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माउस में संवहनी रिसाव का आकलन करने के लिए एक अनुकूलित इवांस ब्लू प्रोटोकॉल

Published: September 12, 2018 doi: 10.3791/57037
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Cardiovascular Pulmonary Research Laboratory, University of Colorado Denver, 2Division of Pulmonary Sciences and Critical Care Medicine, University of Colorado Denver, 3Denver VA Medical Center

Summary

इस अनुच्छेद में, एक किफायती, अनुकूलित, और सरल प्रोटोकॉल वर्णित है जो FVBN चूहों के अंगों में प्लाज्मा extravasation का आकलन करने के लिए इवांस ब्लू डाई विधि का उपयोग करता है कि अन्य उपभेदों, प्रजातियों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और अन्य अंगों या ऊतकों.

Abstract

संवहनी रिसाव, या प्लाज्मा extravasation, कारणों की एक संख्या है, और एक गंभीर परिणाम या एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के लक्षण हो सकता है । इस अध्ययन के अंत में नए या नए तरीके को बाधित या प्लाज्मा extravasation के इलाज के कारणों के विषय में ज्ञान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यह महत्वपूर्ण है कि शोधकर्ताओं ने प्लाज्मा extravasation का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध सर्वोत्तम तरीकों सहित उचित उपकरण, है । इस लेख में, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन, इवांस ब्लू डाई विधि का उपयोग, FVBN चूहों के अंगों में प्लाज्मा extravasation का आकलन करने के लिए. इस प्रोटोकॉल जानबूझकर सरल है, के रूप में महान के रूप में संभव के रूप में एक डिग्री है, लेकिन उच्च गुणवत्ता डेटा प्रदान करता है । इवांस ब्लू डाई मुख्य रूप से चुना गया है क्योंकि यह औसत प्रयोगशाला के लिए उपयोग करने के लिए आसान है. हम इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है सबूत और परिकल्पना है कि एंजाइम neprilysin प्लाज्मा extravasation के खिलाफ vasculature की रक्षा कर सकते है के लिए समर्थन प्रदान करते हैं । हालांकि, इस प्रोटोकॉल प्रयोग किया जा सकता है और आसानी से चूहों के अंय उपभेदों में या अंय प्रजातियों में उपयोग के लिए अनुकूलित, कई विभिंन अंगों या ऊतकों में, अध्ययन के लिए जो अंय कारकों है कि समझ में महत्वपूर्ण है शामिल कर सकते हैं, को रोकने, या इलाज प्लाज्मा extravasation । इस प्रोटोकॉल को व्यापक रूप से अनुकूलित और मौजूदा प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है, और विश्वसनीयता को जोड़ती है, का उपयोग करें, अर्थव्यवस्था में आसानी, और सामग्री और उपकरणों की सामांय उपलब्धता, इस औसत प्रयोगशाला के लिए बेहतर बनाने के लिए इस प्रोटोकॉल में उपयोग अंगों से प्लाज्मा extravasation को बढ़ाता है.

Introduction

अंगों में संवहनी रिसाव extravasation करने के लिए, या अंगों में पोस्ट केशिका venules के endothelium में उत्पादित अंतराल के माध्यम से रक्त प्लाज्मा के रिसाव को संदर्भित करता है । इस प्लाज्मा extravasation या वृद्धि हुई संवहनी पारगम्यता, जो एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के कुछ प्रकार से उत्पन्न हो सकती है, गंभीर परिणाम हो सकता है. इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है कि इस घटना, इसके कारणों, मॉडुलन, और परिणाम, अध्ययन और समझ रहे हैं, और इसी तरह, कि जांचकर्ताओं अच्छा उपकरण और प्रोटोकॉल है जिसके साथ उंहें अध्ययन करने के लिए है । endothelial अंतराल उत्तेजनाओं की एक संख्या के माध्यम से उत्पादन किया जा सकता है, लेकिन आम तौर पर endothelia पर पेप्टाइड न्यूरोट्रांसमीटर और/या tachykinins की कार्रवाई द्वारा उत्पादित कर रहे हैं. इस प्रक्रिया है, जो बढ़ प्लाज्मा extravasation में परिणाम के प्रमुख स्वाभाविक रूप से होने वाली मध्यस्थों में से एक, undecapeptide tachykinin neuropeptide, पदार्थ पी1है ।

तरीकों की जांच करने के लिए और संवहनी पारगम्यता या प्लाज्मा extravasation, जो इवांस ब्लू डाई के एल्ब्युमिन-बाध्यकारी संपत्ति का उपयोग करें, विकसित किया गया है, और आमतौर पर उनके सटीकता, सादगी, अर्थव्यवस्था, सुरक्षा के लिए जाना जाता है, और की अनुमति देने की क्षमता एक बार में कई ऊतकों से प्लाज्मा extravasation का निर्धारण, यदि ऐसा है तो वांछित2,3,4,5,6,7,8,9 . FVBN चूहों के अंगों में प्लाज्मा extravasation का आकलन करने के लिए यह इवांस ब्लू प्रोटोकॉल इन सभी का उपयोग करता है, लेकिन कुछ महत्वपूर्ण संशोधनों कि यह आम तौर पर उपयोगी और भविष्य के अध्ययन के लिए अनुकूल बनाने कहते हैं, औसत प्रयोगशाला है कि आयोजित या होगा शामिल प्लाज्मा extravasation या संवहनी पारगम्यता के साथ जुड़े कारकों की महत्वपूर्ण अध्ययन आचरण. इस प्रोटोकॉल में, पदार्थ पी 1 nmol/kg पर चूहों को पेश किया गया है, जो १.५-गुना तक प्लाज्मा के extravasation को संवर्धित करते हैं । इस प्रोटोकॉल की संवेदनशीलता बढ़ जाती है, और अधिक आसानी से चौकस और प्राप्य परिणाम में जिसके परिणामस्वरूप । अंय कारकों है कि इस तरह के विभिंन अंय पेप्टाइड्स, रसायनों, या विषाक्त चोट के कुछ रूपों के रूप में पारगम्यता प्रभाव, इस्तेमाल किया जा सकता है या अंय प्रयोगशालाओं द्वारा अध्ययन, के रूप में वांछित । Jugular नस इंजेक्शन इवांस नीले और पदार्थ पी प्रणालीबद्ध, जो टर्मिनल सर्जरी की आवश्यकता है परिचय करने के लिए इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है । हालांकि, jugular नस इंजेक्शन5,7,10, यहां तक कि आवश्यक टर्मिनल शल्य चिकित्सा तकनीकों के विचार के बाद, मास्टर करने के लिए आसान कर रहे हैं और अन्य की तुलना में अधिक सुसंगत परिणाम के उत्पादन के लिए नेतृत्व पूंछ नस इंजेक्शन सहित शिरापरक इंजेक्शन,4,9. हालांकि यह इवांस नीले रेट्रो कक्षीय शिरापरक साइनस इंजेक्शन द्वारा दिया जा करने के लिए संभव हो सकता है, साहित्य में कोई संदर्भ नहीं पाया गया है कि इवांस नीले रंग की डिलीवरी के इस विधि का उपयोग करें । हालांकि, पूंछ नस इंजेक्शन के लिए के रूप में, विशेषज्ञता और अभ्यास के उच्च डिग्री reproducibly मास्टर इस तकनीक को बहुत सफल इवांस ब्लू इंजेक्शन के लिए इसके उपयोग की सीमा । इसके विपरीत, वैकल्पिक jugular नस इंजेक्शन विधि के रूप में हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित है, एक तकनीकी रूप से प्राप्य समाधान प्रदान करता है । माउस की नसों के छिड़काव के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया, इवांस ब्लू-perfused माउस के बलिदान के बाद प्रदर्शन किया, अतिरिक्त इवांस ब्लू डाई निकालता है, और इस प्रोटोकॉल में मानकीकृत किया गया है. पहले छिड़काव के तरीकों का वर्णन किया गया है ध्यान से जांच की और वर्तमान प्रक्रिया को प्राप्त करने के लिए संशोधित । अंय संशोधनों यहां वर्णित सभी अनुकूलित कर रहे हैं, सीधा, और सस्ती ।

वहां इवांस ब्लू डाई विधि की कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं हैं । उदाहरण के लिए, इस विधि के साथ जुड़े कम संवेदनशीलता कभी कुछ अतिरिक्त सकल रोग और ऊतकवैज्ञानिक इवांस ब्लू इंजेक्शन जानवरों से ऊतकों की परीक्षा को रोक सकता है । हालांकि, इन और अंय सीमाओं वैकल्पिक तरीकों और मॉडलों के विकास के लिए नेतृत्व किया है कि, फिर भी, इवांस ब्लू का उपयोग करें । प्रतिदीप्ति द्वारा इवांस ब्लू की माप (बजाय दृश्य-रेंज द्वारा) स्पेक्ट्रोस्कोपी विधि की संवेदनशीलता को बढ़ा सकते हैं. इसके अतिरिक्त, इवांस नीले दाग ऊतकों के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और अधिक विशिष्ट11स्थानों में संवहनी रिसाव के अवलोकन के लिए अनुमति देने के लिए विकसित किया गया था । इसके अलावा, पूरे शरीर इमेजिंग और एक जीवित जानवर पहले इवांस ब्लू12 के साथ इंजेक्शन की स्कैनिंग एक सतत तरीके से इवांस नीले सांद्रता की जांच के लिए अनुमति देता है, बजाय प्रयोग के एक विशिष्ट चुना समय बिंदु पर । हालांकि, इस विधि उचित इमेजिंग सुविधाओं की उपलब्धता की आवश्यकता है, और बहुत महंगा हो सकता है । इवांस ब्लू शामिल संशोधन और मॉडल के इन विट्रो प्रकार में प्रदर्शन किया, जैसे एक सेल संस्कृति या लड़की chorioallantoic मॉडल13 (सांचा) में भी वर्णित किया गया है । इन मॉडलों प्रतिदीप्ति और intravital14 माइक्रोस्कोपी द्वारा निगरानी कर रहे हैं, और समय के साथ संवहनी पारगम्यता परिवर्तन के ठहराव अनुमति देते हैं, लेकिन vivo स्थितियों में की सटीक मॉडलिंग के बारे में सवाल उठा सकते हैं और यह भी हो सकता है महंगे.

वहाँ अन्य तरीकों का निर्धारण करने के लिए विकसित किया गया है और संवहनी रिसाव या पारगम्यता, जो इवांस ब्लू के प्रशासन को शामिल नहीं है. इन तरीकों (जैसे एल्ब्युमिन या fluorescein के रूप में), या एक isotopically लेबल या अंयथा अणु टैग के रूप में एक उचित फ्लोरोसेंट अणु को रोजगार कर सकते हैं, जानवरों (या सेल संस्कृति या chorioallantoic (सांचा)13मॉडल, गैर इनवेसिव द्वारा पीछा इमेजिंग (पीईटी स्कैनिंग, एमआरआई, intravital माइक्रोस्कोपी, पूरे शरीर स्कैनिंग) या इनवेसिव इमेजिंग द्वारा (फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी)3,12,15. हालांकि इन तकनीकों अंय इवांस नीले तरीकों पर लाभ के एक नंबर की पेशकश कर सकते हैं, वे भी नुकसान है, जो उनके काफी जटिलताओं, अपेक्षित विशेषज्ञता, संसाधनों, और उच्च मौद्रिक लागत शामिल हो सकते हैं ।

16 Neprilysin (peptidase एंजाइम नेप, भी CD10, MME, या Enkephalinase के रूप में जाना जाता है) के लिए प्लाज्मा extravasation बाधा में शामिल होने का सुझाव दिया गया है, कम भाग में, एंजाइमी चयापचय और अंतर्जात पदार्थ पी की निष्क्रियता के माध्यम से । इस प्रकार, ऊतकों में जो कोशिका सतह peptidase नेप होता है, वहां नेप के peptidase गतिविधि द्वारा संभवतः पदार्थ पी के प्रभाव के एक क्षीणन हो सकता है ।

शुरू में, हम पदार्थ पी प्रेरित प्लाज्मा extravasation FVBN जंगली प्रकार (WT) और नेप नॉकआउट (KO) चूहों के साथ, इस संशोधित इवांस ब्लू प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए परीक्षण किया । पदार्थ पी में नेप भागीदारी-संवर्धित प्लाज्मा extravasation इन प्रारंभिक अध्ययन से संदिग्ध था, और हम इन और आगे प्लाज्मा extravasation में नेप भूमिका शामिल प्रयोगों का वर्णन । हालांकि, इस पांडुलिपि का ध्यान नेप या प्लाज्मा extravasation में अपनी भूमिका नहीं है, बल्कि प्लाज्मा extravasation स्वयं प्रयोगों । नेप परिणाम परिणाम है कि इस संशोधित प्रोटोकॉल के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है की तरह के प्रतिनिधि हैं । इवांस ब्लू विधि प्लाज्मा extravasation को मापने के लिए अनुकूलित और संशोधित किया गया है, FVBN चूहों के लिए नीचे विस्तार में वर्णित के रूप में.

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Protocol

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रयोगों में सभी लागू अंतर्राष्ट्रीय, राष्ट्रीय, और/या पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए संस्थागत दिशानिर्देश (चूहों) का पालन किया गया ।

इस विधि FVBN वयस्क चूहों का उपयोग करता है, 16-20 सप्ताह की आयु, इस अध्ययन के प्रयोजनों के लिए इष्टतम पाया. दिन 1 कदम 1-5 शामिल है और दिन 2 कदम 6-7 (चित्रा 1) शामिल हैं ।

1. उपकरण तैयारी

  1. ketamine/xylazine संवेदनाहारी के रूप में प्रयोग किया जाता है, तो बाँझ, डिस्पोजेबल सिरिंज और सुई, की एक पर्याप्त आपूर्ति सुरक्षित (के रूप में अनुशंसित). यदि isoflurane संवेदनाहारी के रूप में प्रयोग किया जाता है, ऑक्सीजन टैंक और isoflurane के द्रव स्तर की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहां प्रयोग के लिए पर्याप्त आपूर्ति शुरू करने से पहले कर रहे हैं । इसके अलावा, nosecone श्वास सर्किट को इकट्ठा करने और उन्हें प्रेरण बॉक्स करने के लिए संलग्न; श्वास सर्किट के लिए नए चारकोल कनस्तरों संलग्न । ऑक्सीजन पर मोड़ और पता लगाने कि दूसरे चरण लगभग ५० साई पढ़ता द्वारा प्रेरण बॉक्स तैयार करें ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए हीटिंग पैड पर चालू करें ।
  3. सर्जरी के लिए गुदा तापमान जांच की तैयारी करें ।

2. माउस की तैयारी

इस कदम संज्ञाहरण, बालों को हटाने, और स्थिति (वयस्क FVBN चूहों उंर 16-20 सप्ताह) शामिल है ।

  1. चूहों वजन और रिकॉर्ड वजन ।
  2. चूहों को Anesthetize ।
    1. प्रशासन ketamine और xylazine आईपी (८०-१०० मिलीग्राम/किग्रा और ७.५-16 मिलीग्राम/किग्रा, क्रमशः) । हालांकि, यह ketamine और xylazine की कम खुराक के साथ शुरू करने के लिए सिफारिश की है (के बारे में 30 मिलीग्राम/किग्रा और 6 मिलीग्राम/किग्रा, क्रमशः) ।
    2. के बारे में ०.१-०.२५ बार ketamine के प्रारंभिक खुराक के साथ संज्ञाहरण को बनाए रखने/xylazine भर में सर्जरी । Ketamine और xylazine इस विशेष अध्ययन में पसंद के संवेदनाहारी एजेंट (एस) थे, के रूप में अधिक reproducibility और जीवित रहने की गई । अंय अध्ययनों में पसंद के संवेदनाहारी एजेंट (ओं) को अलग पाया जा सकता है ।  यदि isoflurane प्रयोग किया जाता है, एक प्रेरण कक्ष में माउस डाल दिया है और 5% से isoflurane पर बारी जब तक माउस पूरी चेतना खो देता है । फिर एक नाक nosecone पर सेट १.५-२.५% isoflurane प्रक्रिया के शेष भर में उपयोग करें ।
  3. चूहों की निगरानी हर 2-3 मिनट पैर की अंगुली चुटकी से संज्ञाहरण के उचित गहराई के लिए जाँच करने के लिए.
  4. माउस के ventral गर्दन क्षेत्र दाढ़ी ।
  5. एक लापरवाह स्थिति में पहले से गरम पैड पर माउस रखें । पंजे और माउस के पैर टेप के साथ सर्जिकल सतह को सुरक्षित ।
  6. सर्जरी के दौरान बाहर सुखाने को रोकने के लिए आंखों पर कृत्रिम आंसू मरहम लगाएं ।

3. सर्जिकल विवरण

  1. jugular नस पर सही ventral गर्दन में एक 1 सेमी चीरा बनाओ ।
  2. दर्द प्रबंधन के लिए चीरा क्षेत्र में एक या दो बूंदें lidocaine (1-2%) लागू करें और vasodilation को बढ़ावा देने के लिए । lidocaine के प्रभावी होने के लिए 2 min. रुको ।
  3. बेनकाब और कुंद विच्छेदन के माध्यम से सही आंतरिक jugular नस को अलग । 4-0 सीवन के साथ नस टाई और धीरे से एक hemostat के साथ पोत के rostral अंत वापस लेना । एक छेद में कटौती, ठीक कैंची का उपयोग कर, के बारे में 3 मिमी नीचे या टाई करने के लिए caudal, लगभग आधी नस के व्यास के माध्यम से.
  4. अंत से एक PV-1 polyvinyl कैथेटर १.५ सेमी मार्क और एक पोत फैलाव का उपयोग कर छेद के माध्यम से jugular नस में डालें, और पोत के caudal अंत की ओर कैथेटर धागे, लगभग १.५ सेमी ।
  5. (कट नीचे) पोत के caudal भाग के भीतर सुरक्षित रूप से कैथेटर टाई, 4-0 रेशम के साथ । टांका के ढीले सिरों के साथ कैथेटर के बाहर करने के लिए पोत के rostral भाग टाई जो rostral jugular नस टाई करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, ३.३ कदम में ।
  6. हमले त्वचा ढीला वापस एक साथ कैथेटर के आसपास 4-0 रेशम के साथ शरीर की गर्मी और ऊतकों की सुखाना की हानि को रोकने में मदद करने के लिए ।
  7. एक सिरिंज युक्त heparinized खारा (10 यू/एमएल) और कैथेटर फ्लश करने के लिए कैथेटर कनेक्ट ।

4. इंजेक्शन

  1. इवांस ब्लू समाधान इंजेक्षन (५० μL के एक 30 मिलीग्राम/एमएल समाधान में ०.९% सामान्य, unheparinized खारा, या लगभग ५० मिलीग्राम/किग्रा) jugular नस कैथेटर में, heparinized खारा की एक छोटी मात्रा के बाद लाइन फ्लश करने के लिए.
  2. 2 मिनट बाद, इंजेक्शन पदार्थ पी (०.९% सामान्य में ०.३ माइक्रोन समाधान के १०० μL, unheparinized खारा, या 1 nmol/kg), heparinized खारा की एक छोटी मात्रा के बाद लाइन फ्लश करने के लिए. पदार्थ पी endothelial परत के माध्यम से प्लाज्मा प्रोटीन के extravasation में वृद्धि; इस प्रोटोकॉल में, यह नियमित रूप से लगभग १.५ के प्लाज्मा extravasation मूल्यों की वृद्धि-गुना लाती है, प्लाज्मा extravasation मूल्यों को मापने के लिए आसान बना ।
  3. 18 मिनट इंतजार के बाद पदार्थ पी इंजेक्शन है । इस समय के दौरान, इवांस ब्लू डाई equilibrate और प्रसारित होगा ।
  4. प्रयोग 18 मिनट के इंजेक्शन के बाद समाप्त पदार्थ पी (इवांस ब्लू इंजेक्शन के बाद 20 मिनट) ग्रीवा अव्यवस्था के साथ माउस त्याग द्वारा । यह संभावना है कि माउस को सीधे गर्भाशय ग्रीवा, पहले संवेदनाहारी की अधिक मात्रा देने के बिना, के रूप में माउस शायद अभी भी सर्जरी से anesthetized है अच्छी तरह से विनिर्मित कर सकते हैं । हालांकि, अगर यह आवश्यक है, निश्चेतक ketamine/xylazine, isoflurane, या pentobarbital का ओवरडोज दिया जा सकता है, गर्भाशय ग्रीवा के बाद विस्थापन ।

5. अंगों का अलगाव

  1. काट माउस और गुरुत्वाकर्षण के सीने गुहा-perfuse (के बारे में ५१ सेमी या 20 की ऊंचाई से ") दिल और रक्त वाहिकाओं ५० mM सोडियम साइट्रेट की ५० मिलीलीटर, पीएच ३.५ के साथ खुला । पीएच ३.५ संभवतः एल्ब्युमिन के लिए इवांस ब्लू बाइंडिंग को बरकरार रखता है ।
  2. एक्साइज 1-5 प्रासंगिक अंगों (ऊतकों) एक विदारक स्केलपेल के साथ (जैसे मूत्राशय, गुर्दे, पेट, जिगर, अग्ंयाशय, समीपस्थ या बाहर का बृहदांत्र, लघ्वान्त्र, ग्रहणी, पार्श्व त्वचा, कान, पूंछ, दिल, और/या फेफड़ों) और किसी भी अवशिष्ट सामग्री को हटाने, यदि वर्तमान.
  3. कमरे के तापमान में अंगों कुल्ला (आरटी) फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब; १.४४ g of Na2HPO4, ०.२४ g of KH2PO4, ८.० g of NaCl, और ०.२० g of KCl of 1 L, pH ७.४).
  4. दाग ऊतक के साथ अंगों, छमाही में प्रत्येक अंग में कटौती, और हर आधे वजन (गीला वजन, जी में) ।
  5. १५० डिग्री सेल्सियस पर एक सुखाने ओवन में ऊतक के सूखी एक आधा, पंनी पर, ४८ एच के लिए ।
  6. अन्य ऊतक एक सुसंगत मात्रा में आधा प्लेस (अप करने के लिए २०० µ एल) एक microfuge ट्यूब में formamide के ४८ घंटे के लिए (और ७२ के लिए एच) इवांस नीले निकालने के लिए.

6. ऊतक आयुध डिपो का मापन

  1. इवांस ब्लू-संचार formamide के ५० µ एल निकालें (४८ के बाद ७२ एच आरटी गर्मी) microfuge ट्यूब से और जगह एक ९६ अच्छी तरह से polystyrene प्लेट की एक अच्छी तरह से । formamide के साथ ऊतक टुकड़े हस्तांतरण करने के लिए नहीं सावधान रहना ।
  2. जगह ५० µ एल के नए, शुद्ध formamide के दो खाली कुओं में से प्रत्येक में ९६-अच्छी तरह से थाली के लिए कारतूस ।
  3. उपाय और एक अवशोषक प्लेट रीडर पर ९६ अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुआं के आयुध डिपो६२० रिकॉर्ड । ६२० एनएम इवांस ब्लू के अवशोषक मैक्स है ।

7. प्लाज्मा Extravasation की गणना

  1. सूखी ऊतक आधा जो ओवन में ४८ ज के लिए किया गया है वजन ।
  2. प्रत्येक व्यक्ति के माउस से ब्याज की विशिष्ट अंग के लिए गीला वजन/सूखी वजन अनुपात की गणना, इस ऊतक आधे के गीले वजन के साथ शुरू (५.४ चरण में प्राप्त), यह एक ही ऊतक आधे के शुष्क वजन से विभाजित (७.१ कदम में प्राप्त) ।
  3. सूखी वजन की गणना (जी में) ऊतक आधा के formamide में गीला वजन विभाजित करके ऊतक आधा इससे पहले कि यह formamide में रखा गया था (५.४ कदम में प्राप्त) गीला द्वारा: ब्याज के विशिष्ट अंग के लिए शुष्क वजन अनुपात (७.२ चरण में गणना).
  4. सही ओडी६२० मान परिकलित करें । ९६ के प्रत्येक प्रयोगात्मक अच्छी तरह से थाली से आयुध डिपो६२० मूल्य के साथ शुरू (प्रत्येक ऊतक से इवांस ब्लू-संचार formamide युक्त, चरण ६.३ में प्राप्त), खाली अच्छी तरह से घटाना आयुध डिपो६२० मूल्य (मतलब आयुध डिपो६२० के मूल्य शुद्ध formamide युक्त दो कुओं, चरण ६.२ में तैयार, आयुध डिपो६२० प्रत्येक प्रयोगात्मक मूल्य से ६.३) में प्राप्त मूल्यों ।
  5. formamide में ऊतक छमाही के शुष्क वजन द्वारा सही आयुध डिपो६२० (चरण ७.४ में परिकलित) विभाजित करके प्लाज्मा extravasation मान की गणना (चरण ७.३ में परिकलित) । प्लाज्मा extravasation की यूनिट्स ओडी६२०/g ड्राई वेट होगा ।
  6. डेटा का विश्लेषण और अर्थ ± SEM के रूप में व्यक्त करते हैं । सांख्यिकीय टी परीक्षण या एक तरह से विचरण के विश्लेषण और Scheffé's एकाधिक-तुलना परीक्षण (lycofs01.lycoming.edu), के रूप में उपयुक्त द्वारा समूहों की तुलना करें ।

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Representative Results

चित्रा 1में, प्रक्रिया के एक योजनाबद्ध दिखाया गया है, जो सबसे विश्वसनीय और लगातार पदार्थ पी प्रेरित FVBN चूहों के अंगों से प्लाज्मा extravasation मूल्यों में परिणाम पाया गया है. इस प्रक्रिया को आम तौर पर काम के दो दिन लगते हैं, कम से अलग प्रतीक्षा समय के ४८ ज । यह इसे और भी अधिक फैल सकता है, अगर यह लगातार सभी प्रयोगों के लिए किया जाता है की तुलना में है । उदाहरण के लिए, अंगों दिन 1 पर अलग कर रहे हैं के बाद, अंगों तरल नाइट्रोजन में जमे हुए हो सकता है और पर संग्रहित-८० ° c; अंगों को ध्यान से गल जाने पर (एक दो दिनों के भीतर 1 सप्ताह के लिए), वे पंजाब में धोया जा सकता है और प्रोटोकॉल के आराम से पहले blotted । इसके अलावा, हालांकि ऊतकों के सूखने के रूप में किया जाना चाहिए (१५० डिग्री सेल्सियस के लिए ४८ एच), formamide में ऊतक आधा के इवांस नीले निष्कर्षण ४८-७२ एच से बढ़ाया जा सकता है, जब तक formamide में समय के रूप में सभी प्रयोगों के लिए संगत है.

चित्रा 2 और तालिका 1 में दिखाया गया है FVBN जंगली प्रकार (WT) और नेप नॉकआउट (KO) चूहों17, जो मुख्य रूप से इस प्रयोगशाला के कारण उपलब्ध थे के मूत्राशय से extravasation पदार्थ पी प्रेरित प्लाज्मा प्रदर्शन डेटा है नेप में लंबे समय से चली आ रही रुचियां और विनियमन और चयनित neuropeptides के कार्यों18,19। नेप KO चूहों किसी भी ऊतक में नेप व्यक्त नहीं करते. हालांकि, नेप WT चूहों के मूत्राशय के भीतर व्यक्त की है, हालांकि कम स्तर पर20,21,22. चित्रा 2 और तालिका 1 सुझाव है कि चूहों के इन दो समूहों से मूत्राशय से निकलने वाले पदार्थ पी-प्रेरित प्लाज्मा extravasation में अंतर होता है । यह पदार्थ पी-प्रेरित प्लाज्मा extravasation में नेप के लिए एक भूमिका का अर्थ है, क्योंकि नेप की अभिव्यक्ति संभावित WT और नेप KO चूहों के मूत्राशय में मुख्य अंतर है ।

क्योंकि मूल डेटा पदार्थ पी में नेप के लिए एक संभावित भूमिका का सुझाव दिया, मूत्राशय में प्लाज्मा extravasation प्रेरित (चित्रा 2 और तालिका 1), हम और अधिक पूरी तरह से एक और में प्लाज्मा extravasation में नेप की भागीदारी की जांच करने का फैसला किया अंग. सबसे पहले, हम लगभग सार्वभौमिक23नेप व्यक्त करने के लिए एक डबल ट्रांसजेनिक माउस बनाया । इस इंजीनियर माउस FVBN चूहों के तीन प्रकार से डेटा की तुलना: WT चूहों16, जो स्वाभाविक रूप से कई ऊतकों में नेप की एक सीमित मात्रा में व्यक्त की अनुमति दी; नेप KO चूहों17, जो किसी भी ऊतक में कोई नेप व्यक्त; और हमारे दोगुना ट्रांसजेनिक नेप एक्सप्रेस चूहे23, जो doxycycline के प्रशासन पर लगभग सभी ऊतकों में नेप व्यक्त । चूहों 1 सप्ताह सर्जरी करने से पहले के लिए doxycycline-युक्त चाउ करने के लिए स्वतंत्र पहुँच की अनुमति दी जाती है (चित्रा 1); doxycycline खुराक 1 मिलीग्राम/चाउ, रंगा के किलो है । इन दोगुनी ट्रांसजेनिक चूहों कि नेप व्यक्त विस्तृत किया गया है के निर्माण, नेप परख, पश्चिमी, और नेप mRNA qPCR23के विवरण के साथ ।

चूहों के इन 3 प्रकार के साथ, इस प्रोटोकॉल23 ग्रहणी सहित ऊतकों में प्लाज्मा extravasation में नेप के लिए एक भूमिका से पता चलता है (चित्रा 3 और तालिका 2). इन प्रयोगों में, दोहरीकरण ट्रांसजेनिक नेप में नेपी एक्सप्रेस चूहों पर खिला द्वारा चालू किया गया था, 1 दिन से पहले 1 सप्ताह के लिए, चाउ युक्त doxycycline (रंगा; 1 मिलीग्राम doxycycline/मिलीग्राम चाउ, चित्रा 3ए) । एक नियंत्रण के रूप में, कुछ WT और नेप KO चूहों को भी तंग आ गए थे doxycycline चाउ सप्ताह के दौरान पिछले 1 दिन (चित्रा 3बी और ३ c) ।

FVBN चूहों के ग्रहणी में करने के लिए प्लाज्मा extravasation में नेप की भूमिका की पुष्टि करने के लिए, FVBN WT और नेप के ग्रहणी में नेप की अभिव्यक्ति (दोहरीकरण ट्रांसजेनिक) एक्सप्रेस चूहे फेड doxycycline चाउ के खिलाफ एक polyclonal एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी विश्लेषण द्वारा की पुष्टि की थी ह्यूमन नेप (जो माउस नेप के साथ क्रॉस-रिएक्ट करता है)23. इस विश्लेषण की पुष्टि की है कि WT ग्रहणी नेप प्रोटीन की मध्यम मात्रा व्यक्त, लेकिन नेप एक्सप्रेस ग्रहणी 2-3x नेप की मात्रा WT ग्रहणी द्वारा व्यक्त की । नेप KO चूहों, परिभाषा द्वारा, ग्रहणी में किसी भी नेप व्यक्त नहीं करते ।

Figure 1
चित्रा 1: पदार्थ पी प्रेरित प्लाज्मा extravasation को मापने के लिए प्रोटोकॉल के सामान्य स्कीमा. FVBN चूहों के अंगों से पदार्थ पी प्रेरित प्लाज्मा extravasation को मापने के लिए प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध (आयु 16-20 सप्ताह). इस प्रोटोकॉल jugular नस में इंजेक्शन के माध्यम से इवांस ब्लू डाई विधि द्वारा ऊतक प्लाज्मा extravasation की माप शामिल है, और exogenously प्रशासित पदार्थ पी शामिल, संवर्धित और आसानी से प्लाज्मा extravasation मापा प्राप्त करने के लिए मान, की इकाइयों में आयुध डिपो६२०/g शुष्क वजन । वर्णित प्रोटोकॉल FVBN चूहों के विभिंन अंगों से सुसंगत पदार्थ पी प्रेरित प्लाज्मा extravasation मूल्यों में परिणाम पाया गया है, और काम के दो दिन की एक ंयूनतम लेता है । 1 दिन और दिन 2 से कम ४८ ज समय के ऊतकों को सूखा और निकालने के लिए इंतजार कर अलग कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : पदार्थ पी प्रेरित प्लाज्मा WT और नेप KO चूहों के मूत्राशय से extravasation । मूत्राशय प्लाज्मा FVBN चूहों से extravasation (पूर्व doxycycline के बिना) पदार्थ पी प्रशासन द्वारा संवर्धित और OD620 एनएम के रूप में व्यक्त/ मूत्र मूत्राशय FVBN जंगली प्रकार से अलग थे (WT; सफेद पट्टी, एन = 12) या FVBN नेप नॉकआउट (KO; काली पट्टी, एन = 7) चूहों और ऊपर विस्तृत रूप में प्लाज्मा extravasation के लिए प्रोटोकॉल के अधीन । तालिका 1में व्यक्तिगत मान दिए गए हैं । सलाखों के ऊपर लाइनें मतलब (SEM) के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । WT और नेप KO मान एक महत्वपूर्ण अंतर की ओर trended पी = ०.०५१ टी परीक्षण द्वारा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : पदार्थ पी प्रेरित WT के ग्रहणी से प्लाज्मा extravasation, नेप KO, और नेप एक्सप्रेस चूहे । (A-C) ग्रहणी प्लाज्मा extravasation पदार्थ पी प्रशासन द्वारा संवर्धित और आयुध डिपो६२०/g शुष्क वजन के रूप में व्यक्त किया । (क) ग्रहणी पूर्व doxycycline के बिना FVBN WT चूहों से पृथक किए गए (-; सफेद पट्टी, n = 5), नेप को पूर्व doxycycline बिना चूहों को (-; लाइट ग्रे बार, एन = 5), नेप ovexpressor दोगुनी ट्रांसजेनिक चूहों के बिना पूर्व doxycycline (DT-; डार्क ग्रे बार, एन = 5) या नेप ovexpressor पहले doxycycline के साथ दोगुना ट्रांसजेनिक चूहों (डीटी +; काली पट्टी, n = 4) और ऊपर विस्तृत रूप में प्लाज्मा extravasation के लिए प्रोटोकॉल के अधीन । सलाखों के ऊपर लाइनों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं । हालांकि नेप KO (-) मान WT (-) या डीटी (-) मानों से अधिक trended, यह अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था । ग्रहणी प्लाज्मा extravasation मूल्यों doxycycline फेड के समूह के साथ ही काफी कम हो गए थे, नेप ovexpressor दोगुना ट्रांसजेनिक चूहों (डीटी +), अन्य सभी की तुलना में (* p < 0.05, प्रसरण का विश्लेषण). (ख, ग) WT और नेप KO चूहों से ग्रहणी प्लाज्मा extravasation मूल्यों doxycycline प्रशासन द्वारा काफी प्रभावित नहीं थे (p < 0.05). (ख) WT चूहों के बिना doxycycline (WT-; सफ़ेद पट्टी, n = 5) और WT चूहों के साथ doxycycline (WT +; मध्यम धूसर पट्टी, n = 7). (ग) नेप को doxycycline बिना चूहों (ko-; लाइट ग्रे बार, एन = 5) और नेप ko with doxycycline (ko +; मीडियम ग्रे बार, एन = 2). a, B, और C में एक मिश्रित के रूप में दिखाए गए व्यक्तिगत मान तालिका 2में दिए गए हैं । स्प्रिंगर जर्नल अनुच्छेद23 से मामूली संशोधन के साथ बसंती विज्ञान से अनुमति के साथ reproduced + व्यापार मीडिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

जीनोटाइप लिंग मूत्राशय की सूखी वजन अनुपात गीला/ मूत्राशय के गीले वजन आधा (छ; में ८५ μL formamide) मूत्राशय की गणना शुष्क वजन आधा (छ) आयुध डिपो ६२० एनएम-रिक्त OD ६२० एनएम/जी शुष्क वजन (मूत्राशय)
Wt एफ ४.७३७ ०.००३८ ०.०००८ ०.०१५० १८.७५०
Wt एम ४.६३२ ०.००४५ ०.००१० ०.०१०० १०.०००
Wt एफ ४.७०० ०.००४८ ०.००१० ०.०२८० २८.०००
Wt एफ ४.६२५ ०.००६८ ०.००१५ ०.०२३० १५.३३३
Wt एफ ४.५४६ ०.००७७ ०.००१७ ०.०४०० २३.५२९
Wt एम ४.८०० ०.००९४ ०.००२० ०.०५७० २८.५००
Wt एम ५.५०० ०.००९५ ०.००१७ ०.०२४० १४.११८
Wt एफ ४.३१६ ०.००९८ ०.००२३ ०.०६६० २८.६९६
Wt एम ५.०६१ ०.०१२१ ०.००२४ ०.०४०० १६.६६७
Wt एम ५.०६१ ०.०१९२ ०.००३८ ०.०३३० ८.६८४
मतलब +/-SEM (ऊपर कॉलम में प्रविष्टियों का) ४.७९८ +/-०.१०५ ०.००८८ +/-०.००१४ ०.००१८ +/-०.०००३ ०.०३३६ +/-०.००५६ १९.२२८ +/-२.३९३
को एम ४.३१६ ०.०१९६ ०.००४५ ०.१६१० ३५.७७८
को एम ४.६०० ०.०१३४ ०.००२९ ०.१०२० ३५.१७२
को एम ४.३७७ ०.०१०४ ०.००२४ ०.०४१० १७.०८३
को एम ४.७२७ ०.०२५८ ०.००५५ ०.१४१० २५.६३६
को एफ ४.५३९ ०.००२५ ०.०००६ ०.०२५० ४१.६६७
को एम ४.४५७ ०.०१४९ ०.००३३ ०.१४२० ४३.०३०
मतलब +/-SEM (ऊपर कॉलम में प्रविष्टियों का) ४.५०३ +/-०.०६२ ०.०१४४ +/-०.००३२ ०.००३२ +/-०.०००७ ०.१०२० +/-०.०२३३ ३३.०६१ +/-४.०६५

तालिका 1: व्यक्तिगत WT और नेप KO चूहों के मूत्राशय से पदार्थ पी प्रेरित प्लाज्मा extravasation । प्लाज्मा FVBN चूहों से extravasation मूल्यों (पूर्व doxycycline के बिना) व्यक्तिगत रूप से OD620 एनएम के रूप में व्यक्त किए गए थे/g शुष्क वजन, FVBN WT से (n = 12) या नेप KO (n = 7) चूहों और प्लाज्मा extravasation के लिए प्रोटोकॉल के अधीन के रूप में ऊपर विस्तृत । प्लाज्मा extravasation मूल्यों में कोई लैंगिक अंतर स्पष्ट नहीं थे । मूत्राशय अलग-थलग पड़ गए; व्यक्तिगत मूल्यों के लिए दिया जाता है परिकलित गीला/मूत्र मूत्राशय की गीला वजन, formamide में मूत्राशय आधा मूत्राशय की गणना की सूखी वजन formamide (जी में दिया), सही OD620 एनएम (नमूना OD620 एनएम के लिए) । शूंय से meanOD620 nmof (शुद्ध formamide), और OD620 एनएम/जी शुष्क वजन में परिकलित प्लाज्मा extravasation मूल्य (सही OD620 एनएम, परिकलित शुष्क वजन से विभाजित) । परिणामी प्लाज्मा extravasation मूल्यों 2 चित्राका निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया गया ।

जीनोटाइप और doxycycline चाउ, बिना (-) या के साथ (+) लिंग गीला/ग्रहणी के शुष्क वजन अनुपात ग्रहणी का गीला भार आधा (g; in ८५ μL formamide) परिकलित शुष्क वजन ग्रहणी आधा (g) आयुध डिपो ६२० एनएम-रिक्त OD620 एनएम/जी शुष्क वजन (ग्रहणी)
WT एम ४.९२७ ०.०३०७ ०.००६२ ०.०६४० १०.२७२
WT एफ ४.९१२ ०.०१७२ ०.००३५ ०.०४६० १३.१३८
WT एम ५.३३३ ०.०२८१ ०.००५३ ०.०९६० १८.२२१
WT एफ ५.४३३ ०.०३७५ ०.००६९ ०.१०१० १४.६३४
WT एम ५.१७९ ०.०२८७ ०.००५५ ०.०४३० ७.७५९
मतलब +/-SEM (ऊपर कॉलम में प्रविष्टियों का) ५.१५७ +/-०.१०५ ०.०२८४ +/-०.००३३ ०.००५५ +/-०.०००६ ०.०७०० +/-०.०१२२ १२.८०५ +/-१.७९८
WT + एम ५.३४२ ०.०५४२ ०.०१०१ ०.१५२० १४.९८१
WT + एम ५.६५३ ०.०४७७ ०.००८४ ०.११२० १३.२७२
WT + एम ५.७०० ०.०५६४ ०.००९९ ०.१११० ११.२१८
WT + एफ ५.५४२ ०.०४९८ ०.००९० ०.१४३० १५.९१४
WT + एफ ५.७२३ ०.०२६६ ०.००४६ ०.०४७० १०.११२
WT + एफ ५.१८६ ०.०२६२ ०.००५१ ०.०४७० ९.३०४
WT + एम ५.५४३ ०.०३४२ ०.००६२ ०.०४८० ७.७७९
मतलब +/-SEM (ऊपर कॉलम में प्रविष्टियों का) ५.५२७ +/-०.०७५ ०.०४२२ +/-०.००४९ ०.००७६ +/-०.०००९ ०.०९४३ +/-०.०१७५ 11.797 +/-१.१४२
KO एफ ५.७६३ ०.०२०९ ०.००३६ ०.०६९० १९.०२५
KO एम ४.२३२ ०.०१६४ ०.००३९ ०.१०१० २६.०६१
KO एम ४.८१० ०.०२२७ ०.००४७ ०.०८८० १८.६४७
KO एफ ५.६५० ०.०३६३ ०.००६४ ०.०६०० ९.३३९
KO एम ५.२१२ ०.०१७८ ०.००३४ ०.०६४० १८.७३९
मतलब +/-SEM (ऊपर कॉलम में प्रविष्टियों का) ५.१३३ +/-०.२८२ ०.०२२८ +/-०.००३५ ०.००४४ +/-०.०००५ ०.०७६४ +/-०.००७८ १८.३६२ +/-२.६५९
KO + एम ५.१२८ ०.०१९३ ०.००३८ ०.०६०० १५.९४१
KO + एम ५.०३० ०.०४५९ ०.००९१ ०.१९८० २१.६९७
माध्य +/-श्रेणी (ऊपर स्तंभ में प्रविष्टियों की) ५.०७९ +/-०.०४९ ०.०३२६ +/-०.०१३३ ०.००६५ +/-०.००२७ ०.१२९० +/-०.०६९० १८.८१९ +/-२.८७८
DT एम ५.४२६ ०.०३२२ ०.००५९ ०.०७७५ १३.०५८
DT एम ४.२५५ ०.०३६० ०.००८५ ०.०८९५ १०.५७९
DT एम ४.८१८ ०.०३०६ ०.००६४ ०.१४६० २२.९८९
DT एम ५.१८९ ०.०१९७ ०.००३८ ०.०३८० १०.०१०
DT एफ ५.५०० ०.०२५६ ०.००४७ ०.०३९० ८.३७९
मतलब +/-SEM (ऊपर कॉलम में प्रविष्टियों का) ५.०३८ +/-०.२२९ ०.०२८८ +/-०.००२८ ०.००५९ +/-०.०००८ ०.०७८० +/-०.०१९८ १३.००३ +/-२.३६०७
DT + एम ५.००८ ०.०६९४ ०.०१३९ ०.०२७० १.९४८
DT + एम ४.७५० ०.०६६० ०.०१३९ ०.००७० ०.५०४
DT + एम ५.४९५ ०.०५८७ ०.०१०७ ०.०६९२ ६.४७८
DT + एम ५.२३३ ०.०५४२ ०.०१०४ ०.०६२० ५.९८६
मतलब +/-SEM (ऊपर कॉलम में प्रविष्टियों का) ५.१२१ +/-०.१५९ 0.0621 +/-०.००३४ 0.0122 +/-०.००१० ०.०४१३ +/-०.०१४७ ३.७२९ +/-१.४७८

तालिका 2: पदार्थ पी-प्रेरित प्लाज्मा extravasation व्यक्ति WT, नेप KO, और नेप एक्सप्रेस चूहे के ग्रहणी से । प्लाज्मा extravasation मूल्यों FVBN चूहों से (के साथ या बिना पूर्व doxycycline) व्यक्तिगत रूप से व्यक्त किया गया के रूप में OD620 एनएम/FVBN WT चूहों से (n = 5 के बिना, और n = 7 के साथ, doxycycline), नेप को चूहों (n = 5 के बिना, और n = 2 के साथ, doxycycline), और नेप एक्सप्रेस दोगुनी ट्रांसजेनिक चूहों (n = 5 के बिना, और n = 4 के साथ, doxycycline). चूहों के ऊपर विस्तृत रूप में प्लाज्मा extravasation के लिए प्रोटोकॉल के अधीन थे. प्लाज्मा extravasation मूल्यों में कोई लैंगिक अंतर स्पष्ट नहीं थे । ग्रहणी अलग-थलग थे; प्लाज्मा extravasation की गणना में इस्तेमाल व्यक्तिगत मूल्यों के रूप में तालिका 1के लिए वर्णित थे । परिणामी प्लाज्मा extravasation मूल्यों का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया गया चित्रा 3ए-सी।

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Discussion

के रूप में ऊपर चर्चा की, प्लाज्मा extravasation के अध्ययन अंततः नए के कारणों या नए तरीके को बाधित या प्लाज्मा extravasation के इलाज के विषय में ज्ञान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । प्लाज्मा extravasation प्रोटोकॉल के सफल प्रयोग (ऊपर), इवांस ब्लू डाई का उपयोग कर, वर्तमान पांडुलिपि में प्रदर्शित किया गया है । हालांकि डेटा वापस परिकल्पना है कि नेप प्लाज्मा extravasation के खिलाफ vasculature की रक्षा कर सकते है दिखाया, इस वर्तमान में एक माध्यमिक लक्ष्य है, प्राथमिक के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल जो आसानी से औसत प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया जा सकता है वर्तमान जा रहा है लक्ष्य के साथ प्लाज्मा extravasation के भविष्य का अध्ययन । प्रोटोकॉल की सूचना के साथ साथ विभिंन लक्ष्यों, पशुओं, अंगों, और अंय शर्तों के साथ भविष्य के अध्ययन के लिए अनुकूली पर ध्यान केंद्रित है, और विशेष रूप से उपयोगी है क्योंकि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए सरल है, विश्वसनीय, किफायती, और खाते में सामांय लेता है आम सामग्री, रिएजेंट, और सक्षम कर्मियों की उपलब्धता । यह उल्लेखनीय है, तथापि, कि इस प्रोटोकॉल पशुओं के समूह के प्रति दोहराव की एक निष्पक्ष राशि की आवश्यकता होगी (8-12 repetitionया) सांख्यिकीय वैध परिणाम प्राप्त करने के लिए ।

वहां कई अध्ययनों और संवहनी पारगम्यता और प्लाज्मा extravasation को मापने के प्रयास का ब्यौरा रिपोर्ट किया गया है । द्वारा अब तक, इन रिपोर्टों के विस्तार के लिए इवांस ब्लू डाई विधि के साथ प्रयोग किया जाता है प्लाज्मा extravasation और संवहनी पारगम्यता2,3,6,11 की जांच करने के लिए विधियों का सबसे अधिक परिवर्तन 12,13. वहां संवहनी पारगम्यता तरीकों जो सभी3,13,15,24पर इवांस ब्लू शामिल नहीं की कम रिपोर्टों किया गया है; इन अंय तरीकों सामांय में औसत प्रयोगशाला के लिए कम सुलभ हैं, जटिल तरीकों की आवश्यकता होती है, विशेष उपकरण और कर्मियों, और आम तौर पर महंगे हैं ।

इवांस ब्लू प्रोटोकॉल के विकास के ऊपर कई अलग परिवर्तन और संशोधनों के परीक्षण शामिल है । प्रारंभिक प्रयोगों को माउस पूंछ नस के माध्यम से इवांस नीले सुई के प्रयास पर ध्यान केंद्रित किया गया । हालांकि, पूंछ नस इंजेक्शन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण साबित हुआ और असंगत परिणाम के परिणामस्वरूप, necessitating jugular नस इंजेक्शन और टर्मिनल शल्य चिकित्सा तकनीक के शामिल किए जाने के ऊपर वर्णित है । कई प्रारंभिक प्रयोगों को भी इवांस ब्लू और पदार्थ पी की उचित सांद्रता खोजने की कोशिश कर रहे थे । इवांस नीले रंग की सही राशि के लिए आवश्यक नहीं पाया गया था, जब तक यह के बारे में नीचे था २०० मिलीग्राम/किग्रा (तुलना में ५० मिलीग्राम/इन प्रयोगों में प्रयुक्त पदार्थ पी की मात्रा महत्वपूर्ण थी । बहुत प्रयोग के बाद, 1 nmole/exogenously के आदर्श एकाग्रता के लिए जोड़ा पदार्थ पी पाया गया था, एक १.५ में जिसके परिणामस्वरूप-गुना वृद्धि (और इस प्रकार अधिक आसानी से मापने योग्य) प्लाज्मा extravasation मूल्यों । इसके अलावा, यह पाया गया कि पर्याप्त समय इवांस ब्लू के लिए equilibrate (> 10 मिनट) के लिए अनुमति दी जानी चाहिए । रक्त वाहिकाओं के छिड़काव अतिरिक्त इवांस नीले हटाने के लिए, माउस के बलिदान के बाद लेकिन अंग अलगाव से पहले, वर्तमान प्रोटोकॉल का एक अनिवार्य घटक है, के रूप में अन्य प्रोटोकॉल है कि इस छिड़काव चरण4शामिल नहीं करने के लिए विरोध करने के लिए पाया गया था. perfusate (एक सज्जन गुरुत्वाकर्षण ढाल द्वारा दिया) एक पीएच ३.५ समाधान के ५० मिलीलीटर है (जो इवांस ब्लू और एल्ब्युमिन के बंधन को प्रोत्साहित करती है); paraformaldehyde, कई अंय इवांस नीले प्रोटोकॉल6,10,25में प्रचलित, वर्तमान प्रोटोकॉल में लोप है । एक और पहलू है कि इस प्रोटोकॉल में हल किया गया है कि doxycycline चाउ में इस्तेमाल डाई पाचन ट्रैक से ऊतकों में इवांस नीले रंग के OD620 एनएम माप के साथ हस्तक्षेप । इस प्रकार, यह ऊपर प्रयोगों में रंगा doxycycline चाउ का उपयोग करने के लिए आवश्यक था । इसके अलावा, एक महत्वपूर्ण और उपयोगी खोज है कि माउस के लगभग किसी भी अंग ड्यूटियां अलग है और वर्तमान प्रोटोकॉल के माध्यम से जांच की है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों को अपनी बहुमूल्य मदद और इस पांडुलिपि को संपादन के लिए एंडी Poczobutt और डॉ जोरी Leszczynski शुक्रिया अदा करना चाहता हूं ।  राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 और RO3 HL095439) और ' ' दिग्गजों मामलों के विभाग (योग्यता समीक्षा) से प्राप्त अनुदान द्वारा समर्थित ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
isoflurane Vet One 200-070 inhaled anesthetic
ketamine Vet One 200-055 injectable anesthetic
xylazine Lloyd Laboratories 139-236 injectable anesthetic
syringes (10,3 & 1 cc) Becton Dickinson 309604, 309657, 309659
needles (20G1,23G1 & 26G1/2) Becton Dickinson 305178, 305193, 305111
isoflurane induction chamber VetEquip 941443 1 Liter
nosecone breathing circuits  VetEquip RC2 Rodent Circuit Controller 2
oxygen tank Airgas UN 1072 100% medical
heating pad CWE Inc. TC-1000 temperature controller
rectal temperature probe CWE Inc. 10-09012 mouse
balance (for rodents) Ohaus CS 2000
surgical tools-scissors Fine Science tools 15000-00 Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels)  
surgical tools-forceps Fine Science tools 11151-10 Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels)
surgical tools-hemostats Fine Science tools 13009-12 Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools -suture drivers Fine Science tools 12502-12 Olsen-Hegar suture drivers (suturing)
surgical tools-forceps Fine Science tools 11627-12 Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat)
surgical tools-scissors Fine Science tools 14110-15 Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat)
surgical tools-forceps Fine Science tools 18025-10 suture tying forceps (used for Millar cath)
surgical tools-scissors Fine Science tools 14078-10 Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse)
surgical tools-forceps Fine Science tools 11254-20 Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection)
surgical tools-scissors Fine Science tools 14082-09 Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse)
surgical tools-forceps Fine Science tools 11051-10 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse)
surgical tools-forceps Fine Science tools 11251-35 Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels)
surgical tools-retractors Fine Science tools 17012-11 Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical)
surgical tools-forceps Fine Science tools 11294-00 Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice)
surgical tools-forceps Fine Science tools 11297-00 Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection)
surgical tools-scissors Fine Science tools 14058-11 tough cut iris scissors (mouse dissection, bones)
surgical tools-forceps Fine Science tools 11009-13 serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat)
surgical tools-hemostats Fine Science tools 13003-10 Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools-forceps Fine Science tools 11006-12 Adson serrated forceps (tissue grasping)
clippers Oster A5
tape Fisherbrand 159015G
artificial tear ointment Akorn Inc 13985-600-03
lidocaine Hospira 0409-4277-01 2% injectable
polyvinyl catheters Tygon PV-1
Evans blue Sigma Aldrich E2129
Substance P Bachem  H-1890
heparin Sagent Pharmaceuticals 25201-400-10 1000 U/ml
saline solution Hospira 0409-7138-09 0.9% sodium chloride
phenobarbital  Vortech 0298-9373-68
sodium citrate Fisher Scientific BP327-1
PBS Sigma Aldrich P4417-50TAB 
Kimwipes for blotting Fisher Scientific 06-666A
formamide Sigma Aldrich 47670
microbalance Denver Instrument APX-60
microfuge tubes Fisher Scientific 07-200-534
polystyrene 96 well plate Becton Dickenson 351172
absorbance plate reader BioTek Synergy 2
polyacrylamide gels Bio-Rad 3450014 
protein molecular weight standard Bio-Rad 1610374
Protran supported nitrocellulose Amersham (GE) 10600015
gel box Bio-Rad 1658005
Tris Fisher Scientific BP152-1
Tween20 Sigma Aldrich P-1379
sodium chloride Fisher Scientific S271-1
primary NEP polyclonal antibody  R & D Systems AF1182
doxycycline chow Teklad (HARLAN) TD.130750 
FVB/NJ wild type mice Jackson 001800
secondary antibody (goat anti-rabbit) ZyMed 81-6120
ECL solution-Western Lightening Plus PerkinElmer NEL104001EA
film Pierce 34091

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References

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चिकित्सा अंक १३९ संवहनी रिसाव प्लाज्मा extravasation इवांस ब्लू पदार्थ पी मूत्राशय ग्रहणी neprilysin
माउस में संवहनी रिसाव का आकलन करने के लिए एक अनुकूलित इवांस ब्लू प्रोटोकॉल
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Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis,… More

Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse. J. Vis. Exp. (139), e57037, doi:10.3791/57037 (2018).

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