Summary
本文描述了一种经济的、优化的、简单的协议, 它使用埃文斯蓝色染料方法来评估 FVBN 小鼠器官中的血浆渗出物, 这些细胞可以适应其他菌株、物种和其他器官或组织的使用。
Abstract
血管渗漏, 或血浆渗出, 有许多原因, 可能是一个严重的后果或炎症反应的症状。这项研究最终可能导致新的知识, 关于抑制或治疗血浆渗出的原因或新方法。重要的是, 研究人员有适当的工具, 包括最好的方法, 以研究血浆渗出。在本文中, 我们描述了一个协议, 使用埃文斯蓝色染料方法, 以评估血浆渗出的器官 FVBN 小鼠。该协议是故意简单, 尽可能大的程度, 但提供高质量的数据。埃文斯蓝染料的选择主要是因为它是容易的平均实验室使用。我们使用这个协议提供证据和支持的假说, 即酶 neprilysin 可能保护血管, 以防止血浆渗出。然而, 本议定书可在实验上使用, 并易于适应于其他品系的老鼠或其他物种, 在许多不同的器官或组织, 研究可能涉及其他因素, 在理解, 预防或治疗血浆渗出。该协议已从现有的协议中得到了广泛的优化和修改, 并结合了可靠性、易用性、经济性和材料和设备的一般实用性, 使该协议优于一般实验室用于从器官中定量血浆渗出。
Introduction
器官中的血管泄漏是指在器官中毛细血管静脉内皮的间隙产生的渗出或血浆渗漏。这种血浆渗出或增加的血管通透性, 可能产生的某种类型的炎症反应, 可能会有严重的后果。因此, 重要的是, 这一现象, 其原因, 调制器和后果, 被研究和理解, 同样, 调查人员有良好的工具和协议, 以研究他们。内皮间隙可以通过一些刺激产生, 但通常是由肽神经递质和/或 tachykinins 在内皮的作用产生的。这一过程的主要自然发生的调解人之一, 导致增加血浆渗出, 是 undecapeptide 速激肽神经肽, 物质 P1。
利用埃文斯蓝染料的白蛋白结合特性研究和测量血管通透性或血浆渗出的方法已经开发出来, 通常以其准确性、简单性、经济性、安全性以及允许从多个组织一次测定血浆渗出量, 如果需要2,3,4,5,6,7,8,9.这个埃文斯蓝色的协议, 以评估血浆渗出在 FVBN 小鼠的器官使用所有这些, 但增加了一些重要的修改, 使它一般有用和适应未来的研究, 涉及的平均实验室, 进行或将对与血浆渗出或血管通透性相关的因素进行重要研究。本协议将 P 物质引入到 1 nmol/千克的小鼠体内, 使血浆的渗出性增强1.5 倍。这增加了协议的灵敏度, 从而导致更容易观察和获得的结果。其他影响渗透性的因素, 如各种其他多肽、化学物质或某些形式的毒性损伤, 可根据需要由其他实验室使用或研究。本协议采用颈静脉注入法, 对埃文斯蓝和 P 物质进行系统的介绍, 需要进行末端手术。然而, 颈静脉注射5,7,10, 即使在考虑必要的终端手术技术, 更容易掌握和导致生产更一致的结果比其他静脉注射, 包括尾静脉注射4,9。虽然埃文斯蓝可能是由复古眶静脉窦注射提供, 但文献中没有发现使用这种方法的埃文斯蓝色。然而, 对于尾静脉注射, 重现性掌握这种技术的高度专业知识和实践, 大大限制了它的使用成功的埃文斯蓝色注射。相比之下, 我们的协议中所描述的选择性颈静脉注射方法, 提供了一个技术上可获得的解决方案。一个关键的程序, 以灌注鼠标的静脉, 执行后, 在牺牲的埃文斯蓝色灌注鼠标, 删除过剩的埃文斯蓝色染料, 并已在本协议标准化。先前描述的灌注方法已经过仔细检查和修改, 以获得目前的程序。此处描述的其他修改都是优化的、直接的和廉价的。
埃文斯蓝染料的方法存在一些重要的局限性。例如, 低灵敏度有时与此方法可能会阻止一些额外的病理和组织学检查的组织从埃文斯蓝注射动物。然而, 这些和其他限制导致了其他方法和模型的发展, 然而, 仍然使用埃文斯蓝色。用荧光 (而不是视觉范围) 光谱法测量埃文斯蓝可以提高方法的灵敏度。此外, 还开发了埃文斯蓝染色组织的荧光显微术, 以便观察更明显的部位11的血管渗漏。此外, 全身成像和扫描的活动物以前注射埃文斯蓝12允许调查埃文斯蓝浓度的持续方式, 而不是在一个特定的时间点的实验。然而, 这种方法需要适当的成像设施, 可能是非常昂贵的。对埃文斯蓝进行的修改, 并在体外模型中进行, 如在细胞培养或小鸡胚模型13 (CAM) 也被描述。这些模型由荧光和活体14显微镜监测, 并允许定量的血管通透性变化随着时间的推移, 但可能会提出问题,在体内条件的准确建模, 也可能是昂贵。
有其他方法来确定和量化血管渗漏或渗透性, 这并不涉及埃文斯蓝的管理。这些方法可能使用适当的荧光分子 (如白蛋白或荧光素), 或 isotopically 标记或其他标记的分子, 对活动物 (或细胞培养或胚 (CAM) 模型13, 其次是无创影像学 (PET 扫描, MRI, 活体显微镜, 全身扫描) 或侵入性成像 (荧光显微镜)3,12,15。虽然这些技术可能比其他埃文斯蓝色方法提供一些优势, 但它们也有缺点, 其中可能包括其相当复杂、必要的专门知识、资源和高昂的货币成本。
Neprilysin16 (酶酶, 也称为 CD10, 夫人, 或 Enkephalinase) 已被建议参与抑制血浆渗出, 至少部分, 通过酶代谢和失活的内源性物质 P。因此, 在细胞表面酶的组织中, P 物质的作用可能会有衰减, 大概是酶活性的影响。
最初, 我们用这种改良的埃文斯蓝协议对 P 诱导的血浆渗出进行了试验, FVBN 野生型 (小波) 和抗结蛋白 (KO) 小鼠。从这些初步研究中推测, 在 P 增强血浆渗出物中的抗结蛋白参与, 我们描述了这些和进一步的实验, 其中涉及新经济在血浆渗出的作用。然而, 这篇手稿的重点不是在血浆渗出, 而是血浆渗出实验本身的作用。文中的结果代表了通过使用此修改后的协议可以获得的结果类型。埃文斯蓝法测量血浆渗出已被优化和修改, 如下面详细描述 FVBN 小鼠。
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Protocol
在本手稿中所述实验中遵循了所有适用的国际、国家和 (或) 机构指南, 以照顾和使用动物 (小鼠)。
该方法使用 FVBN 成年小鼠, 年龄 16-20 周, 发现是最佳的目的, 本研究。1天包括步骤 1-5 和天2包括步骤 6-7 (图 1)。
1. 设备准备
- 如果使用氯胺酮/甲苯噻嗪作为麻醉药 (如建议的那样), 请确保有充足的无菌、一次性注射器和针头供应。如果使用异氟醚作为麻醉剂, 检查氧气罐和异氟醚的液位, 以确保在开始试验前有足够的供应。同时, 组装 nosecone 呼吸电路并将其连接到感应箱;在呼吸回路上附加新的炭罐。通过打开氧气并确定第二阶段读数大约 50 psi 来准备感应箱。
- 把暖气垫打开37摄氏度。
- 为手术准备直肠温度探头。
2. 鼠标准备
这一步骤包括麻醉, 脱毛和定位 (成年 FVBN 小鼠-年龄 16-20 周)。
- 称量老鼠并记录重量。
- 麻醉老鼠。
- 管理氯胺酮和甲苯噻嗪 IP (分别为 80-100 毫克/千克和 7.5-16 毫克/千克)。然而, 建议以较低剂量的氯胺酮和甲苯噻嗪 (分别为30毫克/千克和6毫克/千克) 开始。
- 用大约 0.1-0.25 倍的剂量氯胺酮/甲苯噻嗪在整个手术中保持麻醉。氯胺酮和甲苯噻嗪是这项研究中选择的麻醉剂, 因为观察到更多的重现性和生存能力。其他研究中所选择的麻醉剂药物可以被发现是不同的。 如果使用异氟醚, 将鼠标放在感应腔内, 将异氟醚打开至 5%, 直到鼠标完全失去知觉为止。然后使用鼻 nosecone 设置在 1.5-2.5% 异氟醚在整个过程的其余部分。
- 每 2-3 分钟通过脚趾捏来监测小鼠, 检查是否有适当的麻醉深度。
- 剃掉鼠标的腹颈区域。
- 将鼠标放在预热垫上的仰卧位置。用胶带将鼠标的爪子和脚固定在手术表面。
- 将人工泪膏放在眼睛上, 以防手术时干燥。
3. 手术细节
- 在颈静脉的右腹颈上做一个1厘米的切口。
- 应用一或两滴利多卡因 (1-2%) 进入切口区域疼痛管理和促进血管舒张。等待2分钟, 以使利多卡因生效。
- 通过钝夹层暴露和隔离右颈内静脉。用4-0 缝线将静脉栓起来, 用止血轻轻缩回血管的延髓端。用细剪刀切开一个洞, 大约3毫米以下或尾鳍到领带, 大约一半通过静脉直径。
- 将 PV-1 聚氯乙烯导管从末端标记为1.5 厘米, 并将其插入颈静脉内, 使用血管扩张, 并将导管螺纹至该血管的尾端, 约为1.5 厘米。
- 将导管安全地栓在船尾部 (切口下面), 用4-0 丝。在步骤3.3 中, 将血管的延髓部分与导管的外侧绑在一起, 该缝合线的松尾用于栓住延髓颈静脉。
- 用4-0 丝将皮肤松散地放回导管周围, 以帮助防止身体发热和组织干燥。
- 将导管连接到含有血气生理盐水 (10 U/毫升) 的注射器上, 并冲洗导管。
4. 注射
- 注射埃文斯蓝溶液 (50 ul 的30毫克/毫升溶液0.9% 正常, unheparinized 生理盐水, 或约50毫克/千克) 入颈静脉导管, 其次是少量的血气盐水冲洗线。
- 2分钟后, 注入物质 P (100 ul 0.3 微米溶液0.9% 正常, unheparinized 生理盐水, 或 1 nmol/千克), 其次是少量的血气盐水冲洗线。P 物质通过内皮层增强血浆蛋白的渗出;在这个协议中, 它通常会导致增加大约1.5 倍的等离子渗出值, 使血浆渗出值更容易测量。
- 注射物质 P 后等待18分钟。在这段时间, 埃文斯蓝色染料将平衡和流通。
- 终止实验18分钟后注射物质 P (20 分钟后, 埃文斯蓝注射液) 通过牺牲鼠标与颈椎脱位。这是可能的老鼠可以直接 cervically 脱臼, 而不首先给予过量的麻醉剂, 因为老鼠可能仍然很好麻醉从手术。然而, 如果有必要, 麻醉药氯胺酮/甲苯噻嗪, 异氟醚, 或戊巴比妥的过量可能会给, 其次是颈椎脱位。
5. 分离器官
- 切开小鼠的胸腔和重力灌注 (从高度大约 51 cm 或 20 ") 心脏和血管与50毫升50毫米柠檬酸钠, pH 3.5。pH 值3.5 推测保留埃文斯蓝对白蛋白的约束力。
- 用解剖手术刀 (如膀胱、肾脏、胃、肝脏、胰腺、近端或远端结肠、回肠、十二指肠、侧面皮肤、耳朵、尾部、心脏和/或肺部) 切除 1-5 相关器官 (组织), 并除去任何残留物, 如果目前。
- 在室温 (RT) 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS; 1.44 克的 Na2HPO4, 0.24 克的2PO4, 8.0 克氯化钠和 0.20 g 的氯化钾在 1 L, pH 7.4) 冲洗器官。
- 用纸巾将器官涂抹, 将每一个器官切成两半, 然后将每半部分 (湿重) 分别称量。
- 在150摄氏度的烘干烤箱中, 在48小时内烘干。
- 将其他组织的一半, 在一个一致的体积 (最多200µL) 的甲酰胺在离心管48小时 (最多72小时), 以提取埃文斯蓝色。
6. 组织 OD 的测量
- 从离心管中取出50µL 的埃文斯蓝注入的甲酰胺 (经过 48-72 小时的 RT 孵化), 放入96井聚苯乙烯板的一个井中。小心不要转移组织件连同甲酰胺。
- 安置50µL 新, 纯净的甲酰胺入每二个空的井96井板材为空白。
- 测量并记录在吸光度板读取器上的96井板的每个井的 OD620 。620毫微米是埃文斯蓝色的吸光度最大值。
7. 等离子体渗出量的计算
- 称48小时内在烤箱中的干燥组织的一半。
- 计算每个单独的鼠标所关心的特定器官的湿重/干重比, 从该组织一半的湿重开始 (在步骤5.4 中获得), 除以该组织一半的干重 (在步骤7.1 中获得)。
- 计算在甲酰胺中组织一半的干重 (g), 方法是将组织一半的湿重除以湿: 特定器官的干重比 (在步骤7.2 中计算), 然后再将其放在甲酰胺 (步骤5.4 中获得)。
- 计算修正的 OD620值。从96井板的每个实验井 (包含埃文斯蓝注入的甲酰胺从每个组织, 获得在步骤 6.3) 的 od620值开始, 减去空白井 OD620值 (平均 od620值两个含纯甲酰胺的井, 在步骤6.2 中制备, 在步骤6.3 中从每个实验值中获得620的值。
- 通过将被校正的 OD620 (在步骤7.4 中计算) 除以组织一半在甲酰胺中的干重来计算等离子渗出值 (在步骤7.3 中计算)。血浆渗出量将为620/克干重。
- 分析数据并表示为平均值的扫描电镜. 统计比较组的 t 检验或单向分析方差和 Scheffé的多比较测试 (lycofs01.lycoming.edu), 酌情。
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Representative Results
在图 1中, 显示了该过程的示意图, 发现这会导致 FVBN 小鼠器官中最可靠和最一致的 P 物质诱导的血浆渗出值。这一过程通常需要两天的时间, 至少48小时的等待。如果对所有的实验进行比较, 这是可能的, 更广泛地传播出来。例如, 在1天隔离器官后, 这些器官可以在液氮中闪光冷冻, 储存在-80 摄氏度;在仔细地解冻器官 (在几天到1星期之内), 他们可以被清洗在 PBS 和被涂抹在协议的其他之前。此外, 虽然组织的干燥应按规定进行 (在150摄氏度为48小时), 但在甲酰胺中提取组织一半的埃文斯蓝可从 48-72 h 延长, 只要甲酰胺的时间与所有实验一致。
如图 2和表 1所示, 数据显示 P 诱导的血浆渗出物从膀胱的 FVBN 野生类型 (野生型) 和基因击倒 (高) 小鼠17, 这是可用的, 主要是由于该实验室的长期利益在新经济和选择的神经肽的章程和行动18,19。在任何组织中, 小鼠都不表达任何的新经济。然而, 在小鼠的膀胱内表达了新经济, 尽管在低水平20,21,22。图 2和表 1显示从这两组小鼠的尿囊中 P 物质诱导的血浆渗出有不同。这就意味着在 P 物质诱导的血浆渗出物中, 新经济对膀胱的作用, 因为在小鼠的膀胱中, 结蛋白的表达可能是主要的差异。
由于最初的数据表明, 在 P 诱导的尿液中的血浆渗出物中的新经济可能作用 (图 2和表 1), 我们决定更充分地研究在另一种血浆渗出中的结蛋白参与器官。首先, 我们创建了一个双转基因小鼠, 过度表达 tshr 几乎普遍23。这个被设计的老鼠允许对三种类型的 FVBN 老鼠的数据进行比较: 小鼠16, 它自然地表达了许多组织中的少量的新经济;小鼠17, 在任何组织中表达没有任何的结,;我们的双转基因 overexpressor 小鼠23, 过度表达 tshr 在强力霉素的管理下几乎所有组织中都有。在手术前1周, 允许老鼠免费接触强力霉素的周 (图 1);强力霉素剂量为1毫克/公斤的周, 染色。对过度表达 tshr 的双转基因小鼠进行了详细的构建, 并对其分析、西部和 qPCR23的基因表达进行了描述。
通过这3种类型的小鼠, 该协议显示了在血浆渗出的组织中, 包括十二指肠23 (图 3和表 2) 中的新经济作用。在这些实验中, 双转基因 overexpressor 小鼠的结节过度表达在1天前1周的喂养中被打开, 含有强力霉素的周 (染色; 1 毫克强力霉素/mg 周,图 3a)。作为一种控制, 一些小鼠和染色在1天前的一周 (图 3b和3c) 中也喂食了强力霉素周。
为确定 FVBN 小鼠十二指肠内的血浆渗出对其的作用, 用多克隆抗体对 FVBN、双转基因 overexpressor 小鼠十二指肠中的结蛋白表达进行了分析证实。人的新经济 (与老鼠的新经济交叉反应)23。这一分析证实, duodenums 表达了适量的结蛋白, 但 overexpressor duodenums 表达了 2-3x 的非均量 duodenums。根据定义, 新经济小鼠不会在十二指肠中表达任何的结。
图 1:测量 P 诱导的血浆渗出量的协议的一般模式.FVBN 小鼠 (16-20 周) 的器官中 P 物质诱导血浆渗出量测定的协议示意图。本协议涉及用埃文斯蓝染料方法通过注射入颈静脉来测量组织血浆渗出, 并纳入外部管理物质 P, 获得增强和易于测量的血浆渗出值, 单位外径620/克干重。被描述的协议被发现导致一致的 P 物质诱导的血浆渗出值从 FVBN 小鼠的各种各样的器官, 并且花费最少两天工作。1和2天被至少48小时的时间隔开, 等待组织干燥和提取。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: P 物质诱导的血浆渗出物从膀胱的重度和新经济小鼠.膀胱血浆渗出从 FVBN 小鼠 (不前强力霉素) 增强的物质 P 管理和表达为 OD620 纳米/克干重。膀胱从 FVBN 野生型 (重量; 白条, n = 12) 或 FVBN 的黑蛋白敲除 (高; 黑色条, n = 7) 小鼠, 并受到上述详细的血浆渗出的协议。表 1给出了各自的值。条形上方的线条表示平均值 (SEM) 的标准误差。通过 t 检验, 小波变换和结点值趋向于 显著差异 p = 0.051。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: P 物质诱导的血浆从重度、overexpressor 和小鼠的十二指肠中渗出。(丙)十二指肠血浆渗出量由 P 物质强化, 表达为外径620/克干重。(A) Duodenums 与 FVBN 小鼠分离, 无强力霉素 (-; 白条, n = 5), 无前强力霉素的小鼠 (-; 浅灰色条, n = 5), 无前强力霉素的 ovexpressor 双转基因小鼠 (DT-; 深灰色条, n = 5) 或新经济ovexpressor 双转基因小鼠与前强力霉素 (DT +; 黑条, n = 4), 并服从等离子体渗出的协议, 如上文详述。条形上方的线条代表 SEM。虽然 "高" (-) 值的趋势高于小波 (-) 或 DT (-) 值, 但这一差异没有统计学意义。与其他所有 (* p < 0.05、方差分析) 相比, 十二指肠血浆渗出量显著降低, 只与组的强力霉素、ovexpressor 双转基因小鼠 (DT +) 相比较。(B、C)强力霉素 (p < 0.05) 对大鼠十二指肠血浆渗出量的影响不显著。(B) 无强力霉素的小鼠 (重量; 白条, n = 5) 和小鼠与强力霉素 (重量 +; 中灰色条, n = 7)。(C) 无强力霉素的小鼠 (高、浅灰色条、n = 5) 和强力霉素 (高 +; 中灰条, n = 2)。表 2给出了在 a、B 和 C 中显示为复合体的单个值。复制与小修改从 springer 杂志文章23与允许从 springer 科学 + 商业媒体。请单击此处查看此图的较大版本.
| 基因 | 性 | 膀胱湿/干重比 | 膀胱湿重 (g; 85 ul 甲酰胺) | 计算膀胱半 (g) 干重 | OD 620 毫微米空白 | 外径 620 nm/克干重 (膀胱) |
| WT | F | 4.737 | 0.0038 | 0.0008 | 0.0150 | 18.750 |
| WT | M | 4.632 | 0.0045 | 0.0010 | 0.0100 | 10.000 |
| WT | F | 4.700 | 0.0048 | 0.0010 | 0.0280 | 28.000 |
| WT | F | 4.625 | 0.0068 | 0.0015 | 0.0230 | 15.333 |
| WT | F | 4.546 | 0.0077 | 0.0017 | 0.0400 | 23.529 |
| WT | M | 4.800 | 0.0094 | 0.0020 | 0.0570 | 28.500 |
| WT | M | 5.500 | 0.0095 | 0.0017 | 0.0240 | 14.118 |
| WT | F | 4.316 | 0.0098 | 0.0023 | 0.0660 | 28.696 |
| WT | M | 5.061 | 0.0121 | 0.0024 | 0.0400 | 16.667 |
| WT | M | 5.061 | 0.0192 | 0.0038 | 0.0330 | 8.684 |
| 平均 +/-SEM (在上面列的条目) | 4.798 +/-0.105 | 0.0088 +/-0.0014 | 0.0018 +/-0.0003 | 0.0336 +/-0.0056 | 19.228 +/-2.393 | |
| 高 | M | 4.316 | 0.0196 | 0.0045 | 0.1610 | 35.778 |
| 高 | M | 4.600 | 0.0134 | 0.0029 | 0.1020 | 35.172 |
| 高 | M | 4.377 | 0.0104 | 0.0024 | 0.0410 | 17.083 |
| 高 | M | 4.727 | 0.0258 | 0.0055 | 0.1410 | 25.636 |
| 高 | F | 4.539 | 0.0025 | 0.0006 | 0.0250 | 41.667 |
| 高 | M | 4.457 | 0.0149 | 0.0033 | 0.1420 | 43.030 |
| 平均 +/-SEM (在上面列的条目) | 4.503 +/-0.062 | 0.0144 +/-0.0032 | 0.0032 +/-0.0007 | 0.1020 +/-0.0233 | 33.061 +/-4.065 |
表 1: P 物质诱导的血浆从膀胱内渗出的单个重量和小鼠的尿液.血浆渗出值从 FVBN 小鼠 (没有以前的强力霉素) 分别表达为 OD620 纳米/克干重, 从 FVBN (n = 12) 或棉高 (n = 7) 小鼠, 并受到血浆渗出的协议, 如上文详述。在血浆渗出值中没有明显的性别差异。膀胱分离;分别给出了计算膀胱湿/干重比的个体值, 尿液中膀胱一半的湿重, 甲酰胺中膀胱半的计算干重 (在 g 中给出), 修正后的 OD620 nm (样品 OD620 纳米减去 meanOD620 nmof 的空白 (纯甲酰胺) 和计算出的等离子渗出值 OD620 nm/克干重 (纠正 OD620 nm, 除以计算的干重)。由此产生的等离子体渗出值用于构造图 2。
| 基因型和强力霉素周, 无 (-) 或与 (+) | 性 | 十二指肠湿/干重比 | 十二指肠湿重 (g; 85 ul 甲酰胺) | 经计算的十二指肠干重为半 (g) | OD 620 毫微米空白 | OD620/克干重 (十二指肠) |
| WT | M | 4.927 | 0.0307 | 0.0062 | 0.0640 | 10.272 |
| WT | F | 4.912 | 0.0172 | 0.0035 | 0.0460 | 13.138 |
| WT | M | 5.333 | 0.0281 | 0.0053 | 0.0960 | 18.221 |
| WT | F | 5.433 | 0.0375 | 0.0069 | 0.1010 | 14.634 |
| WT | M | 5.179 | 0.0287 | 0.0055 | 0.0430 | 7.759 |
| 平均 +/-SEM (在上面列的条目) | 5.157 +/-0.105 | 0.0284 +/-0.0033 | 0.0055 +/-0.0006 | 0.0700 +/-0.0122 | 12.805 +/-1.798 | |
| 重量 + | M | 5.342 | 0.0542 | 0.0101 | 0.1520 | 14.981 |
| 重量 + | M | 5.653 | 0.0477 | 0.0084 | 0.1120 | 13.272 |
| 重量 + | M | 5.700 | 0.0564 | 0.0099 | 0.1110 | 11.218 |
| 重量 + | F | 5.542 | 0.0498 | 0.0090 | 0.1430 | 15.914 |
| 重量 + | F | 5.723 | 0.0266 | 0.0046 | 0.0470 | 10.112 |
| 重量 + | F | 5.186 | 0.0262 | 0.0051 | 0.0470 | 9.304 |
| 重量 + | M | 5.543 | 0.0342 | 0.0062 | 0.0480 | 7.779 |
| 平均 +/-SEM (在上面列的条目) | 5.527 +/-0.075 | 0.0422 +/-0.0049 | 0.0076 +/-0.0009 | 0.0943 +/-0.0175 | 11.797 +/-1.142 | |
| 高 | F | 5.763 | 0.0209 | 0.0036 | 0.0690 | 19.025 |
| 高 | M | 4.232 | 0.0164 | 0.0039 | 0.1010 | 26.061 |
| 高 | M | 4.810 | 0.0227 | 0.0047 | 0.0880 | 18.647 |
| 高 | F | 5.650 | 0.0363 | 0.0064 | 0.0600 | 9.339 |
| 高 | M | 5.212 | 0.0178 | 0.0034 | 0.0640 | 18.739 |
| 平均 +/-SEM (在上面列的条目) | 5.133 +/-0.282 | 0.0228 +/-0.0035 | 0.0044 +/-0.0005 | 0.0764 +/-0.0078 | 18.362 +/-2.659 | |
| 高 + | M | 5.128 | 0.0193 | 0.0038 | 0.0600 | 15.941 |
| 高 + | M | 5.030 | 0.0459 | 0.0091 | 0.1980 | 21.697 |
| 平均 +/-范围 (在上面列的条目) | 5.079 +/-0.049 | 0.0326 +/-0.0133 | 0.0065 +/-0.0027 | 0.1290 +/-0.0690 | 18.819 +/-2.878 | |
| DT | M | 5.426 | 0.0322 | 0.0059 | 0.0775 | 13.058 |
| DT | M | 4.255 | 0.0360 | 0.0085 | 0.0895 | 10.579 |
| DT | M | 4.818 | 0.0306 | 0.0064 | 0.1460 | 22.989 |
| DT | M | 5.189 | 0.0197 | 0.0038 | 0.0380 | 10.010 |
| DT | F | 5.500 | 0.0256 | 0.0047 | 0.0390 | 8.379 |
| 平均 +/-SEM (在上面列的条目) | 5.038 +/-0.229 | 0.0288 +/-0.0028 | 0.0059 +/-0.0008 | 0.0780 +/-0.0198 | 13.003 +/-2.3607 | |
| DT + | M | 5.008 | 0.0694 | 0.0139 | 0.0270 | 1.948 |
| DT + | M | 4.750 | 0.0660 | 0.0139 | 0.0070 | 0.504 |
| DT + | M | 5.495 | 0.0587 | 0.0107 | 0.0692 | 6.478 |
| DT + | M | 5.233 | 0.0542 | 0.0104 | 0.0620 | 5.986 |
| 平均 +/-SEM (在上面列的条目) | 5.121 +/-0.159 | 0.0621 +/-0.0034 | 0.0122 +/-0.0010 | 0.0413 +/-0.0147 | 3.729 +/-1.478 |
表 2: P 物质诱导的血浆渗出物从 duodenums 的个体重量, overexpressor 和新经济小鼠.血浆渗出值从 FVBN 小鼠 (有或没有前强力霉素) 分别表达为 OD620 纳米/克干重, 从 FVBN 小鼠 (n = 5 没有, 和 n = 7 与, 强力霉素), 新经济小鼠 (n = 5 没有, 和 n = 2 与, 强力霉素) 和新经济overexpressor 双转基因小鼠 (n = 5 没有, 和 n = 4 与, 强力霉素)。在上述情况下, 小鼠受到血浆渗出的协议。在血浆渗出值中没有明显的性别差异。Duodenums 分离;在计算等离子体渗出量时使用的单个值如表 1所述。由此产生的等离子体渗出值用于构造图 3A C。
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Discussion
如上文所述, 研究血浆渗出可能最终导致新的知识的原因或新的方法来抑制或治疗血浆渗出。在目前的手稿中, 使用了埃文斯蓝染料, 成功地使用了等离子渗出协议。虽然这些数据显示了一个假设, 即新经济可以保护血管对等离子渗出, 这是一个次要目标, 目前, 主要目标是提出一个优化的协议, 可以很容易地使用在平均实验室为血浆渗出的未来研究。本文所报告的协议的重点是适应未来的研究与不同的目标, 动物, 器官和其他条件, 并特别有用, 因为这个协议是简单的使用, 可靠, 经济, 并考虑到一般普通材料、试剂和合格人员的可用性。然而, 据指出, 这项议定书将要求每组动物有相当数量的重复 (建议的 8-12 重复), 以取得统计上有效的结果。
有许多研究和报告详述了测量血管通透性和血浆渗出量的尝试。到目前为止, 这些报告中的大多数都详细描述了与埃文斯蓝染料方法一起使用的方法, 以调查血浆渗出和血管通透性2,3,6,11, 12,13。在所有3、13、15、24的血管通透性方法中, 没有纳入埃文斯蓝的报告较少;这些其他方法一般都不太容易接近一般实验室, 需要复杂的方法、专门的设备和人员, 而且一般都很昂贵。
上面的埃文斯蓝协议的开发涉及到许多不同的置换和修改的测试。早期的实验集中在试图注射埃文斯蓝色通过鼠尾静脉。然而, 尾静脉注射在技术上具有挑战性, 结果不一致, 因此有必要纳入上述的颈静脉注射和末端手术技术。许多初步实验也做了尝试找到适当的浓度的埃文斯蓝和物质 P。埃文斯蓝的确切数量没有被发现是必要的, 只要它低于大约200毫克/千克 (与目前使用的50毫克/千克相比), 但在这些实验中使用的 P 物质的数量是重要的。经过多次试验, 1 nmole/千克被发现是外部补充物质 P 的理想浓度, 导致1.5 倍的增加 (从而更容易测量) 血浆渗出值。此外, 还发现, 必须允许埃文斯蓝到平衡 (> 10 分钟) 足够的时间。血管灌注去除过量的埃文斯蓝色, 在老鼠牺牲之后但在器官隔离之前, 被发现是本议定书的一个重要组成部分, 而不是其他不包括此灌注步骤4的议定书。灌流液 (由温和的重力梯度提供) 是50毫升的 pH 值3.5 溶液 (这鼓励了埃文斯蓝和白蛋白的结合);多聚甲醛, 普遍在许多其他埃文斯蓝协议6,10,25, 在本议定书中省略。在本议定书中已解决的另一个因素是, OD620 中使用的染料干扰了从消化道组织中对埃文斯蓝的测定。因此, 有必要在上述实验中使用染色强力霉素周。此外, 一项重要而有用的发现是, 几乎所有的老鼠器官都被令人满意地隔离并通过本议定书进行审查。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者希望感谢安迪 Poczobutt 和 Jori 博士 Leszczynski 对这份手稿的宝贵帮助和编辑。 得到国家心脏、肺和血液研究所 (NHLBI RO1 HL078929、HL014985 和 RO3 HL095439) 和退伍军人事务部 (成绩审查) 提供的赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
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