Summary
В этой статье экономичным, оптимизированный и простой протокол описан, которая использует метод Эванс синий краситель для оценки плазмы кровоподтек в органах FVBN мышей, которые могут быть адаптированы для использования в других штаммов, видов и других органов или тканей.
Abstract
Сосудистые утечки или плазмы кровоподтек, имеет ряд причин и может быть серьезным последствием или симптом воспалительной реакции. Это исследование в конечном итоге может привести к новые знания о причинах или новые способы препятствовать или лечения плазмы кровоподтек. Важно, что исследователи имеют правильные инструменты, включая передовые методы, для изучения плазмы кровоподтек. В этой статье мы описываем протокол, с помощью метода синий краситель Эванс, для оценки плазмы кровоподтек в органах FVBN мышей. Этот протокол намеренно прост, чтобы как большой степени, как возможно, но обеспечивает высокое качество данных. Эванс синий краситель был выбран главным образом потому, что это легко для среднего лаборатории для использования. Мы использовали этот протокол для предоставления доказательств и поддержку для гипотезы, что фермент neprilysin может защитить сосудистую против плазмы кровоподтек. Однако этот протокол может экспериментально используются и легко адаптировать для использования в других штаммов мышей или других видов, во многих различных органов или тканей, для исследований, которые могут включать другие факторы, которые важны в понимании, профилактики или лечения плазмы кровоподтек. Этот протокол был широко оптимизирован и изменение существующих протоколов, и сочетает в себе надежность, простота использования, экономики и общей доступности материалов и оборудования, что делает этот протокол Улучшенный для среднего лаборатории для использования в количественная оценка плазмы кровоподтек от органов.
Introduction
Сосудистые утечки в органах относится к кровоподтек, или утечки плазмы крови через пробелы, в эндотелия пост капиллярного венул в органах. Этот плазмы кровоподтек или повышение сосудистой проницаемости, которые могут возникнуть от некоторого типа воспалительной реакции, могут иметь серьезные последствия. Таким образом, важно, что это явление, ее причины, модуляторы и последствия, изучал и понимать, и аналогично, что следователи имеют хорошие инструменты и протоколы с которой для их изучения. Эндотелиальные пробелы могут быть произведены через ряд стимулов, но обычно производятся действия пептида нейротрансмиттеров и/или тахикининов на endothelia. Одним из основных естественных посредников этого процесса, что приводит к увеличению плазмы кровоподтек, является нейропептида tachykinin undecapeptide, вещество P1.
Методы расследования и измерения проницаемости сосудов или плазмы кровоподтек, которые используют свойство альбумин привязки Эванс синий краситель, были разработаны и обычно известны за их точность, простота, экономики, безопасности и возможность определение плазмы кровоподтек из нескольких тканей сразу, если необходимо2,3,4,5,6,,78,9 . Этот протокол Эванс синий для оценки плазмы кровоподтек в органах FVBN мышей использует все эти, но добавляет некоторые важные изменения, которые делают его вообще полезным и адаптированы для будущих исследований, связанных с средняя лаборатория, которая проводит или будет проводят важные исследования факторов, связанных с плазмы кровоподтек или сосудистой проницаемости. В этом протоколе вещество P вводится для мышей 1 нмоль/кг, который дополняет кровоподтек плазмы в 1,5 раза. Это повышает чувствительность протокола, что приводит к более легко наблюдаемых и получить результаты. Другие факторы, которые влияют проницаемости, такие, как различные другие пептиды, химических веществ или некоторые виды токсичных травмы, могут быть использованы или изучены другими лабораториями, как хотелось. Яремной инъекции используются в настоящем Протоколе системно, ввести синий Эванс и вещества P, который требует терминала хирургии. Однако яремной инъекции5,7,10, даже после рассмотрения необходимости терминал хирургические методы, легче освоить и привести к производству более последовательные результаты, чем другие венозная инъекции, включая хвост вен инъекции4,9. Хотя это может быть возможным для Эванс синий доставляться иньекциями ретро орбиталь венозного синуса, нет ссылок в литературе были найдены, что использовать этот способ доставки Эванс синего. Однако что касается инъекции Вену хвост, высокая степень знания и практики можно воспроизвести освоить эту технику значительно ограничивает его использование для успешного Эванс синий инъекции. В отличие от альтернативных яремной инъекционный метод как описано в наших протокол предлагает технически доступная решение. Решающее значение процедуры для перфузии мыши вен, выполняется только после того, как жертву сине увлажненную мыши Эванс, удаляет избыток Эванс синий краситель и был стандартизирован в настоящем Протоколе. Ранее описанных методов перфузии были тщательно рассмотрены и изменены для получения настоящей процедуры. Другие изменения, описанные здесь все оптимизированные, простой и недорогой.
Существуют некоторые важные ограничения метода синий краситель Эванс. Например низкая чувствительность, иногда связанные с этим методом может предотвратить некоторые грубых патологических и гистологической дообследование тканей от Эванс сине вводят животных. Однако эти и другие ограничения привели к развитию альтернативных методов и моделей, которые, тем не менее, по-прежнему использовать синий Эванс. Измерение Эванс голубой флуоресценцией (а не visual диапазона) спектроскопия может увеличить чувствительность метода. Кроме того микроскопии флуоресцирования Эванс сине окрашенных тканей была разработана для наблюдения сосудистые утечки в более различных местах11. Кроме того всего тела imaging и сканирование живое животное ранее вводили с Эванс, синий12 позволяет для расследования Эванс синий концентрации на постоянной основе, а не на одно конкретное время выбран пункт эксперимента. Однако этот метод требует наличия соответствующих изображений объектов и может быть очень дорогим. Изменения с участием Эванс синий и выступал в vitro тип модели, такие как в ячейку культуры или куриных chorioallantoic модель13 (CAM) также были описаны. Эти модели контролируются флуоресценции и прижизненной14 микроскопии и позволить количественная оценка проницаемости сосудистых изменений с течением времени, но может поднять вопросы, касающиеся точного моделирования условий в естественных условиях и могут также быть дорого.
Там были другие методы, разработанные для определения и количественной оценки сосудистые утечки или проницаемость, не предполагающих администрации Эванс синий. Эти методы могут использовать соответствующие флуоресцентные молекулы (например, альбумин или флуоресцеин), или гетерогенны помечены или иным образом тегами молекулы, жить животных (или в ячейку культуры или chorioallantoic (CAM) модели13, следуют неинвазивных Обработка изображений (ПЭТ, МРТ, прижизненной микроскопии, сканирование всего тела) или инвазивных изображений (Люминесцентная микроскопия)3,12,15. Хотя эти методы могут предложить ряд преимуществ над другими Эванс синий методы, они также имеют недостатки, которые могут включать в себя их значительные сложности, необходимого опыта, ресурсов и высокие денежные расходы.
Neprilysin16 (пептидаза фермента НЭПа, также известный как CD10, MME или Enkephalinase) было предложено принять участие в подавлении плазмы кровоподтек, по крайней мере частично, через ферментативный метаболизм и инактивации эндогенного вещество п. Таким образом в тканях, в которых происходит клеток поверхности пептидаза НЭПа, возможно ослабление воздействия вещества P, предположительно, пептидаза активность нэпа
Первоначально мы проверили для вещества P индуцированной плазмы кровоподтек, используя этот измененный Протокол Эванс синий, с FVBN дикого типа (WT) и НЭП нокаут (KO) мышах. НЭП причастности вещество P Расширенная плазмы кровоподтек подозревался в этих первоначальных исследований, мы и описать эти дальнейших экспериментов с участием нэпа роль в плазмы кровоподтек. Однако в центре внимания этой рукописи не нэпа или его роль в плазмы кровоподтек, но скорее плазмы кровоподтек эксперименты сами. Результаты НЭПа, представитель рода результаты, которые могут быть получены путем использования этого измененного Протокола. Эванс синий метод измерения плазмы кровоподтек оптимизированы и изменены, как описано в деталях ниже для FVBN мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все применимые международные, национальные и/или институциональные руководящие принципы ухода и использования животных (мышей) были проведены в эксперименты, описанные в этой рукописи.
Этот метод использует FVBN взрослых мышей, в возрасте 16-20 недель, оказалась оптимальной для целей данного исследования. 1 день включает в себя шаги 1-5 и 2 день шаги 6-7 (рис. 1).
1. Оборудование для подготовки
- Обеспечить адекватное снабжение стерильные, одноразовые шприцы и иглы, если кетамин/Ксилазина используется в качестве анестетика (как рекомендуется). При изофлюрановая используется как обезболивающее, проверьте танк кислород и уровень жидкости изофлюрановая чтобы убедиться, что есть адекватных поставок для эксперимента перед началом. Кроме того собрать ураном, дышая цепи и прикрепить их к индукции поля; Прикрепите новый угольный канистры в дыхательной цепи. Подготовьте поле индукции, повернув на кислород и выяснения, что второй этап читает примерно 50 psi.
- Включите электрогрелку до 37 ° C.
- Подготовьте ректальной температуры зонда для хирургии.
2. Подготовка мыши
Этот шаг включает анестезии, удаление волос и позиционирования (взрослый FVBN мышей возраст 16-20 недель).
- Взвешивание мышей и записывать весов.
- Анестезировать мышей.
- Администрировать кетамина и ксилазина IP (80-100 мг/кг и 7,5-16 мг/кг, соответственно). Однако, рекомендуется начать с более низких доз кетамина и ксилазина (о 30 мг/кг и 6 мг/кг, соответственно).
- Поддержание анестезии с около 0,1 - 0,25 раз первоначальный доз кетамина/Ксилазина всей операции. Кетамин и ксилазина были обезболивающий агент(ы) выбора в данное исследование, наблюдались более воспроизводимость и живучести. Цистит агент(ы) выбора в других исследованиях может найти быть разными. Если используется изофлюрановая, поместите мышь в камеру всасывание и включите изофлюрановая до 5%, до тех пор, пока мышь теряет полное сознание. Затем используйте носовые ураном в 1,5-2,5% изофлюрановая оставшуюся часть процедуры.
- Отслеживать мышей каждые 2-3 мин, мыс пинча для проверки соответствующей глубины анестезии.
- Бритье области брюшной шеи мыши.
- Поместите указатель мыши в лежачем положении на разогретой pad. Закрепите лапы и ноги мыши на хирургические поверхность с лентой.
- Место мазь искусственные слезы на глаза, чтобы предотвратить высыхание во время операции.
3. Хирургическое детали
- Сделайте разрез 1 см в правом вентральной шею над яремной вены.
- Применить одну или две капли лидокаина (1-2%) в области разреза для управления боли и содействовать вазодилатации. Подождите 2 мин для лидокаина вступили в силу.
- Разоблачить и изолировать право внутренней яремной вены через тупым рассечение. Галстук Вену с с 4-0 швом и аккуратно убрать ростральной конце судна с зажим. Вырежьте отверстие, с помощью тонкой ножницы, около 3 мм ниже или хвостовой галстук, примерно на полпути через диаметр вен.
- Марка ПВ-1 поливинилового катетер 1,5 см от конца и вставьте его в яремную Вену через отверстие с помощью расширителя судна и поток катетер к хвостовой конец судна, приблизительно 1,5 см.
- Галстук катетер надежно внутри хвостовой части судна (ниже разреза), с 4-0 шелк. Галстук ростральной части судна к внешней катетер с свободные концы швов, который был использован для галстук с ростральной яремной вены, на шаге 3.3.
- Липкости кожи слабо обратно вместе вокруг катетера с шелком 4-0, чтобы предотвратить потерю тепла тела и сушки тканей.
- Подключите катетер к шприцу, содержащий гепаринизированным физраствора (10 ед/мл) и промойте катетер.
4. инъекции
- Inject Эванс синий раствор (50 мкл 30 мг/мл раствора в нормальных, unheparinized солевой раствор 0,9%, или примерно 50 мг/кг) в яремной катетер, следуют небольшой объем гепаринизированным солевой раствор для очистки линии.
- 2 мин позже, придать вещество P (100 мкл раствора 0,3 мкм в нормальный, unheparinized солевой раствор 0,9%, или 1 нмоль/кг), следуют небольшой объем гепаринизированным солевой раствор для очистки линии. Субстанция Р дополняет кровоподтек белков плазмы через эндотелиального слоя; в этом протоколе он регулярно вызывает увеличение плазмы кровоподтек значения приблизительно в 1,5 раза, делая плазмы кровоподтек значения легче измерить.
- После того, как вводили вещества P, подождите 18 мин. В это время Эванс синий краситель макроэкономическую и распространить.
- Прекратить эксперимент 18 мин после инъекции вещества P (20 мин после инъекции Эванс синий), жертвуя мыши с шейки матки дислокации. Вполне вероятно, что мышь может быть непосредственно cervically вывих, без предоставления передозировки анестетика, как мышь, вероятно все еще хорошо наркотизированных от операции. Однако если это необходимо, передозировка анестезии кетамином/Ксилазина, изофлюрановая или Пентобарбитал может предоставляться, следуют шейки матки дислокации.
5. изоляция органов
- Разрезать грудную полость мыши и тяжести perfuse (с высоты около 51 см или 20»), сердца и кровеносных сосудов с 50 мл, натрия цитрата 50 мм, рН 3,5. рН 3,5 предположительно сохраняет Эванс синий привязки альбумина.
- Акцизный соответствующих органов (тканей) 1-5 с рассечения скальпель (например мочевого пузыря, почек, желудка, печени, поджелудочной железы, проксимальных и дистальных Колон, подвздошной кишки, двенадцатиперстной кишки, фланка кожи, уши, хвост, сердца или легких) и удалите любые остаточные содержания, если настоящее время.
- Промывайте органы в комнатной температуре (RT) фосфат амортизированное saline (PBS; 1,44 г Na2HPO4, 0,24 г х2PO4, 8,0 г NaCl и 0,20 г KCl в 1 Л, рН 7,4).
- Пятно органов с ткани, пополам каждый орган, и весят каждой половины (влажный весов, соль).
- Сухие одной половины ткани в сушильном шкафу при 150 ° C, на фольгу, на 48 ч.
- Место других тканей, половина в последовательной объем (до 200 мкл) формамид в отцентрифугировать трубки в течение 48 часов (и до 72 ч) для извлечения Эванс синий.
6. Измерение ткани ОД
- Удаление 50 мкл Эванс сине проникнуты формамид (после 48-72 ч RT инкубации) из трубки отцентрифугировать и место в одну скважину 96-луночных пенополистирольные плиты. Будьте осторожны, чтобы не передачи куски ткани вместе с формамида.
- Место 50 мкл новой, чистой формамид в каждый из двух пустых скважин 96-луночных пластины для заготовок.
- Измерьте и запишите ОД620 каждой скважины 96-луночных пластины на читателя пластины поглощения. 620 Нм является поглощение Макс Эванс синего.
7. Расчет плазмы кровоподтек
- Вес сухой ткани половина, которая была в духовке в течение 48 ч.
- Вычислите коэффициент веса мокрой сухой вес для конкретного органа интерес от каждой индивидуальной мыши, начиная с живого веса этой ткани половина (полученные в шаг 5.4), делится на сухой вес этой же ткани половина (полученные в шаг 7.1).
- Рассчитать сухой вес (г) ткани пополам формамид путем деления сырого веса половину, прежде чем он был помещен в формамид (полученные на шаге 5.4) по мокрой ткани: сухой вес коэффициент для конкретного органа интерес (рассчитанная на шаге 7.2).
- Вычислить значения исправлены ОД620 . Начиная с ОД620 значение из каждой экспериментальной скважины 96-луночных пластины (содержащие Эванс сине проникнуты формамид от каждой ткани, полученные на шаге 6.3), вычесть пустой хорошо ОД620 (стоимость средняя ОД620 две скважины, содержащих чистые формамид, подготовленную на этапе 6.2, ОД620 значения, полученные на шаге 6.3) от каждого экспериментальные значения.
- Вычислить значение плазмы кровоподтек путем деления исправленные ОД620 (исчисляемый шаг 7,4), сухой вес ткани пополам формамид (исчисляемый шаг 7.3). Единиц плазмы кровоподтек будет ОД620/г сухого веса.
- Анализировать данные и выразить как среднее ± SEM. статистически сравнивать группы t или односторонний дисперсионный анализ и испытания Scheffé в множественные сравнения (lycofs01.lycoming.edu), в случае необходимости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1показано схема процедуры, который был найден приведет к наиболее надежных и последовательных вещество P индуцированной плазмы кровоподтек значения из органов FVBN мышей. Эта процедура обычно занимает два дня работы, разделенных по крайней мере 48 h время ожидания. Это можно разложить даже больше, если это делается последовательно для всех экспериментов для сравнения. Например после того, как органы изолированы на 1 день, органы может быть заморожен в жидком азоте и хранятся при температуре-80 ° C; после тщательно оттаивания органы (в течение нескольких дней до 1 недели), они могут стирать в PBS и смыл перед остальной части протокола. Кроме того хотя сушки тканей должно быть сделано, как указано (при 150 ° C в течение 48 часов), добыча Эванс голубой ткани пополам формамид может быть продлен от 48-72 ч, до тех пор, как время в формамид едины для всех экспериментов.
Показано на рисунке 2 и таблице 1 данные, демонстрируя вещество P индуцированной плазмы кровоподтек от мочевого пузырей FVBN дикого типа (WT) и НЭП нокаут (KO) мышах17, которые были доступны, главным образом из-за этой лаборатории давние интересы в НЭП и регулирование и действия отдельных Нейропептиды18,19. НЭП KO мышей не выражают нэпа в любой ткани. Однако НЭП выражается в пределах мочевого пузыря WT мышей, несмотря на низкий уровень20,21,22. Рисунок 2 и таблице 1 предположить, что есть разница в вещество P индуцированной плазмы кровоподтек из мочевых пузырей из этих двух групп мышей. Это предполагает роль для нэпа в вещество P индуцированной плазмы кровоподтек из мочевого пузыря, так как выражение нэпа потенциально основное различие в пузырях мочевыводящих WT и НЭП KO мышей.
Поскольку исходные данные предложил возможную роль для нэпа в вещество P индуцированной плазмы кровоподтек в мочевого пузыря (рис. 2 и Таблица 1), мы решили более подробно расследовать участие нэпа в плазмы кровоподтек в другой орган. Во-первых, мы создали вдвойне трансгенные мыши overexpress нэпа почти универсально23. Эта мышь инженерии допускается сопоставление данных из трех типов мышей FVBN: WT мышей16, который естественно Экспресс ограниченное количество нэпа во многих тканях; НЭП KO мышей17, который Экспресс не нэпа в любой ткани; и наши вдвойне трансгенных нэпа overexpressor мышей23, который overexpress нэпа в почти всех тканях при отправлении доксициклин. Мышей разрешается свободный доступ к доксициклин содержащих Чоу за 1 неделю до операции (рис. 1); Доксициклин доза-1 мг/кг Чоу, неокрашенные. Строительство этих вдвойне трансгенных мышей, которые overexpress нэпа было подробно, с описанием нэпа анализов, вестерны и НЭП мРНК ПЦР23.
С этих 3 типов мышей этот протокол показывает определенную роль для нэпа в плазмы кровоподтек в тканях, включая двенадцатиперстную кишку23 (Рисунок 3 и таблицу 2). В этих экспериментах, гиперэкспрессия нэпа в вдвойне трансгенных мышей overexpressor нэпа было включено кормления, за 1 неделю до 1 день, чау, содержащие доксициклин (неокрашенные; 1 мг доксициклина/мг Чоу, рис. 3). Как элемент управления некоторые WT и НЭП KO мышей кормили неокрашенные доксициклин Чоу в течение недели, предшествующей день 1 (рис. 3b и 3 c).
Для подтверждения роли нэпа в плазмы кровоподтек в в двенадцатиперстную кишку FVBN мышей, выражение нэпа в двенадцатиперстную кишку FVBN WT и НЭП (вдвойне трансгенных) overexpressor мышей кормили доксициклин Чоу был подтвержден западных анализа с Поликлональные антитела против человека НЭП (которая cross-reacts с помощью мыши нэпа)23. Этот анализ подтвердил, что WT duodenums Экспресс умеренным количеством протеина НЭПа, но duodenums overexpressor нэпа Экспресс 2-3 x количество нэпа выраженные WT duodenums. НЭП KO мышей, по определению, не выразить любой нэпа в двенадцатиперстную кишку.
Рисунок 1: Общая схема протокола для измерения вещество P индуцированной плазмы кровоподтек. Схема протокола для измерения вещество P индуцированной плазмы кровоподтек от органов FVBN мышей (возраст 16-20 недель). Этот протокол включает в себя измерение ткани плазмы кровоподтек Эванс синий краситель методом путем инъекций в яремную Вену и включает в себя экзогенно управляемые вещества P, для получения расширенной и легко измеряемых плазмы кровоподтек значения, в единицах ОД620/г сухого веса. Описывается протокол было установлено в результате последовательной вещество P индуцированной плазмы кровоподтек значения из различных органов FVBN мышей и занимает минимум два дня работы. День 1 и 2 день разделены по крайней мере 48 часов времени на ожидание для тканей для сухой и извлечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Вещество P индуцированной плазмы кровоподтек от мочевого пузыря WT и НЭП KO мышей. Мочевого пузыря плазмы кровоподтек от мышей FVBN (без предварительного Доксициклин) дополнены вещество P администрации и выражается OD620 Нм/г сухого веса. Мочевых пузырей были изолированы от дикого типа FVBN (WT; белая полоса, n = 12) или FVBN нэпа нокаут (KO; черная полоса, n = 7) мышей и подвергается протокол для плазмы кровоподтек, как описано выше. Отдельные значения приведены в таблице 1. Линии выше бары представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). Значения WT и НЭП KO отклонялись к существенной разницы p = 0,051 t-тест. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Вещество P индуцированной плазмы кровоподтек от двенадцатиперстной кишки WT, KO НЭПа и НЭП overexpressor мышей. (A-C) Двенадцатиперстной кишки плазмы кровоподтек дополненной администрацией вещество Р и выраженное как ОД620/г сухого веса. (A) Duodenums были изолированы от FVBN WT мышей без предварительного доксициклин (-; белый бар, n = 5), НЭП KO мышей без предварительного доксициклин (-; светло серый бар, n = 5), НЭП ovexpressor вдвойне трансгенных мышей без предварительного доксициклин (DT-; темно серый бар, n = 5) или нэпа ovexpressor вдвойне трансгенных мышей с предварительного доксициклин (DT +; черную полосу, n = 4) и подвергается протокол для плазмы кровоподтек, как описано выше. Линии выше бары представляют SEM. Хотя значения нэпа KO (-) отклонялись выше, чем WT (-) или DT (-) значения, эта разница не была статистически значимой. Двенадцатиперстной кишки плазмы кровоподтек значения были значительно снизилась только с группой доксициклин, кормили, НЭП ovexpressor вдвойне трансгенных мышей (DT +), по сравнению с всеми другими (* p < 0,05, дисперсионный анализ). (B, C) Двенадцатиперстной кишки плазмы кровоподтек значения от WT и НЭП KO мышей не были существенно затронуты доксициклин администрации (p < 0,05). (B) WT мышей без доксициклин (WT-; белая полоса, n = 5) и WT мышей с доксициклин (WT +; средний серый бар, n = 7). (C) НЭП KO мышей без доксициклин (KO-; светло-серой панели, n = 5) и НЭП KO с доксициклин (KO +; средний серый бар, n = 2). Отдельные значения показано как композитный a, B и C, приведены в таблице 2. Воспроизводится с незначительные изменения с разрешения Springer наука + деловых СМИ от Спрингера журнал статьи23 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Генотип | секс | влажные/сухие весу мочевого пузыря | наполовину мокрые вес мочевого пузыря (g; в 85 формамид мкл) | половина рассчитывается масса сухого мочевого пузыря (g) | ОД 620 Нм - пустой | ОД 620 Нм/г сухого веса (мочевого пузыря) |
| WT | F | 4.737 | 0.0038 | 0,0008 г | 0.0150 | 18.750 |
| WT | M | 4.632 | 0.0045 | 0,0010 | 0,0100 | 10.000 |
| WT | F | 4.700 | 0.0048 | 0,0010 | 0.0280 | 28.000 |
| WT | F | 4.625 | 0.0068 | 0.0015 | 0.0230 | 15.333 |
| WT | F | 4.546 | 0.0077 | 0,0017 | 0.0400 | 23.529 |
| WT | M | 4.800 | 0.0094 | 0.0020 | 0.0570 | 28.500 |
| WT | M | 5.500 | 0.0095 | 0,0017 | 0.0240 | 14.118 |
| WT | F | 4.316 | 0.0098 | 0,0023 | 0.0660 | 28.696 |
| WT | M | 5.061 | 0,0121 | 0,0024 | 0.0400 | 16,667 |
| WT | M | 5.061 | 0.0192 | 0.0038 | 0.0330 | 8.684 |
| Означать + / SEM (из записи в столбце выше) | 4.798 + / 0,105 | 0.0088 + /-0,0014 | 0.0018 + / 0,0003 | 0.0336 + /-0,0056 | 19.228 + / 2.393 | |
| KO | M | 4.316 | 0.0196 | 0.0045 | 0.1610 | 35.778 |
| KO | M | 4.600 | 0.0134 | 0,0029 | 0.1020 | 35.172 |
| KO | M | 4.377 | 0.0104 | 0,0024 | 0.0410 | 17.083 |
| KO | M | 4.727 | 0,0258 | 0,0055 | 0.1410 | 25.636 |
| KO | F | 4.539 | 0,0025 | 0,0006 | 0.0250 | 41.667 |
| KO | M | 4.457 | 0.0149 | 0.0033 | 0.1420 | 43.030 |
| Означать + / SEM (из записи в столбце выше) | 4.503 + /-0,062 | 0.0144 + /-0,0032 | 0,0032 + / 0,0007 | 0.1020 + / 0.0233 | 33.061 + / 4.065 |
Таблица 1: вещества P индуцированной плазмы кровоподтек от мочевого пузыря отдельных WT и НЭП KO мышей. Плазмы кровоподтек значения от мышей FVBN (без предварительного Доксициклин) индивидуально были выражены как OD620 Нм/г сухого веса, от FVBN WT (n = 12) или НЭП KO (n = 7) мышей и подвергается протокол для плазмы кровоподтек, как описано выше. Не гендерные различия проявились в значениях плазмы кровоподтек. Мочевых пузырей были изолированы; отдельные значения даны для вычисляемого влажной/сухой вес отношение мочевого пузыря, сырого веса мочевого пузыря пополам формамид, расчетное сухой вес мочевого пузыря пополам формамид (в g), исправлен OD620 Нм (образец OD620 минус meanOD620 nmof заготовок (чистая формамид) и значение вычисляемого плазмы кровоподтек в OD620 Нм/г сухого веса (исправленный OD620 Нм, деленная на вычисляемый сухого веса). Результирующая плазмы кровоподтек значения были использованы для построения Рисунок 2.
| Генотип и доксициклин Чоу, без (-) или (+) | секс | влажные/сухие соотношение веса двенадцатиперстной кишки | наполовину мокрые вес двенадцатиперстную кишку (g; в 85 формамид мкл) | половина рассчитывается масса сухого двенадцатиперстную кишку (g) | ОД 620 Нм - пустой | OD620 Нм/г сухого веса (двенадцатиперстной кишки) |
| WT- | M | 4.927 | 0.0307 | 0.0062 | 0.0640 | 10.272 |
| WT- | F | 4.912 | 0.0172 | 0,0035 | 0.0460 | 13.138 |
| WT- | M | 5.333 | 0.0281 | 0.0053 | 0.0960 | 18.221 |
| WT- | F | 5.433 | 0,0375 | 0.0069 | 0.1010 | 14,634 |
| WT- | M | 5.179 | 0.0287 | 0,0055 | 0.0430 | 7.759 |
| Означать + / SEM (из записи в столбце выше) | 5.157 + / 0,105 | 0.0284 + / 0.0033 | 0,0055 + /-0,0006 | 0.0700 + / 0.0122 | 12.805 + / 1,798 | |
| WT + | M | 5.342 | 0.0542 | 0.0101 | 0.1520 | 14.981 |
| WT + | M | 5.653 | 0.0477 | 0.0084 | 0.1120 | 13.272 |
| WT + | M | 5.700 | 0.0564 | 0.0099 | 0.1110 | 11.218 |
| WT + | F | 5.542 | 0.0498 | 0.0090 | 0.1430 | 15.914 |
| WT + | F | 5.723 | 0.0266 | 0.0046 | 0.0470 | 10.112 |
| WT + | F | 5.186 | 0.0262 | 0.0051 | 0.0470 | 9.304 |
| WT + | M | 5.543 | 0.0342 | 0.0062 | 0.0480 | 7.779 |
| Означать + / SEM (из записи в столбце выше) | 5.527 + /-0,075 | 0.0422 + / 0,0049 | 0.0076 + / 0,0009 | 0.0943 + / 0.0175 | 11.797 + / 1.142 | |
| КО- | F | 5.763 | 0.0209 | 0,0036 | 0.0690 | 19.025 |
| КО- | M | 4.232 | 0.0164 | 0.0039 | 0.1010 | 26.061 |
| КО- | M | 4.810 | 0.0227 | 0,0047 | 0.0880 | 18.647 |
| КО- | F | 5.650 | 0.0363 | 0.0064 | 0.0600 | 9.339 |
| КО- | M | 5.212 | 0.0178 | 0,0034 | 0.0640 | 18.739 |
| Означать + / SEM (из записи в столбце выше) | 5.133 + / 0,282 | 0.0228 + / 0,0035 | 0.0044 + / 0,0005 | 0.0764 + / 0.0078 | 18.362 + / 2.659 | |
| КО + | M | 5.128 | 0.0193 | 0.0038 | 0.0600 | 15.941 |
| КО + | M | 5.030 | 0.0459 | 0.0091 | 0.1980 | 21.697 |
| Означать + /-диапазоне (из записей в столбце выше) | 5.079 + / 0,049 | 0.0326 + / 0.0133 | 0,0065 + / 0.0027 | 0.1290 + / 0.0690 | 18.819 + / 2.878 | |
| DT- | M | 5.426 | 0.0322 | 0.0059 | 0.0775 | 13.058 |
| DT- | M | 4,255 | 0.0360 | 0.0085 | 0,0895 | 10.579 |
| DT- | M | 4.818 | 0.0306 | 0.0064 | 0.1460 | 22.989 |
| DT- | M | 5.189 | 0.0197 | 0.0038 | 0.0380 | 10.010 |
| DT- | F | 5.500 | 0.0256 | 0,0047 | 0.0390 | 8.379 |
| Означать + / SEM (из записи в столбце выше) | 5.038 + / 0.229 | 0.0288 + / 0.0028 | 0.0059 + / 0,0008 г | 0.0780 + / 0.0198 | 13.003 + / 2.3607 | |
| DT + | M | 5.008 | 0.0694 | 0.0139 | 0.0270 | 1.948 |
| DT + | M | 4.750 | 0.0660 | 0.0139 | 0.0070 | 0,504 |
| DT + | M | 5.495 | 0.0587 | 0.0107 | 0.0692 | 6.478 |
| DT + | M | 5.233 | 0.0542 | 0.0104 | 0.0620 | 5.986 |
| Означать + / SEM (из записи в столбце выше) | 5.121 + / 0.159 | 0.0621 + / 0,0034 | 0.0122 + /-0,0010 | 0.0413 + / 0.0147 | 3.729 + / 1.478 |
Таблица 2: вещество P индуцированной плазмы кровоподтек от duodenums отдельных WT, KO НЭПа и НЭП мышей overexpressor. Плазмы кровоподтек значения от FVBN мышей (с или без предварительного Доксициклин) индивидуально были выражены как OD620 Нм/г сухого веса, от мышей FVBN WT (n = 5 и n = 7 с, Доксициклин), НЭП KO мышей (n = 5 и n = 2 с, Доксициклин) и нэпа overexpressor вдвойне трансгенных мышей (n = 5 и n = 4 с, Доксициклин). Мышей были подвергнуты протокол для плазмы кровоподтек, как описано выше. Не гендерные различия проявились в значениях плазмы кровоподтек. Duodenums были изолированы; отдельные значения, используемые при расчете плазмы кровоподтек были, как описано для таблицы 1. Результирующая плазмы кровоподтек значения были использованы для построения Рисунок 3A-C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как указывалось выше, исследование плазмы кровоподтек в конечном итоге может привести к новые знания о причинах или новые способы препятствовать или лечения плазмы кровоподтек. Успешное использование плазмы кровоподтек протокола (см. выше), с помощью Эванс синий краситель, была продемонстрирована в текущем рукописи. Хотя данные обратно гипотеза, что НЭП может защитить сосудистую против плазмы кровоподтек, это вторичная цель в настоящее время, с основной целью представить оптимизированный протокол, который может быть легко использован в среднем лаборатории для будущие исследования плазмы кровоподтек. Протокол сообщили здесь сосредоточена на технологичность будущих исследований с различными целями, животных, органы и другие условия и особенно полезно, потому что этот протокол является простой в использовании, надежный, экономичный и принимает во внимание Генеральной наличие общих материалов, реагентов и компетентного персонала. Он отметил, однако, что этот протокол будет требовать изрядное количество повторений каждой группы животных (8-12 повторений предложил) чтобы получить статистически значимые результаты.
Там были многочисленные исследования и доклады, подробно попытки измерить сосудистой проницаемости и плазмы кровоподтек. На сегодняшний день, большинство этих докладов подробно комбинаций методов наряду с методом Эванс синий краситель для изучения плазмы кровоподтек и сосудистой проницаемости2,3,,6,11, 12,13. Там было меньше сообщений о сосудистой проницаемости методов, которые не включают Эванс синий в всех3,13,,1524; Эти методы являются в целом менее доступной для среднего лаборатории, требующих сложных методов, специализированного оборудования и персонала и как правило дорогие.
Разработка протокола Эванс синий выше участвует тестирования многих различных перестановок и модификаций. Первые эксперименты были сосредоточены на попытках придать Эванс синий через Вену хвост мыши. Однако хвост инъекции Вену оказались технически сложной и привели к непоследовательным результатам, требующих включения яремной инъекции и терминала хирургические методы, описанные выше. Многие предварительные эксперименты были также сделали пытаются найти соответствующие концентрации Эванс синий и содержание стр. Точное количество синего Эванс не найден необходимо, до тех пор, как он был ниже около 200 мг/кг (по сравнению с 50 мг/кг, используемые в настоящее время), но количество вещества P, используемые в этих экспериментах имеет важное значение. После много экспериментов, 1 нмоль/кг было установлено быть идеальным концентрации экзогенно добавлен вещества P, в 1,5 раза увеличение в результате (и таким образом более легко измеримые) плазмы кровоподтек значения. Кроме того, было установлено, что достаточное время должно быть разрешено для сини Эванс сбалансировать (> 10 мин). Перфузии кровеносных сосудов, чтобы удалить избыток Эванс синий, после жертву мыши, но до органа изоляции, оказалась важным компонентом настоящего Протокола, в отличие от других протоколов, которые не включают этот перфузии шаг4. Perfusate (обеспечиваемая градиент нежный гравитации) — 50 мл раствора рН 3,5 (которая поощряет привязки Эванс синего и альбумина); параформальдегида, характерна для многих других Эванс синий протоколы6,10,25, опущен в настоящем Протоколе. Еще одним фактором, который был решен в этот протокол является, что краситель, используемый в Чоу доксициклин мешает с измерением Нм OD620 Эванс синего в тканях из желудочно-кишечного трек. Таким образом было необходимо использовать неокрашенные доксициклин Чоу в выше экспериментов. Кроме того важным и полезным вывод, что почти любой орган мыши удовлетворительно изолированные и рассмотрены по настоящему Протоколу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Энди Почобут и доктор Йори Лещинский за их ценную помощь и изменения в этой рукописи. При поддержке грантов, полученных от национальных сердца, легких и крови института (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 и RO3 HL095439) и Департамент по делам ветеранов (заслуги обзор).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J.
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin. Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).
- Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals. Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury. Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).
- Figini, M., et al. Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas. Am J Physiol. 272 (4), Pt 1 785-793 (1997).
- Awad, A. S., et al. Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).
- Lu, B., et al. The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase. Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).
- Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D'Orleans-Juste, P., Regoli, D. Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats. Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Saria, A., Lundberg, J. M. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).
- Fricke, I. B., et al. In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis - the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson's disease. Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).
- Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin. Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).
- Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).
- Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. Neutral endopeptidase modulates septic shock. Ann N Y Acad Sci. 780, Mar 22 156-163 (1996).
- Dempsey, E. C., et al. Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia. Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).
- Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism. Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).
- Chu, P., Arber, D. A. Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma. Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).
- Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study. Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).
- Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. A new tumor marker for bladder cancer. Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).
- Wick, M. J., et al. Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern. Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).
- Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats. J Appl Physiol. 107 (4), (1985) 1348-1356 (2009).
- Scholzen, T. E., et al. Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis. J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).
