Summary
To metoder presenteres her for å finne intestinal barriere-funksjonen. En epithelial meter (volt/ohm) brukes for målinger av transepithelial motstand av kultivert epithelia direkte i vev kultur brønner. I mus brukes FITC-dekstran gavage metoden til å bestemme intestinal permeabilitet i vivo.
Abstract
Intestinal barriere beskytter mot sykdomsfremkallende microorganism og mikrobiell gift. Dens funksjon er regulert av tett krysset permeabilitet og epithelial celle integritet og forstyrrelse av funksjonen intestinal barriere bidrar til utviklingen av mage og systemisk sykdom. To enkle metoder er beskrevet her for å måle permeabilitet av intestinal epitel. In vitro, Caco-2BBe celler er belagt i vev kultur brønner som en monolayer og transepithelial motstand (TER) kan måles ved en epiteliale (volt/ohm) meter. Denne metoden er overbevisende grunn av sin bruker-vennlig operasjon og repeterbarhet. I vivo, mus er gavaged med 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dekstran og FITC-dekstran-konsentrasjoner er målt i samlet serumprøver fra mus til å bestemme epithelial permeabilitet. Muntlige gavage gir en nøyaktig dose, og derfor er den foretrukne metoden å måle intestinal permeabilitet i vivo. Sammen disse to metodene kan måle permeabilitet av intestinal epitel i vitro og i vivo, og derfor brukes til å studere sammenhengen mellom sykdommer og barriere-funksjonen.
Introduction
Intestinal epitelceller er ikke bare ansvarlig for absorpsjon av næringsstoffer, men også danne en viktig barriere for å forsvare seg mot sykdomsfremkallende mikroorganismer og mikrobiell giftstoffer. Intestinal barriere funksjonen er regulert av tett krysset permeabilitet og epithelial celle integritet1,2,3, og dysfunksjon av funksjonen epithelial barriere er forbundet med inflammatorisk tarm sykdom (IBD). Perijunctional actomyosin ringen (PAMR) ligger i cellen som er tett siden de trange knutepunktene. Sammentrekning av PAMR, som reguleres av myosin lys kjeden (MLC), er avgjørende for regulering av tett krysset permeabilitet4,5,6,7,8, 9,10. Tumor nekrose faktor (TNF) er sentralt for intestinal barriere tap upregulating intestinal epithelial MLC kinase (MLCK) uttrykk og inducing occludin internalisering11,12,13.
Ioner som Na+ og Cl- kan krysse paracellular plassen med enten pore eller lekkasje veien14. I en "lekk" epitel gjenspeiler endringer i TER primært endret tett krysset permeabilitet. TER måling er en brukte elektrofysiologiske tilnærming å kvantifisere tett krysset permeabilitet, primært til Na+ og Cl-, basert på impedans på celle monolayers. Ulike celletyper, inkludert intestinal epitelceller, lunge epitelceller og vaskulær endotelceller, er rapportert for TER målinger. Fordelene med denne metoden er at TER målinger er ikke-invasiv og kan brukes til å overvåke lever celler i sanntid. I tillegg er TER måleverdien teknikken nyttig for narkotika toksisitet studier15.
Caco-2BBe celler er menneskelig epithelial colorectal adenocarcinoma celler med struktur og funksjon som ligner på differensiert liten intestinal epitelceller: disse cellene har for eksempel microvilli og enzymer assosiert med liten intestinal børste grensen. Derfor benyttes kulturperler Caco-2BBe monolayers som en i vitro modell for testing barriere-funksjonen.
I mus er en måte å studere intestinal paracellular permeabilitet ved å måle evne til FITC-dekstran å krysse fra lumen i blodet. Dermed kan intestinal permeabilitet vurderes av gavaging FITC-dekstran direkte til mus og måle fluorescens i blodet. Følgende protokollen beskriver to enkle metoder for å vurdere intestinal epitel permeabilitet både i vitro og i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av Animal Care og bruk protokollen av Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU), Soochow universitet.
1. plating og vedlikehold av Caco-2bbe på porøse polykarbonat membraner
- Vokse celler i en MT75 bolle med media (DMEM inneholder 10% FBS). Kolber skal fôres regelmessig, avhengig av den celle tettheten.
Merk: For optimal plating, bør celler deler seg raskt og flat "stekt egg" form, som angir at cellene er i vekstfase. - Når cellene er 80% confluent, ta kolbe ut av inkubatoren og fjerne media. Skyll gjenværende medier med 1-2 mL steril PBS (uten Ca2 +). Pipetter 1,5 mL Trypsin-EDTA i flasken og forsiktig rock flasken; deretter plassere kolbe i 37 ° C inkubator for 20 min uten rock.
- Mens cellene er trypsinizing, setter sted som inneholder porøse polykarbonat membraner (porestørrelse, 0.4 µm, areal, 0,33 cm2; se Tabellen for materiale) i 24-vel platene. Tilsett 1,0 mL av kultur medier i basale chamber (lavere avstanden av membranen).
- Pipetter 5 mL av media i flasken og kraftig Pipetter cellene mot siden av flasken 5 - 10 ganger å oppnå løs, individuelle celler eller 2-3 celle grupperer.
-
Plate 0.166 mL celler (oppnå en 1:8 fortynning ratio) i apikale kammeret (øvre løpet av membranen). Ruge på 37 ° C 3 uker.
- Feed celler tre ganger ukentlig ved nøye aspirating media fra den basale kupé av hver godt med et trykk pumpe. Forsiktig dryppe 1 mL av media i apikale kammeret av hver sette.
2. Bruk av epitelial Meter (Volt/Ohm) for å måle TER
Merk: Etter ca 3 uker av kultur på polykarbonat membraner, Caco-2BBe celler er klar for TER måling.
- For cytokin studier, en dag før måling, erstatte basale media med mediet som inneholder 10 ng/mL av IFNγ. På dagen for eksperimentet, kan du erstatte media med HBSS som inneholder 2,5 eller 7,5 ng/mL av TNF.
Merk: IFNγ behandling øker uttrykk for TNF reseptor 2 (TNFR2)16. - Du retter opp måleren ved sett korreksjon elektroden i Input-porten, og velg "Ohm" modus. Juster R Adj skruen med en skrutrekker til måleren viser en lesning av 1000 Ω.
- Sterilisere elektrodene ved å plassere dem i 70% etanol i 15-30 min, og la dem luft tørr til 15 s. skylling elektroden i eksperimentell celle kultur media.
- Slå på strømmen, og velge "Ohm" modus. Nøye plassere lang endene av elektroden broene i den basale kammeret og kort endene inn i apikale kammeret. Kontroller at elektrodene for lengre berører bunnen av fatet, mens kortere elektrodene under overflaten av media men over vev kultur skivene. Holde elektrodene loddrett.
- Måle motstanden i prøven skivene og tom setter inn (dvs. kultur setter inn uten celler, men med HBSS) på 0, 1, 2, 3, 4 h etter cytokin behandling. Registrere motstanden.
- For å oppnå konsistens på tvers av ulike plate formater, Beregn produktet av motstand og effektiv membran området:
For 24-vel innsettinger er effektiv membran området 0,33 cm2.
3. murine modell av dekstran sulfat natrium (DSS)-indusert kolitt
- Legge til DSS autoklaveres vann til en siste konsentrasjon på 3,5% (wt/vol).
- Administrere 3,5% DSS til 8-uke-gamle mannlige C57BL/6 mus totalt 7 dager. Gir vanlige drikkevann uten DSS kontroll mus.
- Bytte DSS inneholder vannet til vanlig drikkevann etter dag 7.
- Veie mus og vurdere kliniske resultater av hver musen hver dag. Normalisere kroppsvekt hver mus til sin første kroppsvekt. Score defineres etter sykdom alvorlighetsgraden av fire parameterne: rektal prolaps (0-2), avføring konsistens (0-2), blødning (0-2) og aktivitet (0-2)5. Summere resultatene fra disse parameterne for klinisk sluttresultatet.
- Analysere histopathological tilstand kolon vev, euthanize mus ved intraperitoneal (IP) injeksjon med 1,2% (vol/vol) Avertin (0,6 mL/10 g kroppsvekt) 7 dager innlegg-DSS behandling. For å forberede et lager av 100% avertin, bland 10 g av 2,2,2-tribromoethanol med 10 ml tert-amyl alkohol. Lagre i mørket på 4° C. Hvis du vil bruke, kan du fortynne 100% aksjer til 2% i vann.
- Isolere tykktarm og cecum og måle lengden av kolon5.
- Kuttet 0,5 cm segmenter fra den distale kolon og fastsette i en 15 mL falcon rør som inneholder 10 mL av 10% formalin over natten. Vask fast vev med gradert etanol (75, 95 og 100%) og xylen. Bygge inn vev i parafin og kuttet 6 mm deler for hematoxylin & eosin flekker8.
4. måle Epithelial barriere permeabilitet i DSS-indusert kolitt mus
- Måle barriere permeabilitet 7 dager etter starten av DSS administrasjon.
- På dagen for analysen, rask mus for 3t.
- Autoclave en gavage pinne for å sikre steriliteten, deretter gavage mus med 150 µL 80 mg/mL 4 kDa FITC-dekstran i sterilt vann, og holde den ubrukte FITC-dekstran for å måle standardkurven etter serum samling. Veie mus for permeabilitet beregning.
Merk: FITC-dekstran løsningen bør gjøres i vann. - Bruke et par saks, klipp et 1 cm stykke halen og samle 100 µL av blod fra halen i serum samling rør. Spinne samlet blod på 10.000 x g i 10 min ved romtemperatur.
- Fortynne serum 1:4 i vann. Å gjøre en standard kurve, fortynne ubrukte FITC-dekstran med vann på 1:300, 1:1, 000, 1:3, 000, 1:10, 000, 1:30 000, 1: 100, 000, 1:300, 000, 1:1, 000, 000 og 1:3, 000, 000. Legg 100 µL/vel av serum og standardkurve prøvene i 96-brønnen platene.
- Les fluorescens i en plate-leser med 485 eksitasjon/528 utslipp. Beregne permeabilitet verdier basert på standardkurven, og multiplisere med 4 korrigere fortynning.
- Dele konsentrasjonen av FITC-dekstran av vekten normalisere verdiene (dette hjelper normalisere forskjellen i FITC-dekstran levering hvis mus er syke og har mistet vekt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I kultur, Caco-2BBe cellene vokse som en monolayer og skille sakte ut modne absorberende enterocytes som pensel kantlinjer. I denne protokollen, Caco-2BBe celler var belagt med en høy tetthet på polykarbonat membraner og celler nådd 100% confluency en dag etter seeding. Men celler er udifferensierte på dette stadiet: Å fullt skille cellene, media endres hver 2-3 dager til 3 uker. Celler var farget med kjerner og F-utgangen flekker for å vise forskjellene mellom udifferensierte og differensierte celler. Stress fiber er tydelig i udifferensierte celler. Sammenlignet med udifferensierte celler, har differensierte celler et mindre volum, større kjerner og færre stress fiber (figur 1).
TNF er sentralt for intestinal barriere tap gjennom MLCK-avhengige tett krysset regulering. TER celler uten eller med TNF behandling på ulike tidspunkt ble analysert. Som vist i figur 2, reduserer TNF betydelig TER av Caco-2BBe-monolayer i en doseavhengig måte, noe som tyder på at TNF øker epithelial permeabilitet.
Administrasjon av DSS induserer akutt kolitt i mus. Mus behandlet med DSS miste vekt betydelig sammenliknet med sin første kroppsvekt (figur 3A). Alvorlighetsgraden av kolitt scores av rektal prolaps, avføring konsistens, blødning og aktivitet (figur 3B). Tverrsnitt av colonic vev med hematoxylin & eosin viser colonic mucosal skade i DSS behandlet mus (Figur 3 c). Lengden på kolon krypten er redusert i DSS behandlet mus (figur 3D). Kolon lengden forkortet i DSS behandlet mus (figur 3E). Som vist i figur 3F, er det omtrent en 2-fold økning i FITC-dekstran nivåer i DSS behandlet mus sammenlignet med kontroll mus.
Figur 1: Caco-2BBe celler kultivert på polykarbonat membraner. Celler kulturperler er 1 dag (udifferensierte) og 3 uker (fullt-differensiert) etter plating farget med Hoechst 33342 (blå) for kjernen og Alexa Fluor 594 Phalloidin for F-utgangen (rød). Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: TNF reduserer TER av Caco-2BBe-monolayer. Cellene er primet med 10 ng/mL IFNγ over natten. På den neste dagen erstattes kultur medium med HBSS som inneholder 2,5 eller 7,5 ng/mL av TNF. TER er målt ved en epithelial meter (Volt/Ohm) på de angitte tidspunkt. Verdiene er gjennomsnittlig ± SEM, n = 4. Betydelige forskjeller angis med * (p < 0,05) og ** (p < 0,01), som sammenlignet TER verdier i celler uten TNF behandling, av tosidige t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: DSS-indusert kolitt i mus. C57BL/6 mannlige mus får 3,5% DSS i drikkevann i 7 dager. Kroppsvekt (A) og kliniske resultater (B) vurderes daglig for hver gruppe (mener ± SEM, n = 4 for hver gruppe). Kontroll mus fikk vann uten DSS. (C) histologiske analyse av colonic vev inndelinger samlet på dag 7 innlegg-DSS behandling. (D) kolon krypten lengder måles på dag 7 innlegg-DSS behandling. (E) kolon lengder måles på dag 7 innlegg-DSS behandling. (F) permeabilitet av kolon epitel måles på dag 7 innlegg-DSS behandling av FITC-dekstran gavage. Verdiene er gjennomsnittlig ± SEM, n = 4. Betydelige forskjeller angis med * (p < 0,05 av tosidige t-test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Poengsum | Rektal prolaps | Krakk konsistens | Blødning | Aktivitet |
| 0 | Ingen | Normal | Ingen | Aktiv |
| 1 | Tegn på prolaps | Myk | Rød | Redusert aktivitet |
| 2 | Omfattende prolaps | Diaré | Brutto blødning | Sløv |
Tabell 1. Sykdom klinisk Score
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere viktige skritt i protokollen. Caco-2BBe (pensel grensen-uttrykke) celler brukes alltid for TER måling, valgt fra Caco-2 cellen linje for uttrykk for brush-grensen proteiner. Caco-2BBe celler har en villus absorberende fenotypen når fullt differensiert (etter ca 3 uker kultur etter samløpet)17. Er det nødvendig å unngå forurensning under målingen, og å sterilisere elektroden. Prosedyren er ikke-steril, kan målinger bare utføres for opptil 8 timer i de fleste tilfeller. Under målingen bestemt vi motstanden verdien av de to punktene i og utenfor innsatsen. Motstand målinger på forskjellige steder kan noen ganger avviker på grunn av forskjeller i cellen staten; Dette er en stor begrensning av metoden. Men kan denne varianten reduseres betydelig ved statistiske metoder og andre metoder. TER metoden kan brukes til andre celler, for eksempel å bestemme barriere integritet lunge epitelceller og vaskulær endotelceller. TER målinger kan i tillegg brukes i medikament toksisitet studier.
Administrasjon med ufordøyelig makromolekyler, som angir intestinal epitel gjennom spredning, kan brukes til å evaluere intestinal permeabilitet. Fordelen med denne metoden er at funksjonen barriere i tarmen kan være undersøkt i vivo. Det finnes flere typer markører som kan brukes, inkludert radioisotopes, polyetylen glycols og sukker18. Imidlertid flere faktorer bør vurderes for nøyaktig måling av permeabilitet: (1) plasseringen av tarmen barriere abnormitet ikke alltid kan nettopp bestemmes; og (2) mucosal blodomløpet og gastrointestinal motilitet kan påvirke opptaket og utskillelse av macromolecules.
I denne studien 4 kDa FITC-dekstran administrert intragastrically mus og mengden av FITC-dekstran i musen serum ble målt. Denne metoden har mange fordeler. Muntlige gavage reduserer risikoen forbundet med å bruke klyster. For eksempel kan utilsiktet verdifall til colonic epitel være forårsaket av endetarms instillasjon, fører til en falske positive resultater. Flere effekter forårsaket av stress bør også bli eliminert. Permeabilitet er kjent for å øke når mus er stresset. Det anbefales å gjennomføre en foreløpig eksperiment minst en uke før det aktuelle eksperimentet. Utføre en praksis eksperimentet vil bidra til å minimere eksperimentelle støy for ekte eksperimentet. En vill-type kontroll (ingen behandling) bør alltid være inkludert.
FITC-dekstran gjennom tynntarm og begynner å gå inn i tykktarmen 3t etter gavaging. Dermed er 3t et ideelt tidspunkt for å måle små intestinal permeabilitet. For måling av colonic permeabilitet, tiden kan forlenges, men dette så blir en balanse mellom lekkasje av FITC-dekstran i lumen og rydding av disse molekylene fra blodet. 4 h er generelt akseptert som et godt tidspunkt for colonic målinger.
Som konklusjon, to separate metoder ble beskrevet for å fastslå intestinal tarmepitelet permeabilitet både i vitro og i vivo. Mens både TER måling og FITC-dekstran gavage metoder måle paracellular permeabilitet, gir de hver uavhengige og distinkte egenskaper paracellular permeabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Jerrold R. Turner, fra Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, for hans sjenerøs hjelp i å fullføre denne studien. Dette arbeidet er støttet av National Natural Science Foundation i Kina (bevilgning nummer 81470804, 31401229 og 81200620), Natural Science Foundation av Jiangsu provinsen (bevilgning nummer BK20180838 og BK20140319), The forskningsprogram innovasjon for College nyutdannede i Jiangsu provinsen (bevilgning nummer KYLX16-0116), avansert forskning prosjekter av Soochow University (bevilgning nummer SDY2015_06), Crohns og kolitt Foundation forskning Fellowship Award (gi nummer 310801).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Black 96-well plates for fluorescence | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cells | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextran sulphate sodium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED with high glucose and sodium pyruvate | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epithelial (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modular Tissue Embedding Center | Leica | EG1150H | |
| Serum collection tubes | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 flask | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonate membranes (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pressure pump | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Rotary Microtomy | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
References
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target? Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).
- Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets. J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).
- Clayburgh, D. R., et al. A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability. J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).
- Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).
- Su, L., et al. Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis. Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).
- Zha, J. M., et al. Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells. Gene. 588, 1-6 (2016).
- He, W. Q., et al. Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1. Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).
- He, W. Q., et al. Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice. Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).
- Li, H. S., et al. Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development. Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).
- Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).
- Ye, D., Ma, T. Y. Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity. J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).
- Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability. Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).
- Peterson, M. D., Mooseker, M. S. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2. J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).
- Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).
