Summary
To metoder er præsenteret her for at bestemme intestinal barriere funktion. En epitelial meter (volt/ohm) bruges til målinger af transepithelial elektrisk modstand af kulturperler epitheler direkte i vævskultur brønde. I mus bruges metoden FITC-dextran sonde til at bestemme intestinal permeabilitet i vivo.
Abstract
Den intestinale barriere beskytter mod sygdomsfremkaldende mikroorganisme og mikrobielle toksin. Dens funktion er reguleret af stram vejkryds permeabilitet og epitelcelle integritet, og forstyrrelse af tarmens barriere funktion bidrager til udviklingen af gastrointestinale og systemiske sygdomme. To enkle metoder er beskrevet her til at måle permeabilitet af intestinale epitel. In vitro, Caco-2BBe celler er belagt i vævskultur brønde som en éncellelag og transepithelial elektrisk modstand (TER) kan måles ved en epitel (volt/ohm) meter. Denne metode er overbevisende på grund af sin brugervenlig betjening og repeterbarhed. In vivo mus er gavaged med 4 kDa fluorescein isothiocyanat (FITC)-dextran og FITC-dextran koncentrationer er målt i indsamlede serumprøver fra mus til at bestemme den epitel permeabilitet. Mundtlige sonde giver en nøjagtig dosis, og derfor er den foretrukne metode til at måle intestinal permeabilitet i vivo. Taget sammen, disse to metoder kan måle permeabilitet af den intestinale epitel in vitro og i vivo, og dermed bruges til at studere sammenhængen mellem sygdomme og barriere funktion.
Introduction
Tarm epitelceller er ikke kun ansvarlig for absorptionen af næringsstoffer, men også udgør en væsentlig hindring for forsvare mod patogene mikroorganismer og mikrobielle toksiner. Denne intestinal barriere funktion reguleres af stram vejkryds permeabilitet og epitelcelle integritet1,2,3, og dysfunktion af epitel barriere funktion er forbundet med inflammatoriske tarm disease (IBD). Perijunctional actomyosin ring (Mobilkommunikationstjenester) ligger inden for den celle, der er nært sammenhængende med de stramme kryds. Sammentrækning af Mobilkommunikationstjenester, som er reguleret af myosin lys kæde (MLC), er afgørende for reguleringen af stram vejkryds permeabilitet4,5,6,7,8, 9,10. Tumornekrosefaktor (TNF) er centralt for intestinal barriere tab af upregulating tarm epitel MLC kinase (MLCK) udtryk og overtalelse occludin internalisering11,12,13.
Ioner som Na+ og Cl- kan krydse paracellular plads ved enten pore eller lækage vej14. I en "utæt" epitel afspejler ændringer i TER primært ændrede tight junction permeabilitet. TER måling er et almindeligt anvendte elektrofysiologiske tilgang til at kvantificere tight junction permeabilitet, primært til Na+ og Cl-, baseret på impedans af celle monolag. Forskellige celletyper, herunder tarm epitelceller, pulmonal epitel celler og vaskulære endotel celler, er blevet rapporteret til TER målinger. Fordelene ved denne metode er at TER målinger er ikke-invasive og kan bruges til at overvåge levende celler i realtid. Derudover er TER måleteknik nyttige for lægemiddel toksicitet undersøgelser15.
CaCO-2BBe celler er menneskelige epitelial kolorektal adenocarcinom celler med en struktur og funktion svarende til de differentierede lille tarm epitelceller: for eksempel, disse celler har microvilli og enzymer forbundet med lille tarm børste grænsen. Derfor er kulturperler Caco-2BBe encellelag udnyttet som en in vitro- model for at teste barriere funktion.
I mus er en måde at studere tarm paracellular permeabilitet ved at måle FITC-dextran evne til at krydse fra lumen i blodet. Således kan gavaging FITC-dextran direkte ind i musene og måle fluorescens i blodet vurderes intestinal permeabilitet. Følgende protokol beskriver to enkle metoder til at vurdere intestinale epitel permeabilitet både in vitro- og in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af Animal Care og brug protokollen af Cambridge-Suda genomisk Resource Center (CAM-SU), Soochow Universitet.
1. plating og vedligeholdelse af Caco-2bbe på porøse polycarbonat membraner
- Vokser celler i en T75 kolbe med media (DMEM indeholder 10% FBS). Kolberne skal fodres regelmæssigt, afhængigt af den celle tæthed.
Bemærk: For optimal plating, celler bør deler sig hurtigt og har en flad "stegt-æg" form, som angiver, at cellerne er i vækstfasen. - Når celler er 80% sammenflydende, tag kolben ud af rugemaskinen og fjerne medier. Skyl eventuelle resterende medier med 1-2 mL steril PBS (uden Ca2 +). Pipette 1,5 mL Trypsin-EDTA i kolben og forsigtigt rock kolben; Placer derefter, kolben i rugemaskinen 37 ° C i 20 min. uden vuggende.
- Mens cellerne trypsinizing, indsætter sted, der indeholder porøse polycarbonat membraner (porestørrelse, 0,4 µm, areal, 0,33 cm2; Se Tabel af materiale) i 24-godt plader. Tilføje 1,0 mL af Kulturmedier i basal salen (den nederste plads af membranen).
- Med pipette overfoeres 5 mL af medier ind i kolben og energisk afpipetteres celler mod siden af kolbens 5 - 10 gange at opnå løs, enkelte celler eller 2-3 celle klumper.
-
Plade 0.166 mL af celler (at opnå en 1:8 fortyndingsforholdet) i den apikale kammer (den øverste plads i membranen). Der inkuberes ved 37 ° C i op til 3 uger.
- Feed celler tre gange ugentlig ved grundigt sugning medier fra den basale rum i hver brønd med en tryk pumpe. Forsigtigt dryppe 1 mL af medier i den apikale kammer af hver Indsæt.
2. brug af epitel Meter (Volt/Ohm) til måling af TER
Bemærk: Efter ca 3 ugers kultur på polycarbonat membraner, Caco-2BBe celler er klar til TER måling.
- Cytokin undersøgelser, Erstat én dag før måling, basal medierne med medier indeholdende 10 ng/mL af IFNγ. På dagen af forsøget, skal du erstatte medierne med HBSS indeholdende 2,5 eller 7,5 ng/mL TNF.
Bemærk: IFNγ behandling øger udtryk for TNF receptor 2 (TNFR2)16. - For at rette måleren, indsætte korrektion elektrode i Input-port, og vælg "Ohm" tilstand. Justere R Adj skruen med en skruetrækker, indtil måleren viser en læsning af 1,000 Ω.
- Sterilisere elektroderne ved at placere dem i 70% ethanol i 15-30 min, og så lad dem lufttørre for 15 s. Skyl elektrode i eksperimentel celle kultur medier.
- Tænd magt, og vælg "Ohm"-tilstand. Omhyggeligt placere lang enderne af elektrode broer i basal kammeret og de korte ender i den apikale kammer. Sikre, at længere elektroderne røre bunden af fadet, samtidig med at de kortere elektroder under overfladen af medierne, men ovenfor vævskultur skær. Holde elektroderne lodret.
- Måle modstanden i stikprøven skær og Tom skær (dvs. kulturen indsætter uden celler, men med HBSS) på 0, 1, 2, 3, 4 h efter cytokin behandling. Optage modstanden.
- For at opnå sammenhæng på tværs af forskellige plade formater, Beregn produktet af modstand og effektive membran-området:
Til 24-godt skær er den effektive membran 0,33 cm2.
3. murine Model af Dextran sulfat natrium (DSS)-induceret Colitis
- Tilføje DSS til autoklaveres vand til en endelig koncentration på 3,5% (wt/vol).
- Administrere 3,5% DSS til 8-uge-forhenværende mandlige C57BL/6 mus for en total på 7 dage. Give regelmæssige drikkevand uden DSS til kontrol mus.
- Skift den DSS-holdige vand til regelmæssig drikkevand efter dag 7.
- Vejer mus og vurdere klinisk vurdering af hver mus hver dag. Normalisere kropsvægt hver mus til sin oprindelige kropsvægt. Scores der defineres inden for sygdommens sværhedsgrad af fire parametre: rektalprolaps (0-2), afføringen konsistens (0-2), blødning (0-2) og aktivitet (0-2)5. Opsummere score fra disse parametre for en endelige kliniske score.
- For at analysere den histopatologiske betingelse af tyktarmen væv, aflive mus ved intraperitoneal (i.p.) injektion med 1,2% (vol/vol) Avertin (0,6 mL/10 g kropsvægt) 7 dage post-DSS behandling. For at forberede en bestand af 100% avertin, mix 10 g af 2,2,2-tribromoethanol med 10 ml af tert-amylalkohol. Opbevares i mørke ved 4° C. Hvis du vil bruge, fortyndes 100% stock til 2% i vand.
- Isolere den kolon, og coecum, og måle længden af kolon5.
- Skåret 0.5 cm segmenter fra den distale colon og fix i en 15 mL falcon rør indeholdende 10 mL 10% formalin natten over. Vaske de faste væv med sorterede ethanol (75, 95 og 100%) og xylen. Integrere væv i paraffin og skær 6 mm sektioner for hæmatoxylin og eosin pletter8.
4. måling af epitel barriere permeabilitet i DSS-induceret Colitis mus
- Måle barriere permeabilitet 7 dage efter start af DSS administration.
- På dagen for analysen, holdbar mus til 3 h.
- Autoklave en sonde nål for at sikre, at steriliteten, derefter sonde mus med 150 µL 80 mg/mL 4 kDa FITC-dextran i sterilt vand, og holde den ubrugte FITC-dextran for at måle standardkurven efter serum samling. Veje mus for beregningen permeabilitet.
Bemærk: FITC-dextran løsningen bør foretages i vand. - Med en saks, klippe et 1 cm stykke af halen, og indsamle 100 µL af blod fra halen til serum indsamling rør. Spin den indsamlede blod på 10.000 x g i 10 min. ved stuetemperatur.
- Fortynd serum 1:4 i vand. At gøre en standard kurve, fortyndes ubrugte FITC-dextran med vand på 1: 300, 1:1, 000, 1:3, 000, 1:10, 000, 1:30, 000, 1: 100, 000, 1: 300, 000, 1:1, 000, 000 og 1:3, 000, 000. Tilsæt 100 µL/brønd af serum og standardkurven prøver i 96-brønd plader.
- Læs fluorescens i en Pladelæser med 485 excitation/528 emission. Beregne permeabilitet værdier baseret på standardkurven, og ganges med 4 at korrigere for fortynding.
- Opdele koncentrationen af FITC-dextran vægtprocent at normalisere værdier (dette hjælper normalisere forskellen i FITC-dextran levering hvis mus er syg og har tabt vægt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I kultur, Caco-2BBe celler vokse som en éncellelag og differentiere langsomt i modne lydabsorberende enterocytes, der har pensel grænser. I denne protokol, Caco-2BBe celler var belagt med en høj tæthed på polycarbonat membraner og celler nået 100% confluency en dag efter såning. Cellerne er imidlertid udifferentierede på dette stadium: for at fuldt differentiere cellerne, medierne ændres hver 2-3 dage til 3 uger. Celler var plettet med kerner og F-actin pletter for at vise forskellene mellem udifferentierede og differentierede celler. Stress fibrene ses tydeligt i udifferentierede celler. Sammenlignet med udifferentierede celler, har differentierede celler en mindre mængde, større kerner og færre stress fibre (figur 1).
TNF er central for intestinal barriere tab gennem MLCK-afhængige tight junction forordning. TER af celler uden eller med TNF behandlingen på forskellige tidspunkter blev analyseret. Som vist i figur 2, nedsætter TNF betydeligt TER af Caco-2BBe éncellelag i en dosisafhængig måde, hvilket tyder på, TNF øger epitelial permeabilitet.
Administration af DSS inducerer akut colitis i mus. Mus behandlet med DSS tabe sig markant i forhold til deres oprindelige kropsvægt (figur 3A). Sværhedsgraden af colitis er scoret af rektal prolaps, afføringen konsistens, blødning og aktivitet (figur 3B). Tværsnit af Colon væv farves med hæmatoxylin og eosin Vis Colon slimhinde skader i DSS behandlede mus (figur 3 c). Længden af kolon krypt er faldet i DSS behandlede mus (figur 3D). Kolon længde er afkortet i DSS behandlede mus (figur 3). Som det ses i figur 3F, er der ca en 2-fold stigning i FITC-dextran niveauer i DSS behandlede mus i forhold til at styre mus.
Figur 1: Caco-2BBe celler dyrkes på polycarbonat membraner. Celler kulturperler 1 dag (udifferentierede) og 3 uger (fuldt differentierede) efter plating farves med Hoechst 33342 (blå) til kernen og Alexa Fluor 594 Phalloidin til F-actin (rød). Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: TNF reducerer TER af Caco-2BBe éncellelag. Celler er primes med 10 ng/mL af IFNγ natten over. Den næste dag erstattes næringssubstratet med HBSS indeholdende 2,5 eller 7,5 ng/mL TNF. TER måles ved en epitelial meter (Volt/Ohm) på de angivne tidspunkter. Værdier er gennemsnit ± SEM, n = 4. Betydelige forskelle er markeret med * (p < 0,05) og ** (p < 0,01), som i forhold til TER værdier af celler uden TNF behandling, af to-sidede t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: DSS-induceret colitis i mus. C57BL/6 mandlige mus får 3,5% DSS i drikkevand i 7 dage. Body vægt (A) og kliniske scores (B) vurderes dagligt for hver gruppe (betyde ± SEM, n = 4 for hver gruppe). Control mus modtaget vand uden DSS. (C) histologiske analyse af Colon væv sektioner indsamlet på dag 7 indlæg – DSS behandling. (D) kolon krypt længder er målt på dag 7 indlæg – DSS behandling. (E) kolon længder er målt på dag 7 indlæg – DSS behandling. (F) permeabilitet af colon epitel måles på dag 7 indlæg-DSS behandling af FITC-Dextran sonde. Værdier er gennemsnit ± SEM, n = 4. Markante forskelle er markeret med * (p < 0,05 af to-sidede t-test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Score | Rektal prolaps | Afføringen konsistens | Blødning | Aktivitet |
| 0 | Ingen | Normal | Ingen | Aktive |
| 1 | Tegnet af prolaps | Blød | Rød | Nedsat aktivitet |
| 2 | Omfattende prolaps | Diarré | Brutto blødning | Sløv |
Tabel 1. Sygdommen klinisk Score
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere kritiske trin i protokollen. CaCO-2BBe (pensel grænse-udtrykker) celler er altid anvendes til TER måling, valgt fra Caco-2 cellelinie for udtryk for pensel-grænsen proteiner. CaCO-2BBe celler har en villus lydabsorberende fænotype når fuldt differentierede (efter ca 3 ugers kultur efter sammenløbet)17. Det er nødvendigt at undgå forurening under målingen og sterilisere elektrode. Fordi proceduren, der er ikke-sterile, kan der kun udføres målinger for op til 8 h i de fleste tilfælde. Under målingen besluttet vi resistance værdi af de to punkter i og uden for indsatsen. Modstand målinger på forskellige websteder kan undertiden høj grad varierer på grund af forskelle i tilstanden celle; Dette er en stor begrænsning af metoden. Denne variation kan dog være reduceret betydeligt af statistiske metoder og andre metoder. TER-metode kan anvendes til andre celler, såsom fastsættelse af pulmonal epitel celler og vaskulære endotel celler barriere integritet. Derudover kan TER målinger bruges i stof toksicitetstest.
Administration af ufordøjelige makromolekyler, som angiver den intestinale epitel gennem diffusion, kan bruges til at evaluere den intestinal permeabilitet. Fordelen ved denne metode er, at den barriere funktion i tarmen kan være undersøgt i vivo. Der findes flere typer af markører, der kan bruges, herunder radioisotoper, polyethylen glycoler og sukker18. Imidlertid flere faktorer bør overvejes til præcis måling af permeabilitet: (1) placeringen af gut barriere abnormitet kan ikke altid bestemmes nøjagtigt; og (2) slimhinde blodgennemstrømningen og gastrointestinale motilitet kan påvirke absorptionen og udskillelse af makromolekyler.
I denne undersøgelse, 4 kDa FITC-dextran blev administreret intragastrically i mus og mængden af FITC-dextran i mus serum blev målt. Denne metode har mange fordele. Mundtlige sonde reducerer mulige risici, der er forbundet med brug af lavement. For eksempel, kan utilsigtet svækkelse til Colon epitel være forårsaget af rektal instillation, fører til en falsk-positive resultat. Yderligere effekter forårsaget af stress, bør også fjernes. Permeabilitet er kendt for at øge når musene er stressede. Det anbefales at foretage en indledende eksperiment mindst en uge før den faktiske eksperiment. Udfører en praksis eksperiment vil hjælpe med at minimere eksperimentel støj til den virkelige eksperiment. Et wild-type kontrolelement (uden behandling) bør altid medtages.
FITC-dextran rejser gennem tyndtarmen og begynder at indtaste kolon 3 h efter gavaging. 3 h er således et ideelt tidspunkt til at måle små intestinal permeabilitet. Til måling af Colon permeabilitet, tiden kan udvides, men dette så bliver en balance mellem udsivningen af FITC-dextran i lumen og clearance af disse molekyler fra blodet. 4 h er generelt accepteret som et godt tidspunkt for Colon målinger.
Afslutningsvis to separate metoder blev beskrevet for at bestemme intestinal epitelcelle permeabilitet både in vitro- og in vivo. TER måling og FITC-dextran sonde metoder måle paracellular permeabilitet, forelaegge de enkelte uafhængige og adskilte egenskaber af paracellular permeabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Jerrold R. Turner, fra Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, for hans generøse hjælp med at gennemføre denne undersøgelse. Dette arbejde er støttet af National Natural Science Foundation i Kina (grant nummer 81470804, 31401229 og 81200620), Natural Science Foundation i Jiangsu provinsen (grant nummer BK20180838, og BK20140319), The forskning Innovation Program for College kandidater af Jiangsu provinsen (grant nummer KYLX16-0116), avanceret forskning projekter af Soochow University (grant nummer SDY2015_06), og Crohns & Colitis Foundation Research Fellowship Award (giver nummer 310801).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Black 96-well plates for fluorescence | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cells | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextran sulphate sodium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED with high glucose and sodium pyruvate | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epithelial (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modular Tissue Embedding Center | Leica | EG1150H | |
| Serum collection tubes | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 flask | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonate membranes (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pressure pump | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Rotary Microtomy | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
References
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target? Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).
- Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets. J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).
- Clayburgh, D. R., et al. A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability. J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).
- Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).
- Su, L., et al. Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis. Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).
- Zha, J. M., et al. Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells. Gene. 588, 1-6 (2016).
- He, W. Q., et al. Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1. Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).
- He, W. Q., et al. Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice. Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).
- Li, H. S., et al. Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development. Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).
- Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).
- Ye, D., Ma, T. Y. Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity. J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).
- Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability. Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).
- Peterson, M. D., Mooseker, M. S. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2. J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).
- Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).
