Summary
Bu protokol için baculovirus baculovirus plazmid geçici transfection Sf9 hücreleri tarafından üretilen ve bir serum serbest süspansiyon kültürde güçlendirilmiş. Süpernatant heparin benzeşme Kromatografi tarafından saf ve ultrasantrifüj tarafından daha da yoğunlaştı. Bu iletişim kuralı üretim ve baculovirus gen terapisi uygulama için arıtma için yararlıdır.
Abstract
Baculovirus geleneksel olarak rekombinant protein ve aşı üretimi için kullanılmıştır. Ancak, son zamanlarda, baculovirus gen terapisi uygulama için umut verici bir vektör olarak ortaya çıkıyor. Burada, baculovirus bir yapisan Sf9 hücre kültüründe baculovirus plazmid DNA (bacmid) geçici transfection tarafından üretilir. İstenen ses elde edilir kadar Baculovirus daha sonra serum serbest süspansiyon kültür Sf9 hücrelerde genişletilir. Sonra kültür heparin benzeşme Kromatografi kullanarak süpernatant saf. Virüs süpernatant glikoprotein baculovirus örtmek için baculovirus parçacıklar süpernatant heparin yakınlık nedeniyle içinde bağlar heparin sütun yüklenir. Sütun kirletici kaldırmak için bir tampon ile yıkanır ve baculovirus ile bir yüksek-tuz arabellek sütundan eluted. Eluate izotonik bir tuz konsantrasyonu seyreltilmiş ve baculovirus parçacıkları daha fazla ultrasantrifüj kullanarak yoğunlaşmıştır. Bu yöntemi kullanarak, baculovirus bulaşıcı parçacıklar % 25 kurtarma ile ilâ 500-fold konsantre olabilir. Burada açıklanan protokol 1 L kültürlerden üretim ve baculovirus arınma gösterir rağmen yönteminin ölçekli-klinik-grade vektör gen terapisi uygulama için üretmek için bir kapalı sistem süspansiyon kültür up.
Introduction
Baculovirus öncelikle rekombinant proteinler ve Lepidoptera Spodoptera fugiperda (Sf) 9 aşı üretimi için kullanılan rekombinant Autographa californica multicapsid nükleer polyhedrosis virüs (AcMNPV) kullanarak böcek hücreleri 1 , 2 , 3 , 4. son zamanlarda, gen terapisi uygulama5için umut verici bir vektör olarak ortaya çıkıyor. Bu geniş bir ev sahibi ve doku tropism sahip olduğu bilinmektedir, durgun ve Proliferasyona hücreleri bozar patojenik olmayan ve ana bilgisayar kromozom4,5,6entegre değil. Ayrıca, ölçeklenebilir ve kapalı sistem için gelecekteki klinik üretim1işlemek sağlar süspansiyon serum serbest kültür baculovirus üretilebilir.
Baculovirus parçacıklar saflığı sitotoksisite7,8,9en aza indirirken etkili iletim ulaşmak için önemlidir. Baculovirus ultrasantrifüj veya teğet akışı filtrasyon (TFF) onun infektivite üzerinde sınırlı etkisi ile konsantre. Ancak, bu işlemler sadece virüs parçacıkları konsantre aynı zamanda hücre artıkları ve proteinlerin Sf9 gelen Kültür, hangi-ebilmek var olmak zehirli vitro (kişisel gözlem) ve iltihap veya bir bağışıklık kullanıldığında yanıt neden olabilir vivo içinde. Bu, özellikle yüksek kullanarak virüs stokları konsantre önlemek için bulaşıcı baculovirus saflaştırılmış ve parçacıklar kirletici ayrılmış gerekir.
Birkaç yöntem arıtma ve toplama baculovirus vektörler10,11,12için rapor edilmiştir. Kullanılabilir yaklaşımlar, heparin benzeşme Kromatografi tek adımlı bir üst düzey arıtma proteinler12kirletici düşük konsantrasyon ile sağlar. Yönteminin kimliği heparan sülfat ile reseptör baculovirus13,14dayanmaktadır. Sf9 hücre süpernatant üstüne belgili tanımlık sütun ve baculovirus bağlama yükledikten sonra sütun ilişkisiz veya gevşek bağlı bulaşıcı parçacıkları kaldırmak için fizyolojik (izotonik) arabellek ile yıkanabilir. Heparin bağlama tersinir olduğundan, baculovirus parçacıklar hemen inactivation önlemek için fizyolojik (izotonik) tuz konsantrasyonu için ozmotik şok12ile seyreltilmiş yüksek bir salt arabellek ile eluted. Ayrıca, üretim baculovirus yanı sıra üzerinde yakalama ve elüsyon Kromatografi sütundan yapılabilir mevcut iyi üretim uygulamaları (cGMP) ile uyumlu olan bir kapalı sistem işlemi kullanarak.
Burada, biz üretim, arıtma ve bulaşıcı baculovirus benzeşme Kromatografi ve Santrifüjü kullanarak konsantrasyon için detaylı bir protokol sağlar. Kısaca, baculovirus ile transfection Sf9 hücre yapisan kültür baculovirus plazmid DNA ile üretmek ve daha fazla serum serbest süspansiyon kültürü bulaşıcı baculovirus genişletin. Heparin benzeşme Kromatografi kullanarak baculovirus arındırmak ve ultrasantrifüj vektör gen terapisi uygulama için son derece konsantre için son adım olarak kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokolü özetleyen bir örnek için bkz: şekil 1 .
1. Baculovirus plazmid DNA saflaştırılması
- Bakteriyel kültür baculoviral plazmid DNA (bacmid)14 200 ml LB suyu antibiyotik içeren büyümek; sefaloridin (50 µg/mL), tetrasiklin (10 µg/mL) ve viomisin (7 µg/mL), orbital Çalkalayıcı ayarını 300 rpm'de 37 ° C'de 16 h için.
- Standart alkalin lizis protokolü15kullanarak bakteriyel kültüründen DNA bacmid arındırmak ve bacmid TE arabelleği geçiyoruz.
2. Baculovirus imalatı
- Kültür Sf9 orbital Çalkalayıcı kuluçka 135 devir/dakika ve 28 ° C'de bir polikarbonat Erlenmeyer şişe serum içermeyen böcek kültür orta1,2,3içeren hücrelerde.
Not: Sf9 hücreleri donmuş stoktan çözdürülen hücrelere yeniden elde etmek ve üstel büyüme aşaması girmek için en az iki hafta izin vermesi. - Üstel büyüme bir hemasitometre ile Trypan mavi ile boyama sonra aşaması, hasat Sf9 hücreleri saymak. 1 x 106 Sf9 hücrelerin 6-iyi doku kültürü tedavi tabakta orta 2 ml bir kuyu başına tohum. Hücre bir kuluçka 28 ° C'de 1 h için eklemek için izin verir.
- Büyüme orta ile 1 mL serum-Alerjik unsupplemented Grace'in böcek kültür orta yerine.
- Böcek hücre transfection reaktif kullanarak Sf9 hücre içine bacmid DNA transfect.
- Mix 8 µL böcek hücre transfection reaktif Grace'in böcek orta 100 µL ile.
- Bacmid DNA unsupplemented böcek orta 100 µL içine 2 µg sulandırmak ve karışımı yavaşça vortexing tarafından.
- Seyreltilmiş DNA seyreltilmiş böcek hücre transfection reaktif ile birleştirmek ve karışımı yavaşça. 15-30 dakika oda sıcaklığında için kuluçkaya.
- Dropwise hücreleri üzerine DNA-lipid karışımı ekleyin. Yaklaşık 5 h için bir kuluçka 28 ° C'de kuluçkaya.
- Transfection karışımı hücrelerdeki kaldırmak ve PBS 2 mL hücrelerle yıkayın.
- Böcek kültür orta 2 mL ekleyin ve kültür bir kuluçka 28 ° C'de medya değiştirmeden devam ediyor.
Not: Bacmid floresan bir protein içeriyorsa, onun ifade hücreleri 48 saat sonrası transfection içinde tespit edilebilir. Baculovirus transfected Sf9 hücreleri tarafından üretilen ve daha sonra untransfected hücreleri bozar kültür orta salgılanan. Tüm hücre nüfus baculovirus ile 5 gün içinde enfekte olur ve cytopathic etkisi olarak da adlandırılan viral enfeksiyon belirtileri gösterir. Bu artan hücre çapı içerir, çarpıtmalar/granül sitoplazma, hücre büyümesini kesilmesi ve ölü ya da lysed hücreleri hücre kültüründe mevcut. Ancak, transfection veya enfeksiyon verimliliği en uygun değilse, kültür açık bir cytopathic etkisi göstermeyebilir. Cytopathic etkisi ile 200-400 X büyütme, bir ters faz mikroskobu görüntülenmeyecektir. Enfekte Baculovirus hücre anti-gp64 antikor11ile boyama tarafından tespit edilebilir. - Baculovirus süpernatant 5 gün P1 virüs stok olarak transfection ve etiket sonra hasat.
- Karanlıkta % 0.5 sığır serum albumin (BSA) ile ışığa duyarlı olan baculovirus süpernatant, PBS içinde saklayın. Kısa süreli (en fazla 90 gün) için 4 ° C'de veya uzun vadeli için-80 ° C'de depolayın.
- Tohum 6 × 106 Sf9 hücreleri doku kültürü tedavi bir 10 cm tabak içinde böcek kültür ortamının 10 mL. İlk baculovirus süpernatant (P1) 1 mL hücrelere ekleyin.
- Baculovirus süpernatant (2P) 5inci gün sonrası enfeksiyon, hasat.
- Tohum 50 mL süspansiyon kültür 250 mL polikarbonat Erlenmeyer flask böcek kültür ortamında Sf9 hücrelerinde (3 x 106 hücre/mL) ve yer bir orbital Çalkalayıcı kuluçka şişeye. P2 stokunun 2 mL hücrelere ekleme ve 28 ° c sabit sıcaklık koruyarak 135 rpm'de sallamak
Not: Üç ya da dört gün sonra enfeksiyon, tüm Sf9 hücre popülasyonu yüksek titresi baculovirus üretim bir göstergesidir cytopathic etkisi gösterir. - İstediğiniz birimin (P3P4,...) elde edilir kadar sırayla yükseltmek baculovirus supernatants 10 50-fold sonraki her enfeksiyon hücre kültüründe hacmiyle artırarak.
Not: P3 3rd yuvarlak enfeksiyon Sf9 1 litre hangi 500 mL içinde hücre kültürü P2 baculovirus süpernatant ile 10-20 mL etkilenmiş olabileceğini belirtir. P4 4th yuvarlak hangi 5-10 L Sf9 hücre kültürü P3 baculovirus süpernatant ve benzeri 100-200 mL ile enfekte enfeksiyon var. Genellikle, Sf9 hücreleri, 3 × 106 hücre/mL serum içermeyen böcek kültür medya seribaşı. - Baculovirus 30 dk 4 ° C'de hücresel enkaz kaldırma ve süpernatant ile 50 adet/mL nükleaz (250 adet/µL stokunun) için 2 h baculovirus 37 ° C genomik DNA ve RNA sindirmek için tedavi için 1000 x g de süpernatant santrifüj kapasitesi. Supernatants 0,45 mikron filtrasyon ünitesi aracılığıyla filtre.
3. Kromatografi Sistemi hazırlanması
- Sırayla örnek ve arabellek satırları her steril su, 1 N sodyum hidroksit, su ile durulama tarafından Kromatografi Sistemi hazırlamak ve arabellek (20 mM sodyum fosfat tampon içeren 150 mM Sodyum Klorür, pH 7,0) 50 mL/dk bir doğrusal akış hızı yıkayın.
- Arabellek (5 CV steril 20 mM sodyum fosfat tampon içeren 2 M Sodyum Klorür, pH 7,0) temizlik sütun sırayla çalıştırarak heparin 50 µm sütun (10 × 10 cm, 7,9 mL (CV) sütun biriminin) hazırlamak ve 5 CV yıkama tampon 7 mL/dk doğrusal akış hızında.
4. Baculovirus vektör saflaştırılması
- Kromatografi Sistemi aşağıdaki gibi ayarlayın:
- Giriş bağlantı noktası süpernatant baculovirus yüklemek için yükleme örneği kullanmak.
- Arabellek girişi bağlantı noktası A1 yıkama arabellek yüklemek için kullanın. En az 500 mL şişe yıkama arabelleği hazırlamak ve yıkama arabellek satırı şişe içine koyun.
- Arabellek girişi bağlantı noktası A2 elüsyon arabellek (1.5 M Sodyum Klorür, pH 8.0 ile 20 mM sodyum fosfat) yüklemek için kullanın. En az 500 mL şişe elüsyon arabelleği hazırlamak ve elüsyon arabellek satırı şişe içine koyun.
- Birkaç 50 mL konik tüpler süpernatant sütun doğrudan baculovirus toplamak için kesir toplayıcı, yıkama arabellek ve eluted baculovirus yerleştirin.
- Heparin sütun yıkama arabelleği (40 mL) 7.0 mL/dk doğrusal akış hızında beş 7.9 mL sütun birimler (CVs) ile equilibrate.
- 250 mL baculovirus süpernatant Kromatografi Sistemi örnek pompa (giriş örnek bağlantı noktası) 2.0 mL/dak bir doğrusal akış hızında çalıştırarak heparin sütuna yerleştirin.
- 10 CVs (80 mL) yıkama arabellek heparin sütun 2.0 mL/dk doğrusal akış hızında ultraviyole (UV) Absorbans eğrisi kadar koşmak-den geçerek (280 nm) satır taban çizgisine geri döndü ve kararlı hale gelir.
- Ne zaman baculovirus parçacıklar heparin sütundan ayırmak elüsyon arabelleği 4.0 mL/dak izle Kromatografik protein keskin elüsyon zirvesine için doğrusal akış hızında baculovirus parçacıklar 7.9 mL heparin sütun 5 CVs (40 mL) ile elute.
- Sonrası elüsyon, hemen 10 kat baculovirus parçacıklar osmotik şoktan inactivation sonraki Santrifüjü sırasında önlemek için suda 20 mM sodyum fosfat tampon kullanarak eluted baculovirus süpernatant sulandırmak.
- Baculovirus süpernatant, yıkama arabellek ve eluate yükleme sırasında toplanan sütun akış yoluyla dahil olmak üzere, her birinin kesirler 100 µL depolamak. HT1080 arıtma işlemi (bakınız Bölüm 6) değerlendirmek için bu baculovirus kesirler bulaştırmak.
- Sütun Temizleme arabellek ve yıkama arabellek sütun ile temizleyin. Son olarak, doğrusal akış 7.0 mL/dk hızında sütun 5 CV steril % 20 etanol su ile durulayın ve 4 ° C'de depolayın
- Su, su ile tekrar 1 N sodyum hidroksit ile % 20 etanol suda 50.0 mL/dk doğrusal akış hızında Kromatografi Sistemi temiz ve sistem % 20 etanol içinde saklayın.
5. konsantrasyonu Baculovirus
- Santrifüj tüpleri bir otoklav kullanarak önceden sterilize. Her ultracentrifuge tüpler doku kültürü başlıklı baculovirus süpernatant eşit bir hacmi ekleyin. Bir denge tarafından tüp ağırlık ölçmek ve steril PBS ultracentrifuge tüplerini içeriğini ağırlığını ayarlamak.
- Her biri ultracentrifuge tüpler kova SW 32 Ti rotor muhalif koyun.
- Ultracentrifuge de 80.000 × g çalıştırmak 4 ° C'de 90 dk
- Ultracentrifuge tüpler doku kültürü mahallede açın ve aseptik baculovirus Pelet kaldırmadan sıvı Aspire edin.
- Her tüpün Pelet şiddetle aşağı yukarı 200 µL % 0,5 (w/vol) BSA içeren PBS ile pipetting tarafından resuspend.
- Cryovials (şişe başına 50-100 µL) için konsantre baculovirus aktarın ve-80 ° C'de depolayın
6. Baculovirus titrasyon
- Enfeksiyon, önceki gün bir hemasitometre Trypan hücrelerle mavi boyama sonra kullanarak HT1080 hücreleri saymak. 6-şey plaka 2 ml, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (% 10 fetal sığır serum (FBS) içeren DMEM) bir kuyu başına 1 x 105 HT1080 hücre tohum. Tohum birkaç ek wells hücreleri enfeksiyon anda mevcut tam sayısını belirlemek için. Kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2hücrelerinde kültür.
Not: Onlar heparan sülfat diğer hücre hatları16ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir seviyede hızlı gibi HT1080 hücreler titrasyon için kullanılır. HT1080 hücreleri olduğundan yapışık, titrasyon daha basit ve daha az zaman alıcı ile karşılaştırıldığında geleneksel Sf9 tabanlı titrasyon kullanarak. - Enfeksiyon günü, iyi başına hücre sayısı hücreleri kuyulardan sayarak belirler. Hücreleri bir kenara önce sütun arıtma ve örnekleri ile sütun akış yoluyla, yıkama ve elüsyon kesirler belirlenmiş olduğunu seyreltilmiş orijinal baculovirus ekleyerek bulaştırmak. Her örnek için seyreltme ve ampirik olarak bulaşıcı baculovirus parçacıkları üzerinde temel birim belirlemek ve her kuyuya nüsha bulaştırmak.
- İki gün sonra enfeksiyon, hücrelerin gen ilgi bir ifade için analiz. Hücreleri floresan protein (örneğin GFP)17ifade edersek bir Akış Sitometresi kullanılarak analiz edilebilir.
- Şimdiki zaman enfeksiyon, seyreltme faktörü ve yüzdeleri formülü kullanarak hücreleri floresan proteinin hücre sayısına titreleri (bulaşıcı birim mL) hesaplamak: (sırasında enfeksiyon × yüzde floresan proteinin hücre sayısı pozitif hücrelerinin × seyreltme faktörü) / baculovirus ml hacmi.
Not: Örneğin, hücreleri enfeksiyon zaman kuyuda başına 1,2 × 105toplam sayısıdır, floresan protein oranı % 5'dir, seyreltme faktörü 100 ise seyreltilmiş baculovirus eklendi hacmi 10 µL titresi 6 × 107 bulaşıcı birim (IU) ise, /mL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sunulan bir akış diyagramı (şekil 1) protokolüdür. Adımlar Sf9 hücre bacmid baculovirus bir tabak içinde yapisan kültür, serum serbest süspansiyon kültür, nükleaz tedavi ve açıklama Santrifüjü ve filtrasyon tarafından sonraki amplifikasyon üretmek için DNA ile geçici transfection içerir, ve heparin benzeşme Kromatografi kullanarak arıtma konsantrasyon ultrasantrifüj ile izledi.
Sonra çözülme, hücreleri gerekir yeniden elde etmek için en az iki hafta Sf9 ve büyüme veya üssel faz girme. Aktif Sf9 büyüyen hücreler ile bacmid DNA yapisan kültür transfected. İki gün sonra transfection, baculovirus zarf glikoproteinlerin, ifade gp64 algıladı ve daha sonra baculovirus üretim başlatılan11yaşında. Baculovirus çoğaltma yetkili olduğundan, enfekte hücreleri hücre büyüme orta salgılanan yeni üretilen baculovirus ile ilerici bir enfeksiyon nedeniyle yavaş yavaş artar. Tüm hücre nüfus enfekte olma zaman hücre supernatants içeren Baculovirus hasat 5 gün sonra transfection vardır. Bu ilk virüs süpernatant 1 (P1) stok geçit belirlenmiştir. P1 hisse senedi büyük bir tabak içinde Sf9 hücrelerinin yeni numaralı seribaşı yapisan kültürünün sonraki enfeksiyon için kullanılır. Tüm hücre nüfusu 5 gün içinde cytopathic etkisi (Şekil 2) olarak adlandırılan enfeksiyon belirtisi gösterir. Süpernatant ile ikinci yapisan hücre kültür hasat edilir ve P2 stok olarak belirlenmiş. Baculovirus süpernatant daha fazla Sf9 süspansiyon kültürü aracılığıyla bir shaker şişe serum içermeyen böcek hücre kültür orta ile taze ekledi Sf9 hücrelerinin devam eden enfeksiyon AMPLİFİKATÖRLÜ. Her enfeksiyon döngüsünün sonunda hücrelerin çoğu cytopathic etkisi ile artan bir hücresel çapı ve baculovirus enfeksiyon tamamlanması için işaretler ölü ya da lysed hücreleri göstermek. İstediğiniz birimin (P3P4,...) elde edilir kadar Baculovirus hisse senedi ardışık olarak güçlendirilmiş. Süpernatant Sf9 hücrelerden düşük hızlı Santrifüjü, viskozite, sonraki arıtma ve toplama adımlar kullanılmadan önce 0,45 mikron membran filtre azaltmak için bir nükleaz ile tedavi ayrılır.
Baculovirus arındırmak için virüslü Sf9 hücrelerden süpernatant heparin sütun yüklenir. Heparin sütun yavaş yavaş şiddetle ilişkili baculovirus ve gevşek ilişkili protein kirleticiler ile doymuş hale gelir. Heparin sütun ultraviyole (UV) Absorbans eğrisi kadar kirletici kaldırmak için yıkama arabelleği ile durulanır (280 nm) satır taban çizgisine döndürür ve sütundan ilişkisiz ve gevşek ilişkili materyallerin kaldırılmasını gösteren istikrarlı olur. Baculovirus parçacıklar Öte yandan güçlü heparin sütuna bağlamak. Bu nedenle, virüs yok önemli miktarda sütun yıkama arabellekte algılanır. Heparin bağlama baculovirus parçacıklar 1.5 M pH 8.0 ve 10 kat seyreltik Sodyum Klorür isotonicity elde ettiği ve virüs inactivation önlemek için arabellek ile eluted. Protein keskin bir zirve sırasında baculovirus kesir (şekil 3) karşılık gelen elüsyon görülmektedir. Örnek yükleme, çamaşır ve bu Kromatografi Protokolü verim % 50 daha fazla kurtarma arıtılmış bulaşıcı baculovirus partikülleri içinde kullanılan elüsyon için en iyi duruma getirilmiş koşullar. Seyreltilmiş supernatants daha fazla ultrasantrifüj ile ilâ 500-fold konsantre ve net % 25 kurtarma11verimleri % 0.5 BSA içeren PBS formüle.
Resim 1 . Üretim ve baculovirus arınma için şematik diyagramı. Sf9 hücreleri ile bacmid DNA transfected hücre kültür tedavi plaka numaralı seribaşı. Baculovirus süpernatant hasat ve yapışık kültüründe yeni Sf9 hücre bulaştırmak için kullanılır. Enfekte hücreleri daha sonra serum serbest süspansiyon kültürü yayılır. Baculovirus süpernatant nükleaz ile tedavi, centrifuged ve filtre. Baculovirus heparin benzeşme sütun Kromatografi tarafından arıtılmış, arabellekte seyreltilmiş ve aseptik ultrasantrifüj tarafından yoğunlaşmıştır. Son olarak, baculovirus süpernatant-80 ° C'de depolanan (Rakam 2016, Mol Ther yöntemleri Clin Dev. 2016; Nasimuzzaman vd., adapte edilmiş 3: 16071 izinle.) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Baculovirus cytopathic etkileri Sf9 hücreleri enfekte. Baculovirus süpernatant doku kültürü tedavi plaka Sf9 hücrelerinde hastalık için kullanıldı. Beş gün sonra enfeksiyon, bir ters faz mikroskopla hücre görüntülenir. A) hastalık bulaşmamış tek Sf9 hücreleri kontrol olarak. B) Baculovirus cytopathic etkisi gösterilen Sf9 hücreleri enfekte. Hücreleri 200 X büyütme oranında gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Akış-aracılığıyla heparin benzeşme Kromatografi sırasında bulaşıcı baculovirus sayısını. Baculovirus titreleri HT1080 hücreleri enfeksiyon tarafından tahmin edilmiştir. Test örnekleri sütun çalışma, yıkama ve eluate dahil. Örnekleri gerektiği gibi seyreltilmiş. Satır (karanlık elmas) baculovirus toplam bulaşıcı birimleri (IU) her kesir gösterir. Sütun akış yoluyla örnek ve yıkama arabellek kesir boyutunu her tüpün içinde 40 mL, ve eluate her tüp 10 mL idi. (Rakam 2016, Mol Ther yöntemleri Clin Dev. 2016; Nasimuzzaman vd., adapte edilmiş 3: 16071 izinle.) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan Protokolü baculovirus süspansiyon kültür Sf9 hücrelerde üretimi ve heparin benzeşme Kromatografi kullanarak baculovirus arınma açıklar. Bu protokol için kullanılan parametreler verimi en üst düzeye çıkarmak ve bulaşıcı baculovirus inactivation en aza indirmek. Burada sağlanan iletişim kuralı baculovirus parçacıklar iyileşme ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde geliştirilmiş bir kurtarma başkaları tarafından9elde gösterir.
Geniş ana bilgisayar tropism nedeniyle aralığı ve doku, merkezi sinir sistemi, karaciğer, göz, yumurtalık, prostat ve testis baculovirus-aracılı gen teslim5,6,7,8 ile çeşitli çalışmalar yapılmıştır . Baculovirus vektörel çizimler intihar genler, Tümör baskılayıcı genler ve kodlama tümör özgü antijenlere başarıyla içinde preklinik yapılmıştır genler gibi tedavi edici genleri içeren hayvan18,19modelleri. Baculovirus insan hücreleri transduce olmasına rağmen sadece böcek hücrelerinde yayılır ve, sonuç olarak, bir risk insan alıcılara teşkil etmez.
Baculovirus böcek hücrelerinde bacmid DNA geçici transfection tarafından üretilir. Bacmid kalitesini yüksek titresi baculovirus üretimi için önemlidir. Genellikle, taze hazırlanmış bacmid o uzun süre buzdolabında saklanır daha iyi bir performans sergiliyor. Aktif Sf9 büyüyen hücreler verimli yüksek titresi baculovirus üreten transfected. Amplifikasyon aşamasında, hücre konsantrasyonu süspansiyon kültürü optimize etmek önemlidir ve baculovirus süpernatant hacmi enfeksiyonu için kullanılan. Baculovirus parçacıklar hücrelere oranını en uygun değilse, baculovirus verim beklenen (kişisel gözlem, MN) daha düşük olabilir.
Baculovirus heparin sütun süpernatant yüklenirken, akış yoluyla sütunun geçiyor gibi virüs parçacıkları için kontrol etmek önemlidir. Bu durum ortaya çıkarsa, koşmak hız bir alt sütun gerekli olabilir veya daha küçük hacimli süpernatant sütun yüklenmesi gerektiğini. Baculovirus supernatants mevcut kirleticilerin çoğunu Kromatografi Çalıştır çamaşır adımı sırasında yıkanır. Baculovirus saflığı gümüş Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) Boyama tarafından değerlendirildi-polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) jel ve elektron mikroskobik çalışma ve bizim saf baculoviruses kaliteli12bulundu.
Biz dikkatle bağlayıcı koşulları en iyi duruma getirilmiş ve POROS heparin orta diğer heparin medya (örn. üstün bulundu HiTrap veya Capto heparin) baculovirus parçacıklar (kişisel gözlem) yakalamak için onun yetenek. Heparin baculovirus daha yüksek örnek hızı ve kapasitesi, bağlama yeteneği büyük ölçekli üretim işleminin aşağı akım işlem zamanı en aza indirmek önemlidir. Baculovirus yanı sıra, heparin orta da heparin bir benzeşim diğer bulaşıcı proteinleri bağlar. En düşük moleküler ağırlıklı kirlenme bir teğet akışı filtrasyon (TFF) adım aşağı koşmak heparin Kromatografi dahil ederek ortadan kaldırılabilir. TFF Santrifüjü alternatif olarak ürün20konsantre için de kullanılır.
Bu iletişim kuralı diğer virüsler ve heparin bir benzeşim proteinlerin saflaştırılması için kullanılabilir. Ancak, yıkama ve elüsyon arabellek oluşturma ve akış hızı değişiklikleri gerekebilir.
Rekombinant protein üretim unpurified baculovirus supernatants doğrudan kullanarak çalışır. Bu nedenle, ham baculovirus rekombinant protein üretimi için kullanılabilir. Baculoviruses vektör olarak vivo içinde gen transferi için veya bir aşı olarak kullanılıyorsa, ancak, ek arıtma Kromatografi, jel filtrasyon ve/veya ultrasantrifüj gibi saf ve konsantre baculovirus elde etmek gerekli adımlar parçacıklar ve toksisite, inflamasyon ve bağışıklık yanıtının önlemek için yapımcı hücre ve kültür medya türetilmiş kirleri en aza indirmek.
Sonuç olarak, üretim ve hangi ölçekli-üretim rekombinant proteinler, aşı ve gen terapisi vektörel çizimler için up baculovirus arınma için basit bir protokol anlatmıştık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.
Acknowledgments
Bu eser kısmen başlangıç Cincinnati çocuk Araştırma Vakfı (CCRF) üzerinden M.N. ve yenilikçi çekirdek Grant (ICG) ulusal sağlık Enstitüleri altında ilerleyen translasyonel Bilimler için Ulusal Merkezi tarafından desteklenen için finansman tarafından desteklenen Ödülü sayı UL1 TR001425. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
- Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
- Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
- Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
- Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
- Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
- Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
- Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
- Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
- Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
- Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
- Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).
