sequenza amplificare i surnatanti di baculovirus fino ad ottenere il volume desiderato (P3,4,...) aumentando 10 a 50 volte volume della coltura delle cellule in ogni successiva infezione.
Nota: P3 è 3rd tondo dell'infezione in cui 500 mL in 1 L di Sf9 coltura cellulare può essere infettato con 10-20 mL di P2 baculovirus surnatante; P4 è il 4th rotondo dell'infezione in cui 5 a 10 L di Sf9 coltura cellulare può essere infettato con 100-200 mL di surnatante di baculovirus3 P e così via. In genere, Sf9 cellule sono seminate a 3 × 106 cellule/mL in terreni di coltura privo di siero dell'insetto. - Centrifugare il baculovirus surnatante a 1.000 x g per 30 min a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari e trattare il baculovirus surnatante con nucleasi 50 unità/mL (250 unità / µ l di brodo) per 2 h a 37 ° C per digerire il RNA e del DNA genomico. Filtrare i surnatanti attraverso un'unità di filtrazione di 0,45 μm.
3. preparazione del sistema di cromatografia
- Preparare il sistema di cromatografia risciacquando in sequenza linee campione e buffer ogni con acqua sterile, 1 N di idrossido di sodio, acqua e lavare il buffer (20 mM sodio fosfato tampone contenente cloruro di sodio 150 mM, pH 7,0) ad un flusso lineare di 50 mL/min.
- Preparare una colonna di eparina 50 µm (10 × 10 cm, 7,9 mL di volume di colonna (CV)) eseguendo in sequenza colonna pulizia tampone (5 CV sterile 20 mM sodio fosfato tampone contenente cloruro di sodio 2 M, pH 7.0) e tampone di lavaggio 5 CV ad un flusso lineare di 7 mL/min.
4. purificazione di Baculovirus vettoriale
- Impostare il sistema di cromatografia come segue:
- Utilizzare il porta di ingresso per il caricamento del baculovirus surnatante di carico del campione.
- Utilizzare la porta di ingresso di buffer A1 per il caricamento del tampone di lavaggio. Preparare un biberon con almeno 500 mL di tampone di lavaggio e posizionare la linea di tampone di lavaggio nella bottiglia.
- Utilizzare la porta di ingresso A2 di buffer per il caricamento del buffer di eluizione (fosfato di sodio di 20 mM con 1,5 M cloruro di sodio, pH 8.0). Preparare un biberon con almeno 500 mL di tampone di eluizione e posizionare la linea di buffer di eluizione nella bottiglia.
- Inserire il collettore di frazione per raccogliere la colonna pass-through baculovirus surnatante, il tampone di lavaggio e il baculovirus eluiti diverse provette coniche da 50 mL.
- Equilibrare la colonna di eparina con volumi di colonna (CVs) di cinque 7,9 mL di tampone di lavaggio (40 mL) ad un flusso lineare di 7,0 mL/min.
- Caricare 250 mL di surnatante sulla colonna di eparina utilizzando la pompa di campionamento (pozzetto campione di ingresso) del sistema di cromatografia ad un flusso lineare di 2,0 mL/min di baculovirus.
- Eseguire 10 CVs (80 mL) di tampone di lavaggio attraverso la colonna di eparina ad un flusso lineare di 2,0 mL/min fino a quando la curva di assorbanza (UV) ultravioletta (280 nm) è ritornato ai valori basali e diventa stabile.
- Eluire le particelle di baculovirus dalla colonna di eparina 7,9 mL con 5 CVs (40 mL) di tampone di eluizione ad un flusso lineare di 4,0 mL/min orologio per un picco di eluizione taglienti della proteina sul cromatogramma, quando le particelle di baculovirus dissociano dalla colonna di eparina.
- Post-eluizione, diluire immediatamente il supernatante di baculovirus eluiti 10 volte utilizzando 20 mM di tampone fosfato di sodio in acqua per evitare che l'inattivazione di baculovirus particelle da shock osmotico durante la successiva centrifugazione.
- Archivio 100 µ l di ciascuna delle frazioni, tra cui il flusso-attraverso la colonna raccolti durante il caricamento del surnatante baculovirus, il tampone di lavaggio e l'eluato. Infettare queste frazioni di baculovirus per HT1080 per valutare il processo di purificazione (Vedi sezione 6).
- Pulire la colonna con colonna buffer e tampone di lavaggio di pulizia. Infine, lavare la colonna con 5 CV sterile 20% di etanolo in acqua ad un flusso lineare di 7,0 mL/min e conservare a 4 ° C.
- Pulire il sistema di cromatografia con acqua, idrossido di sodio 1 N nuovo con acqua e 20% di etanolo in acqua ad un flusso lineare di 50,0 mL/min e conservare il sistema in etanolo al 20%.
5. concentrazione di Baculovirus
- Pre-sterilizzare provette da centrifuga utilizzando un'autoclave. Aggiungere un volume uguale di baculovirus surnatante ogni ultracentrifuga provette in una cappa di coltura del tessuto. Misurare il peso del tubo da un equilibrio e regolare il peso del contenuto dei tubi ultracentrifuga con PBS sterile.
- Posizionare ciascuna delle provette ultracentrifuga opponendosi a benna del rotore SW 32 Ti.
- Eseguire l'ultracentrifuga a 80.000 × g per 90 min a 4 ° C.
- Aprire le provette ultracentrifuga in una cappa di coltura del tessuto e asetticamente aspirare il liquido senza rimuovere il pellet di baculovirus.
- Risospendere il pellet di ogni tubo pipettando energicamente su e giù con 200 µ l di PBS contenente 0.5% (w/vol) BSA.
- Trasferire i baculovirus concentrato per cryovials (50 a 100 µ l per flaconcino) e conservare a-80 ° C.
6. titolazione di Baculovirus
- Il giorno prima dell'infezione, conta cellule HT1080 utilizzando un emocitometro dopo la macchiatura delle celle con Trypan blu. Semi di 1 x 105 HT1080 cellule per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 2 mL dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS). Seme diversi pozzi aggiuntive per essere in grado di determinare l'esatto numero di cellule presenti al momento dell'infezione. Coltura le cellule in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
Nota: Cellule HT1080 vengono utilizzate per la titolazione come essi esprimono un livello superiore di eparan solfato rispetto ad altri la cella linee16. Poiché le cellule HT1080 sono aderenti, la titolazione è più semplice e richiede meno tempo rispetto all'utilizzo la titolazione Sf9-base tradizionale. - Il giorno di infezione, è necessario determinare il numero di cellule per pozzetto contando le cellule da pozzi. Infettare le cellule aggiungendo il baculovirus diluito originale che era stato messo da parte prima di purificazione di colonna e con i campioni dal flusso-attraverso la colonna, lavare e frazioni di eluizione. Per ogni campione, determinare la diluizione e il volume empiricamente basato su particelle infettive baculovirus e infettare ogni pozzetto in triplice copia.
- Due giorni dopo l'infezione, analizzare le cellule per l'espressione del gene di interesse. Le cellule possono essere analizzate utilizzando un citometro a flusso, se esprimono una proteina fluorescente (per esempio GFP)17.
- Calcolare i titoli (infettive unità / mL) basati sul numero di cellule presenti al momento dell'infezione, il fattore di diluizione e percentuali di proteina fluorescente nelle celle utilizzando la formula: (numero di cellule durante infezione × percentuale di proteina fluorescente fattore di diluizione di cellule positive ×) / volume di baculovirus in mL.
Nota: Ad esempio, se il numero totale di cellule per pozzetto al momento dell'infezione è 1,2 × 105, la percentuale di proteina fluorescente è 5%, il fattore di diluizione è 100 e il volume di baculovirus diluito aggiunto è di 10 µ l, il titolo è 6 × 107 unità infettive (IU) / ml.
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Representative Results
Il protocollo presentato è in un diagramma di flusso (Figura 1). Passaggi includono la trasfezione transiente di cellule Sf9 con bacmid DNA per produrre baculovirus in cultura aderente in un piatto, l'amplificazione successiva nella coltura di sospensione serum-free, trattamento di nucleasi e chiarificazione mediante centrifugazione e filtrazione, e la purificazione mediante cromatografia di affinità di eparina seguita da concentrazione con ultracentrifugazione.
Dopo lo scongelamento, Sf9 le cellule hanno bisogno di almeno due settimane per recuperare ed entrando nella fase esponenziale di crescita. Attivamente crescente Sf9 cellule transfected con bacmid del DNA nella cultura aderente. Due giorni dopo la trasfezione, espressione di baculovirus glicoproteine busta, gp64 viene rilevato e successivamente, baculovirus produzione è iniziata11. Poiché baculovirus è replica competente, il numero delle cellule infettate aumenta gradualmente a causa di un'infezione progressiva delle cellule con la nuova produzione baculovirus che viene secreto nel mezzo di crescita. Baculovirus contenente i surnatanti delle cellule sono raccolte 5 giorni dopo la trasfezione quando ha infettata la popolazione intera cella. Questo virus iniziale surnatante viene designato come passaggio 1 (P1) stock. Lo stock di1 P viene utilizzato per la successiva infezione di una cultura appena seminata aderente delle cellule Sf9 in una piastra più grande. La popolazione intera cella Mostra segni di infezione in 5 giorni che si chiama effetto citopatico (Figura 2). Il surnatante da coltura delle cellule aderenti secondo viene raccolto e viene designato come stock2 P. Baculovirus supernatante viene ulteriormente amplificato nella coltura di sospensione Sf9 con l'infezione in corso delle celle Sf9 appena aggiunte in una boccetta di shaker con mezzo di coltura privo di siero insetto cellulare. Alla fine di ogni ciclo di infezione, la maggior parte delle cellule mostrano l'effetto citopatico con un diametro cellulare e cellule morte o lisate, che sono segni per il completamento dell'infezione di baculovirus. Stock in baculovirus è amplificato in modo sequenziale fino ad ottenere il volume desiderato (P3,4,...). Il supernatante è separato dalle cellule Sf9 mediante centrifugazione a bassa velocità, trattati con una nucleasi per ridurre la viscosità, filtrata attraverso una membrana di 0,45 μm, prima di essere utilizzato nei passaggi successivi di purificazione e concentrazione.
Per purificare baculovirus, surnatante da cellule infettate Sf9 è caricato su una colonna di eparina. La colonna di eparina gradualmente diventa saturo di baculovirus fortemente associato e vagamente associato proteine contaminanti. La colonna di eparina è risciacquata con tampone di lavaggio per rimuovere i contaminanti fino a quando la curva di assorbanza (UV) ultravioletta (280 nm) ritorna ai valori basali e diventa stabile, che indica la rimozione di materiali non legati e debolmente legati dalla colonna. Baculovirus particelle d'altra parte si legano fortemente alla colonna di eparina. Di conseguenza, nessuna significativa quantità di virus viene rilevata nel tampone di lavaggio di colonna. Associato a eparina baculovirus particelle vengono eluite con 1.5 M di cloruro di sodio a pH 8.0 e diluita 10 volte con buffer per raggiungere isotonicità ed impedire l'inattivazione di virus. Un picco acuto della proteina è osservato durante l'eluizione che corrisponde alla frazione di baculovirus (Figura 3). Le condizioni ottimizzate per eluizione, lavaggio e caricamento del campione utilizzato in questo recupero della resa più del 50% del protocollo cromatografia di baculovirus infettivi purificati particelle. Sovranatante diluiti sono ulteriormente concentrati fino a 500-fold con ultracentrifugazione e formulati in PBS contenente 0.5% di BSA, che produce un netto recupero di 25%11.
Figura 1 . Diagramma schematico per la produzione e purificazione di baculovirus. SF9 cellule sono seminate nella piastra di coltura-trattati delle cellule transfettata con bacmid DNA. Baculovirus surnatante è raccolta ed usata per infettare nuove cellule Sf9 nella cultura aderente. Cellule infette sono successivamente propagate nella coltura di sospensione serum-free. Baculovirus surnatante è trattata con una nucleasi, centrifugato e filtrato. Baculovirus è purificato mediante cromatografia su colonna di affinità dell'eparina, diluito in un tampone e concentrato asetticamente mediante ultracentrifugazione. Infine, baculovirus surnatante è conservato a-80 ° C. (Nella figura è stata adattata da Nasimuzzaman et al., 2016, Mol Ther metodi Clin dev. 2016; 3: 16071 con permesso.) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Gli effetti citopatici di baculovirus Sf9 cellule infettate da. Baculovirus surnatante è stato utilizzato per infettare le cellule Sf9 in una piastra di coltura del tessuto trattata. Cinque giorni dopo l'infezione, le cellule sono state visualizzate con un microscopio invertito di fase. A) cellule non infette Sf9 come controllo. B) Baculovirus infettati Sf9 cellule che mostrano l'effetto citopatico. Le cellule sono indicate a 200 ingrandimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Il numero di baculovirus infettivi in flusso continuo durante la cromatografia di affinità eparina. Baculovirus titoli sono stati stimati dall'infezione di cellule HT1080. Campioni testati erano inclusi Run-in colonna, lavare ed eluato. I campioni sono stati diluiti secondo le necessità. La linea (scuro diamanti) Mostra il totale unità infettive (IU) di baculovirus in ogni frazione. La dimensione di frazione di colonna flusso-attraverso il campione e il tampone di lavaggio erano 40 mL in ogni provetta, ed eluito era 10 mL in ciascun tubo. (Nella figura è stata adattata da Nasimuzzaman et al., 2016, Mol Ther metodi Clin dev. 2016; 3: 16071 con permesso.) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo presentato qui descrive la produzione di baculovirus in Sf9 cellule in coltura in sospensione e purificazione di baculovirus utilizzando una cromatografia di affinità di eparina. I parametri utilizzati in questo protocollo massimizzare il rendimento e ridurre al minimo l'inattivazione di baculovirus infettivi. Il protocollo fornito qui indica che un recupero significativamente migliorato di baculovirus particelle rispetto ai recuperi realizzato da altri9.
A causa di tropismo di host ampia gamma e tessuto, diversi studi sono stati condotti nel sistema nervoso centrale, fegato, occhio, ovaia, prostata e testicolo con baculovirus-mediata del gene consegna5,6,7,8 . Baculovirus vettori contenenti geni terapeutici, quali geni suicidi, geni oncosoppressori e geni codifica antigeni tumore-specifici sono stati condotti con successo in studi preclinici18,19modelli animali. Anche se baculovirus possono trasdurre cellule umane, può solo essere propagato in cellule di insetto e, di conseguenza, non rappresentano un rischio per i destinatari umani.
Baculovirus è prodotto nelle cellule di insetto mediante trasfezione transitoria di bacmid del DNA. La qualità del bacmid è fondamentale per la produzione di alto-titolo baculovirus. In genere, preparata al momento bacmid esegue meglio di quelli sono conservati in frigorifero per un lungo periodo di tempo. Attivamente crescente Sf9 celle transfected in modo efficiente che producono alto-titolo baculovirus. Durante la fase di amplificazione, è importante ottimizzare la concentrazione di cellule in coltura di sospensione e il volume del surnatante baculovirus usati per l'infezione. Se il rapporto di baculovirus particelle alle cellule non è ottimo, la resa di baculovirus può essere inferiore al previsto (osservazione personale, MN).
Durante il caricamento il baculovirus surnatante sulla colonna di eparina, è importante controllare il flusso continuo per particelle di virus che potrebbe essere passando attraverso la colonna. In questo caso, una colonna inferiore velocità di esecuzione può essere necessaria o più piccolo volume del surnatante deve essere caricato sulla colonna. La maggior parte dei contaminanti presenti nei surnatanti baculovirus vengono lavata via durante la fase di lavaggio della corsa cromatografia. Abbiamo valutato la purezza del baculovirus dalla macchiatura d'argento di sodio dodecil solfato (SDS)-gel di elettroforesi (pagina) del gel di poliacrilammide al microscopio elettronico studio e trovato che la nostra purificate Baculoviridae sono di buona qualità12.
Abbiamo attentamente ottimizzate le condizioni di associazione ed abbiamo trovato che il mezzo di eparina POROS è superiore ad altri mezzi di comunicazione di eparina (ad es. HiTrap o Capto eparina) nella sua capacità di catturare particelle di baculovirus (osservazione personale). La capacità dell'eparina di legare baculovirus alle più alte velocità del campione e capacità è importante ridurre al minimo il tempo di elaborazione a valle per il processo di produzione su larga scala. Oltre a baculovirus, medie di eparina si lega anche altre proteine contaminanti che hanno un'affinità per l'eparina. La maggior parte della contaminazione a basso peso molecolare può essere eliminata inserendo un passaggio di filtrazione (TFF) flusso tangenziale a valle della cromatografia di eparina eseguita. TFF è anche utilizzato come un'alternativa alla centrifugazione per concentrare il prodotto20.
Questo protocollo può essere usato per la purificazione di altri virus e proteine che hanno un'affinità per l'eparina. Tuttavia, le modifiche nella composizione di tampone di lavaggio ed eluizione e la portata possono essere richieste.
Produzione di proteine ricombinanti funziona bene utilizzando impura baculovirus surnatanti direttamente. Di conseguenza, baculovirus grezzo può essere utilizzato per la produzione di proteine ricombinanti. Tuttavia, se Baculoviridae sono utilizzati come vettore di trasferimento del gene in vivo , o come un vaccino, fasi di purificazione supplementare come cromatografia, gel filtrazione e/o ultracentrifugazione sono necessari per ottenere baculovirus puri e concentrati particelle e ridurre al minimo le impurità derivate dal cellulare e terreni di coltura produttore per evitare la tossicità, l'infiammazione e una risposta immunitaria.
In conclusione, abbiamo descritto un semplice protocollo per la produzione e purificazione di baculovirus che può essere su vasta scala per la produzione di proteine ricombinanti, vaccini e vettori di terapia genica.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto in parte attraverso il finanziamento di Start-up da di Cincinnati Children ' s Research Foundation (CCRF) a M.N. e innovativo Core Grant (ICG) supportato dal centro nazionale per le scienze traslazionale avanzando dei National Institutes of Health, sotto Premio numero UL1 TR001425. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
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