Summary
Aquí se presentan protocolos detallados para el cultivo de la línea de célula 32D/G-CSF-R precursor mieloide murinas, realizar infecciones virales y llevar a cabo ensayos de proliferación y diferenciación. Esta línea celular es conveniente para el estudio de desarrollo de las células mieloides y el papel de los genes de interés en el crecimiento de las células mieloides y diferenciación neutrofílica.
Abstract
Comprensión de la biología de células madre y progenitoras hematopoyética tiene implicaciones importantes para la medicina regenerativa y el tratamiento de patologías hematológicas. A pesar de los datos más relevantes que se pueden adquirir con modelos en vivo o cultivos primarios, la baja abundancia de células madre y progenitoras hematopoyéticas restringe considerablemente el conjunto de técnicas apropiadas para su investigación. Por lo tanto, el uso de líneas celulares permite suficiente producción de material biológico para la realización de pruebas o ensayos que requieren un número grande de células. Aquí presentamos una descripción detallada, lectura e interpretación de ensayos de proliferación y diferenciación que se utilizan para la investigación de los procesos implicados en la diferenciación neutrofílica y mielopoyesis. Estos experimentos emplean la línea de células mieloides murinas dependiente 32D/G-CSF-I del cytokine, que posee la capacidad de proliferar en presencia de IL-3 y diferenciar en el G-CSF. Ofrecemos protocolos optimizados para manipular células 32D/G-CSF-R y discutir los principales escollos e inconvenientes que pudieran comprometer el análisis descritos y los resultados esperados. Además, este artículo contiene protocolos de producción lentivirales y retroviral, titulación y transducción de las células 32D/G-CSF-R. Demostramos que la manipulación genética de estas células puede emplearse para realizar con éxito los estudios funcionales y moleculares, que pueden complementar los resultados obtenidos con primarias células madre y progenitoras hematopoyéticas o modelos en vivo .
Introduction
La población de madre y progenitoras hematopoyética suministra al organismo una gran variedad de células maduras, incluyendo las células del linaje mieloide (neutrófilos, eosinófilos, basófilos y monocitos). El proceso que impulsa la producción de células mieloides de las células madre hematopoyéticas se conoce como mielopoyesis y producción adecuada de células mieloides maduras en respuesta a las cambiantes demandas es un prerrequisito para el adecuado afrontamiento del organismo con el estrés condiciones, como infecciones y la pérdida de sangre. Producción insuficiente de células mieloides maduras puede provocar incapacidad para eliminar patógenos, coagulación de la sangre y otros mortales condiciones1,2. Además, alteraciones en el desarrollo del linaje mieloide también pueden ser asociadas con malignidades hematológicas, tales como la leucemia mieloide aguda (AML)3. Alteraciones en la mielopoyesis pueden ocurrir debido a diversas razones, tales como defectos en células receptores de la superficie4, expresiones alteradas de transcripción factores5, deterioraron señalización vías6, dando por resultado la formación de mutaciones / activación de oncogenes7o inactivación de genes de supresor de tumor8.
Varios métodos se han desarrollado para estudiar desarrollo mieloide y evaluar el efecto de las alteraciones genéticas específicas en este proceso. Métodos comunes utilizados para el estudio de la mielopoyesis consisten en células primarias y ratones transgénicos. Aunque estos modelos permiten la adquisición de datos biológicamente relevantes, tienen ciertas limitaciones. El uso de pilas encuentra con un número limitado de células y un período restringido de la cultura, estrechamiento de las posibilidades para alterar la expresión génica y posterior análisis biológico o bioquímico. Ratones transgénicos son costosas y requieren un grado razonable de justificación biológica. Además, trabajar con modelos en vivo añade un grado de complejidad al entender el papel de un gen de interés en un proceso dado. Por lo tanto, se necesitan alternativas para sortear estas limitaciones. Las líneas celulares tienen indiscutibles ventajas: (1) que poseen la capacidad de proliferación ilimitada que permite generar suficiente material para estudios bioquímicos y biológicos, (2) son susceptibles a la manipulación genética (caída, golpe de gracia, la sobreexpresión), (3) el costo es relativamente bajo, y (4) permiten un grado de simplificación biológica necesaria en ciertas aproximaciones experimentales.
La IL-3 padres (interleucina-3) 32D dependiente celular fue establecida en 1983 por Greenberger y colegas por la infección de células de médula ósea de los ratones C3H/HeJ amigo de virus de leucemia murina9. Varios clones 32D fueron descritos en la literatura: cl 2393 cl10y cl 1011. Las células de cl-3 32D mostraron proliferan en IL-3 y experimentan diferenciación neutrofílica sobre el tratamiento con estimulación de granulocitos factor (G-CSF)10. Por el contrario, 32D cl-10 células, siendo dependiente de la IL-3, originalmente no se diferencian en respuesta al tratamiento de G-CSF. En 1995 el grupo del Dr. Ivo Touw retrovirally transduced 32D cl-10 células tipo salvaje y mutante del receptor G-CSF (G-CSF-R), con el fin de identificar regiones funcionalmente importantes de este receptor11. Este estudio dio lugar a la generación de las células 32D/G-CSF-R, que son igualmente dependientes de IL-3, pero dentro de 6 a 10 días después del reemplazo de IL-3 con G-CSF, células para proliferar y diferenciarse irreversiblemente en neutrófilos maduros. Estas propiedades hacen 32D cl-3 y modelos simplificados 32D/G-CSF-R células de diferenciación neutrofílica murino que puede ser modulada por dos bien definido crecimiento y factores de diferenciación - IL-3 y G-CSF. Durante las últimas décadas varios grupos han utilizado células 32D/G-CSF-R para el estudio de la función de genes particulares en proliferación y diferenciación de las células mieloides en cultura12,13,14,15 , 16y para el estudio de G-CSF señalización17,18. Importante, los resultados obtenidos en esta línea celular se correlacionan con datos obtenidos con células primarias y ratones transgénicos16,19,20,21. En consecuencia, creemos que las células 32D/G-CSF-R, un modelo ampliamente utilizado y bien establecida, representan un sistema valioso para estudiar diferenciación mieloide que puede utilizarse en paralelo con otros enfoques de abordar esta cuestión.
Aquí, se presenta protocolos detallados que describen el manejo de la línea celular 32D/G-CSF-R, que cubierta de expansión, diferenciación y evaluación de la proliferación y diferenciación de estas células. Información detallada de la modificación genética de células 32D/G-CSF-R, ya sea por transducción retroviral o lentivirales, así como protocolos para la titulación de virus se proporcionan. Además, disponen de varios resultados representativos que muestran posibles aplicaciones de las células 32D/G-CSF-R.
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Protocol
Nota: Los pasos que describen la expansión, diferenciación y transducción de las células 32D/G-CSF-R se presentan a continuación.
1. preparación
- Preparación de medios de comunicación
- Preparar 250 mL de medio de cultivo: (Roswell Park Memorial Institute) de RPMI 1640 suplementado con 10% de calor inactiva FBS (suero bovino fetal) y murino IL-3 (10 ng/mL).
- Como alternativa, utilizar caseras IL-3. Para producir IL-3 hecho en casa, transducir las células HEK293 con vector de expresión de IL-3 y cobrar IL-3 que contienen sobrenadante22.
Nota: Los antibióticos, como penicilina G (100 UI/mL), estreptomicina (100 μg/mL) y gentamicina (40 μg/mL), pueden utilizarse para el cultivo de células en cualquier paso del Protocolo a menos que se indique lo contrario.
- Como alternativa, utilizar caseras IL-3. Para producir IL-3 hecho en casa, transducir las células HEK293 con vector de expresión de IL-3 y cobrar IL-3 que contienen sobrenadante22.
- Preparar 50 mL de medio de diferenciación: Medio RPMI 1640 suplementado con 10% FBS y G-CSF humano (100 ng/mL).
Nota: (Importante) no todos los lotes de suero ayuda a la diferenciación de las células 32D/G-CSF-R. Antes del inicio del experimento de prueba de diferentes lotes de suero. Se recomienda por lo menos 4 diferentes lotes de prueba y seleccionar el óptimo basado en la capacidad de las células 32D/G-CSF-R para diferenciar. Ver protocolo de diferenciación de 32D/G-CSF-R abajo. - Preparar 10 mL de medio de congelación: Medio RPMI 1640 suplementado con 40% FBS y 10% DMSO (dimetil sulfóxido).
- Preparar 250 mL de medio de cultivo: (Roswell Park Memorial Institute) de RPMI 1640 suplementado con 10% de calor inactiva FBS (suero bovino fetal) y murino IL-3 (10 ng/mL).
- Producción de retrovirus
- Una suspensión unicelular de células de Bosc23 (6 × 106) en un plato de Petri de 16 cm de la placa y cultivar en 18 mL de DMEM (medio modificado Eagle de Dulbecco) que contiene 10% FBS hasta la confluencia de la cultura alcanza el 80% (24 h).
Nota: Las células deben crecer en un monocapa y no forma grumos en la cultura. Conteo de células puede realizarse mediante diversos métodos (válidos para el resto de los protocolos aquí presentados). En caso de bajo número de muestras, se recomienda conteo manual bajo el microscopio con cámara de Bürker. En este caso, utilice Trypan azul para la exclusión de las células muertas. Mezclar las células 1:1 con 0.4% azul de tripano en PBS. Para realizar conteo de gran número de muestras, se puede emplear un contador celular automático. - Se combinan 40 μg de construcción retroviral (como MSCV), 20 μg de pCL-Eco (vector packaging)23, 80 μl de PEI (polietilenimina) y 2 mL de suero reducido medio (por ejemplo, Opti-MEM) medio (sin antibióticos). Incubar la mezcla por 20 min a temperatura ambiente (RT).
- Vuelva a colocar cuidadosamente Bosc23 medio de las células 16 ml de DMEM suplementado con 2% FBS. Pre-calentar el medio a 37 ° C antes de usar.
Nota: No utilice antibióticos durante la transfección, ya que puede reducir eficacia de transfección. - Agregar la mezcla preparada en 1.2.2. gota a gota y con cuidado a la Bosc23 de la cultura e incubar durante 4 h a 37 ° C. Límite de incubación inferior a 6 h debido a la toxicidad del PEI.
- Después de la incubación, cambiar el medio de Bosc23 a 18 mL previamente calentado DMEM con 10% FBS y cultivar las células durante 48 h a 37 ° C. Coloque los platos en un laboratorio de bioseguridad nivel 2, mantener aquí de este paso y seguir procedimientos de seguridad estándar.
- Recoger Bosc23 medio (contiene ecotropic retroviral partículas) usando una pipeta serológica de 25 mL en un tubo cónico de 50 mL y almacenar a 4 ° C.
Nota: Eficiencia de transfección (importante) debe alcanzar el 90% para producir un virus de alto título. - Añadir 18 mL previamente calentado DMEM con 10% FBS a Bosc23 de las células y cultivar durante 24 h.
- Repita el paso 1.2.6.
Nota: Pueden combinarse Retroviral sobrenadantes de 1.2.6 y 1.2.8 una vez que alcanzan la misma temperatura (4 ° C) para preservar la integridad de viral. - Para evitar la contaminación de la Bosc23 en sobrenadante viral, spin virus recogido en 1500 × g por 10 min a 4 ° C. Virus de la alícuota, snap congelación con nitrógeno líquido o hielo seco y almacenar a-80 ° C. Sin embargo, tenga en cuenta que el virus recién preparado es de mayor calidad en términos de eficiencia de la infección que las reservas congeladas.
Nota: (Importante) no repetitiva de congelación/descongelación de virus, puesto que conduce a la degradación viral.
- Una suspensión unicelular de células de Bosc23 (6 × 106) en un plato de Petri de 16 cm de la placa y cultivar en 18 mL de DMEM (medio modificado Eagle de Dulbecco) que contiene 10% FBS hasta la confluencia de la cultura alcanza el 80% (24 h).
- Producción de lentivirus
- Una suspensión unicelular HEK293T (riñón embrionario humano 293T) de células de (6 × 106) en un plato de Petri de 16 cm de la placa y cultivar en 18 mL de DMEM con 10% FBS hasta la confluencia de la cultura alcanza el 80% (24 h).
Nota: Las células deben crecer en un monocapa y no forma grumos en la cultura. - Combinar 15 μg de construcción lentivirales (como pGhU6), embalaje pCMVdR8.74 de plásmidos (codificación de gag/pol, 12 μg) y pMD2.VSVG (codificación para VSV-G, 1,4 μg), PEI 85.2 μl y 2 mL de suero reducido medio (sin antibióticos). Incubar la mezcla por 20 min a TA.
- Vuelva a colocar cuidadosamente HEK293T medio con 16 mL de DMEM suplementado con 2% FBS. Pre-calentar el medio a 37 ° C antes de usar. No utilice antibióticos durante la transfección, ya que puede reducir eficacia de transfección.
- Con cuidado deje caer la mezcla preparada en 1.3.2 a la cultura de células HEK293T e incubar 4 h a 37 ° C. Limitar la duración de la incubación para dentro de 6 h para prevenir la toxicidad del PEI.
- Medio de cambio a 18 mL previamente calentado DMEM 10% FBS y cultivar células durante 48 h a 37 ° C. Coloque los platos en un laboratorio de bioseguridad nivel 2, mantener aquí de este paso y seguir procedimientos de seguridad estándar.
- Recoger HEK293T medio (que contiene partículas lentivirales de amphotropic) con una pipeta serológica de 25 mL en un tubo cónico de 50 mL y almacenar a 4 ° C.
Nota: Eficiencia de transfección (importante) debe alcanzar el 90% para producir un virus de alto título. - Con cuidado agregar 18 mL de DMEM con 10% FBS a las células HEK293T. Cultivar durante 24 h a 37 ° C.
- Repetir el punto 1.3.6.
Nota: Pueden combinarse lentivirales sobrenadantes de 1.3.6 y 1.3.8 una vez que alcanzan la misma temperatura (4 ° C) para preservar la integridad de viral. - Para evitar la contaminación del sobrenadante viral con células HEK293T, spin virus recogido en 1500 × g por 10 min a 4 ° C. Virus de la alícuota, snap congelación con nitrógeno líquido o hielo seco y almacenar a-80 ° C. Sin embargo, notar que recién preparado de virus es de mayor calidad en términos de eficiencia de la infección que las reservas congeladas.
Nota: (Importante) no repetitiva de congelación/descongelación de virus, puesto que conduce a la degradación viral.
- Una suspensión unicelular HEK293T (riñón embrionario humano 293T) de células de (6 × 106) en un plato de Petri de 16 cm de la placa y cultivar en 18 mL de DMEM con 10% FBS hasta la confluencia de la cultura alcanza el 80% (24 h).
- Titulación de virus que contiene un reportero GFP
- Semillas de 1 × 105 células NIH/3T3 en 300 μL de DMEM 10% FBS por pozo en una placa de 24 pocillos. 7 pozos se emplearán al un virus título.
- Descongelar el virus a 37 ° C y añadir 1, 5, 10, 50, 100 y 500 virus μl a culturas de NIH/3T3. No añadir ningún tipo de virus en control negativo también. Cultivar las células en presencia de lo virus durante 48 h a 37 ° C.
- Cosechar las células NIH/3T3 con 30 μl de tripsina/EDTA (ácido etilendiaminotetracético) (0.25% tripsina, 0.01% EDTA en PBS) y células en 250 μl PBS en un tubo de FACS (fluorescencia activada célula clasificación).
- Determinar la frecuencia de células GFP+ por citometría de flujo en cada muestra24. Excluir las células muertas, además de un tinte de viabilidad, como Hoechst 33258.
- Calcular el número total de células GFP+ (basados en el número de células plateados y porcentaje de células GFP+ ) y trazar contra el volumen de virus utilizado para la infección.
Nota: La eficiencia (importante) de la infección alcanza una meseta cuando se aplican grandes dosis virales. Por lo tanto, es importante estimar el título basado en las concentraciones virales en que infección eficiencia se produce en un rango lineal (ejemplo que se muestra en la tabla 1). El número de células GFP+ indica el número de partículas virales funcionales (TU - transformación de unidades) en un volumen determinado virus. Calcular el número de TU por mL.
- Titulación de virus que contiene un reportero puromicina
- Semilla de 5 × 104 células NIH/3T3 en 3 mL de DMEM 10% FBS por pozo en una placa de 6 pozos; emplear 6 pozos al un virus título. Cultura durante la noche a 37 ° C.
- Al día siguiente diluir virus como se indica en la tabla 2. Para diluir el virus, uso de DMEM con 10% FBS. No no agitar con vortex.
- Retire el medio de cultivo de las células NIH/3T3 y añadir 1 mL de virus diluido.
- Incubar durante una noche a 37 ° C.
- Vuelva a colocar el medio que contiene el virus con 2 mL de DMEM con 10% FBS e incubar toda la noche a 37 ° C.
- Vuelva a colocar los NIH/3T3 mediano con 2 mL de precalentado DMEM 10% FBS con puromicina (2 μg/mL).
- Cultivo a 37 ° C y cuidadosamente refresco mediano con puromicina cada 3 días o cuando el medio se vuelve amarillo.
- A los 10-12 días después de la infección, aspirar el medio de cada pozo y lavar suavemente con PBS.
- Mancha con 1 mL de solución de violeta cristal (violeta de cristal de 0,5% en 20% etanol y dH2O), 2 min a temperatura ambiente y lavar cuidadosamente con PBS dos veces.
- Cuenta colonias azul presentes en cada bien bajo el microscopio (aumento X4). No colonias deben observarse bien en el control negativo.
- Calcular el número total de TU/mL considerando el factor de dilución.
2. ampliación y mantenimiento de las células 32D/G-CSF-R
- Si se congelan las células 32D/G-CSF-R, tomar una alícuota y descongelar las células en un baño de agua de 37 ° C por 1 min y las células del frasco en 10 mL de precalentado Medio RPMI 1640 suplementado con 10% FBS en un tubo de 15mL. Invertir el tubo 3 veces y las células de la vuelta abajo a 400 × g. eliminar el sobrenadante y resuspender las células IL-3 que contienen medio de cultivo a una concentración de 0,3 × 106 células/mL.
- Concentración de crecimiento celular óptimo es de 0.25-0.5 × 106 células/mL. Dividir celdas cada 2 días a una concentración de 0.1-0.2 × 106 células/mL.
Nota: Las células 32D/G-CSF-R (importante) pueden perder parcialmente su capacidad para distinguir si se cultiva a concentraciones superiores a 1 × 106 células/mL. Por lo tanto, es muy importante dividir celdas 32D/G-CSF-R en el tiempo. - Según sea necesario, congelar y almacenar alícuotas de células durante largos períodos de tiempo a-80 ° C o en nitrógeno líquido. Desactivación de 3 × 106 células, eliminar el sobrenadante y resuspender en 1 mL de medio de congelación. Coloque el tubo en un recipiente de congelación a-80 ° C. Para almacenamiento a largo plazo, volver a colocar las células en nitrógeno líquido.
3. transducción de células 32D/G-CSF-R
- Células 32D/G-CSF-R de placa en placa de 6 pozos a una concentración de 0,3 × 106 células/mL.
- Añadir la cantidad apropiada de virus a un MOI (multiplicidad de infección) entre 10 y 40.
Nota: MOI más alto dará lugar a aumento del porcentaje de células GFP+ , así como mayores niveles de expresión del gen de interés. Ejemplo: Para infectar a 0,3 × 106 células con un MOI de 10; 3 × 106 TU tendrá que añadirse a las células 32D/G-CSF-R. - Añadir polibreno a concentración final 8 μg/mL e incubar durante 6 h a 37 ° C. Como alternativa, realizar un procedimiento de centrifugado-inoculación: centrifugar a 1200 × g durante 90 minutos a 30 ° C en una placa de cultivo con un rotor de columpio-cubo e incubar durante 3 h a 37 ° C.
- Las células recogemos, transferir a un tubo de 15 mL y girar a 450 × g por 5 min (4 ° C).
- Eliminar el sobrenadante, resuspender las células concentradas en 6 mL de medio de cultivo, colocar en un frasco de cultivo celular T25 y cultivo a 37 ° C.
- 48 h más tarde, las células de la cosecha y girar a 450 × g por 5 min (4 ° C). Deseche el sobrenadante.
- En el caso de un reportero GFP: colocar las células en 500 μl de PBS y tipo células GFP+ utilizando un clasificador de citometría de flujo. En el caso de un reportero de puromicina que contiene vector: colocar las células en medio de cultivo que contiene 2 μg/mL de puromicina.
- Expandir las células según sea necesario para los experimentos y su análisis posterior.
Nota: Células Transduced (opcional) pueden ser congeladas en los medios de comunicación en un recipiente de congelación a-80 ° C de congelación y más almacenadas en nitrógeno líquido.
4. 32D/G-CSF-R análisis de proliferación de la célula
- Para evaluar la proliferación tasa lugar 0,2 × 106 células en 1 mL de medio de cultivo e incubar durante una noche a 37 ° C.
- Al día siguiente cuenta el número de células y diluir a una concentración de 0,2 x 106 células/mL con medio de cultivo. Incubar durante una noche a 37 ° C. Mantener registros de las concentraciones celulares y diluciones aplicadas a las culturas diario utilizando la tabla 3.
- Repita el paso 4.2 durante tantos días como proliferación debe evaluarse.
Nota: La duración de los ensayos de proliferación dependerá el efecto del gen de interés. En el caso de un fenotipo fuerte, 8-9 días podría ser suficientes para observar un efecto significativo (véase Figura 3A). Sin embargo, en el caso de un fenotipo suave, largos períodos de tiempo pueden ser necesarios. - Evaluar el crecimiento de la célula haciendo una curva de proliferación, tal como se indica en la tabla 3.
5. ensayo de diferenciación de la célula 32D/G-CSF-R
- Lavar 0,2 × 106 32D/G-CSF-R las células dos veces con Medio RPMI sin citoquinas.
Nota: Los pasos de lavado antes de la adición de G-CSF en la cultura son importantes, ya que la presencia de IL-3 residual puede inhibir la diferenciación. - Colocar las células en medio de la diferenciación de la 1 mL (contiene 100 ng/mL de G-CSF) en un bien/placa 24, dando por resultado una concentración celular de 0,2 x 106 células/mL (día 0). Cultura durante la noche a 37 ° C.
- Contar el número de células/mL como se indicó anteriormente (paso 1.2.1).
- Cytospin 2-5 × 104 células sobre un portaobjetos de vidrio (76 X 26 mm) utilizando una centrífuga con adaptadores necesarios en 20 × g.
- Actualizar diferenciación medio y placa de las células a una concentración de 0,2 × 105 células/mL en un pozo/placa 24 (día 1). Deseche la placa vieja y continuar al día siguiente paso 5.6 con la nueva placa.
- En los días de 2 a 7, repita los pasos del 5.3 a 5.5. Evaluar la proliferación celular en presencia de G-CSF como se describe en el paso 4.
Nota: (Importante) durante la diferenciación, proliferación celular se ralentiza, por lo tanto después de 3 a 4 días en presencia de G-CSF es adecuada para células en cultivo en concentraciones más altas. - Evaluar el estado de diferenciación de las células 32D/G-CSF-R basado en la morfología celular.
- Fijar las células en el paso 5.4 en metanol durante 5 minutos a temperatura ambiente y dejar el portaobjetos se seque al aire.
Nota: Diapositivas del día 0 al 7 pueden almacenarse a temperatura ambiente y fijo al mismo tiempo. Del mismo modo, se puede también mantener a temperatura ambiente durante más tiempo después de la fijación. - Se tiñen las células con May-Grünwald Giemsa tinción protocolo de siguiente fabricante.
- Visualizar células usando un microscopio y aumento X40.
- Cuantificar el número de blastos, células intermedio diferenciadas y granulocitos maduros con cuadros ilustrativos en la figura 1 y la descripción en el cuadro 4.
- Fijar las células en el paso 5.4 en metanol durante 5 minutos a temperatura ambiente y dejar el portaobjetos se seque al aire.
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Representative Results
Proliferación y diferenciación de las células 32D/G-CSF-R
Para evaluar la proliferación de las células en condiciones de pro-proliferativa y de Pro-diferenciación 32D/G-CSF-R, 32D/G-CSF-R las células fueron cultivadas en medios que contienen IL-3 y G-CSF, respectivamente. Se observó que células cultivadas en medio con IL-3 (10 ng/mL) dividen aproximadamente cada 24 h (figura 2A). En reemplazo de la IL-3 con G-CSF (100 ng/mL) proliferación poco a poco retrasado y paró después de 4 días (figura 2A). Además, se evaluó el estado de diferenciación de las células cultivadas en presencia de G-CSF utilizando células de cytospun de May-Grünwald Giemsa-manchada. Se demostró que en el día 0 (antes del comienzo del tratamiento de G-CSF), las células presentan una morfología myeloblast como inmadura, caracterizada por un gran núcleo y un citoplasma oscuro (figura 2B). En el transcurso del tratamiento, se reduce el tamaño nuclear y la forma de los cambios de núcleo en forma de luna o en forma de donut. Además, el citoplasma se agranda y pierde el color violeta oscuro. Después de 6 días de tratamiento con G-CSF, las células presentan signos de diferenciación completa neutrophilic, caracterizado por un núcleo lobulado y un citoplasma violeta claro (figura 2B). La diferenciación de células 32D/G-CSF-R es un proceso gradual, donde no todas las células evolucionan hacia neutrófilos maduros en la misma exacta velocidad. Cuantificación de células en diferentes etapas a lo largo de la diferenciación (es decir, explosión, intermedio distinguido de la célula, neutrófilo) se muestra en la figura 2B.
Caída Evi2b murino bloquea la diferenciación neutrofílica en células 32D/G-CSF-R
Para downregulation de EVI2B (sitio de integración Viral Ecotropic 2B) en células 32D/G-CSF-R, 3 Evi2b-targeting (Sh2, Sh3, Sh4) y 1 no dirigidos a silenciar no control (NSC1) shRNAs fueron diseñados; Estos fueron clonados en un vector lentivirales llevando un reportero GFP de16. Las células 32d/G-CSF-R fueron transduced con control y Evi2b-silenciamiento shRNAs usando un MOI de 10. Dos días después de la transducción de señales, células GFP+ (transduced) fueron ordenadas y ampliadas para más experimentos. En el caso de Sh3 y Sh4, EVI2B agotamiento alcanzó 80%, sin embargo Sh2 pudo downregulate EVI2B eficientemente los niveles de la proteína y por lo tanto fue utilizado como un control adicional que se refieren aquí como control de silenciamiento no 2 (NSC2). Cuatro días después de la transducción de señales, se realizaron ensayos de proliferación y diferenciación en la presencia de G-CSF, y se evaluaron los efectos de desregulación Evi2b en estos procesos. Se observó que Evi2b-células agotadas (Sh2, Sh3) sostenido la proliferación celular en presencia de GCSF, mientras que las células control (NSC1 y NSC2) reducción proliferación alrededor del día 4 (Figura 3A). Además, Evi2b-silenciadas 32D/G-CSF-R células producen menos neutrófilos intermedias y maduros en comparación con las células del control (figura 3B). Notable, células transduced con NSC2, que ha demostrado pobre eficiencia de precipitación Evi2b , mostraron ligera reducción en el número de neutrófilos maduros (figura 3B). Estos datos fueron publicados recientemente16.
Proteína de fusión BCR-ABL deteriora neutrophilic diferenciación en células 32D/G-CSF-R
Se ha demostrado que la proteína de fusión BCR-ABL daña la diferenciación mieloide, causando una amplia expansión de progenitores mieloides que resulta en insuficiencia hematopoyética durante la fase aguda de la leucemia mieloide crónica25,26. Estudios previos demostraron que la forzada expresión de BCR-ABL en las células de cl-3 32D resultó en un bloque de diferenciación neutrófilo27,28. Por lo tanto, investigamos si podrían obtenerse resultados similares con la línea celular 32D/G-CSF-R. Las células 32d/G-CSF-R fueron transduced con BCR-ABL o control MSCV retroviral vector llevando un reportero GFP (MOI = 20). 2 días después de la transducción de señales, células GFP+ eran ordenadas y ampliadas por 2 semanas en medio que contiene IL-3. A continuación, se realizaron ensayos de diferenciación en la presencia de G-CSF. Observamos que en el día 0 (antes de transferir las células al medio con G-CSF), control de MSCV y BCR-ABL que expresan las células 32D/G-CSF-R presenta una morfología similar, representando principalmente a blastocitos mieloides inmaduras (figura 4). Sin embargo, hemos demostrado que mientras que vector vacío células transduced control experimentaron la diferenciación neutrofílica después de 6 días de tratamiento de G-CSF (producción de 11,5% de neutrófilos maduros y 56.4% de células intermedio diferenciadas), no maduran neutrófilos se obtuvieron de las células BCR-ABL-transduced 32D/G-CSF-R (figura 4). Consecuentemente, el porcentaje de explosión inmadura en células expresan BCR-ABL en el G-CSF seguía siendo similar al porcentaje de explosión en condiciones de IL-3.
Figura 1. Morfología de la célula de imágenes representativas de distinta 32D/G-CSF-R. 32d/G-CSF-R las células pueden clasificarse morfológicamente como explosión, intermedio diferenciado células y neutrófilos maduros. Véase el cuadro 4 para la descripción.
Figura 2. Proliferación y diferenciación de las células 32D/G-CSF-R. (A) proliferación de células 32D/GCSFR de 10 ng/mL IL-3 (línea negra) o 100 ng/mL de G-CSF (línea azul) que contienen medio. El eje X representa días de tratamiento. El eje Y en escala logarítmica (log2) e indica el número de células x 105. Resultados representan el promedio de 3 experimentos independientes. Barras de error indican la desviación estándar. (B) la diferenciación de células 32D/G-CSF-R en el medio que contiene el G-CSF (100 ng/mL). En el panel superior, el pie-parcelas demostrar el porcentaje de blastos (negro), intermedio diferenciado células (rosa) y neutrófilos (rojos) en la cultura después de 0, 2, 4 y 6 días de tratamiento de G-CSF. El panel inferior contiene imágenes representativas de las células cytospun de los respectivos puntos teñidos con May-Grünwald Giemsa de tiempo. Un mínimo de 100 células fueron evaluados para cada punto del tiempo.
Figura 3. Silenciamiento de Evi2b bloquea la diferenciación neutrofílica en células 32D-G-CSF-R. (A) proliferación de Evi2b-silenciadas (líneas naranjas) y control (líneas negras) 32D/G-CSF-R células en medio que contienen de 100 ng/mL G-CSF. El eje X representa días de tratamiento. El eje Y en escala logarítmica (log2) e indica el número de células x 105. Los resultados demuestran un resultado representativo de 3 experimentos independientes. (B) evaluación de la diferenciación de las células 32D/G-CSF-R transduced con Evi2b-control y silenciamiento shRNAs en medio que contiene el G-CSF (100 ng/mL) utilizando la coloración de May-Grünwald Giemsa de las células cytospun. En el panel superior, el pie-parcelas demostrar el porcentaje de blastos (negro), intermedio diferenciado células (rosas) y neutrófilos (rojo) en la cultura. Los paneles inferiores contienen imágenes representativas de las células cytospun. Diferenciación se evaluó en el día 7 de diferenciación. Por lo menos 100 células fueron evaluadas para cada condición.
Figura 4. Sobreexpresión de la proteína de fusión BCR-ABL deteriora la diferenciación de las células 32D/G-CSF-R. Evaluación de la diferenciación de las células 32D/G-CSF-R transduced con control MSCV o gen de fusión BCR-ABL en medio que contiene el G-CSF (100 ng/mL). Superiores pie-parcelas demostrar la proporción de blastos (negro), intermedio diferenciado células (rosas) y neutrófilos (rojo) el día 6 de diferenciación. Los paneles inferiores muestran cuadros representativos de cytospun células teñidas con May-Grünwald Giemsa. Por lo menos 100 células fueron evaluadas para cada punto del tiempo.
| Virus V [μl] | Número de células plateadas | % GFP+ | Recuento de células GFP+ | ¿Lineal? | TU/mL | Promedio (TU/mL) |
| 1 | de 100 000 | 1,83 | 1 830 | Sí | 1 830 000 | 2 350 000 |
| 5 | de 100 000 | 12.9 | 12 900 | Sí | 2 580 000 | |
| 10 | de 100 000 | 26.4 | 26 400 | Sí | 2 640 000 | |
| 50 | de 100 000 | 71,4 | 71 400 | No | ||
| 100 | de 100 000 | 85,1 | 85 100 | No | ||
| 500 | de 100 000 | 85.6 | 85 600 | No |
Tabla 1. Determinación del título viral para reportero GFP con vectores. Ejemplo de los datos obtenidos con el retrovirus MSCV y cálculo realizado para estimar la concentración viral. Título viral se calculó con base en el número de células GFP+ adquirida cuando se aplica cierta cantidad de virus. La cantidad de virus empleado para la infección debe ser en una correlación lineal con el porcentaje de células GFP+ medido. TU: transformación de unidades.
| Tubo | Descripción de tubo | DMEM + 10% FBS | Virus de la | Volumen total | Factor de dilución |
| (ΜL) | (ΜL) | (ΜL) | |||
| 1 | dilución 1 | 1485 | Acción viral de 15 μl | 1500 | 1 x 102 |
| 2 | dilución 2 | 1350 | Tubo 150 μL 1 | 1500 | 1 x 103 |
| 3 | dilución 3 | 1350 | Tubo 150 μL 2 | 1500 | 1 x 104 |
| 4 | dilución 4 | 1350 | Tubo 150 μL 3 | 1500 | 1 x 105 |
| 5 | dilución 5 | 1350 | Tubo 150 μL 4 | 1500 | 1 x 106 |
Tabla 2. Determinación del título viral para reportero de puromicina que contienen vectores. Estrategia de dilución viral para determinar el título viral en puromicina que contienen vectores. Tabla indica cómo preparar 5 tubos (1-5) que contiene una dilución seriada de la acción viral. Tubo 1 contiene 1485 μl DMEM + 10% FBS y 15 μl del virus produce, proporcionando un 1 × 102 virus diluyen. Tubo 2 contiene 1350 μl DMEM + 10% FBS y 150 μL de 1 × 102 diluyen virus (tubo 1), proporcionando un 1 virus diluido de3 × 10. Tubo 3 contiene 1350 μl DMEM + 10% FBS y 150 μL de 1 × 103 diluyen virus (tubo 2), que 1 × 104 virus diluido. Tubo 4 contiene 1350 μl DMEM + 10% FBS y 150 μL de 1 × 104 diluyen virus (tubo 3), que 1 × 105 virus diluido. Tubo 5 contiene 1350 μl DMEM + 10% FBS 150 μL del 1 × 105 diluyen y virus (tubo 4), que 1 × 106 virus diluido. 1 ml de los tubos 1-5 se utiliza a concentración del virus.
| Recuentos celulares (x = número de células por ml) | |||||||
| día 0 | día 1 | día 2 | día 3 | día 4 | día 5 | día 6 | |
| Muestra 1 | x0 | x1 | x2 | x3 | x4 | x5 | x6 |
| Dilución (d) (y = volumen de las células utilizadas para replating [mL]; z = volumen final [mL]) | |||||||
| día 0 | día 1 | día 2 | día 3 | día 4 | día 5 | día 6 | |
| Muestra 1 | d0= 1 | d1= y1/z1 | d2= y2/z2 | d3= y3/z3 | d4= y4/z4 | d5= y5/z5 | |
| Recuento de células totales | |||||||
| día 0 | día 1 | día 2 | día 3 | día 4 | día 5 | día 6 | |
| Muestra 1 | x0 | x1 /d0 | x2/d1 | x3/d2/d1 | x4/d3/d2/d1 | x5/d4/d3/d2/d1 | x65/d /d4/d3/d2/d1 |
Tabla 3. Generación de la curva de crecimiento. La tabla describen las ecuaciones necesarias para la evaluación del índice de proliferación de células 32D/G-CSF-R.
| Núcleo | Citoplasma | |
| Ráfagas | Oscuro, redondeadas | Oscuro, casi indistinguible del núcleo |
| Almacena células diferenciadas | Pronunciados cambios en la forma nuclear, buñuelo-como a menudo o en forma de lunares | Citoplasma más claro y distinguible |
| Neutrófilos maduros | Núcleo lobulado; casi no hay conexiones entre los lóbulos | Citoplasma claro |
Tabla 4. morfología de la célula 32D/G-CSF-R durante la diferenciación neutrofílica. La tabla resume las características morfológicas principales que permite la distinción de blastos inmaduros y células diferenciadas intermedio neutrófilos maduros. Se describen las características citoplasmáticas y nucleares. Vea la figura 1 para imágenes representativas.
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Discussion
La elección de un modelo experimental es uno de los temas principales en la investigación. Aunque las células animales y humanas primarias se creen para producir los datos más relevantes, estos modelos pueden incluir preocupaciones éticas y a menudo se asocian a procedimientos costosos y sofisticados aislamiento/cultivo. Células primarias son limitadas en número y es difícil manipularlos genéticamente. Además, las células primarias representan una población heterogénea compuesta por diversos tipos celulares que pueden complicar la interpretación de datos29. En contraste, líneas celulares proveen una fuente virtualmente ilimitada de material biológico, son rentables y permiten eludir las cuestiones éticas. Sin embargo, es importante tener en cuenta líneas se consideran un sistema experimental artificial, que genéticamente y fenotípicamente difiere de su tejido de origen de la célula. No obstante, de células cuando se combina con otras aproximaciones experimentales, proporcionan un modelo valioso para la generación de datos reproducibles y biológicamente relevantes.
La línea celular 32D/G-CSF-R, así como 32D cl-3 células, están bien establecidas y ampliamente utilizan modelos de cultivo celulares de diferenciación neutrofílica murino14,15,24,30. Varios grupos de investigación utilizan estas células para evaluar la función de genes particulares en la mielopoyesis y obtuvo resultados que correlacionan con los datos obtenidos en vivo modelos y células primarias16,31. Aquí proporcionamos un protocolo para el manejo de la línea celular 32D/G-CSF-R, sin embargo, se pueden aplicar procedimientos similares para cultivar y manipular células 32D de cl-3. Es importante señalar que diversas hornadas de las células de cl-3 32D utilizan en diferentes laboratorios presente diferencias en el cariotipo, lo que sugiere que diferentes grupos podrían estar trabajando con su propio subclones32. Basado en esta observación, presumimos que la variabilidad genética del mismo modo puede estar presente en las células 32D/G-CSF-R, y esto debe tenerse en cuenta al comparar los resultados obtenidos por diferentes grupos de investigación. Modelos de cultura alternativa celular células 32D/G-CSF-R son inmortalizados progenitoras hematopoyéticas líneas22,33,34,35,36. Este enfoque es útil cuando la expansión a gran escala del progenitor se requiere, por ejemplo a fin de estudiar las interacciones de la proteína22. Una ventaja para las células 32D/G-CSF-R es que progenitores inmortalizadas pueden ser generados de un ratón genéticamente modificado, aunque el momento de establecer la línea es considerablemente largo37. Además, el manejo y manipulación de progenitores de médula ósea inmortalizada requiere más conocimientos que las células 32D/G-CSF-R.
Fin de familiarizar al lector con el modelo 32D/G-CSF-R, en la primera parte de los resultados representativos demostramos la cinética de proliferación y diferenciación de células 32D/G-CSF-R en presencia de IL-3 y G-CSF. Se presentaron imágenes representativas que demuestra la morfología de las células en condiciones de proliferación de IL-3, así como en diferentes puntos temporales de la diferenciación inducida de GCSF. Se evaluó diferenciación neutrofílica por análisis morfológico, sin embargo se ha reportado que 32D cl-3 diferenciación puede ser determinada por análisis de citometría de flujo utilizando el CD11b celular superficial del marcador27,31, 38,39. A nuestro conocimiento y experiencia, CD11b no es upregulated durante diferenciación neutrofílica de 32D/G-CSF-R. De normalización, en los ensayos de proliferación 32D/G-CSF-R se empleó comercialmente disponible IL-3. Sin embargo, observamos que las células proliferan bien en caseros IL-3, producido según lo descrito por Drobek y colegas22. Para obtener un buen grado de diferenciación neutrofílica inducida por G-CSF, es importante recordar que la capacidad de diferenciación de células 32D/G-CSF-R puede reducirse si las células se cultivan por encima de una concentración de 1 × 106 células/mL. Además, el grado y la velocidad de diferenciación pueden ser afectadas por la composición del suero. Por lo tanto, se recomienda probar la capacidad de diferenciación de células 32D/G-CSF-R en varios lotes FBS, y seleccione la que mejor soporta el desarrollo de neutrófilos maduros en 6 a 9 días de cultivo en presencia de G-CSF.
Proporcionamos dos experimentos representativos mostrando posibilidades de estudiar el papel de las proteínas particularmente en la diferenciación mieloide (figura 3 y figura 4). En primer lugar, mostramos downregulation de EVI2B, una proteína transmembrana que se expresa en células hematopoyéticas, conduce a un bloque de diferenciación mieloide en células 32D/G-CSF-R. Estos datos han sido publicados recientemente por nuestro grupo, en combinación con el análisis realizado con células primarias y Evi2b de ratones knockout16. En segundo lugar, investigó el efecto de BCR-ABL, una proteína de fusión resultante de la translocación genética t(9,22) (q34; q11), en diferenciación neutrofílica de 32D/G-CSF-R. Este desplazamiento fue originalmente identificada en pacientes con leucemia mieloide crónica40,41. Previamente se demostró que la expresión de la oncoproteína de fusión BCR-ABL en 32D cl-3 células conduce a una diferenciación mieloide detención27,28. Aquí hemos demostrado que la sobreexpresión de BCR-ABL tiene similares efectos sobre las células 32D/G-CSF-R. En ambos conjuntos de experimentos presentados aquí (con Evi2b downregulation y sobreexpresión de BCR-ABL), modificación genética de células 32D/G-CSF-R fue realizada a través de la transducción viral, que se traduce en la expresión génica estable. La elección de los retrovirales contra entrega lentivirales no afecta la proliferación o diferenciación de las células 32D/G-CSF-R. Sin embargo, la infección lentivirales es más eficiente que la transducción retroviral debido a la presencia de retrovirus endógenos en células 32D/G-CSF-R. Según nuestra experiencia, la transfección de estas células reactivos estándar lipofílico no es eficiente. Sin embargo, si es necesario la construcción transitoria de expresión, transfección por la electroporación es un enfoque viable42,43,44. Aquí, presentamos la manipulación genética de células 32D/G-CSF-R seguido de GFP de clasificación y análisis de las células infectadas del bulto. Sin embargo, si es necesario, única célula clasificación podría emplearse para generar clones de células individuales previamente divulgados12,45.
Además de ensayos de proliferación y diferenciación, las células 32D/G-CSF-R han sido empleadas para determinar con éxito el papel de ciertas proteínas en la célula la migración y apoptosis13,46,47,48 . Además, la línea 32D/G-CSF-R se ha utilizado para determinar el crecimiento independiente de citocinas mediada por oncoproteínas19,20. Otra línea utilizada para el estudio de citoquinas independencia es Ba/F3 células21,49. Ba/F3 es una línea de células murinas dependiente de IL-3 derivada de la cepa de ratón C3H, semejantemente a 32D/G-CSF-R las células. Aunque ambos sistemas se pueden emplear para estudiar la proliferación independiente de citoquinas, las células Ba/F3 se distinguen mal en presencia de G-CSF.
En conjunto, sugerimos que las células 32D/G-CSF-R, aunque siendo menos preferido de células primarias, ofrecen varias ventajas incluyendo la capacidad ilimitada de proliferación y manejo sencillo. Creemos que para la generación de datos confiables, experimentos realizados en células 32D/G-CSF-R deben ser complementados con los datos adquiridos mediante alternativas experimentales como modelos murinos y cultivos primarios.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen Prof. Ruud Delwel y Prof. Ivo Touw por facilitarnos la línea 32D/G-CSF-R celular y Prof. Daniel G. Tenen por facilitarnos la línea celular de Bosc23. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Agencia de donación de la República Checa (GACR 15-03796S y GACR 17-02177S) a MA-J, el apoyo del Instituto de Genética Molecular de la Academia Checa de Ciencias (RVO 68378050) a MA-J, una beca de Reino Unido GA (proyecto no. 341015) de la Universidad de Charles en Praga a MK y una beca de Reino Unido GA (proyecto Nº 1278217) de la Universidad de Charles en Praga a PD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
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