Summary
במאמר זה מתואר פרוטוקול חסכוני, אופטימיזציה, ופשוט אשר משתמשת בשיטת צבע כחול אוונס להערכת extravasation פלזמה באיברים של עכברים FVBN אשר ניתן להתאים לשימוש זנים אחרים, מינים, ואת שאר איברים או רקמות.
Abstract
דליפת דם, או פלזמה extravasation, יש מספר סיבות, עשוי להיות עם תוצאה חמורה או סימפטום מתגובה דלקתית. מחקר זה עשוי להוביל בסופו של דבר הידע החדש בדבר הגורמים או דרכים חדשות כדי לעכב או לטפל extravasation פלזמה. חשוב כי החוקרים יש כלים מתאימים, כולל את השיטות הטובות ביותר הזמינות, לימוד פלזמה extravasation. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול, שימוש בשיטת הצבע הכחול אוונס, להערכת extravasation פלזמה באיברים של עכברים FVBN. פרוטוקול זה היא פשוטה במכוון, כדי גדול תואר ככל האפשר, אבל מספק נתונים באיכות גבוהה. אוונס כחול צבע נבחר בעיקר כי זה קל עבור המעבדה הממוצע להשתמש. השתמשנו פרוטוקול זה לספק ראיות ותמיכה עבור ההשערה כי neprilysin האנזים עשויה להגן את להערכת כנגד פלזמה extravasation. עם זאת, פרוטוקול זה ייתכן השפעול בשימוש ויש להתאים בקלות לשימוש זנים אחרים של עכברים או מינים אחרים, רבים איברים שונים או רקמות, עבור מחקרים אשר עשוי לכלול גורמים אחרים, חשובים להבנת, מניעת או לטיפול extravasation פלזמה. פרוטוקול זה הותאם בהרחבה, שונה מן הפרוטוקולים הקיימים, המשלב אמינות, להקל על השימוש, הכלכלה, ואת הזמינות הכללית של חומרים וציוד, הפיכת פרוטוקול זה מעולה עבור המעבדה הממוצע להשתמש ב לכימות פלזמה extravasation של איברים.
Introduction
דליפת דם באברים מתייחס extravasation, או דליפה של פלזמה דם דרך פערים מיוצר על אנדותל של פוסט venules נימי באיברים. Extravasation פלזמה או חדירות כלי דם מוגבר, אשר עשויה לנבוע סוג מתגובה דלקתית, זו עשויות להיות השלכות חמורות. לכן חשוב כי תופעה זו, את הסיבות, מאפננים, וההשלכות, הם למדו והבינו, באופן דומה, כי החוקרים יש יופי כלים, פרוטוקולים שבה ללמוד אותן. הפערים אנדותל עשויים להיווצר באמצעות שורה של גירויים, אך בדרך כלל מיוצרים על ידי הפעולה של נוירוטרנסמיטורים פפטיד ו/או tachykinins על endothelia. אחד המתווכים המתרחשים באופן טבעי העיקריים של תהליך זה, דבר המתבטא פלזמה מוגברת extravasation, הוא undecapeptide tachykinin neuropeptide, חומר P1.
שיטות כדי לחקור ולמדוד את חדירות כלי דם או פלסמה extravasation, אשר להשתמש במאפיין אלבומין-איגוד של צבע כחול אוונס, פותחו, ידועים בדרך כלל עבור דיוק, פשטות, הכלכלה, ביטחונם, היכולת לאפשר קביעת extravasation פלזמה רקמות כמה בבת אחת, אם כן רצוי2,3,4,5,6,7,8,9 . פרוטוקול זה אוונס כחול להערכת extravasation פלזמה באיברים של עכברים FVBN משתמשת כל אלה, אך מוסיף כמה שינויים חשובים, זה עושה את זה בדרך כלל שימושי וישימה עבור מחקרים עתידיים, מעורבים הממוצע המעבדה מבצעת או יהיה לנהל מחקרים חשובים של גורמים הקשורים extravasation פלזמה או חדירות כלי דם. ב פרוטוקול זה, חומר P הוא הציג העכברים-1 nmol/ק ג, אשר מרחיב את extravasation של פלזמה על-ידי 1.5-fold. זה מגביר את הרגישות של הפרוטוקול, וכתוצאה מכך תוצאות הנצפה, השגה בקלות רבה יותר. גורמים נוספים שמשפיעים על חדירות, כמו פפטידים שונים אחרים, כימיקלים או כמה צורות של פגיעה רעילים, עשוי להשתמש בו או נחקר על ידי מעבדות אחרות, כרצונכם. זריקות ומוחלף נמצאים בשימוש פרוטוקול זה להציג את אוונס כחול, חומר P מערכתית, אשר דורש ניתוח מסוף. עם זאת, ומוחלף זריקות5,7,10, גם לאחר התחשבות הטכניקות הנדרשות מסוף כירורגי, קלים יותר לשלוט ולהוביל הייצור של תוצאות עקביות יותר מהאחרים זריקות ורידים, כולל הזנב הווריד זריקות4,9. למרות שזה עשוי להיות אפשרי אוונס כחול מועברת על ידי זריקות סינוסים ורידים רטרו-מסלולית, אין הפניות בספרות נמצאו זה להשתמש בשיטה זו של מסירת אוונס כחול. אולם, לגבי זריקות וריד הזנב, רמה גבוהה של מומחיות ותרגול לשלוט בטכניקה זו reproducibly באופן משמעותי מגביל את השימוש זריקות אוונס כחול מוצלחת. לעומת זאת, בשיטת הזרקת אלטרנטיביות. ווריד הצוואר כפי שמתואר הפרוטוקול שלנו מציע פתרון טכנית השגה. שגרה מכריע עבור זלוף של הוורידים של העכבר, לבצע רק לאחר ההקרבה של אוונס perfused כחול העכבר, מסיר עודפי צבע כחול אוונס, בוצע שעבר סטנדרטיזציה של פרוטוקול זה. שיטות שתואר לעיל זלוף כבר בזהירות בדק, שונה כדי לקבל את ההליך הנוכחי. שינויים אחרים המתוארים כאן הם כל ממוטבת, פשוטה וזולה.
ישנן כמה מגבלות חשובות של השיטה צבע כחול אוונס. לדוגמה, רגישות נמוכה המשויכות לעתים שיטה זו עלולה למנוע כמה נוספים ברוטו פתולוגיים ומאפיינים היסטולוגית בדיקה של רקמות מחיות המוזרק כחול אוונס. עם זאת, אלה ומגבלות אחרות הובילו לפיתוח שיטות אלטרנטיביות ומודלים זה, בכל זאת, עדיין להשתמש אוונס כחול. המדד של אוונס כחול על-ידי קרינה פלואורסצנטית (במקום visual-טווח) ספקטרוסקופיה עשוי להגביר את הרגישות של השיטה. בנוסף, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה של אוונס מוכתם כחול רקמות פותחה כדי לאפשר התבוננות דליפת דם מיקומים ברורים יותר11. בנוסף, לכל הגוף הדמיה וסריקה של-חיים בעבר הזריקו אוונס כחול12 מאפשר חקירה של ריכוזים אוונס כחול באופן רציף, במקום ספציפי אחד נבחר הזמן בנקודה של הניסוי. עם זאת, שיטה זו דורש את הזמינות של מתקני הדמיה המתאימה, וזה עשוי להיות יקר מאוד. השינויים הכרוכים אוונס כחול והושמעה בסוג במבחנה של מודל, כגון בתא תרבות או דגם chorioallantoic13 (CAM) גם תוארו. מודלים אלה מפוקח על-ידי קרינה פלואורסצנטית, מיקרוסקופ intravital14 , לאפשר כימות של חדירות כלי דם שינויים לאורך זמן, אבל עלול להעלות שאלות הנוגעות דוגמנות מדויק של תנאים ויוו ו אולי גם יקר.
היו שיטות אחרות שפותחו כדי לקבוע ולכמת דליפת דם או חדירות, שאינן כוללות את הניהול של אוונס כחול. שיטות אלה עשויה להשתמש של מולקולה פלורסנט המתאים (כגון אלבומין או fluorescein), או isotopically עם תוויות או אחרת מתויג מולקולה, לחיות חיות (או לתא תרבות או chorioallantoic (CAM) מודלים13, ואחריו לא פולשנית הדמיה (PET סריקה, MRI, מיקרוסקופ intravital, כל הגוף סריקה) או על-ידי פולשני הדמיה (מיקרוסקופ פלואורסצנטי)3,12,15. למרות הטכניקות הללו עשויים להציע מספר יתרונות על פני אחרים אוונס שיטות כחול, יש להם גם חסרונות, אשר עשויים לכלול שלהם ניכר המורכבות הנדרשות מומחיות, משאבים, עלויות כספיות גבוהות.
Neprilysin16 (peptidase האנזים NEP, הידוע גם בשם CD10, גברת או Enkephalinase) הוצע להיות מעורב עיכוב פלזמה extravasation, לפחות בחלקו, דרך מטבוליזם אנזימטי איון אנדוגני פ חומר לפיכך, ברקמות שבו מתרחשת תא השטח peptidase NEP, ייתכנו הנחתה השפעת חומר P, ככל הנראה על ידי פעילות peptidase NEP.
בתחילה, בדקנו עבור חומר P-induced פלזמה extravasation ניצול פרוטוקול זה אוונס כחולה ששונו, עם FVBN פראי סוג (WT) ועכבר נוקאאוט (KO) NEP. NEP מעורבות פלזמה בתוספת חומר P extravasation נחשד ממחקרים אלה הראשונית, אנו מתארים אלה, בהמשך הניסויים תפקיד של NEP מעורבים פלזמה extravasation. עם זאת, המוקד של כתב יד זה אינה NEP או תפקידה פלזמה extravasation, אלא מעדיף extravasation פלזמה הניסויים עצמם. התוצאות NEP הן נציג של סוג התוצאות שניתן להשיג באמצעות שימוש של פרוטוקול זה שונה. השיטה אוונס כחול כדי למדוד פלזמה extravasation יש כבר אופטימיזציה, שינוי, כפי שיתואר בפירוט להלן עבור עכברים FVBN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההנחיות הבינלאומי, הלאומי, ו/או מוסדיים החלים על טיפוח ועל השימוש בבעלי חיים (עכברים) הובילו ב הניסויים המתוארים בכתב היד.
שיטה זו משתמשת עכברים בוגרים FVBN, בגילאי 16-20 שבועות, יימצא אופטימלית לצורך מחקר זה. יום 1 כולל שלבים 1-5 וכוללת יום 2 שלבים 6-7 (איור 1).
1. ציוד הכנה
- מאובטח על אספקה נאותה של סטריליות, חד פעמיות מזרקים ומחטים, אם חריגות קטמין/השירותים הווטרינריים משמש ההרדמה (כפי שמומלץ). אם איזופלוריין משמש ההרדמה, בדוק את מיכל החמצן ואת רמת נוזלים של איזופלוריין כדי לוודא שלא יהיו אספקה נאותה לניסוי לפני שמתחילים. בנוסף, להרכיב את nosecone נושם מעגלים ולצרף אותם אל תיבת אינדוקציה; לצרף המיכלים פחם חדשים המעגלים נשימה. הכן תיבת אינדוקציה על ידי הפעלת את החמצן, ברור כי השלב השני קורא כ 50 psi.
- הפעל את כרית החימום כדי 37 מעלות צלזיוס.
- להכין את החללית טמפרטורה רקטלית לניתוח.
2. העכבר הכנה
שלב זה כולל הרדמה, הסרת שיער, מיצוב (למבוגרים FVBN עכברים-גיל 16-20 שבועות).
- שוקל העכברים ולהקליט את המשקולות.
- עזים ומתנגד העכברים.
- לנהל את ה-IP קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים (80-100 מ"ג/ק"ג ו- 7.5-16 מ"ג/ק"ג, בהתאמה). עם זאת, מומלץ להתחיל עם מינונים נמוכים יותר של קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים (30 מ"ג/ק"ג ועל 6 מ"ג/ק"ג, בהתאמה).
- לשמור על ההרדמה עם 0.1 - 0.25 פעמים הראשוני מינונים של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים במהלך הניתוח. קטמין חריגות השירותים הווטרינריים היו agent(s) הרדמה להתמקד במחקר מסוים זה, כפי יותר הפארמצבטית, שרידות נצפו. ניתן למצוא את agent(s) הרדמה להתמקד במחקרים אחרים יהיו שונים. אם איזופלוריין, להכניס את העכבר תא אינדוקציה והפעל איזופלוריין ל 5% עד העכבר מאבד הכרה מלאה. לאחר מכן השתמש nosecone האף שוכן בגובה 1.5-2.5% איזופלוריין תוצרי הלמידה ההליך.
- לפקח על העכברים כל 2-3 דקות על ידי צביטה הבוהן כדי לבדוק לעומק המתאים של הרדמה.
- לגלח את האזור הצוואר הגחון של העכבר.
- הנח את העכבר במצב פרקדן על משטח preheated. אבטח את כפות הידיים וכפות הרגליים של העכבר על פני השטח כירורגית עם קלטת.
- במקום דמעות מלאכותיות משחה על גבי העיניים כדי למנוע ייבוש במהלך הניתוח.
3. ניתוח פרטי
- עושים חתך 1 ס מ בצוואר הגחון ממש מעל ומוחלף.
- החל טיפות אחת או שתיים של לידוקאין (1-2%) אל אזור החתך לניהול כאב וכדי לקדם את התרחבות. המתן 2 דק. עבור לידוקאין שהשינויים ייכנסו לתוקף.
- לחשוף ולבודד נכון הפנימי, ווריד הצוואר באמצעות עמום. . תקשור את הווריד 4-0 בתפר ומשכו בעדינות את הסוף rostral של כלי השיט עם עוצר דימום. לחתוך חור, באמצעות מספריים בסדר, בערך 3 מ מ מתחת או סימטרית לעניבה, בערך באמצע הקוטר של הווריד.
- מארק קטטר פוליויניל PV-1 1.5 ס מ מהקצה להכניס אותו לתוך ומוחלף על דרך החור באמצעות מרחיב כלי השיט ו לשרשר את הצנתר לקראת הסוף סימטרית של כלי השיט, כ- 1.5 ס מ.
- לקשור את הצנתר באופן מאובטח בתוך החלק סימטרית של כלי השיט (להלן גזירה), עם 4-0 משי. לקשור את החלק rostral של כלי השיט החיצוני של הקטטר עם הקצוות של התפר ששימש לקשור rostral ומוחלף, בשלב 3.3.
- נעץ העור באופן רופף חזרה יחד הקטטר עם 4-0 משי כדי למנוע איבוד חום הגוף והתייבשות רקמות.
- להתחבר הקטטר המזרק המכיל heparinized מלוחים (10 U/mL) ומורידים את הקטטר.
4. זריקות
- להזריק את הפתרון אוונס כחול (50 μL של פתרון 30 מ"ג/מ"ל תמיסת מלח, נורמלי, unheparinized, 0.9% או כ 50 מ"ג/ק"ג) לתוך הצנתר ומוחלף, ואחריו נפח קטן של מלוחים heparinized לרוקן את הקו.
- 2 דקות אחר כך, להזריק חומר P (100 μL של פתרון 0.3 μM saline 0.9% נורמלי, unheparinized, או 1 nmol/ק ג), ואחריו נפח קטן של מלוחים heparinized לרוקן את הקו. חומר P מגבירה את extravasation של פלזמה חלבונים דרך השכבה אנדותל; ב פרוטוקול זה, הוא יוצר באופן שגרתי של הגדלת פלזמה הערכים extravasation של 1.5-fold, המקל פלזמה extravasation ערכים למדוד.
- לחכות 18 דקות לאחר מוזרק חומר P. במהלך תקופה זו, הצבע הכחול אוונס equilibrate, לזרום.
- לסיים את הניסוי 18 דקות לאחר ההזרקה של חומר P (20 דקות לאחר ההזרקה אוונס כחול) ע י הקרבת את העכבר עם נקע בצוואר הרחם. סביר להניח כי העכבר ניתן ישירות cervically נקע, בלי הראשון לתת מנת יתר של סם הרדמה, כמו העכבר הוא כנראה עדיין היטב anesthetized מהניתוח. עם זאת, אם זה הכרחי, ממנת יתר של חומרי הרדמה קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים, איזופלוריין או פנטוברביטל יכול להינתן, ואחריו נקע בצוואר הרחם.
5. בידוד איברים
- לפתוח את החזה של העכבר, כוח המשיכה-perfuse (מגובה של-51 ס מ או 20") של הלב וכלי הדם עם 50 מ של 50 מ מ סודיום ציטרט, pH 3.5. pH 3.5 משמר ככל הנראה מחייב אוונס כחול אלבומין.
- בלו 1-5 האיברים הרלוונטיים (רקמות) עם איזמל ויבתר (למשל שלפוחית השתן, הכליה, הקיבה, הכבד, הלבלב, צינתור או דיסטלי קולון, מעי, תריסריון, האגף העור, האוזניים, הזנב, הלב, ו/או הריאות) ולהסיר כל תוכן שיורית, אם נוכח.
- יש לשטוף את האיברים בתוך בטמפרטורת החדר (RT) באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS; 1.44 g של נה2HPO4, 0.24 גר' ח'2PO4, 8.0 גר' של NaCl ו- g 0.20 של אשלגן כלורי ב- 1 ליטר, pH 7.4).
- כתם האברים ברקמות לחצי כל איבר ואיבר, שוקלים כל חצי (רטוב משקולות, ב- g).
- יבש אחד חצי של הרקמה בתנור ייבוש ב 150 ° C, על רדיד, במשך 48 שעות.
- מקם את רקמות אחרות חצי נפח עקבית (עד 200 µL) של formamide ב microfuge הצינור עבור 48 שעות (ועד 72 h) כדי לחלץ את אוונס כחול.
6. מדידה של רקמות OD
- הסר µL 50 של אוונס חלוטים כחול formamide (לאחר 48-72 h RT הדגירה) צינור microfuge והמקום לבאר אחת של צלחת פוליסטירן 96-ובכן. יש להיזהר לא העברת רקמות חתיכות יחד עם formamide.
- במקום 50 µL של formamide חדש, טהור לתוך כל אחד שתי בארות ריק של צלחת 96-ובכן עבור החסר.
- למדוד ולהקליט את יתר620 של כל טוב של הלוחית 96-ובכן בקורא צלחת ספיגת. 620 ננומטר הוא ספיגת מקסימום של אוונס כחול.
7. חישוב של פלזמה Extravasation
- שוקל הרקמה יבש חצי אשר כבר בתנור במשך 48 שעות.
- לחשב את יחס משקל משקל רטוב/יבש ספציפי האיבר ריבית כל לעכבר הבודד, החל המשקל הרטוב של רקמה זו חצי (שלב שהושג ב- 5.4), מחולק לפי משקל יבש של זו רקמת אותו חצי (שלב שהושג ב- 7.1).
- לחשב משקל יבש (ב- g) של הרקמה חצי formamide על ידי חלוקת המשקל הרטוב של הרקמה חצי לפני זה בוצעה ב- formamide (שהושג בשלב 5.4) על-ידי רטובה: יחס משקל יבש של איבר מסוים ריבית (שחושבו בצעד 7.2).
- לחשב את הערכים620 OD מתוקן . החל יתר620 ערך מכל קידוח ניסיוני של צלחת 96-ובכן (מכיל אוונס חלוטים כחול formamide מרקמות כל, שהושג בשלב 6.3), לחסר ריק טוב OD620 הערך (את יתר620 הערך הממוצע של שתי הבארות המכיל formamide טהור, מוכן בשלב 6.2, כמנת620 הערכים שהתקבלו בשלב 6.3) מכל ערך ניסיוני.
- לחשב את הערך extravasation פלזמה על-ידי חלוקת את המתוקן OD620 (שלב מחושבים ב- 7.4) לפי המשקל היבש של הרקמה חצי formamide (שלב מחושבים ב- 7.3). היחידות של פלזמה extravasation יהיה OD620/g משקל יבש.
- ניתוח נתונים, אקספרס כמו הממוצע ± ב- SEM סטטיסטית להשוות בין קבוצות על ידי מבחן t או בכיוון אחד השונות מבחן מרובה-השוואה של Scheffé (lycofs01.lycoming.edu), לפי הצורך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1, תיאור סכמטי של התהליך מוצג, אשר נמצא את התוצאה הערכים extravasation עקבי ואמין ביותר של חומר P-induced פלזמה, מן האיברים של עכברים FVBN. הליך זה בדרך כלל לוקח שני ימי עבודה, מופרדים על-ידי לפחות 48 שעות של זמן המתנה. זה אפשרי להפיץ את זה אפילו יותר, אם זה נעשה באופן עקבי עבור כל ניסויים לצורך השוואה. לדוגמה, לאחר האברים מבודדות על יום 1, האיברים ניתן פלאש קפוא חנקן נוזלי ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס; על בקפידה מפשיר את האיברים (תוך כמה ימים עד שבוע 1), הם יכולים להיות שטף ב- PBS, מחק לפני השאר בפרוטוקול. כמו כן, למרות הייבוש של רקמות נעשה כאמור (ב 150 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות), החילוץ של אוונס כחול של רקמת חצי formamide יורחב מ 48-72 שעות, כל עוד הפעם formamide מתאים עבור כל הניסויים.
המוצג באיור 2 , טבלה 1 נתונים הדגים extravasation פלזמה הנוצרות על-ידי חומר P מ שלפוחיות השתן וסוג FVBN בר (WT) עכברים knockout (KO) NEP17, אשר היו זמינים בעיקר בשל של המעבדה הזה אינטרסים ארוכת שנים NEP ואת תקנה פעולות של הנבחרת neuropeptides18,19. עכברים NEP KO שאינם מבטאים NEP בכל רקמה. עם זאת, NEP מתבטאת בתוך שלפוחית השתן של עכברים WT, אמנם על רמות נמוכות20,21,22. איור 2 ו לטבלה 1 מציע שישנו הבדל ב פלזמה חומר P-induced extravasation מ שלפוחיות השתן של אלה שתי קבוצות של עכברים. זה מרמז על תפקיד עבור NEP ב- extravasation חומר P-induced פלזמה משלפוחית השתן, שכן הביטוי של NEP הוא פוטנציאל ההבדל העיקרי ב שלפוחיות השתן של עכברים WT ו NEP KO.
כי הנתונים המקוריים המוצעת תפקיד אפשרי עבור NEP פלזמה חומר P-induced extravasation בשלפוחית השתן (איור 2 , טבלה 1), החלטנו לחקור באופן מלא יותר את המעורבות של NEP פלזמה extravasation אחר ? למה? ראשית, יצרנו עכבר כפליים כדי overexpress NEP כמעט אוניברסלית23. זה עכבר מהונדסים מותרת השוואה של נתונים מתוך שלושה סוגים של עכברים FVBN: WT עכברים16, אשר באופן טבעי אקספרס כמות מוגבלת של NEP ברקמות רבות; NEP KO עכברים17, צ'ק אין NEP ברקמה כלשהי; ו שלנו כפליים הטרנסגניים NEP overexpressor עכברים23איזה NEP overexpress ברקמות כמעט כל על הניהול של דוקסיציקלין. עכברים מורשים גישה חופשית המכיל דוקסילין צ'או במשך שבוע לפני הניתוח (איור 1); דוקסיציקלין המינון הוא 1 מ"ג/ק"ג של צ'או, undyed. הבנייה של אלה העכברים הטרנסגניים כפליים overexpress NEP יש כבר מפורט, עם תיאור של מבחני NEP, מערבונים, NEP mRNA qPCR23.
עם אלה 3 סוגים של עכברים, פרוטוקול זה מציג תפקיד עבור NEP פלזמה extravasation ברקמות כולל התריסריון23 (איור 3 ו לטבלה 2). בניסויים אלה, ביטוי NEP בעכברים overexpressor כפליים הטרנסגניים NEP היה מופעל על ידי האכלה, עבור 1 שבוע לפני יום 1, צ'או המכיל דוקסילין (undyed; 1 מ ג דוקסילין/mg צ'או, איור 3). בתור פקד, גם הואכלו עכברים WT ו NEP KO האוכל דוקסיציקלין undyed במהלך השבוע שלפני יום 1 (איור 3b ו- 3 c).
כדי לאשר את התפקיד של NEP ב extravasation פלזמה כדי בתריסריון של עכברים FVBN, הביטוי של NEP בתריסריון FVBN WT ו NEP (כפליים הטרנסגניים) overexpressor עכברים שקיבלו דוקסיציקלין צ'או אושר ע י ניתוח המערבי עם נוגדן polyclonal נגד NEP אנושי (אשר cross-reacts עם העכבר NEP)23. ניתוח זה אישר כי WT duodenums אקספרס כמויות מתונות של החלבון NEP, אבל duodenums overexpressor NEP אקספרס 2-3x כמויות NEP שביטאו duodenums WT. העכברים NEP KO, מעצם הגדרתו, לא מבטא כל NEP בתריסריון.
איור 1: סכמה כללית של פרוטוקול למדידת חומר P-induced פלזמה extravasation. תיאור סכמטי של הפרוטוקול למדידת חומר P-induced פלזמה extravasation האיברים של עכברים FVBN (גיל 16-20 שבועות). פרוטוקול זה כרוך המידה של רקמות פלזמה extravasation בשיטת צבע כחול אוונס באמצעות הזרקה לתוך ומוחלף על, וכולל בתוכו מנוהל exogenously חומר P, להשיג extravasation פלזמה רבודה, נמדד בקלות ערכים, ביחידות של יתר620/g משקל יבש. הפרוטוקול המתואר נמצאה תוצאה עקבית פלזמה חומר P-induced ערכי extravasation מאיברים שונים של עכברים FVBN, לוקח מינימום של שני ימי עבודה. 1 יום ויום 2 מופרדים על ידי לפחות 48 שעות של זמן מחכה רקמות יבש ולחלץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : Extravasation פלזמה חומר P-induced משלפוחית השתן של עכברים WT ו NEP KO. שלפוחית השתן extravasation פלזמה של עכברים FVBN (ללא מוקדמת דוקסיציקלין) בתוספת חומר P המינהל, המבוטא OD620 ננומטר/g משקל יבש. שלפוחיות השתן הם בודדו אותנו מהמתרחש FVBN פראי סוג (WT; הבר הלבנים, n = 12) או נוקאאוט FVBN NEP (KO; פס שחור, n = 7) עכברים ונחשפו הפרוטוקול עבור פלזמה extravasation כמפורט לעיל. טבלה 1מקבלים ערכים בודדים. שורות מעל הסורגים מייצגים שגיאת התקן של הממוצע (SEM). הערכים WT ו- NEP KO trended לכיוון p הבדל משמעותי = 0.051 על ידי מבחן t. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : Extravasation חומר P-induced פלזמה של התריסריון של עכברים overexpressor WT NEP KO, NEP. (A-C) Extravasation פלזמה תריסריון בתוספת חומר P המינהל, המבוטא OD620/g משקל יבש. Duodenums (א) הם בודדו אותנו מהמתרחש FVBN WT עכברים ללא דוקסיציקלין מוקדמת (-; לבן בר, n = 5), קו NEP עכברים ללא דוקסיציקלין מוקדמת (-; אור בר אפור, n = 5), NEP ovexpressor העכברים הטרנסגניים כפליים ללא דוקסיציקלין מוקדמת (DT-; בר אפור כהה, n = 5) או NEP העכברים הטרנסגניים כפליים ovexpressor עם דוקסיציקלין מוקדמת (DT +; שחור בר, n = 4) ונחשפו הפרוטוקול עבור פלזמה extravasation כמפורט לעיל. שורות מעל הסורגים מייצגים ב- SEM. למרות שהערכים NEP KO (-) trended גבוה יותר של WT (-) או את DT (-) ערכים, ההבדל הזה לא היה משמעותי סטטיסטית. ערכים extravasation פלזמה תריסריון ירדו באופן משמעותי רק עם הקבוצה של דוקסיציקלין מאכילה, NEP ovexpressor כפליים העכברים הטרנסגניים (DT +), לעומת כל האחרים (* p < 0.05, השונות). (ב, ג) פלזמה תריסריון ערכים extravasation מ- WT ו NEP KO עכברים לא הושפעו באופן משמעותי על ידי המינהל דוקסיציקלין (p < 0.05). (B) WT עכברים ללא דוקסיציקלין (WT-; הבר הלבנים, n = 5) ועכברים WT עם דוקסיציקלין (WT +; בינוני אפור בר, n = 7). (ג) NEP עכברים KO ללא דוקסיציקלין (KO-; בר אפור בהיר, n = 5) ו- NEP קו עם דוקסיציקלין (KO +; בינוני אפור בר, n = 2). ערכים בודדים כמוצג ללא הפרדות צבע a, B ו- C, מקבלים בטבלה מס ' 2. מרובה עם מינימאליים של שפרינגר יומן סעיף23 באישור המדע ספרינגר + עסקים מדיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| גן # מושגים בסיסיים | סקס | יחס משקל רטוב/יבש של שלפוחית השתן | להרטיב את המשקל של שלפוחית השתן חצי (g; ב- 85 μL formamide) | חישוב משקל יבש של שלפוחית השתן חצי (g) | OD 620 nm - ריק | OD 620 nm/g משקל יבש (שלפוחית השתן) |
| WT | F | 4.737 | 0.0038 | 0.0008 | 0.0150 | 18.750 |
| WT | M | 4.632 | 0.0045 | 0.0010 | 0.0100 | 10.000 |
| WT | F | 4.700 | 0.0048 | 0.0010 | 0.0280 | 28.000 |
| WT | F | 4.625 | 0.0068 | 0.0015 | 0.0230 | 15.333 |
| WT | F | 4.546 | 0.0077 | 0.0017 | 0.0400 | 23.529 |
| WT | M | 4.800 | 0.0094 | 0.0020 | 0.0570 | 28.500 |
| WT | M | 5.500 | 0.0095 | 0.0017 | 0.0240 | 14.118 |
| WT | F | 4.316 | 0.0098 | 0.0023 | 0.0660 | 28.696 |
| WT | M | 5.061 | 0.0121 | 0.0024 | 0.0400 | 16.667 |
| WT | M | 5.061 | 0.0192 | 0.0038 | 0.0330 | 8.684 |
| זאת אומרת + /-SEM (של הערכים בעמודה לעיל) | 4.798 + /-0.105 | 0.0088 + /-0.0014 | 0.0018 + /-0.0003 | 0.0336 + /-0.0056 | 19.228 + /-2.393 | |
| KO | M | 4.316 | 0.0196 | 0.0045 | 0.1610 | 35.778 |
| KO | M | 4.600 | 0.0134 | 0.0029 | 0.1020 | 35.172 |
| KO | M | 4.377 | 0.0104 | 0.0024 | 0.0410 | 17.083 |
| KO | M | 4.727 | 0.0258 | 0.0055 | 0.1410 | 25.636 |
| KO | F | 4.539 | 0.0025 | 0.0006 | 0.0250 | 41.667 |
| KO | M | 4.457 | 0.0149 | 0.0033 | 0.1420 | 43.030 |
| זאת אומרת + /-SEM (של הערכים בעמודה לעיל) | 4.503 + /-0.062 | 0.0144 + /-0.0032 | 0.0032 + /-0.0007 | 0.1020 + /-0.0233 | 33.061 + /-4.065 |
טבלה 1: extravasation פלזמה חומר P-induced משלפוחית השתן של עכברים WT ו NEP KO בודדים. פלזמה ערכים extravasation מ- FVBN עכברים (ללא מוקדמת דוקסיציקלין) היו בנפרד המבוטא OD620 ננומטר/g משקל יבש, מן FVBN WT (n = 12) או NEP KO (n = 7) עכברים ונחשפו הפרוטוקול עבור פלזמה extravasation כמפורט לעיל. אין הבדלי מגדר ניכרו את הערכים extravasation פלזמה. שלפוחיות השתן היו מבודדים; ערכים בודדים מקבלים עבור יחס משקל רטוב/יבש מחושב של שלפוחית השתן, משקל רטוב שלפוחית השתן חצי formamide, המחושבים יבש משקל שלפוחית השתן חצי formamide (נתון ב ז), nm OD620 המתוקן (מדגם OD620 ננומטר מינוס nmof meanOD620 את החסר (formamide טהור), ואת הערך extravasation פלזמה מחושב בסול/OD620 ננומטר יבש משקל (המתוקן OD620 ננומטר, מחולק לפי משקל יבש מחושב). הערכים extravasation פלזמה הנובעת שימשו לבניית באיור 2.
| צ'או גנוטיפ ו דוקסיציקלין, בלי (-) או (+) | סקס | יחס משקל רטוב/יבש של התריסריון | להרטיב את המשקל של התריסריון חצי (g; ב- 85 μL formamide) | חישוב משקל יבש של התריסריון חצי (g) | OD 620 nm - ריק | OD620 ננומטר/g משקל יבש (התריסריון) |
| WT- | M | 4.927 | 0.0307 | 0.0062 | 0.0640 | 10.272 |
| WT- | F | 4.912 | 0.0172 | 0.0035 | 0.0460 | 13.138 |
| WT- | M | 5.333 | 0.0281 | 0.0053 | 0.0960 | 18.221 |
| WT- | F | 5.433 | 0.0375 | 0.0069 | 0.1010 | 14.634 |
| WT- | M | 5.179 | 0.0287 | 0.0055 | 0.0430 | 7.759 |
| זאת אומרת + /-SEM (של הערכים בעמודה לעיל) | 5.157 + /-0.105 | 0.0284 + /-0.0033 | 0.0055 + /-0.0006 | 0.0700 + /-0.0122 | 12.805 + /-1.798 | |
| WT + | M | 5.342 | 0.0542 | 0.0101 | 0.1520 | 14.981 |
| WT + | M | 5.653 | 0.0477 | 0.0084 | 0.1120 | 13.272 |
| WT + | M | 5.700 | 0.0564 | 0.0099 | 0.1110 | 11.218 |
| WT + | F | 5.542 | 0.0498 | 0.0090 | 0.1430 | 15.914 |
| WT + | F | 5.723 | 0.0266 | 0.0046 | 0.0470 | 10.112 |
| WT + | F | 5.186 | 0.0262 | 0.0051 | 0.0470 | 9.304 |
| WT + | M | 5.543 | 0.0342 | 0.0062 | 0.0480 | 7.779 |
| זאת אומרת + /-SEM (של הערכים בעמודה לעיל) | 5.527 + /-0.075 | 0.0422 + /-0.0049 | 0.0076 + /-0.0009 | 0.0943 + /-0.0175 | 11.797 + /-1.142 | |
| KO- | F | 5.763 | 0.0209 | 0.0036 | 0.0690 | 19.025 |
| KO- | M | 4.232 | 0.0164 | 0.0039 | 0.1010 | 26.061 |
| KO- | M | 4.810 | 0.0227 | 0.0047 | 0.0880 | 18.647 |
| KO- | F | 5.650 | 0.0363 | 0.0064 | 0.0600 | 9.339 |
| KO- | M | 5.212 | 0.0178 | 0.0034 | 0.0640 | 18.739 |
| זאת אומרת + /-SEM (של הערכים בעמודה לעיל) | 5.133 + /-0.282 | 0.0228 + /-0.0035 | 0.0044 + /-0.0005 | 0.0764 + /-0.0078 | 18.362 + /-2.659 | |
| קו + | M | 5.128 | 0.0193 | 0.0038 | 0.0600 | 15.941 |
| קו + | M | 5.030 | 0.0459 | 0.0091 | 0.1980 | 21.697 |
| זאת אומרת + /-טווח (של ערכים בעמודה לעיל) | 5.079 + /-0.049 | 0.0326 + /-0.0133 | 0.0065 + /-0.0027 | 0.1290 + /-0.0690 | 18.819 + /-2.878 | |
| DT- | M | 5.426 | 0.0322 | 0.0059 | 0.0775 | 13.058 |
| DT- | M | 4.255 | 0.0360 | 0.0085 | 0.0895 | 10.579 |
| DT- | M | 4.818 | 0.0306 | 0.0064 | 0.1460 | 22.989 |
| DT- | M | 5.189 | 0.0197 | 0.0038 | 0.0380 | 10.010 |
| DT- | F | 5.500 | 0.0256 | 0.0047 | 0.0390 | 8.379 |
| זאת אומרת + /-SEM (של הערכים בעמודה לעיל) | 5.038 + /-0.229 | 0.0288 + /-0.0028 | 0.0059 + /-0.0008 | 0.0780 + /-0.0198 | 13.003 + /-2.3607 | |
| DT + | M | 5.008 | 0.0694 | 0.0139 | 0.0270 | 1.948 |
| DT + | M | 4.750 | 0.0660 | 0.0139 | 0.0070 | 0.504 |
| DT + | M | 5.495 | 0.0587 | 0.0107 | 0.0692 | 6.478 |
| DT + | M | 5.233 | 0.0542 | 0.0104 | 0.0620 | 5.986 |
| זאת אומרת + /-SEM (של הערכים בעמודה לעיל) | 5.121 + /-0.159 | 0.0621 + /-0.0034 | 0.0122 + /-0.0010 | 0.0413 + /-0.0147 | 3.729 + /-1.478 |
בטבלה 2: חומר P-induced פלזמה extravasation מ duodenums של עכברים overexpressor בודדים של WT NEP KO, NEP. פלזמה ערכים extravasation מ- FVBN עכברים (עם או בלי מוקדמת דוקסיציקלין) היו בנפרד המבוטא OD620 ננומטר/g משקל יבש, מן FVBN WT עכברים (n = 5, וללא n = 7 עם, דוקסיציקלין), עכברים NEP KO (n = 5, וללא n = 2 עם, דוקסיציקלין), ו- NEP העכברים הטרנסגניים כפליים overexpressor (n = 5, וללא n = 4 עם, דוקסיציקלין). עכברים היו נענשים הפרוטוקול עבור פלזמה extravasation כמפורט לעיל. אין הבדלי מגדר ניכרו את הערכים extravasation פלזמה. Duodenums היו מבודדים; ערכים בודדים המשמשים לחישוב פלזמה extravasation היו כפי שמתואר בטבלה1. הערכים extravasation פלזמה הנובעת שימשו לבניית איור 3A-C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כפי שצוין לעיל, המחקר של פלזמה extravasation יוביל בסופו של דבר הידע החדש בדבר הגורמים או דרכים חדשות כדי לעכב או לטפל extravasation פלזמה. באמצעות צבע כחול אוונס, שימוש מוצלח של פרוטוקול extravasation פלזמה (לעיל), הוכח בכתב היד הנוכחי. למרות שהנתונים המוצגים בחזרה ההשערה כי NEP עשויה להגן על להערכת נגד extravasation פלזמה, זו מטרה משנית תוך זמן קצר, עם המטרה העיקרית היא להציג את פרוטוקול אופטימיזציה אשר עשוי לשמש בקלות במעבדה הממוצע עבור מחקר עתידי של פלזמה extravasation. פרוטוקול דיווח בזאת מתמקדת הסתגלות מחקרים עתידיים עם מטרות שונות, בעלי חיים, האיברים של תנאים אחרים, ולא שימושי במיוחד, מכיוון פרוטוקול זה הוא פשוט לשימוש, אמין, חסכוני, והיא לוקחת בחשבון הגנרל הזמינות של חומרים נפוצים, ריאגנטים, ואנשי המוסמכת. הוא ציין, עם זאת, פרוטוקול זה ידרוש כמות נכבדה של חזרות לכל קבוצה של בעלי חיים (8-12 חזרות הציע) כדי להשיג תוצאות סטטיסטית תקפה.
היו מחקרים ודוחות רבים המפרט את ניסיונות למדוד חדירות כלי דם, פלסמה extravasation. עד כה, רוב הדיווחים פירוט התמורות שיטות יחד עם שיטת צבע כחול אוונס לחקור extravasation פלזמה וחדירות כלי דם2,3,6,11, 12,13. היו דיווחים פחות של שיטות חדירות כלי דם אשר לא לשלב אוונס כחול-כל3,13,15,24; השיטות האחרות הן באופן כללי פחות נגיש עבור המעבדה הממוצע, הדורשים מסובך שיטות, ציוד מיוחד ואנשי, הן בדרך כלל יקרות.
הפיתוח של פרוטוקול אוונס כחול לעיל מעורב בדיקה של צירופים שונים ושינויים רבים. הניסויים הראשונים התמקדו ניסיונות להחדיר אוונס כחול דרך הווריד הזנב של העכבר. עם זאת, זנב וריד זריקות הוכיח טכנית מאתגר וכתוצאה תוצאות לא עקביות, המחייב ההכללה של הזריקות עורק הצוואר וטכניקות כירורגיות מסוף שתוארו לעיל. ניסויים ראשוניים רבים היו גם בוצע מנסה למצוא בריכוזים המתאימים של אוונס כחול ו פ חומר הסכום המדויק של אוונס כחול לא נמצאה להיות הכרחית, כל עוד זה היה מתחת בערך 200 מ"ג/ק"ג (לעומת 50 מ"ג/ק"ג המשמש כיום), אבל כמות חומר P שימוש בניסויים אלה היה חשוב. לאחר הרבה ניסויים, 1 של nmole ק ג נמצאה להיות אידיאלי ריכוז חומר נוסף exogenously P, וכתוצאה מכך הגדלת 1.5-fold של (, ובכך למדידה בקלות רבה יותר) פלזמה extravasation ערכים. כמו כן, נמצא כי חייבים לתת מספיק זמן בשביל הכחול אוונס equilibrate (> 10 דקות). זלוף של כלי הדם כדי להסיר עודפי אוונס כחול, לאחר ההקרבה של העכבר, אבל לפני בידוד איברים, נמצא כמרכיב חיוני של פרוטוקול הנוכחי, לעומת פרוטוקולים אחרים שאינם כוללים זלוף שלב4. Perfusate (שנמסרו על-ידי מעבר הדרגתי הכבידה עדין) הוא 50 מ של פתרון ה-pH 3.5 (המעודד איגוד של אוונס כחול אלבומין); paraformaldehyde, ונפוצים רבים אחרים אוונס פרוטוקולים כחול6,10,25, מושמט בפרוטוקול הנוכחי. גורם נוסף אשר נפתרה ב פרוטוקול זה הוא לצבוע בשימוש דוקסיציקלין צ'או משבשת המדידה nm OD620 של אוונס כחול ברקמות מן המסלול מסולקים. לכן היה צורך להשתמש דוקסיציקלין undyed צ'או בניסויים לעיל. גם, ממצא חשוב ושימושי הוא כי כמעט כל איבר של העכבר באופן משביע רצון מבודדים, בחן באמצעות פרוטוקול הנוכחי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות אנדי Poczobutt, ד ר Jori Leszczynski עזרה יקר, עריכות כתב היד הזה. הנתמכים על ידי מענקים שהתקבלו מתוך הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 ו- RO3 HL095439), המחלקה לענייני חיילים משוחררים של (Merit ביקורת).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J.
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin. Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).
- Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals. Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury. Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).
- Figini, M., et al. Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas. Am J Physiol. 272 (4), Pt 1 785-793 (1997).
- Awad, A. S., et al. Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).
- Lu, B., et al. The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase. Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).
- Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D'Orleans-Juste, P., Regoli, D. Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats. Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Saria, A., Lundberg, J. M. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).
- Fricke, I. B., et al. In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis - the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson's disease. Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).
- Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin. Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).
- Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).
- Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. Neutral endopeptidase modulates septic shock. Ann N Y Acad Sci. 780, Mar 22 156-163 (1996).
- Dempsey, E. C., et al. Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia. Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).
- Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism. Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).
- Chu, P., Arber, D. A. Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma. Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).
- Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study. Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).
- Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. A new tumor marker for bladder cancer. Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).
- Wick, M. J., et al. Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern. Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).
- Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats. J Appl Physiol. 107 (4), (1985) 1348-1356 (2009).
- Scholzen, T. E., et al. Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis. J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).
