Summary
여기 자세한 위한 프로토콜 murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R 셀 라인 경작, 수행 하는 바이러스 성 감염, 확산 및 감 별 법 분석 실험 수행 되 게 됩니다. 이 셀 줄은 골수성 세포 개발, 골수성 세포 성장 및 neutrophilic 분화의 유전자의 역할을 공부 하 고 적합 합니다.
Abstract
조 혈 줄기와 조상 세포 생물학의 이해 재생 의학 및 혈액 병 리 치료에 대 한 중요 한 의미를 갖는다. 가장 관련성이 높은 데이터를 취득 될 수 있다 vivo에서 모델 또는 기본 문화권을 사용 하 여에 불구 하 고 조 혈 줄기와 조상 세포의 낮은 풍부 상당히 그들의 조사에 대 한 적합 한 기술을 풀을 제한 합니다. 따라서, 세포의 사용 검사 또는 큰 휴대 번호를 필요로 하는 분석의 성능에 대 한 생물학 자료의 충분 한 생산을 수 있습니다. 여기 자세한 설명, 판독, 및 myelopoiesis 및 neutrophilic 분화에 관련 된 프로세스의 조사를 위해 사용 되는 확산 및 감 별 법 분석 실험의 해석 하는 것이 선물이. 이러한 실험 32D/G-CSF-R cytokine 종속 murine 골수성 세포 선, IL-3의 확산 및 G-CSF 차별화 능력을 보유 하 고 사용 합니다. 32D/G-CSF-R 셀을 처리 하기 위한 프로토콜 최적화 제공 하며 주요 함정 및 기술된 분석 및 예상된 결과 손상 시킬 수 있는 단점에 대해. 또한,이 문서 lentiviral retroviral 생산, 적정, 및 32D/G-CSF-R 셀의 변환에 대 한 프로토콜을 포함합니다. 이 세포의 유전자 조작 기본 조 혈 줄기와 조상 세포 또는 vivo에서 모델 결과 보완할 수 있는 기능과 분자 연구를 성공적으로 수행을 채택 될 수 있다 설명 합니다.
Introduction
조 혈 줄기 및 조상 인구 유기 체 세포 (호 중구, 호 산 구는, basophils, 및 monocytes) 골수성 계보에서를 포함 하 여 성숙한 셀의 큰 범위를 제공 합니다. Myelopoiesis, 조 혈 줄기 세포에서 골수성 세포의 생산을 구동 하는 과정 이라고 변화 하는 요구에 대 한 응답에서 골수성 세포로 성숙의 적절 한 생산 이며 스트레스와 유기 체의 적절 한 대처에 대 한 전제 조건 조건, 감염 등 혈액 손실입니다. 성숙한 골수성 세포의 부족 한 생산 병원 체, 감소 된 혈액 응고, 및 다른 생명을 위협 조건1,2를 발생할 수 있습니다. 또한, 골수성 혈통 개발에서 변경 관련 혈액 악성 종양, 급성 골수성 백혈병 (AML)3등 된 수도 있습니다. Myelopoiesis 변경 결함 세포 표면 수용 체4, 녹음 방송 요인5, 변경된 식에에서 장애 신호 경로6, 변이 형성의 결과로 같은 다양 한 이유로 인해 발생할 수 있습니다 / 7oncogenes 또는 종양 억제기 유전자8의 비활성화의 활성화.
다양 한 방법은 골수성 개발, 연구 하 고이 과정에서 특정 유전자 변경의 영향을 평가 개발 되었습니다. Myelopoiesis를 공부 하는 데 사용 하는 일반적인 방식 기본 세포와 유전자 변형 쥐를 포함 한다. 이러한 모델 생물학 관련 데이터의 수집을 허용, 하지만 그들은 특정 제한이 있다. 일차 전지를 사용 하 여 셀의 수를 제한 및 변경 유전자 발현 및 후속 생물 학적 또는 생화학 분석 가능성을 축소 하는 문화의 제한 기간 발생 합니다. 유전자 변형 쥐 비용이 고 생물 칭의의 합리적인 학위 필요. 또한, vivo에서 모델 작업 지정된 된 프로세스에 관심사의 유전자의 역할을 이해 복잡성의 정도 추가 합니다. 따라서, 이러한 제한을 우회 하는 대체 접근 필요 합니다. 셀 라인 명백한 이점이 있다: (1) 그들은 생 화 확 및 생물 학적 연구에 대 한 충분 한 자료를 생성 수 무제한 확산 능력을가지고, (2) 그들은 (최저, 녹아웃, 유전자 조작에 취약 overexpression), (3) 비용은 상대적으로 낮은, 그리고 (4) 그들은 생물 학적 단순화 특정 실험적인 접근에 필요한 정도의 허용.
부모의 일 3 (인터 루 킨-3) 종속 32D 셀 라인에서 친구 murine 백혈병 바이러스9C3H/HeJ 마우스 골 수 세포의 감염에 의해 Greenberger와 동료에 의해 1983 년에 설립 되었다. 여러 32D 클론 문학에서 설명 했다: cl-239, cl-310및 cl 1011. 32D cl-3 셀 IL 3에 증식 하 여 치료 granulocyte-콜로 니 자극 인자 (G-CSF)10시 neutrophilic 차별화를 받아야 표시 했다. 그와 반대로, 32D cl-10의 세포, IL-3 의존 하면서 원래 했다 하지 차별화 G-CSF 치료에 대 한 응답. 1995 년에 박사가 보 Touw의 그룹 retrovirally이 수용 체11의 기능적으로 중요 한 영역을 식별 하기 위해 야생 종류와 돌연변이 형태의 G-CSF 수용 체 (G-CSF-R) 32D cl-10 셀을 불리고. 이 연구 결과 마찬가지로 IL 3에 의존, 32D/G-CSF-R 세포의 생성 하지만 IL-3 G-CSF의 교체 후 6 ~ 10 일 이내 셀 격 증 하 고 irreversibly 성숙한 호 중구로 차별화를 중지 합니다. 이러한 속성 32D cl-3 및 2 개의 잘 정의 된 성장과 감 별 법 요인-일 3 G-CSF로 변조 수 murine neutrophilic 차별화의 32D/G-CSF-R 셀 단순화 된 모델을 확인 합니다. 지난 십년 동안 여러 그룹 사용 32D/G-CSF-R 셀 확산에 특정 유전자의 역할 및 문화12,13,,1415 에 골수성 세포의 분화 연구 , 16, 그리고 G-CSF 신호17,18공부 하. 중요 한 것은,이 셀 라인을 사용 하 여 얻은 결과 기본 세포와 유전자 변형 마우스16,19,,2021얻은 데이터와 상관 된다. 따라서, 우리가 널리 사용 하 고 잘 설립 모델, 32D/G-CSF-R 셀 골수성 차별화 병행이이 문제를 해결 하는 다른 접근에 사용 될 수 있는 연구에 귀중 한 시스템 대표 믿습니다.
여기, 상세한 프로토콜 32D/G-CSF-R 셀 라인의 처리를 설명 하는 커버 확장, 차별화, 및 확산의 평가 및 이러한 셀의 제공 됩니다. 32D/G-CSF-R 세포의 유전 수정에 대 한 자세한 정보를 retroviral 또는 lentiviral 변환 뿐만 아니라 바이러스 적정에 대 한 프로토콜에 의해 제공 됩니다. 또한, 32D/G-CSF-R 세포의 잠재적인 응용 프로그램을 보여 주는 몇 가지 대표적인 결과 제공 됩니다.
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Protocol
참고: 확장을 설명 하는 단계, 차별화, 및 32D/G-CSF-R 셀의 변환 되 게 됩니다 아래.
1입니다. 준비
- 미디어 준비
- 문화 매체의 250 mL 준비: 10% 열 보충 (로스웰 파크 기념 연구소) RPMI 1640 매체 비활성화 FBS (태아 둔감 한 혈 청) 및 murine IL-3 (10 ng/mL).
- 또는 집에서 만든 IL-3를 사용 하 여. 집에서 만든 IL 3 생산, IL-3 표현 벡터와 HEK293 세포 transduce 하 고 IL-3 표면에 뜨는22를 포함 하를 수집 합니다.
참고: 항생제, 페니실린 G 등 (100 IU/mL), 스 (100 µ g/mL), 및 gentamicin (40 µ g/mL), 달리 명시 하지 않는 한 프로토콜의 어떤 단계에서 세포 배양에 사용할 수 있습니다.
- 또는 집에서 만든 IL-3를 사용 하 여. 집에서 만든 IL 3 생산, IL-3 표현 벡터와 HEK293 세포 transduce 하 고 IL-3 표면에 뜨는22를 포함 하를 수집 합니다.
- 차별 매체의 50 mL를 준비: RPMI 1640 매체 보충 10 %FBS, 그리고 인간의 G-CSF (100 ng/mL).
참고: 모든 혈 청 일괄 지원 32D/G-CSF-R 세포의 분화 (중요). 실험 시작 전에 혈 청의 다른 배치를 테스트 합니다. 4 다른 일괄 처리를 테스트 하 고 최적의 32D/G-CSF-R 세포의 분화 능력에 따라 선택 하는 것이 좋습니다. 32D/G-CSF-R 차별화 프로토콜 아래를 참조 하십시오. - 냉동 매체의 10 mL를 준비: RPMI 1640 매체 보충 40 %FBS, 그리고 10 %DMSO (디 메 틸 sulfoxide).
- 문화 매체의 250 mL 준비: 10% 열 보충 (로스웰 파크 기념 연구소) RPMI 1640 매체 비활성화 FBS (태아 둔감 한 혈 청) 및 murine IL-3 (10 ng/mL).
- 레트로 바이러스의 생산
- Bosc23 셀 (6 × 106) 16 cm 배양 접시의 단일 세포 현 탁 액을 접시 하 고 10 %FBS 문화의 confluency까지 도달 80% (24 시간)를 포함 하는 18 ml DMEM (Dulbecco의 수정이 글의 중간)의 육성.
참고: 셀 문화에 단층 및 하지 양식 수 풀에서 성장 해야 합니다. 셀 세은 (여기에 제시 된 프로토콜의 나머지 부분에 대 한 유효한) 다른 방법을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 샘플의 낮은 수의 경우 현미경 Bürker 챔버를 사용 하 여 수동 계산 것이 좋습니다. 이 경우에, Trypan blue를 사용 하 여 죽은 세포의 배제에 대 한. 셀 1:1 혼합 0.4 %Trypan 파랑 PBS에. 샘플의 많은 수의 계산을 수행 하려면 자동 셀 카운터를 사용할 수 있습니다. - Retroviral 구문 (예: MSCV) 40 µ g, pCL 에코 (포장 벡터)23의 20 µ g, 페이 (polyethylenimine)의 80 µ l 감소-혈 청 매체 (예: Opti 메모리) (항생제) 없이 매체의 2 mL을 결합 합니다. 실 온 (RT)에서 20 분 동안이 혼합물을 품 어.
- 신중 하 게 Bosc23 세포 매체 16 mL DMEM 2% 보완 대체 FBS. 미리 따뜻하게 사용 하기 전에 37 ° C에 매체.
참고:는 transfection 효율을 줄일 수 있습니다 그것 때문에, transfection, 동안 항생제를 사용 하지 마십시오. - 1.2.2에 혼합물을 추가 합니다. dropwise을 신중 하 게는 Bosc23 문화, 고 37 ° c.에 4 h에 대 한 품 어 미만 6 h 페이 독성 때문에 외피를 제한 합니다.
- 부 화, 이후 18 ml Bosc23 매체 변경 사전 예 열 10% 포함 된 DMEM FBS, 37 ° c.에서 48 h에 대 한 셀을 육성 요리는 biosafety 수준 2 실험실에서 여기에,이 단계에서 계속 놓고 표준 안전 절차를 따르십시오.
- Bosc23 매체 (포함 ecotropic retroviral 입자) 50 mL 원뿔 튜브로 25 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 수집 및 4 ° c.에 저장
참고: (중요) Transfection 효율 높은 titer 바이러스 생산 90% 도달 한다. - 추가 18 mL 미리 따뜻하게 DMEM 10 %FBS Bosc23 세포와 24 h에 대 한 육성.
- 1.2.6 단계를 반복 합니다.
참고: 일단 바이러스 무결성을 유지 하기 위해 동일한 온도 (4 ° C) 도달 하면 Retroviral supernatants 1.2.6 1.2.8에서 풀링된 수 있습니다. - Bosc23 바이러스 supernatants 오염을 방지 하려면 스핀 4 ° c.에서 10 분 동안 1500 × g에서 수집 된 바이러스 Aliquot 바이러스, 동결 드라이 아이스 나 액체 질소를 사용 하 여 스냅 그리고-80 ° c.에 저장 그러나, 그 갓된 바이러스는 냉동된 주식 보다 감염 효율 측면에서 높은 품질의 note.
참고: (중요) 피하 반복적인 동결/녹고 바이러스, 때문에 그것은 바이러스 성 저하로 연결
- Bosc23 셀 (6 × 106) 16 cm 배양 접시의 단일 세포 현 탁 액을 접시 하 고 10 %FBS 문화의 confluency까지 도달 80% (24 시간)를 포함 하는 18 ml DMEM (Dulbecco의 수정이 글의 중간)의 육성.
- Lentivirus의 생산
- 플레이트 HEK293T (인간 미 발달 신장 293T) 셀 (6 × 106) 16 cm 배양 접시의 단일 세포 현 탁 액 그리고 18 mL 10 %FBS 문화의 confluency까지 도달 80% (24 시간)를 포함 된 DMEM의 육성.
참고: 셀 문화에 단층 및 하지 양식 수 풀에서 성장 해야 합니다. - 15 µ g lentiviral 구문 (예: pGhU6), 플라스 미드 pCMVdR8.74 (개 그/폴, 12 µ g에 대 한 인코딩) 포장의 결합 및 pMD2.VSVG (1.4 µ g VSV G에 대 한 인코딩), 85.2 µ L 페이, 그리고 감소-혈 청 (항생제) 없이 매체의 2 mL. 실시간에서 20 분 동안이 혼합물을 품 어
- 신중 하 게 2% 보완 DMEM의 16 mL HEK293T 매체를 바꿉니다 FBS. 미리 따뜻하게 사용 하기 전에 37 ° C에 매체. Transfection 효율을 줄일 수 있습니다 그것 때문에, transfection, 동안 항생제를 사용 하지 마십시오.
- 신중 하 게 HEK293T 세포 배양에 1.3.2에 혼합물을 삭제 하 고 37 ° c.에 4 h에 대 한 품 어 페이 독성을 방지 하기 위해 6 h 이내에 부 화 기간을 제한 합니다.
- 변경 매체 18 mL를 미리 예 열 DMEM 10% FBS 37 ° c.에서 48 h에 대 한 셀을 육성 요리는 biosafety 수준 2 실험실에서 여기에,이 단계에서 계속 놓고 표준 안전 절차를 따르십시오.
- HEK293T 매체 (포함 amphotropic lentiviral 입자) 50 mL 원뿔 튜브로 25 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 수집 하 고 4 ° c.에 그것을 저장합니다
참고: (중요) Transfection 효율 높은 titer 바이러스 생산 90% 도달 한다. - 신중 하 게 추가 미리 따뜻하게 DMEM의 18 mL 10% FBS HEK293T 셀에. 37 ° c.에 24 시간 배양
- 1.3.6 단계를 반복 합니다.
참고: 일단 바이러스 무결성을 유지 하기 위해 동일한 온도 (4 ° C) 도달 하면 Lentiviral supernatants 1.3.6 1.3.8에서 풀링된 수 있습니다. - HEK293T 세포와 바이러스 상쾌한의 오염을 방지 하려면 스핀 4 ° c.에서 10 분 동안 1500 × g에서 수집 된 바이러스 Aliquot 바이러스, 동결 드라이 아이스 나 액체 질소를 사용 하 여 스냅 그리고-80 ° c.에 그것을 저장합니다 그러나, 알 갓 바이러스 준비 냉동된 주식 보다 감염 효율 측면에서 높은 품질의.
참고: (중요) 피하 반복적인 동결/녹고 바이러스, 때문에 그것은 바이러스 성 저하로 연결
- 플레이트 HEK293T (인간 미 발달 신장 293T) 셀 (6 × 106) 16 cm 배양 접시의 단일 세포 현 탁 액 그리고 18 mL 10 %FBS 문화의 confluency까지 도달 80% (24 시간)를 포함 된 DMEM의 육성.
- GFP 기자를 포함 하는 바이러스의 적정
- 씨앗 DMEM의 300 µ L에 1 × 105 NIH/3T3 세포 10% FBS 24-잘 접시에 잘 당. 7 웰 스 한 바이러스 titer에 채택 될 것입니다.
- 37 ° C에서 바이러스를 해 동 하 고 추가 1, 5, 10, 50, 100 그리고 500 µ L 바이러스 NIH/3T3 문화. 추가 하지 마십시오 어떤 바이러스 부정적인 제어에 잘. 37 ° c.에서 48 h에 대 한 바이러스의 세포 배양
- NIH/3T3 세포의 트립 신/EDTA (ethylenediaminetetraacetic 산) 30 µ L를 사용 하 여 수확 (0.25 %Trypsin, PBS에 0.01 %EDTA) FACS (형광 활성화 된 세포 분류) 튜브에 250 µ L PBS에 셀을 배치 하 고.
- 각 샘플24cytometry 여 GFP+ 세포의 주파수를 결정 합니다. Hoechst 33258 같은 생존 염료의 추가 의해 죽은 세포를 제외 합니다.
- GFP+ (도금된 셀 수와 GFP+ 세포의 비율에 따라), 세포의 총 숫자를 계산 하 고 바이러스 감염에 대 한 사용의 볼륨에 대 한 플롯.
참고: 감염의 (중요) 효율 도달 고원 큰 바이러스 성 복용량 적용 됩니다 때. 따라서, 그것은 효율성 선형 범위 (예를 들어 표 1에 표시 된)에서 발생 하는 어떤 감염에 바이러스 농도에 따라 titer를 추정 하는 것이 중요. GFP+ 셀 수 주어진된 바이러스 볼륨에서 기능 바이러스 성 입자 (TU-단위 변환)의 수를 나타냅니다. ML 당 투 수를 다시 계산.
- Puromycin 기자를 포함 하는 바이러스의 적정
- 시드 3 ml DMEM의 5 × 104 NIH/3T3 세포 10% FBS 6 잘 플레이트;에 잘 당 6 우물 titer 1 바이러스를 사용 합니다. 37 ° c.에 하룻밤 문화
- 표 2에 표시 된 대로 다음 날 바이러스 희석. 바이러스, 희석을 사용 하 여 미리 따뜻하게 DMEM 10 %FBS. 와 동 하지 마십시오.
- NIH/3T3 세포에서 문화 매체를 제거 하 고 희석된 바이러스의 1 mL를 추가 합니다.
- 37 ° c.에서 밤새 품 어
- 부드럽게 바꿉니다 바이러스 포함 된 매체 미리 따뜻하게 DMEM의 2 mL 10 %FBS, 고 37 ° c.에서 밤새 품 어
- 부드럽게 NIH/3T3 매체를 바꿉니다 미리 따뜻하게 DMEM 10 %FBS 포함 puromycin (2 µ g/mL)의 2 mL.
- 37 ° C 그리고 puromycin 매 3 일을 신중 하 게 새로 고침 매체 또는 중간 노란색에 문화.
- 감염 후 10-12 일, 각 우물에서 매체를 발음 하 고 PBS로 부드럽게 씻어.
- 크리스탈 바이올렛 솔루션 (20% 에탄올과 dH2O 0.5% 크리스탈 바이올렛)의 1 mL와 stain RT, 2 분 하 고 신중 하 게 PBS와 두 번 씻어.
- 각 잘 (X4 확대) 현미경에 파란색 식민지를 계산 합니다. 아니 식민지 부정적인 제어에 잘 관찰 해야.
- TU/mL 희석 요인 고려의 총 숫자를 계산 합니다.
2. 확장 및 32D/G-CSF-R 셀의 유지 보수
- 32D/G-CSF-R 셀이 고정 되어 있으면 한 약 수 1 분 동안 37 ° C 물 욕조에 세포를 해 동 하 고 10% 보충 미리 따뜻하게 RPMI 1640 매체의 10 mL에 직접 유리병에서 세포를 부 어 15 mL 튜브에서 FBS. 튜브 3 시간 및 400 × g.에 아래로 셀 스핀 반전 상쾌한을 제거 하 고 0.3 × 106 셀/mL의 농도에서 IL-3 포함 문화 매체에 셀 resuspend.
- 최적의 세포 성장 농도 0.25-0.5 × 106 셀/mL. 0.1-0.2 × 10의 농도에 그들을 데리고 2 일 마다 셀 분할6 셀/mL.
참고: (중요) 32D/G-CSF-R 셀 부분적으로 그들의 능력을 1 × 106 셀/mL 이상의 농도에 성장 하는 경우를 차별화 하를 잃을 수 있습니다. 따라서, 그것은 매우 시간에 32D/G-CSF-R 셀을 분할 하는 것이 중요입니다. - 필요에 따라 동결 하 고 오랜 기간-80 ° C에 또는 액체 질소에 대 한 셀 aliquots를 저장 합니다. 3 × 106 셀 아래로 회전 시키십시오, 상쾌한, 제거 하 고 냉동 매체의 1 mL에 resuspend. 튜브-80 ° c.에는 냉동 컨테이너에 배치 장기 저장을 위해 액체 질소를 셀 위치를 변경할.
3. 32D/G-CSF-R 셀의 변환
- 0.3 × 106 셀/mL의 농도에서 6 잘 플레이트에 플레이트 32D/G-CSF-R 셀.
- 10과 40 사이 나 (감염의 다양성)에 도달 하는 바이러스의 적절 한 금액을 추가 합니다.
참고: 높은 MOI는 GFP+ 세포의 증가 비율으로 관심사의 유전자의 표현의 상부에서 발생 합니다. 10;의 나와 셀 0.3 × 106 감염 예: 3 × 106 화 32D/G-CSF-R 셀에 추가 해야 합니다. - 최종 농도 8 µ g/mL에 polybrene를 추가 하 고 37 ° c.에 6 h에 대 한 품 어 또는 스핀 접종 절차: 스윙 양동이 터를 사용 하 여 자란 접시에 30 ° C에서 90 분 동안 1200 × g에서 원심 고 37 ° c.에 3 h에 대 한 품 어
- 수집 셀, 15 mL 튜브에 전송 하 고 5 분 (4 ° C) 450 × g에서 회전.
- 상쾌한, 수송과 세포 배양의 6 ml에서 resuspend, T25 세포 배양 플라스 크, 고 37 ° c.에서 문화에
- 48 h 후, 세포를 수확 하 고 5 분 (4 ° C) 450 × g에서 그들을 회전. 폐기는 상쾌한.
- GFP 기자 경우: 500 µ L 흐름 cytometry 정렬을 사용 하 여 PBS 및 정렬 GFP+ 셀의 셀 배치. Puromycin 기자 벡터를 포함 하는 경우: puromycin의 2 µ g/mL를 포함 하는 배양 세포 에서도.
- 추가 분석 및 실험에 대 한 필요에 따라 셀을 확장 합니다.
참고: (선택 사항) Transduced 셀 미디어-80 ° C에서 냉동 컨테이너에서에 냉동 고 추가 액체 질소에 저장 될 수 있습니다.
4. 32D/G-CSF-R 세포 확산 분석 결과
- 확산 속도 0.2 × 106 세포 배양의 1ml에 평가 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어를
- 셀의 수를 계산 하는 다음 날 고 문화 매체를 사용 하 여 0.2 × 106 셀/mL의 농도에 다시 그들을 희석. 37 ° c.에서 밤새 품 어 세포 농도 및 표 3를 사용 하 여 매일 문화에 적용 하는 희석의 기록을 유지.
- 로 확산 평가 하는 데 필요한 많은 일에 대 한 4.2 단계를 반복 합니다.
참고: 확산 분석 실험의 길이 관심사의 유전자의 영향에 따라 달라 집니다. 강한 형의 경우 8-9 일 (참조 그림 3A)는 상당한 효과 관찰 하기에 충분 한 수 있습니다. 그러나, 가벼운 표현 형의 경우 오랜 시간 필요할 수 있습니다. - 표 3에 표시 된 대로 확산 곡선을 함으로써 세포 성장을 평가 합니다.
5. 32D/G-CSF-R 세포 감 별 법 분석 결과
- 0.2 × 106 32D/G-CSF-R 세포 cytokines 없이 RPMI 매체와 두 번 씻는 다.
참고: 문화 G-CSF의 추가 하기 전에 세척 단계 중요 하다, 때문에 잔여 일 3의 존재는 차별화를 억제 수 있습니다. - 1 mL 차별화 매체 (100 ng/mL G-CSF 포함)는 24 잘/접시 셀 농도 0.2 × 106 셀/mL (0 일)의 결과에 셀을 배치 합니다. 37 ° c.에 하룻밤 문화
- 셀/mL (1.2.1 단계) 위에 표시 된의 수를 계산 합니다.
- Cytospin 2-5 × 104 셀 (76 X 26 mm) 유리 슬라이드에 20 × g에서 필요한 어댑터와 원심 분리기를 사용 하 여.
- 24 잘/접시 (1 일)에 0.2 × 105 셀/mL의 농도에서 차별화 매체와 플레이트 셀을 새로 고칩니다. 오래 된 접시를 삭제 하 고 날 새로운 플레이트 5.6 단계를 진행.
- 2 ~ 7 일에 5.3-5.5 단계를 반복 합니다. 단계 4에서에서 설명한 G-CSF의 세포 증식을 평가 합니다.
참고: (중요) 차별화, 동안 세포 증식 속도가 느려집니다, 따라서 G-CSF의 3 ~ 4 일 후 그것은 높은 농도에 문화 세포에 적절 한. - 셀 형태에 따라 32D/G-CSF-R 세포의 분화 상태를 평가 합니다.
- RT 5 분에 대 한 메탄올에 5.4 단계에서 셀을 수정 하 고 건조를 슬라이드를 둡니다.
참고: 하루 0 ~ 7에서에서 슬라이드에 RT, 저장 고 동시에 고정 될 수 있습니다. 마찬가지로, 그들은 또한 보관할 수 있습니다 RT에 고정 후 오랜 동안. - 5 월-그 룬 발트 Giemsa 얼룩 다음 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여 셀을 얼룩.
- 확대 X40 및 현미경을 사용 하 여 얼룩진된 셀을 시각화.
- 계량 수 폭발, 판매인 차별화 된 세포와 성숙한 granulocytes 설명 그림을 사용 하 여 그림 1 과 표 4에 설명.
- RT 5 분에 대 한 메탄올에 5.4 단계에서 셀을 수정 하 고 건조를 슬라이드를 둡니다.
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Representative Results
확산 및 32D/G-CSF-R 세포의 분화
32D/G-CSF-R 프로 증식 및 프로 차별화 조건 하에서 세포의 확산을 평가, 32D/G-CSF-R 셀 IL 3, G-CSF, 각각 포함 된 미디어에서 경작 했다. IL-3 포함 매체 (10 ng/mL)에 경작 하는 세포 (그림 2A) 약 24 시간 모든 분할 관찰 되었다. G-CSF (100 ng/mL) 확산 점차적으로 감속 하 고 4 일 (그림 2A) 후 중지와 IL-3의 교체 시. 또한, G-CSF cytospun 5 월-그 룬 발트 Giemsa 얼룩 세포를 사용 하 여 존재 배양 세포의 분화 상태 평가 했다. 그것은 하루 0 (G-CSF 치료의 시작) 전에,에 셀 미 숙 myeloblast 같은 형태학, 큰 핵과 어두운 세포질 (그림 2B)에 의해 특징을 제시 표시 했다. 치료의 과정 동안 핵 크기 감소와 달 모양의 핵 변경 또는 도넛 모양 모양. 또한, 세포질 확대 하 고 진한 바이올렛 색을 잃는다. G-CSF와 치료의 6 일 후 셀 전체 neutrophilic 차별화, lobulated 핵과 빛 바이올렛 세포질 (그림 2B)에 의해 특징의 징후를 제시. 32D/G-CSF-R 세포의 분화는 점진적 과정, 모든 셀 정확한 동일한 속도로 성숙 호 중구 쪽으로 진화. 차별화 (즉 폭발, 판매인 차별화 된 셀 및 neutrophil)의 과정 동안 여러 단계에서 세포의 정량화는 그림 2B에 표시 됩니다.
Murine Evi2b 최저 차단 32D/G-CSF-R 셀에 neutrophilic 차별화
Downregulation의 EVI2B에 대 한 (Ecotropic 바이러스 성 통합 사이트 2B) 32D/G-CSF-R 셀, 3 Evi2b-(Sh3, Sh2 Sh4)를 대상으로 하 고 1 비 대상으로 입을 비 제어 (NSC1) shRNAs 설계 되었습니다; 이러한 GFP 기자16들고 lentiviral 벡터에 복제 했다. 32D/G-CSF-R 세포 제어 및 Evi2b불리고 있었다-10 나를 사용 하 여 shRNAs를 입을. 2 일 후 변환, GFP+ (불리고) 셀 정렬, 되었고 추가 실험에 대 한 확장. 그러나 Sh2 downregulate EVI2B 단백질 수준을 효율적으로 하지 못했습니다 하 고 따라서 추가 제어로 사용 되었다 여기 참조 경우 Sh3 및 Sh4, EVI2B 소모는 80%에 도달, 비 입을 제어 2 (NSC2)로. 변환, 후 4 일 G-CSF, 존재 감 별 법 그리고 확산 분석 실험 수행 하 고 이러한 프로세스에서 Evi2b downregulation의 효과 평가 했다. 그것은 관찰 되었다 그 Evi2b-고갈 된 셀 (Sh2, Sh3) 지속 존재 GCSF, 세포 증식 제어 셀 (NSC1 및 NSC2) 하루 4 (그림 3A) 확산을 감소 하는 반면. 또한, Evi2b-침묵된 32D/G-CSF-R 셀 생산 제어 셀 (그림 3B)에 비해 적은 중간 및 성숙한 호 중구. 놀랍게도, 가난한 Evi2b 최저 효율 시연, NSC2로 불리고 세포도 성숙 호 중구 (그림 3B)의 수에 약간의 감소를 보였다. 이러한 데이터는 최근에 출판 된16했다.
BCR ABL 융합 단백질 손상 32D/G-CSF-R 셀에 neutrophilic 차별화
BCR ABL 융합 단백질 손상 골수성 차별화, 만성 골수성 백혈병25,26의 급성 단계 동안 조 혈 실패 귀착되는 골수성 창시자의 광범위 한 확장을 일으키는 것으로 표시 되었습니다. 이전 학문 32D cl-3 셀에 BCR ABL의 적용된 식 블록 호 중구 차별화27,28의 결과 설명 했다. 따라서, 우리는 32D/G-CSF-R 셀 라인으로 비슷한 결과 얻을 수 있는지 조사 합니다. 32D/G-CSF-R 셀 BCR ABL 또는 제어 MSCV retroviral 벡터 들고 GFP 기자로 불리고 있었다 (나 = 20). 변환, 후에 2 일 GFP+ 셀 정렬 하 고 IL 3 포함 매체에 2 주 동안 확장 했다. 다음, 차별화 분석 G-CSF의 수행 했다. 우리 날 0 (전송 하기 전에 셀 G-CSF 포함 매체), MSCV 제어 BCR ABL 32D/G-CSF-R 세포 표현 제시 비슷한 형태, 주로 미 숙 골수성 폭발 세포 (그림 4)를 나타내는 것을 관찰. 그러나, 우리는 빈 벡터 동안 불리고 제어 셀을 받았다 G-CSF (성숙 호 중구의 11.5%와 56.4% 판매인 차별화 된 셀의 생산), 치료의 6 일 후 neutrophilic 차별화 아니 시연 성숙 호 중구 BCR ABL 불리고 32D/G-CSF-R 셀 (그림 4)에서 생성 했다. 일관 되 게, BCR ABL 표현 셀 G-CSF에 미숙한 폭발의 비율 남아 IL-3 조건에서 폭발의 비율이 비슷한.
그림 1입니다. 고유한 32D/G-CSF-R의 대표 이미지 셀 형태학. 32D/G-CSF-R 세포 형태학 상으로 폭발으로 분류 될 수 있다, 판매인 분화 세포와 성숙한 호 중구. 설명 표 4 를 참조 하십시오.
그림 2입니다. 확산 및 32D/G-CSF-R 셀의. (A) 매체 포함 된 10 ng/mL IL-3 (검은 선) 또는 100 ng/mL G-CSF (파란 선) 32D/GCSFR 셀의 확산. X 축은 치료의 일을 나타냅니다. Y 축 눈금 (로그2)에 표시 되 고 셀 × 105의 수를 나타냅니다. 결과 3 독립적인 실험의 평균을 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. (B) 32D/G-CSF-R G-CSF 포함 된 매체 (100 ng/mL)에서 세포의 감 별 법. 상단 패널에서 파이-플롯 폭발 (검정)의 비율을 보여, 판매인 분화 세포 (분홍색), 및 호 중구 문화 0, 2, 4, 후에 (빨간색)와 G-CSF 치료의 6 일. 각각에서 cytospun 셀의 대표 이미지를 포함 하는 낮은 패널 포인트 5 월-그 룬 발트 Giemsa로 얼룩진 시간. 최소 100 셀의 각 시간 지점에 대해 평가 했다.
그림 3입니다. Evi2b 입을 32D-G-CSF-R 셀에 neutrophilic 차별화를 차단합니다. (A) Evi2b의 확산-입 막 음된 (오렌지 라인) 및 컨트롤 (검은 선) 32D/G-CSF-R 셀 100 ng/mL G-CSF 포함 매체에. X 축은 치료의 일을 나타냅니다. Y 축 눈금 (로그2)에 표시 되 고 셀 × 105의 수를 나타냅니다. 결과 3 독립적인 실험의 대표적인 결과 보여 줍니다. Evi2b로 불리고 32D/G-CSF-R 세포의 분화의 (B) 평가-입 및 제어 shRNAs G-CSF 포함 된 매체 (100 ng/mL)에서 cytospun 셀의 5 월-그 룬 발트 Giemsa 얼룩을 사용 하 여. 상단 패널에서 파이-플롯 폭발 (검정)의 비율을 보여, 판매인 (분홍색), 세포 및 호 중구 (레드) 문화에 분화. 낮은 패널 cytospun 셀의 대표 사진을 포함합니다. 차별화는 차별화의 7 일에 평가 했다. 적어도 100 셀 각 조건에 대해 평가 했다.
그림 4입니다. BCR ABL 융합 단백질의 overexpression 32D/G-CSF-R 세포의 손상. 32D/G-CSF-R 세포의 분화의 평가 불리고 제어 MSCV 또는 G-CSF 포함 된 매체 (100 ng/mL)에 BCR ABL 융합 유전자. 위 파이-플롯 폭발 (검정)의 비율을 보여, 판매인 차별화의 날 6 (분홍색), 세포 및 호 중구 (레드) 분화. 낮은 패널 5 월-그 룬 발트 Giemsa로 얼룩진 cytospun 세포의 대표적인 사진을 표시 합니다. 적어도 100 셀 각 시간 지점에 대해 평가 했다.
| 바이러스 V [µ L] | 도금 된 셀의 개수 | GFP+ % | GFP+ 세포 수 | 선형? | TU/mL | 평균 (TU/mL) |
| 1 | 100 000 | 1.83 | 1 830 | 예 | 1 830 000 | 2 350 000 |
| 5 | 100 000 | 12.9 | 12 900 | 예 | 2 580 000 | |
| 10 | 100 000 | 26.4 | 26 400 | 예 | 2 640 000 | |
| 50 | 100 000 | 71.4 | 71 400 | 아니요 | ||
| 100 | 100 000 | 85.1 | 85 100 | 아니요 | ||
| 500 | 100 000 | 85.6 | 85 600 | 아니요 |
표 1입니다. 바이러스 titer GFP 기자 포함 하는 벡터에 대 한 결정입니다. 바이러스 titer를 추정 하는 MSCV 레트로 바이러스와 계산으로 얻은 데이터의 예를 수행. 바이러스 titer GFP+ 세포 바이러스의 특정 금액 적용 된 취득의 수에 따라 계산 했다. 바이러스 감염에 대 한 고용의 양을 측정 하는 GFP+ 세포의 백분율을 가진 선형 상관 관계에 있어야 합니다. 부 엉: 단위 변환.
| 튜브 | 튜브 설명 | DMEM + 10% FBS | 바이러스 | 총 볼륨 | 희석 비율 |
| (Μ L) | (Μ L) | (Μ L) | |||
| 1 | 희석 1 | 1485 | 15 µ L 바이러스 성 주식 | 1500 | 1 x 102 |
| 2 | 희석 2 | 1350 | 150 µ L 튜브 1 | 1500 | 1 x 103 |
| 3 | 희석 3 | 1350 | 150 µ L 튜브 2 | 1500 | 1 x 104 |
| 4 | 희석 4 | 1350 | 150 µ L 튜브 3 | 1500 | 1 x 105 |
| 5 | 희석 5 | 1350 | 150 µ L 튜브 4 | 1500 | 1 x 106 |
표 2입니다. 바이러스 titer puromycin 기자 포함 하는 벡터에 대 한 결정입니다. 바이러스 희석 전략 puromycin 포함 하는 벡터에에서 바이러스 titer 결정 하. 표 (1-5) 포함 하는 바이러스 성 주식의 직렬 희석 5 튜브를 준비 하는 방법을 나타냅니다. 튜브 1 포함 1485 µ DMEM L + 10 %FBS 및 1 × 102 를 제공 하는 생산된 바이러스의 15 µ L 희석 바이러스. 튜브 2 포함 1350 µ DMEM L + 10 %FBS 및 1 × 102 의 150 µ L 희석 바이러스 (튜브 1), 1 × 103 희석된 바이러스를 제공. 튜브 3 포함 1350 µ DMEM L + 10 %FBS 및 1 × 103 의 150 µ L 희석 바이러스 (튜브 2), 1 × 104 희석된 바이러스를 제공. 튜브 4 포함 1350 µ DMEM L + 10 %FBS 및 1 × 104 의 150 µ L 희석 바이러스 (관 3), 1 × 105 희석된 바이러스를 제공. 튜브 5 포함 1350 µ DMEM L + 10 %FBS 및 1 × 105 의 150 µ L 희석 바이러스 (튜브 4), 1 × 106 희석된 바이러스를 제공. 1 ml 튜브 1-5에서에서 사용 되는 바이러스 titer를.
| 셀 계산 (x = ml 당 세포의 수) | |||||||
| 하루 0 | 제 1 일 | 제 2 일 | 제 3 일 | 제 4 일 | 제 5 일 | 제 6 일 | |
| 샘플 1 | 0 x | 1 x | x2 | x3 | x4 | 5 x | 6 x |
| 희석 (d) (y = [mL]; replating에 사용 되는 셀의 볼륨 z = 최종 볼륨 [mL]) | |||||||
| 하루 0 | 제 1 일 | 제 2 일 | 제 3 일 | 제 4 일 | 제 5 일 | 제 6 일 | |
| 샘플 1 | d0= 1 | d1= y1/z1 | d2y2/z2 = | d3= y3/z3 | d4= y4/z4 | d5= y5/z5 | |
| 총 세포 수 | |||||||
| 하루 0 | 제 1 일 | 제 2 일 | 제 3 일 | 제 4 일 | 제 5 일 | 제 6 일 | |
| 샘플 1 | 0 x | 1 /d0 x | 2/d1 x | 3/d2/d1 x | 4/d3/d2/d1 x | 5/d4/d3/d2/d1 x | 6/d5/d4/d3/d2/d1 x |
테이블 3입니다. 성장 곡선 생성. 표에서 32D/G-CSF-R 세포의 확산 속도의 평가에 필요한 방정식.
| 핵 | 세포질 | |
| 폭발 | 어둡고, 둥근 | 어두운, 핵에서 거의 구별할 수 없는 |
| 판매인 세포 분화 | 종종 도넛 모양의 핵 형태로 변화를 발음 또는 달 같은 모양 | 가볍고, 구별할 수 세포질 |
| 성숙한 호 중구 | Lobulated 핵; lobules 사이의 연결이 거의 없음 | 빛 세포질 |
표 4. neutrophilic 차별화 동안 32D/G-CSF-R 셀 형태학. 테이블 요약 주요 형태학 기능 미 숙 폭발, 판매인 차별화 된 세포와 성숙한 호 중구의 구별을 사용 합니다. 핵과 세포질 특성 설명 되어 있습니다. 대표 이미지 그림 1 을 참조 하십시오.
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Discussion
실험적인 모델의 연구의 주요 문제 중 하나입니다. 기본 인간과 동물 세포 가장 생물학적으로 관련 데이터를 생산으로, 이러한 모델 윤리적 우려를 포함할 수 있습니다 고은 종종 비싼 및 정교한 분리/배양 절차와 관련 된. 1 차 셀 숫자에 제한 됩니다 그리고 유전자 조작 하기 어렵다. 또한, 1 차 셀 데이터 해석29을 복잡 하 게 수 있습니다 다양 한 세포 유형의 구성 유형이 다른 인구를 대표 한다. 대조적으로, 셀 라인 생물학 물자의 거의 무제한 소스 제공, 비용 효과, 고을 윤리적인 문제를 무시할. 그러나, 그것은 라인 유전자 수는 근원의 그들의 조직에서 다 phenotypically 인공 실험 시스템 간주 됩니다 해당 셀을 고려 하는 것이 중요. 그럼에도 불구 하 고, 셀 라인 다른 실험적인 접근법과 결합 될 때, 재현할 수 및 생물학 관련 데이터의 생성에 대 한 유용한 모델을 제공 합니다.
32D cl-3 셀 뿐 아니라 32D/G-CSF-R 셀 라인, 잘 설립 하 고 널리 이용 되는 세포 문화 모델 murine neutrophilic 차별화14,15,,2430의. 여러 연구 그룹에서 myelopoiesis, 특정 유전자의 역할을 평가 하기 위해 이러한 세포를 사용 있고 vivo에서 모델 및 1 차 셀16,31를 사용 하 여 얻은 데이터와 상관 하는 결과 얻었습니다. 그러나 여기 우리 32D/G-CSF-R 셀 라인을 처리 하기 위한 프로토콜을 제공,, 유사한 절차 경작 하 고 32D cl-3 셀에 적용할 수 있습니다. 그것은 지적 32D cl-3 셀의 다른 배치 다른 실험실에서 현재 차이 karyotype, 다른 그룹 그들의 자신의 subclones32일 하 수 있습니다 제안에 사용 하는 것이 중요. 이 관찰을 바탕으로, 우리가 가설 유전적 다양성 마찬가지로 32D/G-CSF-R 셀에 있을 그리고이 다양 한 연구 그룹에 의해 얻은 결과 비교 하는 때 고려 될 필요가. 32D/G-CSF-R 셀에 다른 셀 문화 모델은 불멸 하 게 조 혈 모 조상 라인22,33,,3435,36. 이 방법은 대규모 조상 확장 예를 들어에 필요한 경우 유용 단백질 상호 작용22공부. 32D/G-CSF-R 셀에 장점은 시간 라인을은 상당히 긴37어떤 유전자 변형된 마우스에서 불멸 하 게 창시자를 생성할 수 있습니다 것입니다. 또한, 처리 및 골 불후 창시자의 조작 32D/G-CSF-R 셀 보다 더 많은 전문 지식을 필요 합니다.
32D/G-CSF-R 모델의 대표적인 결과의 첫 번째 부분에는 독자를 우리 IL 3, G-CSF의 32D/G-CSF-R 세포의 증식과 분화 활동을 설명 했다. GCSF 유도 분화의 다른 시간 지점에서 뿐만 아니라 IL 3 확산 조건에서 셀의 형태를 보여 주는 대표적인 이미지 제시 했다. 그러나 그것은 알려졌다 32D cl-3 세포 분화는 CD11b 세포 표면 마커27,31를 사용 하 여 흐름 cytometric 분석에 의해 결정 될 수 있다 우리 형태소 분석, neutrophilic 분화 평가 38,39. 우리의 지식과 전문성, CD11b은 upregulated 32D/G-CSF-R 셀의 neutrophilic 차별화 하는 동안. 표준화, 32D/G-CSF-R 확산 분석 실험에서 우리가 상용 IL-3 사용. 그러나, 우리는 셀 집에서 만든 IL-3, Drobek와 동료22에 설명 된 대로 생산에서 잘 증식을 관찰. G-CSF 유도 neutrophilic 차별화의 좋은 학위를 얻으려면, 그것은 경우 셀 1 × 106 셀/mL의 농도 이상 교양 32D/G-CSF-R 세포의 분화 능력 손상 될 수 있습니다 기억 하는 것이 중요. 또한, 학위와 차별화의 속도 수 있습니다 영향을 받을 혈 청 성분으로. 따라서, 몇 개의 FBS 배치에, 32D/G-CSF-R 세포의 분화 능력을 테스트 하 고 더 나은 문화 G-CSF 존재의 6 ~ 9 일에 성숙 호 중구의 개발을 지 원하는 것을 선택 하는 것이 좋습니다.
우리는 골수성 차별화 (그림 3 및 그림 4)에 있는 특정 단백질의 역할을 연구 하기 가능한 방법을 보여 주는 두 개의 대표적인 실험 제공. 32D/G-CSF-R 셀에 골수성 차별화의 블록 조 혈 모 세포에 표현 하는 막 횡단 단백질 첫째, 리드 EVI2B의 그 downregulation를 살펴보았습니다. 이러한 데이터 분석 1 차 셀 및 Evi2b 녹아웃 쥐16를 사용 하 여 수행과 함께에서 우리의 그룹에 의해 최근에 출판 되었다. 둘째, 우리는 32D/G-CSF-R 셀의 neutrophilic 차별화에 BCR ABL, (q34; q11)를 유전 전 t(9,22)에서 유래 융해 단백질의 효과 조사. 이 전 원래 만성 골수성 백혈병40,41고통 받아 환자에서 확인 되었다. 그것은 이전 골수성 차별화 체포27,2832D cl-3 셀 리드에서 그 표현의 BCR ABL 융합 oncoprotein 표시 했다. 여기 우리 BCR ABL overexpression 32D/G-CSF-R 셀에 비슷한 효과가지고 입증. 실험의 두 세트에서 ( Evi2b downregulation BCR ABL overexpression 포함) 여기에 제시 된, 32D/G-CSF-R 세포의 유전자 조작 바이러스 성 변환, 안정적인 유전자 발현을 통해 수행 되었다. Lentiviral 배달 대 retroviral의 확산 또는 32D/G-CSF-R 세포의 분화에 영향을 미치지 않습니다. 그러나, lentiviral 감염 32D/G-CSF-R 셀에 내 인 성 레트로 바이러스의 존재로 인해 retroviral 변환 보다 더 효율적입니다. 우리의 경험에의 하면 표준 질 성 시 약을 사용 하 여 이러한 세포의 transfection 비효율적 이다. 그러나, 일시적인 구조 식이 필요한 경우 transfection electroporation에 의해 가능한 접근42,,4344이다. 여기, 우리가 제시 GFP 정렬 다음 32D/G-CSF-R 세포의 유전자 조작 및 대량 감염 된 세포의 분석. 그러나, 필요한 경우, 단일 셀 정렬 수 수 고용 이전에 보고 된12,45단일 세포 클론을 생성 하.
확산 및 감 별 법 분석 실험 이외에 32D/G-CSF-R 셀 셀 마이그레이션 및 apoptosis13,,4647,48에에서 특정 단백질의 역할을 성공적으로 확인을 고용 되어 . 또한, 32D/G-CSF-R 라인은 cytokine 독립적인 성장 oncoproteins19,20에 의해 중재를 결정 하기 위해 사용 되었습니다. 자주 cytokine 독립을 공부 하는 데 사용 하는 또 다른 선 학사/F3 셀21,49이다. 학사/F3 32D/G-CSF-R 셀에 마찬가지로 C3H 마우스 변형에서 파생 된 IL 3 종속 murine 셀 라인입니다. 두 시스템은 cytokine 독립적인 확산 연구 채택 될 수 있다, 비록 바/F3 셀 제대로 G-CSF의 차별화.
전부, 32D/G-CSF-R 셀, 비록 1 차 셀 보다 덜 선호 되 고 무제한 확산 용량 및 간단한 처리를 포함 하 여 여러 가지 이점을 제공 하는 것이 좋습니다. 우리는 신뢰할 수 있는 데이터의 생성에 대 한 실험 32D/G-CSF-R 셀에서 수행 해야 보완 될 murine 모델 등 주요 문화 다른 실험 방법을 사용 하 여 인수 데이터 믿습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 교수 뤼트 Delwel 및 32D/G-CSF-R 셀 라인, 우리를 제공 하기 위한 교수가 보 Touw 및 Bosc23 셀 선 제공에 대 한 교수 다니엘 G. 되어 감사 합니다. 이 작품 MA j 체코 공화국 (GACR 15-03796S 및 GACR 17-02177S)의 그랜트의 교부 금에 의해 지원 되었다, MA-j, GA 영국 원정대 (프로젝트 번호 341015) 체코 과학 아카데미 (RVO 68378050)의 분자 유전학 연구소에서 지원 PD 프라하 찰스 대학교에서 MK, 하가 영국 원정대 (프로젝트 번호 1278217) 프라하에 있는 찰리 대학.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
References
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