Summary
Здесь представлены два метода для определения функции, кишечный барьер. Эпителиальный метр (ом/вольт) используется для измерения электрического сопротивления transepithelial культивировали эпителия непосредственно в скважинах культуры ткани. В мышей FITC-декстран затравки метод используется для определения кишечную проницаемость в естественных условиях.
Abstract
Кишечный барьер защищает от патогенных микроорганизмов и микробного токсина. Его функция регулируется жесткой перехода проницаемость и целостности эпителиальных клеток, и нарушение функции кишечника барьер способствует прогрессирование заболевания желудочно-кишечного тракта и системные. Два простых способа описаны здесь для измерения проницаемость кишечного эпителия. В пробирке, Како 2BBe клетки покрыты в культуре ткани скважин как монослоя и transepithelial электрического сопротивления (тер) может быть измерена по счётчикам эпителиальных (ом/вольт). Этот метод является убедительным из-за его удобного операции и повторяемость. В естественных условиях, мышей gavaged с 4 кДа флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-декстран и концентрации FITC-декстран измеряются в пробах сыворотки, собранных мышей для определения эпителиальной проницаемости. Пероральная затравка обеспечивает точную дозу и поэтому является предпочтительным методом для измерения проницаемости кишечника в естественных условиях. Взятые вместе, эти два метода могут измерять проницаемость кишечного эпителия в пробирке и в естественных условияхи таким образом быть использованы для изучения связи между заболеваниями и барьерную функцию.
Introduction
Кишечные эпителиальные клетки отвечают не только за поглощение питательных веществ, но также образуют важный барьер для защиты от патогенных микроорганизмов и токсинов, микроорганизмов. Эта функция кишечный барьер регулируется жесткой перехода проницаемость и эпителиальных клеток целостности1,2,3, и дисфункции эпителиальных барьерной функции ассоциируется с воспалительных кишечника болезнь (IBD). Кольцо actomyosin perijunctional (PAMR) лежит в пределах ячейки, тесно примыкать плотные соединения. Сокращение PAMR, который регулируется лёгкие цепи миозина (док), имеет решающее значение для регулирования туго Джанкшен проницаемость4,5,6,,78, 9,10. Фактор некроза опухоли (ФНО) является центральным элементом кишечный барьер потери по upregulating кишечного эпителия док киназы (MLCK) выражение и вызывая occludin интернализации11,,12-13.
Ионы Na+ и Cl– могут пересекать пространство параклеточный поры или утечки путь14. В «Дырявый» эпителия изменения в Тер главным образом отражают изменены туго Джанкшен проницаемости. Измерение тер представляет собой часто используемые электрофизиологических подход к количественно туго Джанкшен проницаемость, главным образом в+ Na и Cl-, основанный на сопротивление клетки монослои. Типов различных клеток, включая клетки кишечного эпителия, легочной эпителиальных клеток и сосудов эндотелиальных клеток, были зарегистрированы для измерения тер. Преимущества этого метода, что Тер измерения неинвазивные и может быть использован для мониторинга живой клетки в режиме реального времени. Кроме того метод измерения Тер полезен для исследования токсичности препарата15.
Како 2BBe клетки являются клетки человека эпителия кишки аденокарциномы с структурой и функцией похож на дифференцированной малого кишечника эпителиальных клеток: к примеру, эти клетки имеют микроворсинки и ферментов, связанных с щеточкой кишечника границы. Таким образом искусственный монослои Како 2BBe используются как модель в пробирке для тестирования барьерную функцию.
В мышей один из способов изучить проницаемость кишечного параклеточный является путем измерения способности FITC-декстран крест из просвета в кровь. Таким образом Кишечная проницаемость может оцениваться gavaging FITC-декстран непосредственно в мышей и измерения флуоресценции в крови. Следующий протокол описывает два простых методов для оценки проницаемость кишечного эпителия в пробирке и в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было одобрено животное уход и использование протокола из Кембриджа-Suda геномной ресурсный центр (CAM-Су), Soochow университета.
1. обшивка и поддержание Како 2bbe на пористых поликарбоната мембраны
- Рост клеток в колбе T75 с СМИ (DMEM, содержащие 10% FBS). Фляги должны подаваться регулярно, в зависимости от плотности клеток.
Примечание: Для оптимального покрытия, клетки следует разделить быстро и имеют форму плоской «жареный яйцо», который указывает, что клетки находятся в фазе роста. - После того, как клетки 80% вырожденная, принимать настой из инкубатора и удалить средства массовой информации. Промойте любых остаточных средств массовой информации с 1-2 мл стерильного PBS (без Ca2 +). Накапайте 1,5 мл трипсина-ЭДТА в колбу и мягко рок колбу; затем место колбу в инкубаторе 37 ° C 20 мин без качания.
- В то время как клетки trypsinizing, место вставляет, содержащие пористых поликарбоната мембраны (Размер поры, 0,4 мкм; площадь поверхности, 0,33 см2; см. Таблицу материалы) в 24-ну пластины. Добавление 1,0 мл культуры средств массовой информации в зале базальную (нижнюю площадь мембраны).
- Накапайте 5 мл СМИ в колбу и энергично накапайте клетки против стороны колбы 5 - 10 раз для достижения сыпучих, отдельные ячейки или ячейки 2-3 сгустки.
-
Пластина 0,166 мл клеток (достижение коэффициент разбавления 1:8) в апикальной камеру (верхняя пространства мембраны). Инкубируйте при 37 ° C до 3 недель.
- Кормить клетки три раза каждую неделю, тщательно аспирационных СМИ от базальной отсек каждый хорошо с помощью давления насоса. Аккуратно капельно 1 мл СМИ в апикальной палаты каждой вставки.
2. Использование эпителиальных метр (ом/вольт) для измерения Тер
Примечание: После 3 недель культуры на поликарбонат мембраны, клетки Caco-2BBe готовы к Тер измерения.
- Для исследования cytokine один день перед измерением, замените СМИ, содержащие 10 нг/мл IFNγ базальной СМИ. В день эксперимента замените HBSS, содержащие 2,5 или 7,5 нг/мл ФНО СМИ.
Примечание: IFNγ лечения увеличивает выражение ФНО рецептор 2 (TNFR2)16. - Чтобы исправить метр, вставьте коррекции электрод в порт ввода и выбрать режим «Ом». Отрегулируйте R Adj винт с помощью отвертки до тех пор, пока индикатор показывает чтения 1000 Ω.
- Стерилизовать электродов, помещая их в 70% этанола для 15-30 мин, а затем дать им высохнуть за 15 с. промойте электрод в экспериментальной клетки культуры средств массовой информации.
- Включите питание и выбрать режим «Ом». Осторожно поместите длинные концы электродов мостов в базальной камеру и короткие концы в апикальной камеру. Обеспечить больше электродов касаться дна блюдо, сохраняя короче электроды ниже поверхности средств массовой информации, но выше вставки культуры ткани. Держите вертикальных электродов.
- Измерьте сопротивление образца вставок и пустые вставки (т.е., что культура вкладыши без клетки, но с HBSS) на 0, 1, 2, 3, 4 h после лечения цитокина. Записи стойкость.
- Для достижения согласованности различных форматов различных пластины, вычислите произведение сопротивления и области эффективного мембраны:
Для 24-ну вставки эффективную мембрану площадь составляет 0,33 см2.
3. мышиных модель декстран сульфата натрия (DSS)-индуцированной колит
- Добавьте DSS газобетона воды до конечной концентрации 3,5% (wt/vol).
- Администрировать 3,5% DSS для 8-недельных самцов мышей C57BL/6 для в общей сложности 7 дней. Дать очередной питьевой воды без DSS управления мышей.
- Переключатель DSS-содержащих воду регулярно питьевой воды после 7 день.
- Взвешивание мышей и оценки клинической оценки каждой мыши каждый день. Нормализации веса тела каждой мыши, чтобы его первоначального веса. Баллы по тяжести заболевания определяются четырьмя параметрами: выпадение прямой кишки (0-2), стул последовательности (0-2), кровотечения (0-2) и деятельности (0-2)5. Сумма баллов из этих параметров для окончательного клиническая оценка.
- Чтобы проанализировать состояние гистопатологические толстой ткани, усыпить мышей впрыской внутрибрюшинного (и.п.) с 1,2% (vol/vol) Avertin (0,6 мл/10 г веса тела) 7 дней пост DSS лечения. Подготовить запас 100% Авертен, Смешайте 10 г 2,2,2-tribromoethanol с 10 мл трет Амиловый спирт. Хранить в темноте при 4° C. Чтобы использовать, разбавляют 100% акций до 2% в воде.
- Изолировать слепой кишки и толстой кишки и измерить длину двоеточия5.
- Вырежьте сегменты 0,5 см от дистальной части толстой кишки и исправить в 15 мл Сокол тубы 10 мл формалина 10% на ночь. Мыть фиксированных тканей с градуированной этанола (75, 95 и 100%) и ксилола. Внедрить в парафин ткани и сократить разделы 6 мм для гематоксилином и эозином, окрашивание8.
4. Измерение проницаемость эпителия барьер DSS-индуцированной колит мышей
- Измерения проницаемости барьер 7 дней после начала DSS администрации.
- В день assay быстро мышей за 3 ч.
- Автоклав затравки иглы для обеспечения стерильности, затем затравки мышей с 150 мкл kDa 80 мг/мл 4 FITC-декстрана в стерильной воде и держать неиспользуемые FITC-декстран измерить калибровочной кривой после сбора сыворотки. Взвешивание мышей для расчета проницаемости.
Примечание: В воде следует решение FITC-декстрана. - С помощью ножниц, клип 1 см кусок хвост и собирать 100 мкл крови от хвоста в сыворотке крови коллекции трубок. Спиновые собранной крови на 10000 x g 10 мин при комнатной температуре.
- Разбавьте сыворотки 1:4 в воде. Чтобы сделать стандарт кривой, разбавить неиспользуемые FITC-декстрана с водой 1: 300, 1:1, 000, 1:3, 000, 1:10, 000, 1:30, 000, 1: 100 000, 1: 300, 000, 1:1, 000, 000 и 1:3, 000, 000. Добавьте 100 мкл/колодец сыворотки и образцы калибровочной кривой в 96-луночных пластины.
- Читайте флуоресценции в тарелку читателя с 485 возбуждения/528 выбросов. Рассчитать значения проницаемости, основанные на стандартной кривой и умножить на 4 исправить для разбавления.
- Разделите концентрацию FITC-декстран вес нормализовать значения (это помогает нормализовать разницу в FITC-декстран доставки, если мышами больны и потеряли вес).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В культуре Како 2BBe клетки растут как монослоя и медленно дифференцироваться в зрелых освоения enterocytes, имеющих кисть границы. В этом протоколе Како 2BBe клетки были покрытие с высокой плотностью на поликарбонат мембраны, и клетки достигли 100% confluency один день после посева. Однако, клетки недифференцированные на данном этапе: В полной мере дифференцировать клетки, средства массовой информации меняется каждые 2-3 дня на 3 недели. Клетки окрашивали с ядрами и F-актина пятна Показать различия между недифференцированных и дифференцированных клеток. Стресса волокон отчетливо видны в недифференцированных клеток. По сравнению с недифференцированных клеток, дифференцированных клеток имеют меньший объем, больше ядер и меньше стресса волокон (рис. 1).
TNF является центральным элементом кишечный барьер потери через MLCK-зависимых жесткие соединения регулирование. Было проанализировано Тер клеток без или с лечением ФНО в разное время точках. Как показано на рисунке 2, ФНО значительно уменьшается Тер монослоя Како 2BBe в зависимости от дозы, предполагая, что TNF увеличивает проницаемость эпителия.
Администрация DSS вызывает острый колит в мышах. Мышей, получавших DSS потерять вес значительно по сравнению с их первоначального веса (рис. 3A). Тяжесть колит забил Выпадение прямой кишки, стул последовательности, кровотечение и активности (рис. 3B). Поперечные сечения из толстой ткани окрашивали гематоксилином и эозином Показать толстой повреждение слизистой оболочки в DSS лечение мышей (рис. 3 c). Длина толстой кишки склеп уменьшается в DSS лечение мышей (Рисунок 3D). Колон длина сокращается в DSS лечение мышей (Рисунок 3E). Как видно на рисунке 3F, есть примерно 2 раза увеличение уровней FITC-декстрана в мышей DSS лечение, по сравнению с контролировать мышей.
Рисунок 1: како 2BBe клетки культивировали на поликарбонат мембраны. Клетки культивировали 1 день (недифференцированный) и 3 недель (полностью дифференцированных) после покрытия запятнаны с Hoechst 33342 (синий) для ядра и Alexa Fluor 594 Фаллоидин для F-актина (красный). Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: ФНО уменьшает Тер монослоя Како 2BBe. Клетки загрунтованных с 10 нг/мл IFNγ на ночь. На следующий день питательной среды заменяется HBSS, содержащие 2,5 или 7,5 нг/мл ФНО. Тер измеряется по счётчикам эпителиальных (ом/вольт) в назначенное время точках. Значения являются среднее ± SEM, n = 4. Существенные различия отмечены * (p < 0,05) и ** (p < 0.01), как по сравнению с Тер значения ячеек без лечения ФНО, двустороннее t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: DSS-индуцированной колит в мышах. Самцов мышей C57Bl/6 приводятся 3,5% DSS в питьевой воде для 7 дней. Тело вес (A) и клинические результаты (B) ежедневно оцениваются для каждой группы (означает ± SEM, n = 4 для каждой группы). Мышь управления получил воду без DSS. (C) гистологический анализ разделов толстой ткани собранные на день 7 пост DSS лечения. (D) Колон, склеп длины измеряются на день 7 пост DSS лечения. (E) Колон длины измеряются на день 7 пост DSS лечения. (F)-проницаемость эпителия кишечника на день обращения 7 пост DSS измеряется FITC-декстран затравки. Значения являются среднее ± SEM, n = 4. Существенные различия отмечены * (p < 0,05, двустороннее t-тест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Оценка | Выпадение прямой кишки | Консистенции стула | Кровотечение | Деятельность |
| 0 | Нет | Нормальный | Нет | Активные |
| 1 | Знак пролапса | Мягкий | Красный | Снижение активности |
| 2 | Обширные пролапса | Диарея | Грубые кровотечение | Вялой |
Таблица 1. Заболевание клиническая оценка
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько важных шагов в протоколе. Како 2BBe (кисть границы выражая) клетки всегда используются для измерения тер, от линии клеток Caco-2 для выражения кисти границы белков. Како 2BBe клетки имеют ворсинок освоения фенотип когда полностью дифференцированной (примерно через 3 недели после слияния культуры)17. Необходимо, чтобы избежать загрязнения во время измерения и стерилизовать электрода. Поскольку процедура нестерильные, измерения может выполняться только для до 8 ч, в большинстве случаев. Во время измерения мы определили значение сопротивления две точки внутри и за пределами insert. Измерения сопротивления на различных участках иногда сильно могут отличаться из-за различия в состоянии клетки; Это ограничение основных метода. Однако этот вариант может быть значительно уменьшена статистических методов и других методов. Тер-метод может применяться для других клеток, таких как определение целостности барьер легочной эпителиальных клеток и сосудов эндотелиальных клеток. Кроме того Тер измерения может использоваться в исследованиях токсичности препарата.
Администрация переваривается макромолекул, которые поступают в эпителии кишечника путем диффузии, может использоваться для оценки кишечную проницаемость. Преимуществом этого метода является, что барьерной функции кишечника могут быть рассмотрены в естественных условиях. Существует несколько типов маркеров, которые могут использоваться, в том числе радиоизотопы, полиэтиленгликолей и сахара18. Однако, некоторые факторы должны рассматриваться для точного измерения проницаемости: (1) всегда не может точно определить положение аномалия барьер кишечника; и (2) слизистых оболочек кровотока и моторику желудочно-кишечного тракта может повлиять на всасывание и выведение макромолекул.
В этом исследовании 4 кДа FITC-декстран вводили intragastrically в мышах и было измерено количество FITC-декстрана в сыворотке крови мыши. Этот метод имеет многочисленные преимущества. Пероральная затравка уменьшает возможные риски, которые связаны с использованием клизм. К примеру непреднамеренного нарушения в эпителии кишечника может быть вызвано ректальной инстилляции, ведущих к ложно положительных результатов. Следует также исключить дополнительные эффекты, вызванные стрессом. Проницаемость известен увеличить когда подчеркнули мышей. Рекомендуется проводить предварительные эксперимент по крайней мере за одну неделю до фактической эксперимент. Выполнение эксперимента практика поможет свести к минимуму экспериментальные шума для реального эксперимента. Одичал тип элемента управления (без лечения) всегда должны быть включены.
FITC-декстран проходит через кишечник и начинает вводить Колон 3 ч после gavaging. Таким образом 3 h является точкой идеальное время для измерения малых кишечную проницаемость. Для измерения проницаемости кишечника время может быть продлен, но затем становится баланс между утечки FITC-декстрана в просвет и оформления этих молекул из потока крови. 4 h является общепринятым точки хорошее время для толстой измерений.
В заключение, были описаны две отдельные методы для определения проницаемости кишечной эпителиальных клеток in vitro и в естественных условиях. Тер измерения и методы кормления FITC-декстран измерения проницаемости параклеточный, в то время как они каждый предоставляют независимые и собственный свойства параклеточный проницаемости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Тернер Джерролд р., от Бригама и женской больнице, Гарвардской медицинской школы, за его щедрую помощь в завершении этого исследования. Эта работа поддерживается Национальный фонд естественных наук Китая (номер гранта, 81470804, 31401229 и 81200620), естественные науки фонд провинции Цзянсу (номер гранта BK20180838 и BK20140319), программа исследований инноваций для Выпускники колледжа провинции Цзянсу (номер KYLX16-0116 Грант), передовых исследовательских проектов Soochow университета (Грант № SDY2015_06) и крона и колит Стипендия фонда научных исследований (Грант номер 310801).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Black 96-well plates for fluorescence | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cells | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextran sulphate sodium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED with high glucose and sodium pyruvate | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epithelial (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modular Tissue Embedding Center | Leica | EG1150H | |
| Serum collection tubes | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 flask | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonate membranes (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pressure pump | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Rotary Microtomy | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
References
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target? Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).
- Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets. J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).
- Clayburgh, D. R., et al. A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability. J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).
- Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).
- Su, L., et al. Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis. Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).
- Zha, J. M., et al. Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells. Gene. 588, 1-6 (2016).
- He, W. Q., et al. Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1. Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).
- He, W. Q., et al. Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice. Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).
- Li, H. S., et al. Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development. Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).
- Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).
- Ye, D., Ma, T. Y. Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity. J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).
- Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability. Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).
- Peterson, M. D., Mooseker, M. S. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2. J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).
- Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).
