Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

התפשטות ובידול של קודמן מיאלואידית מאתר 32D/G-CSF-R תאים

Published: February 21, 2018 doi: 10.3791/57033
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,2
1Department of Hemato-Oncology, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Childhood Leukaemia Investigation Prague, Department of Paediatric Haematology and Oncology, 2nd Faculty of Medicine, Charles University
* These authors contributed equally

Summary

כאן מוצגים נתונים היסטוריים פרוטוקולים culturing הקו תא 32D/G-CSF-R מאתר קודמן מיאלואידית, ביצוע זיהומים נגיפיים של ביצוע מבחני התפשטות ובידול. הקו תא מתאים ללמוד פיתוח התאים מיאלואידית, ואת התפקיד של גנים של עניין גדילת התאים מיאלואידית ובידול neutrophilic.

Abstract

ההבנה של הביולוגיה תא גזע, קדמון hematopoietic יש השלכות חשובות על רפואה רגנרטיבית והטיפול של פתולוגיות hematological. למרות הנתונים הרלוונטיים ביותר שניתן לרכשה באמצעות מודלים ויוו או תרבויות העיקרי, שפע נמוכה של תאי גזע וקדמון hematopoietic מגבילה במידה ניכרת את הבריכה של טכניקות מתאימים עבור החקירה שלהם. לכן, השימוש של שורות תאים מאפשרת ייצור מספיק של חומר ביולוגי עבור הביצועים של הקרנות או מבחני הדורשות תאים גדולים מספרים. כאן אנו מציגים תיאור מפורט, בדיקה, פרשנות של מבחני התפשטות ובידול אשר משמשים לחקירה של תהליכים מעורבים myelopoiesis ובידול neutrophilic. ניסויים אלה מעסיקים הקו מהתא מיאלואידית מאתר 32D/G-CSF-R ציטוקינים, אשר ברשותה את היכולת להתרבות בנוכחות IL-3, להבדיל ב- G-CSF. אנו מספקים מותאם פרוטוקולים לטיפול 32D/G-CSF-R תאים, לדבר על החסרונות העיקריים והחסרונות שיכול לסכן את מבחני שתואר ואת התוצאות הצפויות. בנוסף, מאמר זה מכיל פרוטוקולים עבור ייצור lentiviral, retroviral טיטור, התמרה חושית של תאים 32D/G-CSF-R. נדגים כי מניפולציה גנטית של תאים אלה יכול להיות מועסק כדי לבצע בהצלחה לימודי פונקציונלי ומולקולרית, אשר יוכלו להשלים את התוצאות המתקבלות עם ראשי hematopoietic תאי גזע וקדמון או מודלים ויוו .

Introduction

האוכלוסייה גזע ו קדמון hematopoietic מספקת האורגניזם עם מגוון גדול של תאים בוגרים, כולל תאים מן השושלת מיאלואידית (נויטרופילים, אאוזינופילים, בזופילים, ו ומונוציטים). תהליך שמניע את הייצור של התאים מיאלואידית מתאי גזע hematopoietic ידוע בשם myelopoiesis, ייצור מספיק של התאים מיאלואידית בוגרים בתגובה לדרישות השוק המשתנות הוא תנאי הכרחי להתמודדות נכונה של האורגניזם עם הלחץ תנאים, כגון זיהומים ואובדן דם. ההפקה מספקת של התאים מיאלואידית בוגרים עלול להוביל לחוסר יכולת לחסל פתוגנים, קרישת דם מופחתת, ו אחרים סכנת חיים בתנאים1,2. בנוסף, שינויים בהתפתחות השושלת מיאלואידית עשוי גם להיות מזוהה עם hematological ממאירות, כגון לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML)3. שינויים myelopoiesis עלולה להתרחש מסיבות שונות, כגון פגמים משטח קולטני התא4, ביטויים מסולף של גורמי שעתוק5, ליקויי איתות המסלולים6, מוטציות וכתוצאה מכך היווצרות / הפעלה של oncogenes7או איון של הגידול משתיק קול גנים8.

פותחו שיטות שונות ללמוד פיתוח מיאלואידית, ואף להעריך את ההשפעה של שינויים גנטיים מסוימים בתהליך זה. גישות נפוצות המשמשות ללימוד myelopoiesis לערב ראשי התאים ואת העכברים הטרנסגניים. על פי מודלים אלה לאפשר רכישת נתונים רלוונטיים מבחינה ביולוגית, יש להם מגבלות מסוימות. השימוש העיקרי תאים מפגשים מספר מצומצם של תאים, תקופה מוגבלת של תרבות, צמצום האפשרויות לשינוי גנים וניתוח ביולוגי או ביוכימי עוקבות. העכברים הטרנסגניים יקרות ודורשים מידה סבירה של הצדקה ביולוגית. בנוסף, עבודה עם מודלים ויוו מוסיף דרגת המורכבות לתוך להבין את התפקיד של הגן עניין בתהליך נתונה. לכן, גישות אלטרנטיביות כדי לעקוף את מגבלות אלה נדרשים. שורות תאים יש יתרונות עוררין: (1) שהם בעלי יכולת התפשטות ללא הגבלה המאפשרת יצירת מספיק חומר עבור מחקרים ביוכימיים וביולוגיים, (2) הם רגישים מניפולציות גנטיות (נוקאאוט, נוקאאוט, ביטוי), (3) העלות היא נמוכה יחסית, (4) הם לאפשר מידה מסוימת של הפשטה ביולוגי הנדרשים גישות ניסיוניות מסוימים.

הורים IL-3 (אינטרלוקין-3) 32D תלויה שורת התאים הוקמה בשנת 1983 על ידי Greenberger ועמיתיו על-ידי זיהום של תאים במח העצם של עכברים C3H/HeJ עם החבר לוקמיה מאתר וירוס9. מספר שיבוטים 32D תוארו בספרות: cl-239, cl-310ו- cl-1011. התאים cl-3 32D הוצגו כדי להתרבות IL-3 עוברים התמיינות neutrophilic על טיפול עם מושבת גרנולוציט גירוי פקטור (G-CSF)10. להיפך, 32D cl-10 תאים, תוך כדי להיות איל-3 תלוי במקור היו לא המבדילים בתגובה לטיפול G-CSF. בשנת 1995 הקבוצה של ד ר איבו Touw transduced retrovirally 32D cl-10 תאים עם פראי סוג וצורות מוטציה של קולטן G-CSF (G-CSF-R), על מנת לזהות אזורים חשיבות תפקודית של קולטן זה11. מחקר זה הניב בדור של התאים 32D/G-CSF-R, אשר תלויות באופן דומה ב- IL-3, אבל בתוך 6 עד 10 ימים לאחר החלפה של IL-3 עם G-CSF, תאים להפסיק להתרבות, בלתי הפיך להתמיין נויטרופילים בוגרת. מאפיינים אלה להפוך 32D cl-3 תאים 32D/G-CSF-R מודלים מפושטת של התמיינות neutrophilic מאתר זה יכול להיות מווסת על ידי שני גורמים בידול - IL-3 ו- G-CSF וצמיחה מוגדרים היטב. בעשורים האחרונים קבוצות מרובות השתמשו 32D/G-CSF-R תאים ללמוד את התפקיד של גנים מסוימים התפשטות ו התמיינות של התאים מיאלואידית תרבות12,13,14,15 , 16, ללמוד G-CSF איתות17,18. חשוב לציין, התוצאות המתקבלות באמצעות הקו תא בקורלציה עם נתונים שהושגו עם ראשי תאים, העכברים הטרנסגניים16,19,20,21. כתוצאה מכך, אנו מאמינים כי תאים 32D/G-CSF-R, להיות דוגמנית בשימוש נרחב ומבוסס היטב, מייצגים מערכת יקר ללמוד התמיינות תאים מיאלואידים אשר יכול לשמש במקביל עם גישות אחרות מיעון השאלה הזאת.

. הנה, פרוטוקולים מפורט המתאר טיפול של הקו תא 32D/G-CSF-R, איזה כיסוי הרחבה בידול, הערכה של התפשטות, התמיינות של תאים אלה מוצג. מידע מפורט על ההנדסה הגנטית של תאים 32D/G-CSF-R, או על ידי התמרה חושית retroviral או lentiviral, וכן פרוטוקולים עבור טיטור וירוס הינם מסופקים. בנוסף, ניתנים מספר תוצאות נציג המדגימים יישומים אפשריים של תאים 32D/G-CSF-R.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: השלבים המתאר התרחבות, בידול, התמרה חושית של תאים 32D/G-CSF-R מוצגים להלן.

1. הכנה

  1. הכנה מדיה
    1. להכין 250 מ של תרבות בינוני: בינוני 1640 RPMI (רוזוול, מכון ממוריאל פארק) בתוספת 10% חום להשבית FBS (סרום שור עוברית) ואיל מאתר-3 (10 ng/mL).
      1. לחלופין, השתמש IL-3 מתוצרת בית. כדי לייצר תוצרת בית איל-3, מגלי HEK293 תאים עם וקטור לביטוי IL-3 ולאסוף את IL-3 המכיל supernatant22.
        הערה: אנטיביוטיקה, כגון פניצילין G (100 IU/mL), סטרפטומיצין (100 µg/mL) ו גנטמיצין (40 µg/mL), יכול לשמש עבור תא culturing בשלב כלשהו של הפרוטוקול אלא אם צויין אחרת.
    2. הכנת 50 מ של בידול בינוני: בינוני RPMI 1640 בתוספת 10% FBS ולאחר האנושי G-CSF (100 ng/mL).
      הערה: (חשוב) לא כל סרום אצוות תומך התמיינות של תאים 32D/G-CSF-R. לפני תחילת הניסוי מבחן קבוצות שונות של סרום. מומלץ לבדוק לפחות 4 קבוצות שונות, בחר של האופטימלית בהתבסס על היכולת של תאי 32D/G-CSF-R להבחין. ראה להלן פרוטוקול בידול 32D/G-CSF-R.
    3. הכינו 10 מ"ל של מדיום ההקפאה: בינוני RPMI 1640 בתוספת 40% FBS ולאחר 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד).
  2. הייצור של רטרווירוס
    1. צלחת השעיה תא בודד של תאים Bosc23 (6 × 106) בצלוחית 16 ס"מ, מטפחים את 18 מ ל DMEM (בינוני ששינה הנשר של Dulbecco) המכיל 10% FBS עד confluency של התרבות מגיע ל- 80% (24 שעות).
      הערה: תאים תגדל במקבצים טפט וטופס לא בתרבות. ספירת תאים יכול להתבצע באמצעות שיטות שונות (תקף למשך כל הפרוטוקולים המובאת כאן). במקרה של מספר נמוך של דגימות, ספירה ידנית תחת המיקרוסקופ באמצעות לשכת Bürker מומלץ. במקרה זה, השתמש Trypan blue עבור אי-הכללה של תאים מתים. מערבבים תאים 1:1 עם 0.4% Trypan Blue ב- PBS. כדי לבצע ספירה של מספר רב של דוגמאות, מונה הניתן תא אוטומטי יכול להיות מועסק.
    2. לשלב 40 µg של retroviral לבנות (כגון MSCV), µg 20 של pCL-Eco (אריזה וקטורית)23, µl 80 של פיי (polyethylenimine), ו 2 מיליליטר מופחתת-סרום בינונית (למשל Opti-מ) בינונית (ללא אנטיביוטיקה). דגירה תערובת זו עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    3. בזהירות להחליף Bosc23 תאים בינוני 16 מ"ל DMEM בתוספת 2% FBS. לחמם את המדיום עד 37 ° C לפני השימוש.
      הערה: אין להשתמש אנטיביוטיקה במהלך תרביות תאים, מאז זה עשוי להפחית את יעילות תרביות תאים.
    4. להוסיף את התערובת המבושלות 1.2.2. dropwise ובזהירות כדי Bosc23 את תרבות ולאחר תקופת דגירה של 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס. להגביל דגירה עד פחות מ 6-אייץ ' בשל רעילות פיי.
    5. לאחר דגירה, שנה את בינוני Bosc23 מ"ל 18 מראש חימם DMEM המכיל 10% FBS, ולטפח תאים עבור h 48-37 מעלות צלזיוס. במקום מנות במעבדה רמה 2 אבטחה, למנוע כאן צעד זה על ופעל נהלי הבטיחות הסטנדרטי.
    6. לאסוף Bosc23 בינוני (המכיל חלקיקי retroviral ecotropic) באמצעות פיפטה סרולוגית 25-mL לתוך צינור חרוטי 50-mL, ולאחסן ב 4 º C.
      הערה: יעילות תרביות תאים (חשוב) אמורים להגיע 90% כדי לייצר וירוס כייל נוגדנים גבוה.
    7. להוסיף 18 mL מראש חימם DMEM 10% FBS כדי Bosc23 תאים, מטפחים במשך 24 שעות ביממה.
    8. חזור על שלב 1.2.6.
      הערה: supernatants Retroviral 1.2.6 ו 1.2.8 יכול להיות איחדו ברגע שיגיעו הטמפרטורה זהה (4 ° C) כדי לשמר את שלמות ויראלי.
    9. כדי למנוע זיהום Bosc23 ב supernatants ויראלי, ספין וירוס שנאספו ב g 1500 × 10 דקות ב 4 º C. וירוס aliquot, הצמד ההקפאה באמצעות חנקן נוזלי או קרח יבש, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס. עם זאת, שימו לב את הוירוס הטרי של איכות גבוהה מבחינת זיהום יעילות יותר מניות קפוא.
      הערה: הימנע (חשוב) חוזרות הקפאה \ הפשרה של וירוס, שכן זה מוביל השפלה ויראלי.
  3. הפקה של lentivirus
    1. צלחת השעיה תא בודד של תאים (כליה עובריים אנושיים 293T) HEK293T (6 × 106) בצלוחית 16 ס מ, מטפחים את 18 מ של DMEM המכיל 10% FBS עד confluency של התרבות מגיע ל- 80% (24 שעות).
      הערה: תאים תגדל במקבצים טפט וטופס לא בתרבות.
    2. לשלב 15 µg של המבנה lentiviral (כגון pGhU6), אריזה pCMVdR8.74 פלסמידים (קידוד עבור החלטורה/pol, 12 µg) ו pMD2.VSVG (קידוד עבור VSV-G, 1.4 µg), פיי 85.2 µL ולאחר 2 מ"ל של מדיום מופחת-סרום (ללא אנטיביוטיקה). דגירה תערובת זו עבור 20 דקות ב- RT.
    3. בזהירות להחליף בינוני HEK293T מ"ל 16 של DMEM בתוספת 2% FBS. לחמם את המדיום עד 37 ° C לפני השימוש. אל תשתמש אנטיביוטיקה במהלך תרביות תאים, מאז זה עשוי להפחית את יעילות תרביות תאים.
    4. . זרוק את התערובת המבושלות 1.3.2 לתרבות תא HEK293T ובזהירות דגירה במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס. להגביל את משך הדגירה כדי בתוך 6 שעות כדי למנוע רעילות פיי.
    5. שינוי בינוני 18 מ ל מראש חימם DMEM 10% FBS ולטפח תאים עבור h 48-37 מעלות צלזיוס. במקום מנות במעבדה רמה 2 אבטחה, למנוע כאן צעד זה על ופעל נהלי הבטיחות הסטנדרטי.
    6. לאסוף HEK293T בינוני (המכיל חלקיקי lentiviral amphotropic) באמצעות פיפטה סרולוגית 25-mL לתוך צינור חרוטי 50 מ ל ואחסונו ב 4 º C.
      הערה: יעילות תרביות תאים (חשוב) אמורים להגיע 90% כדי לייצר וירוס כייל נוגדנים גבוה.
    7. מוסיפים בזהירות 18 מ של DMEM מראש ומחוממת 10% FBS לתאים HEK293T. מטפחים במשך 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס.
    8. חזור על שלב 1.3.6.
      הערה: supernatants Lentiviral מן 1.3.6 1.3.8 יכול להיות איחדו ברגע שיגיעו הטמפרטורה זהה (4 ° C) כדי לשמר את שלמות ויראלי.
    9. כדי למנוע זיהום ויראלי תגובת שיקוע עם תאים HEK293T, ספין וירוס שנאספו ב g 1500 × 10 דקות ב 4 º C. וירוס aliquot, הצמד ההקפאה באמצעות חנקן נוזלי או קרח יבש, ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס. עם זאת, שים לב להתמחויות וירוס זה של איכות גבוהה מבחינת זיהום יעילות יותר מניות קפוא.
      הערה: הימנע (חשוב) חוזרות הקפאה \ הפשרה של וירוס, שכן זה מוביל השפלה ויראלי.
  4. טיטור של וירוס המכיל כתב GFP
    1. זרע 1 × 105 תאים NIH/3T3 300 µL של DMEM 10% FBS לכל טוב לתוך צלחת 24-. טוב. 7 בארות המעולים וירוס אחד כייל נוגדנים.
    2. הפשרת וירוס ב 37 מעלות צלזיוס ולהוסיף 1, 5, 10, 50, 100 ו- 500 µL וירוס NIH/3T3 תרבויות. אל תוסיף כל וירוס לתוך הפקד שלילי. טוב. לטפח תאים בנוכחות הווירוס h 48-37 מעלות צלזיוס.
    3. הקציר NIH/3T3 תאים באמצעות 30 µL של טריפסין/EDTA (חומצה ethylenediaminetetraacetic) (0.25% טריפסין, EDTA 0.01% ב- PBS) והמקום התאים ב- PBS 250 µL בשפופרת FACS (מיון תא פלורסצנטיות מופעל).
    4. לקבוע את התדירות של תאים GFP+ על ידי cytometry זרימה כל מדגם24. הכללת תאים מתים על ידי תוספת של צבע הכדאיות, כגון Hoechst 33258.
    5. לחשב מספרים הכוללת את תאי ה-GFP+ (מבוסס על מספר התאים מצופה ואחוז תאי GFP+ ), מניחים אותם כנגד הנפח של וירוס זיהום.
      הערה: (חשוב) יעילות של זיהום מגיע מישור כאשר מינונים גבוהים ויראלי מוחלים. לכן, חשוב להעריך את כייל נוגדנים בהתבסס על ריכוזי ויראלי-איזה זיהום יעילות מתרחשת בטווח ליניארי (למשל שמוצג בטבלה 1). מספר התאים GFP+ מציין את מספר חלקיקים נגיפיים פונקציונלי (TU - הפיכת יחידות) באמצעי אחסון וירוס נתון. חשב מחדש את המספר של TU לכל mL.
  5. טיטור של וירוס המכיל כתב puromycin
    1. זרע 5 × 104 תאים NIH/3T3 3 מ"ל של DMEM 10% FBS לכל טוב בצלחת 6-טוב; מעסיקים 6 בארות כדי וירוס אחד כייל נוגדנים. תרבות בין לילה ב 37 º C.
    2. למחרת לדלל וירוס כמצוין בטבלה מס ' 2. כדי לדלל וירוס, להשתמש DMEM מראש ומחוממת 10% FBS. לא מערבולת.
    3. הסר בינוני תרבות מתאי NIH/3T3 ולהוסיף 1 מ"ל של וירוס מדולל.
    4. דגירה בין לילה ב 37 º C.
    5. בעדינות להחליף המדיום המכיל וירוס 2 מ של DMEM מראש ומחוממת 10% FBS, דגירה בין לילה ב 37 º C.
    6. בעדינות להחליף NIH/3T3 בינוני 2 מיליליטר ומחוממת מראש DMEM 10% FBS המכילים puromycin (2 µg/mL).
    7. תרבות-37 ° C ו בקפידה רענון בינוני עם puromycin כל 3 ימים או מתי בינוני לצהוב.
    8. ב 10-12 ימים לאחר ההדבקה, תשאף בינוני מכל קידוח, לשטוף בעדינות עם PBS.
    9. כתם עם 1 מ"ל של פתרון קריסטל ויולט (0.5% קריסטל ויולט ב 20% אתנול וביו -dH2O), 2 דקות ב RT, לשטוף היטב עם PBS פעמיים.
    10. ספירת כחול מושבות מציגים מכל קידוח תחת מיקרוסקופ (הגדלה X4). אין מושבות להתייחס בפקד שלילי. טוב.
    11. לחשב את מספרי הכולל של TU/mL שוקל את הפקטור דילול.

2. הרחבה ותחזוקה של תאים 32D/G-CSF-R

  1. אם תאים 32D/G-CSF-R מוקפאים, לקחת aliquot ואת להפשיר תאים בתוך אמבט מים 37 ° C עבור 1 דקות ויוצקים תאים המבחנה ישירות לתוך 10 מ"ל של מדיום RPMI 1640 ומחוממת מראש בתוספת 10% FBS בשפופרת 15-mL. ' היפוך ' ברכבת התחתית 3 פעמים, לסובב את התאים למטה-400 ג' × להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בתאים המכילים IL-3 בינוני תרבות-ריכוז של 0.3 × 106 תאים למ"ל.
  2. ריכוז גדילה אופטימלית בתא הוא 0.25-0.5 × 106 תאים למ"ל. לפצל תאים כל יומיים והביאה אותם בריכוז 0.1-0.2 × 106 תאים למ"ל.
    הערה: תאים 32D/G-CSF-R (חשוב) חלקית עלולים לאבד את היכולת שלהם להבחין בין אם גדל ריכוז גבוה יותר מאשר 1 × 106 תאים למ"ל. לכן, חשוב מאוד לפצל תאים 32D/G-CSF-R בזמן.
  3. לפי הצורך, להקפיא ולאחסן תא aliquots במשך פרקי זמן ארוכים ב- 80 ° C או בחנקן נוזלי. ספין למטה 3 × 106 תאים, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend ב 1 מ"ל של מדיום מקפיא. צינור המקום במיכל ההקפאה ב-80 מעלות צלזיוס. לאחסון לטווח ארוך, מיקום מחדש של תאים חנקן נוזלי.

3. התמרה חושית של תאים 32D/G-CSF-R

  1. צלחת 32D/G-CSF-R תאים לתוך צלחת 6-ובכן-ריכוז של 0.3 × 106 תאים למ"ל.
  2. להוסיף את הכמות המתאימה של וירוס להגיע MOI (ריבוי של זיהום) בין 10 ל- 40.
    הערה: MOI גבוהה יותר תגרום אחוז מוגברת של תאים GFP+ , כמו גם רמות גבוהות יותר של ביטוי של הגן עניין. דוגמה: להדביק × 10 0.36 תאים עם MOI של 10; 3 × 106 TU יהיה צורך להוסיף את התאים 32D/G-CSF-R.
  3. להוסיף polybrene הריכוז הסופי 8 µg/mL, תקופת דגירה של 6-אייץ '-37 מעלות צלזיוס. לחלופין, לבצע הליך ספין-חיסון: צנטריפוגה ב 1200 × g למשך 90 דקות ב 30 מעלות צלזיוס בצלחת culturing באמצעות רוטור סווינג-דלי ולאחר תקופת דגירה של h 3-37 מעלות צלזיוס.
  4. איסוף תאים, להעביר צינור 15-mL ויסתובב ב g × 450 במשך 5 דקות (4 ° C).
  5. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend מגורען תאים 6 מ של תרבות בינוני, למקם את T25 תא תרבות הבקבוק תרבות ב 37 º C.
  6. 48 שעות לאחר מכן, לקצור תאי ולסובב אותם ב g × 450 במשך 5 דקות (4 ° C). למחוק את תגובת שיקוע.
  7. במקרה של עיתונאי GFP: למקם את התאים µL 500 תאים GFP+ PBS ומיון באמצעות של סדרן cytometry זרימה. במקרה של כתב puromycin וקטורית: המקום התאים במדיום תרבות המכיל 2 µg/mL של puromycin.
  8. הרחב את התאים לפי הצורך עבור ניתוח נוסף וניסויים.
    הערה: תאים Transduced (אופציונלי) יכול להיות קפואים קפואים מדיה במיכל ההקפאה ב-80 מעלות צלזיוס, ומאוחסנים נוסף חנקן נוזלי.

4. 32D/G-CSF-R תא assay התפשטות

  1. כדי להעריך את התפשטות שיעור מקום 0.2 × 106 תאים ב- 1 מ"ל של תרבות בינוני, דגירה בין לילה ב 37 º C.
  2. למחרת לספור את מספר התאים, לדלל אותם בחזרה אל ריכוז של 0.2 × 106 תאים למ"ל באמצעות תרבות בינוני. דגירה בין לילה ב 37 º C. לשמור תיעוד של תא ריכוזים של דילולים חלה על התרבויות יומי באמצעות טבלה 3.
  3. חזור על שלב 4.2 במשך ימים רבים כמו התפשטות צריך להיות מוערך.
    הערה: האורך של מבחני התפשטות תלויות השפעת הגן עניין. במקרה של הפנוטיפ חזקה, 8-9 ימים עשויה להספיק לבחון השפעה משמעותית (ראה איור 3 א). עם זאת, במקרה של הפנוטיפ מתון, תקופות זמן ארוכות יותר ייתכן שיהיה צורך.
  4. להעריך גדילת התאים על ידי ביצוע עיקול התפשטות כמצוין בטבלה3.

5. 32D/G-CSF-R תא assay בידול

  1. רחץ תאים 32D/G-CSF-R6 × 10 0.2 פעמיים עם RPMI הבינונית ללא ציטוקינים.
    הערה: השלבים כביסה לפני חיבור של G-CSF אל התרבות חשובים, מאז נוכחות של איל שיורית-3 עלול לעכב בידול.
  2. מקום תאים 1 מ"ל בידול בינוני (מכיל 100 ננוגרם למ"ל G-CSF) ב 24 באר/צלחת, וכתוצאה מכך ריכוז תא של 0.2 × 106 תאים למ"ל (יום 0). תרבות בין לילה ב 37 º C.
  3. לספור את מספר תאים למ"ל כמצוין לעיל (שלב 1.2.1).
  4. Cytospin 2-5 × 104 תאים על משטח זכוכית (76 מ"מ X 26 מ"מ) באמצעות צנטריפוגה עם מתאמים הכרחי ב 20 × g.
  5. רענן התמיינות תאים בינונית, צלחת על ריכוז של 0.2 × 105 תאים למ"ל על 24 באר/צלחת (יום 1). למחוק את הלוח הישנה, והמשך יום למחרת עם צעד 5.6 עם הלוח החדש.
  6. בימים 2-7, חזור על שלבים 5.3 עד 5.5. להעריך את התפשטות תאים בנוכחות G-CSF כפי שמתואר בשלב 4.
    הערה: (חשוב) במהלך התמיינות, התפשטות תאים מאט, ולכן לאחר 3-4 ימים בנוכחות G-CSF היא מספקת את התרבות התאים בריכוזים גבוהים.
  7. להעריך את המדינה התמיינות של תאים 32D/G-CSF-R בהתבסס על מורפולוגיה תאים.
    1. לתקן תאים צעד 5.4 מתנול עבור 5 דקות ב RT ולהשאיר את השקופיות מילה נהדרת...
      הערה: שקופיות מיום 0 עד 7 יכול להיות מאוחסן ב- RT, קבוע בו זמנית. באופן דומה, הם יכולים גם להיות כל הזמן ב- RT לתקופות ארוכות לאחר קיבוע.
    2. כתם תאים באמצעות Giemsa מאי-גרונוולד מכתים הפרוטוקול של היצרן הבא.
    3. דמיינו תאים מוכתם באמצעות מיקרוסקופ הגדלה X40.
    4. לכמת את המספר של תקיעות, intermediately תאים בוגרים גרנולוציטים באמצעות תמונות המחשה על איור 1 , תיאור בטבלה4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התפשטות ובידול של תאים 32D/G-CSF-R

כדי להעריך את התפשטות של תאים 32D/G-CSF-R בתנאים pro-proliferative ובידול פרו, תאים 32D/G-CSF-R היו תרבותי בתקשורת המכיל IL-3 ו- G-CSF, בהתאמה. זה היה ציין כי חלוקת התאים תרבותי IL-3 המכיל בינוני (10 ng/mL) כ כל 24 שעות (איור 2 א). בעת החלפה של IL-3 עם התפשטות (100 ng/mL) G-CSF בהדרגה האט ועצר לאחר 4 ימים (איור 2 א). עוד יותר, המדינה התמיינות של תאים תרבותי בנוכחות G-CSF באמצעות תאים cytospun שהוכתמו מאי-גרונוולד Giemsa הוערך. זה הוצגה ביום 0 (לפני תחילת הטיפול G-CSF), תאים מציגים מורפולוגיה לא בשלה כמו myeloblast, המאופיינת על ידי גרעין גדול של הציטופלסמה כהה (איור 2B). במהלך הטיפול, גרעיני מוקטן והצורה של גרעין שינויים בצורת ירח או בצורת סופגניה. יתר על כן, הציטופלסמה מוגדלים ומאבד את צבע סגול כהה. לאחר 6 ימים של טיפול עם G-CSF, תאים מציג סימנים של בידול neutrophilic מלא, מאופיין על ידי גרעין lobulated של הציטופלסמה סגול בהיר (איור 2B). הבידול של תאים 32D/G-CSF-R הוא תהליך הדרגתי, שבו לא כל התאים להתפתח לכיוון בוגר נויטרופילים בדיוק באותה מהירות. כימות של תאים בשלבים שונים במהלך התמיינות (כלומר ההדף תא intermediately הבדיל, נויטרופילים) מוצג באיור 2B.

נוקאאוט Evi2b מאתר חוסם בידול neutrophilic בתאים 32D/G-CSF-R

עבור downregulation של EVI2B (Ecotropic ויראלי אינטגרציה אתר 2B) בתאי 32D/G-CSF-R, 3 Evi2b-מיקוד (Sh2, Sh3, Sh4) ו 1 ללא פילוח להשתיק ללא שליטה (NSC1) shRNAs תוכננו; אלה היו משובטים לתוך וקטור lentiviral נושא כתב GFP16. 32D/G-CSF-R התאים היו transduced עם שליטה, Evi2b-להשתיק shRNAs באמצעות MOI של 10. יומיים לאחר התמרה חושית, תאים GFP+ (transduced) היו ממוינים, הרחיבה לניסויים נוספים. במקרה של Sh3 ו Sh4, דלדול EVI2B הגיע 80%, אולם Sh2 הצליח ליצור רמות החלבון downregulate EVI2B ביעילות, ולכן שימש פקד נוספים התייחסו כאן כפקד שאינם להשתיק 2 (NSC2). ארבעה ימים לאחר התמרה חושית, בוצעו מבחני בידול והתפשטות בנוכחות G-CSF, הוערכו את ההשפעות של Evi2b downregulation בתהליכים אלה. זה היה ציין כי Evi2b-תאים מדולדל (Sh2, Sh3) ספג התפשטות תאים בנוכחות GCSF, ואילו תאי בקרה (NSC1 ו- NSC2) מופחת התפשטות סביב יום 4 (איור 3 א). יתר על כן, Evi2b-תאים 32D/G-CSF-R המושתק המיוצר פחות נויטרופילים ביניים ובוגרת לעומת תאים שליטה (איור 3B). למרבה הפלא, תאים transduced עם NSC2, אשר הפגינו יעילות תמונות ציפורים המסכן Evi2b , הראה גם תורגש ירידה במספר של נויטרופילים בוגרת (איור 3B). נתונים אלה היו שפורסמו לאחרונה16.

חלבון כימרי BCR-ABL פוגע neutrophilic התמיינות בתאים 32D/G-CSF-R

הוכח כי חלבון כימרי BCR-ABL פוגע התמיינות תאים מיאלואידים, גורם הרחבה נרחב של אבות מיאלואידית שתוצאתו כישלון hematopoietic במהלך שלב אקוטי של לוקמיה מיאלואידית כרונית25,26. מחקרים קודמים הראו כי ביטוי שנאכפת BCR-ABL ב 32D cl-3 תאים, גרמו בלוק של בידול נויטרופילים27,28. לכן, חקרנו אם היתה אפשרות להשיג תוצאות דומות עם הקו תא 32D/G-CSF-R. 32D/G-CSF-R התאים היו transduced עם BCR-ABL או פקד MSCV retroviral וקטור נושא כתב GFP (MOI = 20). יומיים לאחר התמרה חושית, התאים GFP+ היו ממוינים, הרחיב 2 שבועות בינוני המכיל IL-3. לאחר מכן, בוצעו מבחני בידול בנוכחות G-CSF. הבחנו כי ביום 0 (לפני העברת תאי G-CSF המכילות בינוני), לשלוט MSCV והציג BCR-ABL לבטא 32D/G-CSF-R תאים דומים מורפולוגיה, המייצג בעיקר ילדותי מיאלואידית הפיצוץ תאים (איור 4). עם זאת, הפגנו כי בעוד וקטור ריק תאים שליטה transduced עברו התמיינות neutrophilic לאחר 6 ימים של טיפול G-CSF (בהפקת 11.5% של נויטרופילים בוגרת 56.4% תאים intermediately), לא בוגר נויטרופילים היו שנוצר מתאי BCR-ABL-transduced ' 32D/G-CSF-R (איור 4). באופן עקבי, האחוז של הפיצוץ ילדותי בתאים לביטוי BCR-ABL ב- G-CSF נותרה דומה האחוז של הפיצוץ בתנאים IL-3.

Figure 1
איור 1. להחליפן בתמונות של נפרדות 32D/G-CSF-R תא מורפולוגיה. 32D/G-CSF-R תאים יכולים להיות מסווגים מורפולוגית כמו הפיצוץ, intermediately הבדיל תאים, ו נויטרופילים בוגרת. לקבלת תיאור, ראה בטבלה 4 .

Figure 2
באיור 2. התפשטות ובידול של תאים 32D/G-CSF-R. (א) התפשטות של תאים 32D/GCSFR 10 ננוגרם למ"ל IL-3 (קו שחור) או 100 ננוגרם למ"ל G-CSF (קו כחול) המכילים בינוני. ציר X מייצג ימי טיפול. ציר Y מוצג סרגל לוגריתמי (כניסה2), המציין את מספר התאים × 105. התוצאות מייצגים ממוצע של 3 ניסויים עצמאית. קווי שגיאה מציינות סטיית תקן. (B) התמיינות של תאים 32D/G-CSF-R ב- G-CSF-המכיל בינונית (100 ng/mL). הפאנל העליון, הפאי-החלקות להדגים אחוז של תקיעות (שחור), intermediately הבדיל תאים (ורוד), נויטרופילים (אדום) בתרבות לאחר 0, 2, 4, ו 6 ימים של טיפול G-CSF. הלוח התחתון מכיל תמונות נציג של תאים cytospun בהתאמה צבעונית עם מאי-גרונוולד Giemsa נקודות זמן. מינימום של 100 התאים הוערכו עבור כל נקודת זמן.

Figure 3
איור 3. Evi2b להשתיק חוסם בידול neutrophilic בתאים 32D-G-CSF-R. (א) התפשטות Evi2b-המושתק (קווים כתום) ותאים 32D/G-CSF-R בקרת (קווים שחורים) במדיום המכיל 100 ננוגרם למ"ל G-CSF. ציר X מייצג ימי טיפול. ציר Y מוצג סרגל לוגריתמי (כניסה2), המציין את מספר התאים × 105. תוצאות להדגים תוצאה נציג של 3 ניסויים עצמאית. (B) הערכה של התמיינות של תאים 32D/G-CSF-R transduced עם Evi2b-שליטה ואף shRNAs G-CSF-המכיל בינוני (100 ng/mL) באמצעות צביעת Giemsa מאי-גרונוולד של תאים cytospun. בחלונית העליונה, הפאי-החלקות להדגים אחוז של תקיעות (שחור), intermediately הבדיל תאים (ורוד), ו נויטרופילים (אדום) בתרבות. הלוחות התחתונה מכילים תמונות נציג של תאים cytospun. בידול נאמד ביום 7 של בידול. לפחות 100 התאים הוערכו עבור כל תנאי.

Figure 4
באיור 4. ביטוי של חלבון כימרי BCR-ABL פוגע התמיינות של תאים 32D/G-CSF-R. הערכה של התמיינות של תאים 32D/G-CSF-R transduced עם שליטה MSCV או הגן BCR-ABL פיוז'ן ב- G-CSF-המכיל בינונית (100 ng/mL). העוגה העליונה-מגרשים להדגים את הפרופורציה של תקיעות (שחור), intermediately הבדיל תאים (ורוד), ו נויטרופילים (אדום) ביום 6 של בידול. הלוחות התחתון הצג תמונות נציג של תאים cytospun מוכתם Giemsa מאי-גרונוולד. לפחות 100 התאים הוערכו עבור כל נקודת זמן.

וירוס V [µL] מספר תאים מצופים % GFP+ ספירת התאים GFP+ לינארי? טו/mL ממוצע (טו/mL)
1 100 000 1.83 1 830 כן 1 830 000 2 350 000
5 100 000 12.9 12 900 כן 2 580 000
10 100 000 26.4 26 400 כן 2 640 000
50 100 000 71.4 71 400 לא
100 100 000 85.1 85 100 לא
500 100 000 85.6 85 600 לא

טבלה 1. נחישות ויראלי כייל נוגדנים עבור כתב GFP המכיל וקטורים. דוגמא נתונים שהושגו עם הרטרו וירוס MSCV, חישוב שבוצעה כדי להעריך את כייל ויראלי. כייל נגיפי היה מחושב בהתבסס על מספר התאים GFP+ רכשה כאשר כמות מסוימת של וירוס היה מוחל. כמות המועסקים זיהום וירוס צריך להיות קשר ליניארי עם האחוז של תאים GFP+ נמדד. טו: הפיכת יחידות.

שפופרת תיאור tube DMEM + 10% FBS וירוס הנפח הכולל גורם לדילול
(ΜL) (ΜL) (ΜL)
1 דילול 1 1485 15 µL מניות ויראלי 1500 עונה 1 פרק 102
2 דילול 2 1350 150 µL צינור 1 1500 עונה 1 פרק 103
3 דילול 3 1350 150 µL צינור 2 1500 עונה 1 פרק 104
4 דילול 4 1350 150 µL צינור 3 1500 עונה 1 פרק 105
5 דילול 5 1350 150 µL צינור 4 1500 עונה 1 פרק 106

בטבלה 2. נחישות ויראלי כייל נוגדנים עבור הכתבת puromycin המכיל וקטורים. אסטרטגיה דילול ויראלית כדי לקבוע את כייל ויראלי ב puromycin המכיל וקטורים. בטבלה מציין כיצד להכין צינורות 5 (1-5) המכיל לדילול טורי של המניה ויראלי. צינור 1 מכיל 1485 µL DMEM + 10% FBS ו 15 µL של הווירוס המיוצר, מתן 1 × 102 מדולל וירוס. צינור 2 מכיל 1350 µL DMEM + 10% FBS ו- µL 150 × 10 12 מדולל וירוס (צינור 1), מתן 1 × 103 וירוס מדולל. צינור 3 מכיל 1350 µL DMEM + 10% FBS ו- 150 µL של 1 × 103 מדולל וירוס (צינור 2), מתן 1 × 104 וירוס מדולל. צינור 4 מכיל 1350 µL DMEM + 10% FBS ו- µL 150 מ 1 × 104 מדולל וירוס (צינור 3), מתן 1 × 105 וירוס מדולל. צינור 5 מכיל 1350 µL DMEM + 10% FBS ו- 150 µL של 1 × 105 מדולל וירוס (צינור 4), מתן 1 × 106 וירוס מדולל. 1 מ"ל משפופרות 1-5 משמש כדי כייל הוירוס.

תא נחשב (x = מספר תאים לכל ml)
יום 0 יום 1 יום 2 יום 3 יום 4 יום 5 יום 6
דוגמה 1 x0 x1 x2 x3 x4 x5 x6
דילול (d) (y = נפח התאים המשמש replating [mL]; z = נפח סופי [mL])
יום 0 יום 1 יום 2 יום 3 יום 4 יום 5 יום 6
דוגמה 1 d0= 1 d1= y1/z1 d2= y2/z2 d3= y3/z3 d4= y4/z4 d5= y5/z5
ספירת התאים הכולל
יום 0 יום 1 יום 2 יום 3 יום 4 יום 5 יום 6
דוגמה 1 x0 x1 /d0 x2/d1 x3/d2/d1 x4/d3/d2/d1 x5/d4/d3/d2/d1 x6/d5/d4/d3/d2/d1

בטבלה 3. דור עקומת הגדילה. הטבלה מתארת משוואות. הכרחי עבור הערכה של קצב התפשטות של תאים 32D/G-CSF-R.

גרעין ציטופלזמה
תקיעות כהה, מעוגל כהה, כמעט ולא מהגרעין
Intermediately הבדיל תאים מבטאים את השינויים בצורה גרעינית, לעיתים קרובות, כמו סופגנייה או דמויי הירח בצורת הציטופלסמה המצית, להבדיל
נויטרופילים בוגרת גרעין lobulated; כמעט אין קשרים בין האוניות הציטופלסמה אור

בטבלה 4. מורפולוגיה תא 32D/G-CSF-R במהלך התמיינות neutrophilic. הטבלה מסכמת את התכונות העיקריות מורפולוגיים המאפשרים הבחנה של תקיעות ילדותי, intermediately תאים בוגרים נויטרופילים. מאפייני גרעינית, cytoplasmic מתוארים. ראה איור 1 להחליפן בתמונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הבחירה של מדגם ניסיוני הוא אחד הנושאים המרכזיים במחקר. למרות ראשי תאים בעלי חיים ועל האדם הם האמינו כדי לייצר את הנתונים הרלוונטיים ביותר מבחינה ביולוגית, מודלים אלה עשויה להיות כרוכה חששות אתיים, הקשורים לעתים קרובות עם יקרים ו/או מתוחכם בידוד/culturing הליכים. ראשי תאים מוגבלים במספרים, קשה לתמרן אותם גנטית. בנוסף, ראשי תאים לייצג אוכלוסייה הטרוגנית המורכבת סוגי תאים שונים זה עלול לסבך את פרשנות הנתונים29. לעומת זאת, שורות תאים לספק מקור כמעט בלתי מוגבל של חומר ביולוגי, העלות האפקטיבית, אפשר לעקוף את סוגיות אתיות. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון את אותו תא קווים נחשבים מערכת ניסויית מלאכותי, אשר עשויים גנטית, phenotypically נבדלים שלהם רקמת המוצא. יחד עם זאת, תא קווים בשילוב עם גישות אחרות, מספקות מודל חשוב לדור של נתונים רלוונטיים מבחינה ביולוגית הדירים.

תא 32D/G-CSF-R קו, כמו גם 32D cl-3 תאים, ומבוססת הינם בשימוש נרחב תא מודלים תרבות של בידול neutrophilic מאתר14,15,24,30. מספר קבוצות מחקר יש להשתמש תאים אלה כדי להעריך את התפקיד של גנים מסוימים myelopoiesis, השיגו תוצאות בקורלציה עם נתונים שהושגו באמצעות ויוו מודלים ותאים הראשי16,31. כאן אנו מספקים פרוטוקול לטיפול קו תא 32D/G-CSF-R, עם זאת, ניתן להחיל נהלים דומים עבור culturing וטיפול 32D cl-3 תאים. חשוב לציין כי קבוצות שונות של התאים cl-3 32D להשתמש במעבדות שונות נוכח ההבדלים קריוטיפ, רומז כי ייתכן שתעבוד קבוצות שונות עם משלהם subclones32. על סמך התבוננות זו, אנו משערים כי השתנות גנטי דומה עשוי להיות נוכח בתאים 32D/G-CSF-R, זה צריך להילקח בחשבון בעת השוואת התוצאות שהושגו על ידי קבוצות מחקר שונות. מודלים תרבות אלטרנטיבית תא לתאי 32D/G-CSF-R הם מונצחים קדמון hematopoietic שורות22,33,34,35,36. גישה זו היא שימושית כאשר נדרשת הרחבה קדמון בקנה מידה גדול, למשל על מנת ללמוד אינטראקציות חלבון22. יתרון לתאים 32D/G-CSF-R היא כי ניתן להפיק מונצחים אבות של כל עכבר מהונדסים, למרות הזמן כדי לבסס את הקו הוא ארוך משמעותית37. בנוסף, טיפול ומניפולציה של מח העצם מונצחים אבות דורש יותר מומחית תאים 32D/G-CSF-R.

כדי להכיר את הקורא עם דגם 32D/G-CSF-R, בחלק הראשון של התוצאות נציג להדגים התפשטות ובידול קינטיקה של תאים 32D/G-CSF-R בנוכחות IL-3 ו- G-CSF. להחליפן בתמונות הממחיש את המורפולוגיה של תאי בתנאים מתרבים IL-3, כמו גם בנקודות זמן שונות של בידול GCSF-induced הוצגו. אנחנו מוערך בידול neutrophilic על ידי ניתוח מורפולוגי, אולם בעבר דווח כי 32D cl-3 תאית התמיינות יכול להיקבע על ידי ניתוח תזרים cytometric באמצעות CD11b תא סמן משטח27,31, 38,39. הידע והניסיון שלנו, CD11b אינה upregulated במהלך neutrophilic התמיינות של תאים 32D/G-CSF-R. התקינה, ב מבחני 32D/G-CSF-R התפשטות אנחנו מועסקים IL זמינים מסחרית-3. עם זאת, הבחנו כי התאים להתרבות גם תוצרת בית איל-3, המיוצר כפי שתואר על ידי Drobek ועמיתיו22. על מנת להשיג דרגת התמיינות neutrophilic G-CSF-induced טוב, חשוב לזכור כי יכולת התמיינות של תאים 32D/G-CSF-R יכול להיות לקוי, אם תאים מתורבתים מעל ריכוז 1 × 106 תאים/מ ל.... בנוסף, התואר ואת המהירות של בידול עשויה להיות מושפעת על ידי ההרכב סרום. לכן, מומלץ לבדוק יכולת התמיינות של תאים 32D/G-CSF-R בקבוצות FBS מספר, לבחור את זה טוב יותר תומך הפיתוח של נויטרופילים בוגרת על 6-9 ימים של תרבות בנוכחות G-CSF.

סיפקנו שני ניסויים נציג הממחיש את הדרכים האפשריות כדי ללמוד את התפקיד של חלבונים מסוימים בהתמיינות תאים מיאלואידים (איור 3 ו- 4 באיור). ראשית, הראנו את downregulation של EVI2B, חלבון טראנסממברנלי הביע בתאים hematopoietic, מוביל אל בלוק של התמיינות תאים מיאלואידים בתאים 32D/G-CSF-R. נתונים אלה פורסמו לאחרונה על-ידי הקבוצה שלנו, בשילוב עם מבחני מבוצעים על-ידי ראשי תאים, עכברים knockout Evi2b 16. שנית, אנחנו בדקו את ההשפעה של BCR-ABL, חלבון פיוז'ן הנובע t(9,22) הגנטי טרנסלוקציה (q34; q11), על neutrophilic התמיינות של תאים 32D/G-CSF-R. רוברטסונית זה זוהה במקור בחולים הסובלים לוקמיה מיאלואידית כרונית40,41. זה היה בעבר באיור את הביטוי הזה של BCR-ABL פיוז'ן oncoprotein cl-3 תאים 32D, שמוביל התמיינות תאים מיאלואידים מעצר27,28. כאן אנחנו הוכיח כי ביטוי BCR-ABL יש השפעות דומות על תאים 32D/G-CSF-R. שתי ערכות של הניסויים שהוצגו כאן (מעורבים Evi2b downregulation לבין ביטוי BCR-ABL), ההנדסה הגנטית של תאים 32D/G-CSF-R בוצעה באמצעות התמרה חושית ויראלי, אשר התוצאות. בביטוי הגנים יציב. הבחירה של retroviral לעומת משלוח lentiviral אינו משפיע על התפשטות או התמיינות של תאים 32D/G-CSF-R. עם זאת, זיהום lentiviral יעיל יותר מאשר התמרה חושית retroviral בשל נוכחותם של רטרווירוס אנדוגני בתאים 32D/G-CSF-R. הניסיון שלנו, תרביות תאים של תאים אלה באמצעות תקן ריאגנטים lipophilic אינה יעילה. אולם, אם הביטוי מבנה ארעי, תרביות תאים על-ידי אלקטרופורציה היא גישה מעשית42,43,44. . הנה, הצגנו מניפולציה גנטית של תאי 32D/G-CSF-R ולאחריו GFP מיון בצובר ניתוח של התאים הנגועים. עם זאת, במידת הצורך, מיון תא בודד יכול להיות מועסק כדי ליצור שיבוטים תא בודד כפי שדווחה בעבר12,45.

בנוסף מבחני התפשטות ובידול, תאים 32D/G-CSF-R יש כבר מועסקים בהצלחה לקבוע את התפקיד של חלבונים מסוימים בתוך התא ההעברה של אפופטוזיס13,46,47,48 . עוד, הקו 32D/G-CSF-R שימש לקביעת ציטוקין צמיחה עצמאית מתווכת על-ידי oncoproteins19,20. שורה נוספת בשימוש תכוף ללמוד ציטוקין עצמאותן היא Ba/F3 תאים21,49. Ba/F3 הוא קו מהתא מאתר IL-3 נגזר C3H העכבר זן, בדומה לתאים 32D/G-CSF-R. למרות שתי מערכות יכול להיות מועסק ללמוד הפצה עצמאית ציטוקינים, Ba/F3 תאים להבדיל בצורה גרועה בנוכחות G-CSF.

בסך הכל, אנו ממליצים כי תאים 32D/G-CSF-R, אבל להיות פחות מועדף מאשר ראשי תאים, מציעים מספר יתרונות כולל יכולת התפשטות ללא הגבלה, הטיפול הפשוט. אנו מאמינים כי לדור של נתונים אמינים, ניסויים שבוצעו בתאים 32D/G-CSF-R יש השלמה עם נתונים רכשה משתמש חלופי גישות ניסיוניות כגון מודלים מאתר ותרבויות העיקרי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים תודה פרופסור ruud ב Delwel פרופסור איבו Touw שסיפקו שורת התאים 32D/G-CSF-R, ואת פרופסור דניאל ג Tenen סיפק לנו שורת התאים Bosc23. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של הסוכנות מענק של הרפובליקה הצ'כית (GACR 15-03796S ו- GACR 17-02177S) כדי MA-J, תמיכה מן המכון לגנטיקה מולקולרית האקדמיה למדעים של הצ'כית (RVO 68378050) MA-J, מלגת GA בבריטניה (פרוייקט מס 341015) מ אוניברסיטת קארל בפראג ח"כ ולאחר מלגת GA בבריטניה (פרוייקט מס 1278217) מ אוניברסיטת קארל בפראג לתחנת משטרה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 powder medium Merck, Kenilworth, NJ, USA T 121-10 without NaHCO3, with L-glutamine
DMEM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15028
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 31985-047 L-Glutamine, Phenol Red
Fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) MT35011CV For differentiation of 32D/G-CSF-R cells
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270 Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells
Penicillin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) P3032
Streptomycin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) S9137 Streptomycin sulfate salt powder
Gentamicin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) G1914
murine IL-3 PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 213-13
human G-CSF PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 300-23
Polyethylenimine Polyscience, Warrington, PA, USA 23966 Linear, MW 25,000 (PEI 25000)
Polybrene Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) H9268
Trypsin VWR Chemicals, Radnor, PA, USA 0458
EDTA Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) E5134
Crystal violet Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) C0775
Trypan blue Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) T6146
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) D2650
May-Grünwald Giemsa DiaPath, Martinengo, BG, Italy 10802

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
  2. Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
  3. Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
  4. Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
  5. Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
  6. Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
  7. Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
  8. Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
  9. Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
  10. Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
  11. Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
  12. Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
  13. Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
  14. Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
  15. Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
  16. Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
  17. Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
  18. Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
  19. Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
  20. Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270 (2006).
  21. Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
  22. Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
  23. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  24. Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
  25. Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
  26. Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
  27. Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
  28. Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
  29. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  30. Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
  31. Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46 (2017).
  32. Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
  33. Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
  34. Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
  35. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
  36. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
  37. Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082 (2013).
  38. Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
  39. Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
  40. Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
  41. Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
  42. Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
  43. Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
  44. Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
  45. Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
  46. Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
  47. Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
  48. Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
  49. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 132 תאים 32D/G-CSF-R קודמן מיאלואידית מאתר תאים תרבית נוזלית בידול נויטרופילים התפשטות ציטוקינים IL-3 G-CSF
התפשטות ובידול של קודמן מיאלואידית מאתר 32D/G-CSF-R תאים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zjablovskaja, P., Danek, P.,… More

Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. J. Vis. Exp. (132), e57033, doi:10.3791/57033 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter