Summary
Un protocole simple, optimisé et économique décrit dans cet article, qui utilise la méthode du colorant bleu Evans pour évaluer l’extravasation plasmatique dans les organes des souris FVBN qui peuvent être adaptés à d’autres souches, espèces et autres organes ou tissus.
Abstract
Une fuite vasculaire ou l’extravasation plasmatique, a un certain nombre de causes et peut être une conséquence grave ou un symptôme d’une réaction inflammatoire. Cette étude pourrait déboucher sur les nouvelles connaissances concernant les causes du ou des nouveaux moyens d’inhiber ou de traiter l’extravasation plasmatique. Il est important que les chercheurs aient les outils appropriés, y compris les meilleures méthodes disponibles, pour étudier l’extravasation plasmatique. Dans cet article, nous décrivons un protocole, à l’aide de la méthode de colorant bleu Evans, pour évaluer l’extravasation plasmatique dans les organes des souris FVBN. Ce protocole est volontairement simple, à aussi grand un degré possible, mais fournit des données de haute qualité. Bleu Evans a été choisi principalement parce qu’il est facile pour le laboratoire moyen à utiliser. Nous avons utilisé ce protocole pour fournir des preuves et le soutien pour l’hypothèse que l’enzyme néprilysine pourrait protéger les vaisseaux contre l’extravasation plasmatique. Toutefois, ce protocole peut être expérimentalement utilisé et facilement adapté pour être utilisés dans d’autres souches de souris ou chez d’autres espèces, dans de nombreux différents organes ou tissus, pour les études qui peut impliquer des autres facteurs qui sont importants dans la compréhension, la prévention ou le traitement, extravasation plasmatique. Ce protocole a été grandement amélioré et modifiés de protocoles existants et combine fiabilité, facilité d’utilisation, économie et la disponibilité générale des matériaux et équipements, rendant ce protocole supérieur pour le laboratoire moyens à utiliser dans quantifier l’extravasation plasmatique des organes.
Introduction
Une fuite vasculaire dans les organes se réfère à l’extravasation, ou fuite du plasma sanguin par des fentes produites dans l’endothélium des post veinules capillaires dans les organes. Cette extravasation plasmatique ou augmentation de la perméabilité vasculaire, qui peut-être découler d’une réaction inflammatoire quelconque, peut avoir des conséquences graves. Ainsi, il est important que ce phénomène, ses causes, les modulateurs et les conséquences, sont étudiés et compris, et même, que les enquêteurs ont bien des outils et protocoles permettant de les étudier. Les lacunes endothéliales peuvent être produits par un certain nombre de stimuli, mais sont habituellement produites par l’action des neurotransmetteurs peptidiques et/ou tachykinines sur l’endothelia. Un des principaux médiateurs naturels de ce processus, ce qui provoque l’extravasation plasmatique accrue, est l’undecapeptide TACHYKININE neuropeptide, la substance P1.
Méthodes d’enquêter et de mesurer la perméabilité vasculaire ou l’extravasation plasmatique, qui utilisent la propriété de liaison de l’albumine de bleu Evans, ont été développés et sont généralement réputés pour leur précision, simplicité, économie, sécurité et aptitude à permettre le détermination de l’extravasation plasmatique de plusieurs tissus à la fois, dans l’affirmative désiré2,3,4,5,6,7,8,9 . Ce protocole de bleu Evans pour évaluer l’extravasation plasmatique dans les organes des souris FVBN utilise tous ces, mais ajoute quelques modifications importantes qui le rendent généralement utile et adaptable pour de futures études, impliquant le laboratoire moyens qui effectue ou qui seront mener des études importantes des facteurs liés à l’extravasation plasmatique ou perméabilité vasculaire. Dans ce protocole, la substance P est introduite à la souris à 1 nmol/kg, ce qui augmente l’extravasation de plasma par 1,5 fois. Ceci augmente la sensibilité du protocole, ce qui entraîne plus facilement des résultats observables et réalisables. Autres facteurs qui influent sur la perméabilité, telles que diverses autres peptides, produits chimiques ou certaines formes de lésions toxiques, peuvent être utilisés ou étudiés par d’autres laboratoires, comme vous le souhaitez. Veine jugulaire injections sont utilisés dans le présent protocole qui va présenter le bleu Evans et substance P systémique, qui nécessite une chirurgie terminale. Cependant, veine jugulaire injections5,7,10, même après avoir examiné les techniques chirurgicales terminales nécessaires, sont plus faciles à maîtriser et conduire à la production de résultats plus cohérents qu’autre des injections veineuses, y compris la queue de la veine des injections4,9. Bien qu’il serait possible de bleu Evans doivent être fournis par des injections de sinus veineux rétro-orbitaire, aucuns références dans la littérature n’ont été trouvés qui utilisent cette méthode de livraison de bleu Evans. Toutefois, en ce qui concerne les injections de queue de veine, le degré élevé d’expertise et de la pratique de façon reproductible maîtriser cette technique très limite son utilisation pour des injections de bleu Evans réussies. En revanche, la méthode d’injection de rechange veine jugulaire, comme décrit dans notre protocole, offre une solution techniquement possible. Une procédure cruciale pour la perfusion des veines de la souris, effectué juste après le sacrifice de la souris sous perfusion bleu Evans, supprime les excès bleu Evans et a été normalisé par le présent protocole. Méthodes précédemment décrites de perfusion ont été soigneusement examinés et modifiés pour obtenir la procédure actuelle. Autres modifications décrites ici sont tous optimisés, simple et peu coûteux.
Il y a certaines limitations importantes de la méthode de colorant bleu Evans. Par exemple, faible sensibilité, parfois associée à cette méthode peut empêcher certains examen brut supplémentaire de pathologique et histologique des tissus provenant d’animaux d’injection de bleu Evans. Cependant, ceux-ci et autres contraintes ont conduit au développement de méthodes alternatives et des modèles qui, néanmoins, toujours utilisent bleu Evans. La mesure de bleu Evans par fluorescence (plutôt que par la portée visuelle) spectroscopie peut augmenter la sensibilité de la méthode. En outre, la microscopie de fluorescence des tissus de coloration bleu Evans a été développée pour permettre l’observation d’une fuite vasculaire en plus distincts endroits11. Aussi, confiné d’imagerie et d’analyse d’un animal vivant précédemment injecté avec Evans bleu12 permet d’enquête des concentrations de bleu Evans d’une manière continue, plutôt qu’au une propre fois choisi le point de l’expérience. Toutefois, cette méthode requiert la disponibilité d’installations d’imagerie appropriées et peut être très coûteuse. Les adaptations impliquant Evans bleu et interprété dans un type in vitro de modèle, comme dans une cellule culture ou poussin modèle Chorio-13 (CAM) ont également été décrites. Ces modèles sont surveillées par fluorescence et de la microscopie intravitale14 et permettent la quantification des modifications de la perméabilité vasculaire au fil du temps, mais peuvent soulever des questions au sujet de la modélisation précise de in vivo des conditions et peuvent également être cher.
Il y a eu des autres méthodes mises au point afin de déterminer et de quantifier une fuite vasculaire ou perméabilité, qui n’impliquent pas l’administration de bleu Evans. Ces méthodes peuvent employer une molécule fluorescente appropriée (comme l’albumine ou fluorescéine), ou une molécule tagged isotopiquement étiquetée ou autrement, d’animaux vivants (ou à la cellule culture ou Chorio (CAM) modèles13, suivi non invasif imagerie (balayage d’animal de compagnie, MRI, la microscopie intravitale, corps entier balayage) ou invasive d’imagerie (microscopie fluorescente)3,12,15. Bien que ces techniques peuvent offrir un certain nombre d’avantages par rapport aux autres Evans méthodes bleus, ils ont aussi des inconvénients, qui peuvent comprendre leur complexité considérable, compétences requises, les ressources et les coûts monétaires élevés.
Néprilysine16 (la peptidase enzyme NEP, également connu sous le nom CD10, MME ou enképhalinase) a été suggéré d’être impliqués dans l’inhibition de l’extravasation plasmatique, au moins en partie, par le métabolisme enzymatique et l’inactivation de P. de substance endogène Ainsi, dans les tissus où la peptidase de surface cellulaire NEP survient, il peut y avoir une atténuation de l’effet de la substance P, probablement par l’activité peptidase du NEP.
Au départ, nous avons testé pour l’extravasation plasmatique induite par la substance P utilisant ce protocole modifié de bleu Evans, avec FVBN sauvage (WT) et souris knockout (KO) de NEP. Participation de NEP à l’extravasation plasmatique augmentée la substance P a été soupçonnée de ces premières études, et nous décrire ces expériences plus rôle de NEP impliquant dans l’extravasation plasmatique. Toutefois, la mise au point de ce manuscrit n’est pas son rôle dans l’extravasation plasmatique ou NEP, mais plutôt l’extravasation plasmatique expériences eux-mêmes. Les résultats de la NEP sont représentatifs du type de résultats pouvant être obtenus via l’utilisation de ce protocole modifié. La méthode de bleu Evans pour mesurer l’extravasation plasmatique a été optimisée et modifiée, tel que décrit en détail ci-dessous pour les souris FVBN.
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Protocol
Toutes les directives internationales, nationales et/ou institutionnels pour le soin et l’utilisation des animaux (souris) ont été suivis dans les expériences décrites dans ce manuscrit.
Cette méthode utilise des souris adultes FVBN, âgés de 16 à 20 semaines, jugées optimales pour l’application de la présente étude. Jour 1 comprend les étapes 1 à 5 et 2 jours comprend les étapes 6 et 7 (Figure 1).
1. matériel préparation
- Garantir un approvisionnement suffisant de seringues stériles, jetables et aiguilles, si la kétamine/xylazine est utilisé comme l’anesthésie (comme recommandé). Si l’isoflurane est utilisé comme l’anesthésie, vérifier le réservoir d’oxygène et le niveau de liquide d’isoflurane pour s’assurer qu’un approvisionnement adéquat pour l’expérience avant de commencer. En outre, assembler l’ogive circuits de respiration et joignez-les à la boîte de l’induction ; Fixez nouvelles cartouches à charbon sur les circuits respiratoires. Préparer la zone induction en tournant sur l’oxygène et s’être assuré que la deuxième étape lit environ 50 lb/po2.
- Mettre en marche le coussin chauffant à 37 ° C.
- Préparer la sonde de température rectale à la chirurgie.
2. préparation souris
Cette étape comprend l’anesthésie, l’épilation et positionnement (FVBN souris-âge adulte 16 à 20 semaines).
- Peser les souris et noter leur poids.
- Anesthésier les souris.
- Administrer la kétamine et xylazine IP (80-100 mg/kg et 7,5-16 mg/kg, respectivement). Toutefois, il est recommandé de commencer avec faibles doses de kétamine et de xylazine (30 mg/kg et de 6 mg/kg, respectivement).
- Maintenir l’anesthésie avec environ 0,1 - 0,25 fois initiale des doses de kétamine/xylazine tout au long de la chirurgie. Kétamine et xylazine étaient les agents anesthésiques de choix dans cette étude, car plus de reproductibilité et de survie ont été observés. On trouvera les agents anesthésiques de choix dans d’autres études d’être différent. Si l’isoflurane est utilisé, placez la souris dans une chambre à induction et allumez isoflurane à 5 % jusqu'à ce que la souris perd conscience complète. Ensuite, utilisez une pointe nasale fixée à 1,5 à 2,5 % isoflurane durant le reste de la procédure.
- Surveiller les souris toutes les 2-3 min par pincement d’orteil pour vérifier la profondeur appropriée de l’anesthésie.
- Raser la zone ventrale de cou de la souris.
- Placez votre souris en position couchée sur le pad préchauffé. Fixez les pattes et les pieds de la souris sur la surface chirurgicale avec du ruban adhésif.
- Placez la larme artificielle onguent sur les yeux pour éviter le dessèchement pendant la chirurgie.
3. chirurgies détails
- Faire une incision de 1 cm dans le cou juste ventral sur la veine jugulaire.
- Appliquer une ou deux gouttes de lidocaïne (1-2 %) dans la zone de l’incision pour la gestion de la douleur et à favoriser la vasodilatation. Attendez 2 min. de la lidocaïne prenne effet.
- Exposer et isoler la veine jugulaire interne droite par l’intermédiaire de dissection non tranchante. Attacher la veine avec suture 4-0 et retirer doucement l’extrémité rostrale du navire avec une pince hémostatique. Découpez un trou, à l’aide des ciseaux, environ 3 mm ci-dessous ou caudale à la cravate, environ à mi-chemin à travers le diamètre de la veine.
- Marquer un cathéter polyvinylique PV-1 à 1,5 cm de l’extrémité et insérez-le dans la veine jugulaire dans le trou à l’aide d’un dilatateur de navire et visser le cathéter vers l’extrémité caudale du navire, environ 1,5 cm.
- Attacher le cathéter solidement dans la partie caudale du navire (en dessous de la coupe), avec de la soie de 4-0. Attacher la partie rostrale du navire à l’extérieur du cathéter avec les deux bouts de la suture qui servait à attacher la veine jugulaire rostrale, à l’étape 3.3.
- Amure la peau lâche de retour ensemble autour de la sonde avec de la soie de 4-0 pour aider à prévenir la perte de chaleur corporelle et de la dessiccation des tissus.
- Raccorder le cathéter à une seringue contenant du sérum physiologique hépariné (10 U/mL) et rincer le cathéter.
4. injections
- Injecter la solution de bleu Evans (50 μL d’une solution de 30 mg/mL dans une solution saline normale, unheparinized de 0,9 %, ou environ 50 mg/kg) dans le cathéter de la veine jugulaire, suivi d’une petite quantité de sérum physiologique hépariné pour rincer la ligne.
- 2 min plus tard, injecter la substance P (100 μL d’une solution de 0,3 μM dans une solution saline normale, unheparinized de 0,9 %, ou 1 nmol/kg), suivie d’une petite quantité de sérum physiologique hépariné pour rincer la ligne. La substance P augmente l’extravasation de protéines plasmatiques à travers la couche endothéliale ; dans ce protocole, il induit systématiquement une augmentation des valeurs de l’extravasation plasmatique d’environ 1,5 fois, faire de plasma extravasation valeurs, plus facile à mesurer.
- Attendre 18 min après que la substance P est injecté. Pendant ce temps, le colorant bleu Evans s’équilibrer, faire circuler.
- Mettre fin à l’expérience 18 min après l’injection de la substance P (20 min après l’injection de bleu Evans) en sacrifiant la souris avec dislocation cervicale. Il est probable que la souris peut être directement doivent disloqué, sans premier donner une surdose d’anesthésique, comme la souris est probablement encore bien anesthésié de la chirurgie. Toutefois, s’il le faut, une surdose de l’anesthésique kétamine/xylazine, isoflurane ou pentobarbital peut être donnée, suivie par dislocation cervicale.
5. isolation des organes
- Fend la cavité thoracique de la souris et gravité-perfuse (d’une hauteur d’environ 51 cm ou 20"), le cœur et les vaisseaux sanguins avec 50 mL de 50 mM du citrate de sodium, pH de 3,5. pH 3.5 conserve sans doute contraignant de bleu Evans à l’albumine.
- D’accise 1-5 organismes concernés (tissus) avec un scalpel dissection (p. ex. de la vessie, rein, estomac, foie, pancréas, proximale ou distale du côlon, iléon, duodénum, flanc peau, oreilles, queue, coeur, et poumons) et de supprimer tout contenu résiduel, si présents.
- Rincez les organes à température ambiante (RT) tampon phosphate salin (PBS ; 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, 8,0 g de NaCl et 0,20 g de KCl dans 1 L, pH 7,4).
- Épongez les organes avec tissu, couper chaque organe en deux et peser chaque moitié (wet poids, g).
- Sécher une moitié du tissu dans une étuve à 150 ° C, sur une feuille, pendant 48 h.
- Placez les autres tissus de la moitié dans un volume cohérent (200 µL) de formamide dans un microtube tube pendant 48 h (et jusqu'à 72 h) pour extraire le bleu Evans.
6. mesures de tissu OD
- Enlever 50 µL de formamide d’infusé de bleu Evans (après une incubation de 48-72 h RT) du tube à centrifuger et lieu dans un puits d’une plaque 96 puits en polystyrène. Veillez à ne pas transférer des morceaux de tissu ainsi que le formamide.
- Place 50 µL de nouveau, pure formamide dans chacun des deux puits vides de la plaque à 96 puits pour les blancs.
- Mesurer et consigner la do620 de chaque puits de la plaque de 96 puits sur un lecteur de plaque d’absorbance. 620 nm est l’absorbance maximale de bleu Evans.
7. calcul de l’Extravasation plasmatique
- Peser le tissu sec la moitié qui a été dans le four pendant 48 h.
- Calculer le ratio de poids poids humide/sec pour l’organe spécifique d’intérêt de chaque souris individuels, commençant par le poids de ce tissu moitié (obtenu en étape 5.4), divisé par le poids sec de ce même tissu moitié (obtenu en étape 7.1).
- Calculer le poids sec (en g) du tissu moitié en formamide en divisant le poids du tissu moitié avant il a été placé en formamide (obtenu à l’étape 5.4) par la voie humide : ratio de poids sec pour l’organe spécifique d’intérêt (calculé à l’étape 7.2).
- Calculer les valeurs de620 OD corrigé . À partir de l' OD620 valeur de chaque puits expérimental de la plaque à 96 puits (contenant du formamide de Evans bleu infusé de chaque tissu, obtenu à l’étape 6.3), soustraire la vierge bien OD620 (la valeur moyenne OD620 de les deux puits contenant du formamide pur, préparé à l’étape 6.2, OD620 valeurs obtenues à l’étape 6.3) de chaque valeur expérimentale.
- Calculer la valeur de l’extravasation plasmatique en divisant le corrigé do620 (calculée en étape 7,4) par le poids sec du tissu moitié en formamide (calculée en étape 7.3). Les unités de l’extravasation plasmatique sera OD620/g de poids sec.
- Analyser les données et explicite sous forme de moyenne ± SEM. statistiquement comparer les groupes de test t ou analyse de variance et test de comparaison multiple de Scheffé (lycofs01.lycoming.edu), selon le cas.
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Representative Results
Dans la Figure 1, un schéma de la procédure est montré, qui a été trouvé pour entraîner les valeurs de l’extravasation plasmatique induite par la substance P plus fiable et cohérente des organes des souris FVBN. Cette procédure prend généralement deux jours de travail, séparés par au moins 48 h de délai d’attente. Il est possible de l’étendre encore plus, si cela est fait systématiquement pour toutes les expériences à comparer. Par exemple, après que les organes sont isolées au jour 1, les organes peuvent être flash congelés dans l’azote liquide et conservé à-80 ° C ; après décongélation soigneusement les organes (à moins de quelques jours à 1 semaine), ils peuvent être lavées dans du PBS et effacés avant le reste du protocole. Aussi, bien que le séchage des tissus devrait se faire comme indiqué (à 150 ° C pendant 48 h), l’extraction de bleu du tissu Evans moitié en formamide peut être prolongée de 48-72 h, aussi longtemps que le temps en formamide est compatible pour toutes les expériences.
Montré en Figure 2 et tableau 1 données montre l’extravasation plasmatique induite par la substance P de la vessie urinaire de FVBN sauvage (WT) et NEP de souris knockout (KO)17, qui étaient disponibles, principalement en raison de ce laboratoire intérêts depuis longtemps à la NEP et la réglementation et les actions de certains neuropeptides18,19. Souris KO NEP n’expriment pas de NEP dans n’importe quel tissu. Cependant, NEP s’exprime dans la vessie des souris WT, quoiqu’à des niveaux faibles de21,20,22. Figure 2 et tableau 1 indiquent qu'il y a une différence dans l’extravasation plasmatique induite par la substance P de la vessie urinaire de ces deux groupes de souris. Cela implique un rôle pour NEP dans l’extravasation plasmatique induite par la substance P de la vessie, car l’expression de la NEP est potentiellement la principale différence dans les vessies urinaires de souris WT et NEP KO.
Parce que les données d’origine a proposé un rôle possible pour NEP dans l’extravasation plasmatique induite par la substance P dans la vessie (Figure 2 et tableau 1), nous avons décidé d’étudier plus en détail la participation de NEP à l’extravasation plasmatique dans un autre Organ. Tout d’abord, nous avons créé une souris doublement transgénique à overexpress NEP presque universellement23. Cette souris ingénierie a permis une comparaison des données de trois types de souris FVBN : WT souris16, qui expriment naturellement une quantité limitée de NEP dans de nombreux tissus ; NEP KO souris17, qui n’expriment aucun NEP dans n’importe quel tissu ; et notre doublement transgéniques NEP overexpressor souris23, dont NEP overexpress dans presque tous les tissus à l’administration de doxycycline. Souris ont libre accès à doxycycline contenant chow pendant 1 semaine avant l’intervention chirurgicale (Figure 1) ; dose de doxycycline est de 1 mg/kg de chow, incolores. La construction de ces souris doublement transgéniques qui surexpriment NEP a été détaillée, avec description des essais de NEP, westerns et NEP ARNm qPCR23.
Avec ces 3 types de souris, ce protocole présente un rôle pour NEP dans l’extravasation plasmatique dans les tissus, y compris le duodénum23 (Figure 3 et tableau 2). Dans ces expériences, la surexpression de NEP chez les souris d’overexpressor NEP doublement transgéniques a été activée par l’alimentation, car 1 semaine avant le jour 1, chow contenant doxycycline (incolores ; 1 mg doxycycline/mg chow, Figure 3a). Comme un contrôle, certaines souris WT et NEP KO ont été également nourris le chow Etoffe doxycycline pendant la semaine qui précède le jour 1 (Figure 3b et 3C).
Pour confirmer le rôle de NEP dans l’extravasation plasmatique à dans le duodénum de souris FVBN, l’expression de NEP dans le duodénum de FVBN WT et NEP (doublement transgénique) souris overexpressor chow doxycycline a été confirmée par analyse Western avec un anticorps polyclonal dirigé contre NEP humaine (qui réagit avec souris NEP)23. Cette analyse confirme que duodenums WT expriment des quantités modérées de la protéine de la NEP, mais les duodenums d’overexpressor de NEP expriment 2-3 x le montant de NEP exprimé par les duodenums WT. Les souris NEP KO, par définition, n’expriment pas tout NEP dans le duodénum.
Figure 1: schéma général du protocole de mesure de l’extravasation plasmatique induite par la substance P. Schéma du protocole de mesure de l’extravasation plasmatique induite par la substance P des organes des souris FVBN (âgés de 16 à 20 semaines). Ce protocole consiste à mesurer l’extravasation plasmatique tissulaire par la méthode de colorant bleu Evans par injection dans la veine jugulaire et incorpore de façon exogène administrée la substance P, pour obtenir l’extravasation plasmatique augmentée et facilement mesurables valeurs, en unités de OD620/g de poids sec. Le protocole décrit s’est avéré conforme induite par la substance P plasma extravasation valeurs de divers organes des souris FVBN et prend un minimum de deux jours de travail. Jour 1 et jour 2 sont séparés par au moins 48 h de temps d’attente pour les tissus à sécher et à extraire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Extravasation plasmatique induite par la Substance P de la vessie des souris WT et NEP KO. L’extravasation plasmatique vessie de souris FVBN (sans préalable doxycycline) augmentée par l’administration de la substance P et exprimée en OD620 nm/g de poids sec. Vessies urinaires ont été isolées de type sauvage FVBN (WT ; barre blanche, n = 12) ou knockout FVBN NEP (KO ; barre noire, n = 7) souris et soumis au protocole de l’extravasation plasmatique comme détaillé ci-dessus. Les valeurs individuelles sont indiquées au tableau 1. Les lignes au-dessus des barres représentent l’écart-type de la moyenne (SEM). Les valeurs de l’EM et NEP KO suivi une tendance vers une différence significative p = 0.051 t test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Extravasation plasmatique induite par la Substance P du duodénum de souris overexpressor WT, NEP KO et NEP. (A-C) L’extravasation plasmatique duodénal augmentée par l’administration de la substance P et exprimée en OD620/g de poids sec. Duodenums (A) ont été isolés chez des souris de FVBN WT sans préalable doxycycline (- ; blanc bar, n = 5), souris NEP KO sans préalable doxycycline (- ; légère barre grise, n = 5), NEP ovexpressor doublement transgéniques sans préalable doxycycline (DT- ; barre grise foncée, n = 5) ou NEP ovexpressor doublement transgéniques avec la doxycycline préalable (DT + ; noir bar, n = 4) et soumis au protocole de l’extravasation plasmatique comme détaillé ci-dessus. Les lignes au-dessus des barres représentent le SEM. Bien que les valeurs de NEP KO (-) affiché une tendance à plus de la WT (-) ou à la DT (-) valeurs, cette différence n’était pas statistiquement significative. Valeurs d’extravasation plasmatique duodénale ont diminué significativement qu’avec le groupe de doxycycline nourri, NEP ovexpressor doublement transgéniques (DT +), par rapport à tous les autres (* p < 0,05, analyse de la variance). (B, C) Valeurs l’extravasation plasmatique duodénal souris WT et NEP KO n’étaient pas significativement affectés par l’administration de doxycycline (p < 0,05). (B) WT souris sans doxycycline (WT- ; barre blanche, n = 5) et souris WT avec la doxycycline (WT + ; moyenne barre grise, n = 7). (C), NEP KO souris sans doxycycline (KO- ; barre grise clair, n = 5) et NEP KO avec la doxycycline (KO + ; moyenne barre grise, n = 2). Valeurs individuelles montrés comme un composite a, B et C, sont donnés dans le tableau 2. Reproduit avec une modification mineure du Springer journal article23 avec la permission de Springer Science + Business Media. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Génotype | sexe | ratio poids humide/sec de vessie | poids de la vessie urinaire, moitié (g ; en 85 formamide μL) | calculé le poids sec de vessie moitié (g) | OD 620 nm - blanc | OD 620 nm/g de poids sec (vessie) |
| WT | F | 4,737 | 0,0038 | 0,0008 | 0,0150 | 18.750 |
| WT | M | 4.632 | 0,0045 | 0,0010 | 0,0100 | 10.000 |
| WT | F | 4,700 | 0,0048 | 0,0010 | 0,0280 | 28.000 |
| WT | F | 4.02s | 0,0068 | 0,0015 | 0,0230 | 15.333 |
| WT | F | 4,546 | 0.0077 | 0,0017 | 0.0400 | 23.529 |
| WT | M | 4.800 | 0,0094 | 0,0020 | 0.0570 | 28,500 |
| WT | M | 5,500 | 0,0095 | 0,0017 | 0.0240 | 14.118 |
| WT | F | 4.316 | 0,0098 | 0,0023 | 0.0660 | 28.696 |
| WT | M | 5.061 | 0.0121 | 0,0024 | 0.0400 | 16,667 |
| WT | M | 5.061 | 0.0192 | 0,0038 | 0.0330 | 8.684 |
| Moyenne +/-SEM (des entrées dans la colonne ci-dessus) | 4.798 +/-0,105 | 0.0088 +/-0,0014 | 0,0018 +/-0,0003 | 0,0336 euro +/-0,0056 | 19.228 +/-2.393 | |
| KO | M | 4.316 | 0.0196 | 0,0045 | 0.1610 | 35,778 |
| KO | M | 4.600 | 0,0134 | 0,0029 | 0.1020 | 35.172 |
| KO | M | 4.377 | 0,0104 | 0,0024 | 0.0410 | 17.083 |
| KO | M | 4,727 | 0.0258 | 0,0055 | 0.1410 | 25.636 |
| KO | F | 4.539 | 0,0025 | 0,0006 | 0.0250 | 41.667 |
| KO | M | 4.457 | 0,0149 | 0,0033 | 0.1420 | 43.030 |
| Moyenne +/-SEM (des entrées dans la colonne ci-dessus) | 4.503 +/-0,062 | 0,0144 +/-0,0032 | 0,0032 +/-0,0007 | 0.1020 +/-0.0233 | 33.061 +/-4.065 |
Tableau 1 : extravasation plasmatique induite par la Substance P de la vessie des souris individuels de WT et NEP KO. Valeurs de l’extravasation plasmatique de souris FVBN (sans préalable doxycycline) ont été individuellement exprimées en OD620 nm/g de poids sec de FVBN WT (n = 12) ou NEP KO (n = 7) souris et soumis au protocole de l’extravasation plasmatique comme détaillé ci-dessus. Aucune différence entre les sexes n’était évidents dans les valeurs de l’extravasation plasmatique. Vessies urinaires ont été isolées ; valeurs individuelles sont donnés pour le ratio calculé poids humide/sec de la vessie, le poids net de la vessie, moitié en formamide, le calcul de poids sec de la vessie urinaire moitié en formamide (donnée en g), le corrigé OD620 nm (échantillon OD620 nm moins la nmof de meanOD620 les blancs (formamide pur) et la valeur de l’extravasation plasmatique calculée à OD620 nm/g de matière sèche (le corrigé OD620 nm, divisé par le poids sec calculé). Les valeurs de l’extravasation plasmatique résultante ont servi à construire la Figure 2.
| Génotype et doxycycline chow, sans (-) ou (+) | sexe | rapport poids / du duodénum sec/humide | demi de poids du duodénum humide (g ; en 85 formamide μL) | calculer le poids sec du duodénum moitié (g) | OD 620 nm - blanc | OD620 nm/g de poids sec (duodénum) |
| WT- | M | 4.927 | 0,0307 | 0,0062 | 0.0640 | 10.272 |
| WT- | F | 4.912 | 0,0172 | 0,0035 | 0,0460 | 13.138 |
| WT- | M | 5.333 | 0,0281 | 0,0053 | 0.0960 | 18.221 |
| WT- | F | 5,433 | 0,0375 | 0,0069 | 0.1010 | 14.634 |
| WT- | M | 5,179 | 0,0287 | 0,0055 | 0.0430 | 7.759 |
| Moyenne +/-SEM (des entrées dans la colonne ci-dessus) | 5.157 +/-0,105 | 0,0284 +/-0,0033 | 0,0055 +/-0,0006 | 0.0700 +/-0,0122 | 12.805 +/-1.798 | |
| WT + | M | 5.342 | 0.0542 | 0,0101 | 0.1520 | 14.981 |
| WT + | M | 5.653 | 0,0477 | 0,0084 | 0.1120 | 13.272 |
| WT + | M | 5.700 | 0.0564 | 0,0099 | 0.1110 | 11,218 |
| WT + | F | 5,542 | 0.0498 | 0,0090 | 0.1430 | 15.914 |
| WT + | F | 5.723 | 0,0266 | 0,0046 | 0,0470 | 10.112 |
| WT + | F | 5.186 | 0.0262 | 0.0051 | 0,0470 | 9.304 |
| WT + | M | 5.543 | 0,0342 | 0,0062 | 0.0480 | 7.779 |
| Moyenne +/-SEM (des entrées dans la colonne ci-dessus) | 5.527 +/-0,075 | 0.0422 +/-0,0049 | 0.0076 +/-0,0009 | 0.0943 +/-0,0175 | 11.797 +/-1,142 | |
| KO- | F | 5.763 | 0.0209 | 0,0036 | 0,0690 | 19.025 |
| KO- | M | 4.232 | 0.0164 | 0,0039 | 0.1010 | 26.061 |
| KO- | M | 4.810 | 0.0227 | 0,0047 | 0.0880 | 18.647 |
| KO- | F | 5.650 | 0.0363 | 0.0064 | 0.0600 | 9.339 |
| KO- | M | 5.212 | 0,0178 | 0,0034 | 0.0640 | 18.739 |
| Moyenne +/-SEM (des entrées dans la colonne ci-dessus) | 5.133 +/-0,282 | 0.0228 +/-0,0035 | 0,0044 +/-0,0005 | 0.0764 +/-0,0078 | 18.362 +/-2.659 | |
| KO + | M | 5.128 | 0.0193 | 0,0038 | 0.0600 | 15.941 |
| KO + | M | 5.030 | 0.0459 | 0.0091 | 0.1980 | 21.697 |
| Moyenne +/-gamme (des entrées dans la colonne ci-dessus) | 5.079 +/-0,049 | 0,0326 +/-0,0133 | 0,0065 +/-0,0027 | 0.1290 +/-0,0690 | 18.819 +/-2,878 | |
| DT- | M | 5.426 | 0.0322 | 0,0059 | 0,0775 | 13.058 |
| DT- | M | 4.255 | 0,0360 | 0,0085 | 0,0895 | 10.579 |
| DT- | M | 4.818 | 0.0306 | 0.0064 | 0.1460 | 22.989 |
| DT- | M | 5.189 | 0.0197 | 0,0038 | 0,0380 | 10.010 |
| DT- | F | 5,500 | 0,0256 | 0,0047 | 0.0390 | 8.379 |
| Moyenne +/-SEM (des entrées dans la colonne ci-dessus) | 5,038 +/-0.229 | 0,0288 +/-0.0028 | 0,0059 +/-0,0008 | 0.0780 +/-0.0198 | 13,003 +/-2.3607 | |
| DT + | M | 5.008 | 0,0694 | 0,0139 | 0.0270 | 1.948 |
| DT + | M | 4,750 | 0.0660 | 0,0139 | 0,0070 | 0,504 |
| DT + | M | 5,495 | 0.0587 | 0,0107 | 0.0692 | 6.478 |
| DT + | M | 5.233 | 0.0542 | 0,0104 | 0.0620 | 5.986 |
| Moyenne +/-SEM (des entrées dans la colonne ci-dessus) | 5.121 +/-0.159 | 0.0621 +/-0,0034 | 0,0122 +/-0,0010 | 0.0413 +/-0,0147 | 3.729 +/-1.478 |
Tableau 2 : extravasation plasmatique induite par la Substance P de le duodenums de souris individuels d’overexpressor WT, NEP KO et NEP. Valeurs de l’extravasation plasmatique de souris FVBN (avec ou sans préalable doxycycline) ont été individuellement exprimées en OD620 nm/g de poids sec, de souris FVBN WT (n = 5 sans et n = 7, avec la doxycycline), souris NEP KO (n = 5 sans et n = 2, avec la doxycycline) et NEP doublement transgéniques d’overexpressor (n = 5 sans et n = 4, avec la doxycycline). Souris ont été soumises au protocole d’extravasation plasmatique comme détaillé ci-dessus. Aucune différence entre les sexes n’était évidents dans les valeurs de l’extravasation plasmatique. Duodenums ont été isolées ; les valeurs individuelles utilisées pour calculer l’extravasation plasmatique ont été comme pour le tableau 1. Les valeurs de l’extravasation plasmatique résultante ont servi à construire la Figure 3A-C.
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Discussion
Comme indiqué ci-dessus, l’étude de l’extravasation plasmatique pourrait déboucher sur les nouvelles connaissances concernant les causes du ou des nouveaux moyens d’inhiber ou de traiter l’extravasation plasmatique. L’utilisation efficace du protocole extravasation plasmatique (ci-dessus), à l’aide de bleu Evans, a été démontrée dans le manuscrit actuel. Bien que les données affichées en arrière l’hypothèse que le NEP peut protéger les vaisseaux contre l’extravasation plasmatique, c’est un objectif secondaire actuellement, dont le but principal est de présenter un protocole optimisé qui peut être facilement utilisé dans le laboratoire de moyens pour les étude future de l’extravasation plasmatique. Le protocole rapporté ici se concentre sur l’adaptabilité à des études ultérieures avec des objectifs différents, les animaux, les organes et les autres conditions et est particulièrement utile, parce que ce protocole est simple à utiliser, fiable et économique et prend en compte le général disponibilité des matériaux communs, aux réactifs et personnel compétent. Il est à noter, cependant, que ce protocole exigera une bonne quantité de répétitions par groupe d’animaux (8-12 répétitions suggérées) pour obtenir des résultats statistiquement valides.
Il y a eu plusieurs études et rapports détaillant les tentatives de mesure de la perméabilité vasculaire et l’extravasation plasmatique. De loin, la plupart de ces rapports détail permutations des méthodes utilisées avec la méthode du colorant bleu Evans pour enquêter sur l’extravasation plasmatique et la perméabilité vasculaire2,3,6,11, 12,,13. On a signalé moins de méthodes de perméabilité vasculaire qui n’incorporent Evans bleu à tous les3,13,15,24; ces autres méthodes sont en général moins accessible pour le laboratoire moyens, nécessitant des méthodes compliquées, des équipements spécialisés et du personnel et sont généralement coûteux.
L’élaboration du protocole bleu Evans ci-dessus consistait aux tester de nombreuses différentes permutations et modifications. Premières expériences ont porté sur les tentatives d’injecter Evans blue dans la veine de queue de souris. Toutefois, la queue injections de veine s’est avérées techniquement difficile et a abouti à des résultats incohérents, ce qui a nécessité l’inclusion des veine jugulaire des injections et terminales techniques chirurgicales décrites ci-dessus. De nombreuses expériences préliminaires ont également fait essayer de le trouver des concentrations appropriées d’Evans bleu et la substance P. La quantité exacte de bleu Evans n’a pas été trouvée de façon impérative, tant il était inférieur d’environ 200 mg/kg (contre 50 mg/kg, utilisé actuellement), mais la quantité de substance P utilisée dans ces expériences était importante. Après beaucoup d’essais, 1 nmole/kg s’est avéré pour être la concentration idéale d’exogène de la substance P, aboutissant à une augmentation de 1,5 fois de (et donc plus facilement mesurable) les valeurs de l’extravasation plasmatique. En outre, il a été constaté doit permettre suffisamment de temps pour le bleu Evans s’équilibrer (> 10 min). La perfusion des vaisseaux sanguins pour enlever l’excès Evans bleu, après le sacrifice de la souris, mais avant l’isolement de l’orgue, s’est avérée pour être un élément essentiel du présent protocole, par opposition à d’autres protocoles qui n’incluent pas cette étape de perfusion4. Le perfusat (envoyée par un gradient de gravité douce) est de 50 mL d’une solution de pH 3.5 (qui favorise la liaison de l’albumine et de bleu Evans) ; paraformaldéhyde, répandue dans de nombreux autres Evans protocoles bleu6,10,25, est omis dans le présent protocole. Un autre facteur qui a été résolu par le présent protocole est que le colorant utilisé dans la nourriture de doxycycline interfère avec la mesure de nm OD620 de bleu Evans dans les tissus de la voie alimentaire. Ainsi, il fallait utiliser chow Etoffe doxycycline dans les expériences ci-dessus. En outre, une conclusion importante et utile est que presque n’importe quel organe de la souris est convenablement isolé et examiné par le présent protocole.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Andy Poczobutt et Dr Jori Leszczynski pour leur aide précieuse et les modifications à ce manuscrit. Pris en charge par des subventions provenance du National Heart, Lung et Blood Institute (NHLBI RO1 HL078929, HL014985 de PPG et RO3 HL095439) et l’anciens combattants Ministère des (examen du mérite).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
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