Summary
In dit artikel, is een zuinige, geoptimaliseerde en eenvoudig protocol beschreven die de Evans blauwe kleurstof methode gebruikt voor het beoordelen van de extravasation van het plasma in de organen van FVBN muizen die aangepast voor gebruik in andere stammen, soorten, en andere organen of weefsels worden kunnen.
Abstract
Vasculaire lek, of plasma extravasation, kan heeft een aantal oorzaken, en een ernstig gevolg of symptoom van een ontstekingsreactie. Deze studie kan uiteindelijk leiden tot nieuwe kennis over de oorzaken van of nieuwe manieren om te remmen of plasma extravasation behandelen. Het is belangrijk dat onderzoekers de juiste hulpmiddelen hebben, met inbegrip van de beste methoden beschikbaar, voor de studie van plasma extravasation. In dit artikel beschrijven we een protocol, met behulp van de methode van de blauwe kleurstof Evans, voor de beoordeling van de extravasation van het plasma in de organen van FVBN muizen. Dit protocol is opzettelijk eenvoudig, als groot een diploma als mogelijk, maar biedt hoogwaardige gegevens. Evans blauwe kleurstof heeft uitgekozen, vooral omdat het is gemakkelijk voor de gemiddelde laboratorium te gebruiken. We hebben dit protocol gebruikt om te bewijs en ondersteuning bieden aan de hypothese dat het enzym neprilysin de therapieën tegen plasma extravasation kan beschermen. Echter kan dit protocol worden experimenteel gebruikt en gemakkelijk aangepast voor gebruik in andere muizenstammen of in andere soorten, in vele verschillende organen of weefsels, voor studies die andere factoren die belangrijk zijn bij het begrijpen, te voorkomen of te behandelen kunnen meebrengen Plasma extravasation. Dit protocol is uitgebreid geoptimaliseerd en aangepast ten opzichte van de bestaande protocollen en combineert betrouwbaarheid, gebruiksgemak, economie, en algemene beschikbaarheid van materialen en uitrusting, waardoor dit protocol superieur voor de gemiddelde laboratorium in te gebruiken kwantificeren van plasma extravasation van organen.
Introduction
Vasculaire lek in de organen verwijst naar extravasation, of lekkage van bloedplasma via lacunes geproduceerd in het endotheel van post capillaire venules in de organen. Deze plasma extravasation of toegenomen vasculaire permeabiliteit, die uit een soort van een ontstekingsreactie voortvloeien kan, kan ernstige gevolgen hebben. Het is dus belangrijk dat dit fenomeen, de oorzaken modulatoren en gevolgen, zijn bestudeerd en begrepen, en ook dat onderzoekers goede hebben instrumenten en protocollen om te bestuderen. Het endotheel hiaten via een aantal stimuli kunnen worden geproduceerd, maar meestal worden geproduceerd door de actie van peptide neurotransmitters en/of tachykinins op de endothelia. Een van de grootste natuurlijk voorkomende bemiddelaars van dit proces, wat in verhoogde plasma extravasation resulteert, is de undecapeptide tachykinin neuropeptide substantie P1.
Methoden te onderzoeken en te meten vasculaire permeabiliteit of plasma extravasation, die de albumine-bindende eigenschap van Evans blauwe kleurstof gebruikt, zijn ontwikkeld, en zijn meestal bekend voor hun nauwkeurigheid, eenvoud, economie, veiligheid, en de mogelijkheid om de bepaling van plasma extravasation uit verschillende weefsels tegelijk, als zo gewenst2,3,4,5,6,7,8,9 . Dit protocol Evans blauw voor de beoordeling van de extravasation van het plasma in de organen van FVBN muizen gebruikt al deze, maar voegt enkele belangrijke wijzigingen waarmee u gemakkelijker in het algemeen nuttig en aanpasbaar voor toekomstige studies, waarbij de gemiddelde laboratorium dat voert of zal belangrijk onderzoek van factoren die samenhangen met plasma extravasation of vasculaire permeabiliteit verrichten. In dit protocol, is stof P ingevoerd om de muizen op 1 nmol/kg, die de extravasation van plasma door 1.5-fold verhoogt. Dit verhoogt de gevoeligheid van het protocol, wat resulteert in meer gemakkelijk waarneembare en verkregen resultaten. Andere factoren die van invloed zijn permeabiliteit, zoals verschillende andere peptiden, chemische stoffen of bepaalde vormen van giftige letsel, kunnen worden gebruikt of worden bestudeerd door andere laboratoria, zoals gewenst. Halsslagader injecties worden gebruikt in dit protocol te voeren Evans blauw en stof P systemisch, waarvoor terminal chirurgie. Halsslagader injecties5,7,10, zijn zelfs na bestudering van de nodige terminal chirurgische technieken, echter gemakkelijker te beheersen en leiden tot de productie van meer consistente resultaten dan andere veneuze injecties, met inbegrip van de staart ader injecties4,9. Hoewel het mogelijk voor Evans blauw worden geleverd door de retro-orbitaal veneuze sinus injecties, hebben geen verwijzingen in de literatuur gevonden die gebruik maken van deze methode van levering van Evans blauw. Echter wat staart ader injecties beperkt de hoge graad van expertise en praktijk te reproducibly beheersen deze techniek zeer het gebruik ervan voor succesvolle Evans blauwe injecties. In tegenstelling, biedt de alternatieve halsslagader injectie methode zoals beschreven in ons protocol, een technisch verkrijgbaar oplossing. Een cruciale procedure voor perfusie van de muis van de aderen, uitgevoerd net nadat het offer van de Evans blauw-geperfundeerd muis, verwijdert overtollige Evans blauwe kleurstof en is gestandaardiseerd in dit protocol. Eerder beschreven methoden van perfusie zijn zorgvuldig onderzocht en bewerkt met het oog op de huidige procedure. Andere wijzigingen die hier worden beschreven zijn al geoptimaliseerd, eenvoudig en goedkoop.
Er zijn enkele belangrijke beperkingen van de methode van de blauwe kleurstof Evans. Lage gevoeligheid soms geassocieerd met deze methode kan bijvoorbeeld voorkomen dat met sommige extra bruto pathologische en histologisch onderzoek van weefsels van Evans blauw-geïnjecteerd dieren. Deze en andere beperkingen hebben echter geleid tot de ontwikkeling van alternatieve methoden en modellen, die echter nog steeds gebruik maken van Evans blauw. De meting van Evans blauw door fluorescentie (in plaats van visual-bereik) spectroscopie kan het verhogen van de gevoeligheid van de methode. Bovendien, werd fluorescentie microscopie van Evans blauw gebeitste weefsels ontwikkeld als u wilt toestaan voor de waarneming van vasculaire lek in duidelijker locaties11. Ook hele lichaam imaging en scannen van een levend dier eerder ingespoten met Evans blauw12 voorziet in een onderzoek van Evans blauwe concentraties op een continue wijze, in plaats van op een specifieke tijd gekozen punt van het experiment. Echter, deze methode vereist de beschikbaarheid van adequate beeldvorming faciliteiten, en kan erg duur. Wijzigingen waarbij Evans blauwe en uitgevoerd in een in vitro soort model, zijn zoals in een cel cultuur of kuiken chorion model13 (CAM) ook beschreven. Deze modellen zijn gecontroleerd door fluorescentie en intravital14 microscopie, en toestaan dat de kwantificering van veranderingen van de vasculaire permeabiliteit na verloop van tijd, maar vragen over nauwkeurige modellering van in vivo voorwaarden kunnen verhogen en kunnen ook worden duur.
Zijn er andere methoden ontwikkeld om te bepalen en kwantificeren van vasculaire lekken of permeabiliteit, waarbij niet de administratie van Evans blauw. Deze methoden kunnen tewerkstellen een passende fluorescerende molecuul (zoals albumine of fluoresceïne), of een ionenpaar met een label of anderszins tagged molecule, tot levende dieren (of cel cultuur of chorion (CAM) modellen13, gevolgd door niet-invasieve Imaging (PET-scan, MRI, intravital microscopie, hele lichaam scannen) of door invasieve beeldvormende (fluorescent microscopie)3,12,15. Hoewel deze technieken een aantal voordelen ten opzichte van andere Evans blauwe methoden bieden kunnen, hebben ze ook nadelen, waaronder eventueel hun aanzienlijke complexiteit, vereiste expertise, middelen en hoge monetaire kosten.
Neprilysin16 (de peptidase enzym NEP, ook bekend als CD10, MME of Enkephalinase) heeft gesuggereerd betrokken te worden bij het remmen van plasma extravasation, ten minste gedeeltelijk, door de enzymatische metabolisme en inactivatie van endogene stof P. Dus, in weefsels waarin de cel-oppervlakte peptidase NEP plaatsvindt, kan er een verzwakking van het effect van stof P, vermoedelijk door de peptidase activiteit van NEP.
In eerste instantie, we getest voor stof P-geïnduceerde plasma extravasation met behulp van dit gewijzigde Evans blauw-protocol, met NEP knock-out (KO) muizen en FVBN wild type (WT). NEP betrokkenheid in plasma stof P-augmented extravasation werd verdacht van deze eerste studies, en we beschrijven deze en verdere experimenten waarbij NEP de rol in plasma extravasation. De focus van dit manuscript is niet NEP of haar rol in plasma extravasation, echter liever de plasma extravasation experimenten zelf. De NEP-resultaten zijn representatief voor de aard van de resultaten die kunnen worden verkregen door het gebruik van dit gewijzigde protocol. De blauwe Evans-methode voor het meten van plasma extravasation is geoptimaliseerd en gewijzigd, zoals beschreven in detail hieronder voor FVBN muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle internationale, nationale en/of institutionele richtsnoeren van toepassing voor de zorg en het gebruik van dieren (muizen) werden gevolgd in de experimenten beschreven in dit manuscript.
Deze methode gebruikt FVBN volwassen muizen, leeftijd 16-20 weken, vastgesteld dat optimale voor de doeleinden van deze studie. Dag 1 bevat stappen 1-5 en dag 2 stappen 6-7 (Figuur 1).
1. apparatuur voorbereiding
- Veilig een voldoende toevoer van steriele, disposable spuiten en naalden, als ketamine/xylazine wordt gebruikt als de verdoving (aanbevolen). Als Isofluraan als de verdoving wordt gebruikt, controleert u de zuurstoftank en het vloeistofniveau van Isofluraan om te controleren of er voldoende voorraden voor het experiment voordat u begint. Ook de neuskegel ademhaling schakelingen te monteren en deze koppelen aan het vak inductie; nieuwe houtskool vaten hechten aan de ademhaling circuits. Bereid het vak inductie door te draaien op de zuurstof en na te gaan dat de tweede fase ongeveer 50 psi leest.
- Inschakelen van de verwarming pad tot 37 ° C.
- Bereiden de rectale temperatuursonde voor de operatie.
2. muis voorbereiding
Deze stap omvat anesthesie, ontharing en positionering (volwassen FVBN muizen-leeftijd 16-20 weken).
- Weeg de muizen en opnemen van de gewichten.
- Anesthetize van de muizen.
- Beheren van ketamine en xylazine IP (80-100 mg/kg en 7.5-16 mg/kg, respectievelijk). Het is echter raadzaam om te beginnen met lagere doses van ketamine en xylazine (over 30 mg/kg en 6 mg/kg, respectievelijk).
- Handhaven van de narcose met ongeveer 0,1 - 0,25 keer initiële doses van ketamine/xylazine tijdens de operatie. Ketamine en xylazine waren de verdoving agent(en) van keuze in dit bijzondere studie, zoals meer reproduceerbaarheid en de overlevingskansen werden waargenomen. De verdoving agent(en) van keuze in andere studies kan worden gevonden om anders te zijn. Als Isofluraan wordt gebruikt, zet de muis in de kamer van een inductie en inschakelen van Isofluraan tot 5% totdat de muis volledig bewustzijn verliest. Gebruik vervolgens een nasale neuskegel vastgesteld op 1,5 tot 2,5% Isofluraan gedurende de rest van de procedure.
- De muizen elke 2-3 min door teen knijpen om te controleren op de juiste diepte van anesthesie volgen.
- Scheren de ventrale halsgebied van de muis.
- Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een liggende positie op de voorverwarmde pad. Beveilig de poten en voeten van de muis naar de chirurgische oppervlakte met tape.
- Plaats van kunstmatige scheur zalf op de ogen om te voorkomen dat tijdens de operatie uitdrogen.
3. chirurgische Details
- Maak een incisie van 1 cm in de rechts ventrale nek over de halsslagader.
- Gelden één of twee druppels van lidocaïne (1-2%) in het gebied van de incisie voor pijnbehandeling en ter bevordering van vasodilatatie. Wacht 2 minuten voor de lidocaïne kracht.
- Bloot en isoleren van de juiste interne halsslagader via botte dissectie. Tie van de ader af met 4-0 hechtdraad en zachtjes trekken de rostraal einde van het schip met een hemostat. Een gat, met behulp van fijn schaar, ongeveer 3 mm hieronder of caudal aan de stropdas, ongeveer halverwege de diameter van de ader.
- Een PV-1 polyvinyl katheter 1,5 cm van het einde markeren en plaatst u deze in de halsslagader door het gat met behulp van een vaartuig dilator en draad van de katheter caudal eind van het vaartuig, ongeveer 1,5 cm.
- De katheter veilig binnen de staartzijde van het schip (onder de gesneden), met 4-0 zijde binden. Bind de rostraal deel van het schip aan de buitenkant van de katheter met de losse eindjes van de hechtdraad die werd gebruikt om te binden uit de rostraal halsslagader, in stap 3.3.
- Tack de huid weer los bij elkaar rond de katheter met 4-0 zijde om te voorkomen dat het verlies van lichaamswarmte en uitdroging van de weefsels.
- De katheter verbinden met een injectiespuit met EDTA saline (10 U/mL) en de katheter spoelen.
4. injecties
- Injecteren de Evans blauwe oplossing (50 μl van een 30 mg/mL oplossing in de normale, unheparinized saline 0,9%, of ongeveer 50 mg/kg) in de halsslagader katheter, gevolgd door een klein volume van EDTA zoutoplossing te spoelen van de lijn.
- 2 min later injecteren stof P (100 μl van een 0,3 μM-oplossing in de normale, unheparinized saline 0,9%, of 1 nmol/kg), gevolgd door een klein volume van EDTA zoutoplossing te spoelen van de lijn. Stof P verhoogt de extravasation van plasma-eiwitten door het endotheel laag; in dit protocol induceert het routinematig een vergroting van plasma extravasation waarden van ongeveer 1.5-fold, gemakkelijker plasma extravasation waarden te meten.
- 18 min wachten nadat de stof P wordt geïnjecteerd. Gedurende deze tijd, zal de Evans blauwe kleurstof equilibreer en circuleren.
- Beëindigen van het experiment 18 min na de injectie van stof P (20 min na Evans blauwe injectie) door het opofferen van de muis met cervicale dislocatie. Het is waarschijnlijk dat de muis rechtstreeks cervically worden kan ontwricht, zonder een overdosis van een verdovingsmiddel, als de muis is waarschijnlijk nog goed narcose vanuit de chirurgie. Echter, als het nodig is, een overdosis van de verdoving ketamine/xylazine, Isofluraan of pentobarbital mag worden verleend, gevolgd door cervicale dislocatie.
5. isolatie van organen
- De borstholte van de muis opengesneden en zwaartekracht-perfuse (vanaf een hoogte van ongeveer 51 cm of 20") het hart en de bloedvaten met 50 mL 50 mM Natriumcitraat, pH 3,5. pH 3.5 behoudt vermoedelijk Evans blauwe binding met albumine.
- 1-5 relevante organen (weefsels) met een ontleden scalpel (bijvoorbeeld de urineblaas, nieren, maag, lever, alvleesklier, proximaal of DISTAAL colon, ileum, twaalfvingerige darm, flank huid, oren, staart, hart, en/of longen) accijnzen en verwijder eventuele resterende inhoud, als aanwezig.
- Spoel de organen in een kamertemperatuur (RT)-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 1,44 g Na,2HPO4, 0,24 g KH2PO4, 8,0 g van NaCl en 0,20 g van KCl in 1 L, pH 7.4).
- Vlek van de organen met weefsel, elk orgaan in tweeën gesneden en elke helft wegen (NAT gewichten, in g).
- Droog een helft van het weefsel in een droogstoof bij 150 ° C, op folie, voor 48 uur.
- Plaats de andere helft in een consistent volume (maximaal 200 µL) van formamide in een microfuge buis voor 48 uur (en maximaal 72 h) weefsel uitpakken van de blauwe Evans.
6. meting van de weefsel OD
- Verwijder 50 µL van Evans blauw-geïnfundeerd formamide (na 48-72 uur RT incubatie) uit de microfuge buis en de plaats in een putje van een 96-Wells polystyreen plaat. Wees voorzichtig niet over te dragen van weefsel stukken samen met de formamide.
- Plaats 50 µL van nieuwe, pure formamide in elk van de twee lege putjes van de 96-wells-plaat voor de blanco.
- Meten en registreren van de OD620 van elk putje van de 96-wells-plaat op een extinctie-afleesapparaat. 620 nm is de extinctie max Evans blauw.
7. berekening van de Plasma Extravasation
- Weeg het droge weefsel helft die al in de oven gedurende 48 uur.
- Bereken de natte gewicht/droog gewichtsverhouding voor de specifieke orgel van belang van elke afzonderlijke muis, beginnend met het natte gewicht van dit weefsel helft (verkregen in stap 5.4), gedeeld door het droge gewicht van dit dezelfde weefsel helft (verkregen in stap 7.1).
- Berekenen van het droge gewicht (in g) van het weefsel helft in formamide door te delen het natte gewicht van het weefsel helft voordat het werd geplaatst in formamide (verkregen in 5.4 stap) door de natte: droge gewichtsverhouding voor de specifieke orgel van belang (berekend in stap 7.2).
- Berekenen van de waarden OD-620 gecorrigeerd . Beginnen met de OD620 aftrekken waarde van elk experimentele putje van de 96-wells-plaat (met Evans blauw-geïnfundeerd formamide uit elk weefsel, verkregen in stap 6.3), de lege goed OD620 waarde (de gemiddelde OD620 waarde van de twee putten met zuivere formamide, bereid in stap 6.2, OD620 waarden verkregen in stap 6.3) van elke experimentele waarde.
- De plasma extravasation waarde berekenen door de gecorrigeerde OD620 (berekend in stap 7.4) te delen door het droge gewicht van het weefsel helft in formamide (berekend in stap 7.3). De eenheden van plasma extravasation zullen OD620/g drooggewicht.
- Gegevens analyseren en uitdrukkelijke als het gemiddelde ± SEM. statistisch vergelijken groepen door t of one-way variantie-analyse en Scheffé van meerdere-vergelijking test (lycofs01.lycoming.edu), zo nodig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In Figuur 1, wordt een schema van de procedure weergegeven, die leiden tot de meest betrouwbare en consistente stof P-geïnduceerde plasma extravasation waarden uit organen van FVBN muizen is gebleken. Deze procedure duurt meestal twee dagen werk, gescheiden door ten minste 48 uur wachttijd. Het is mogelijk om het te verspreiden zelfs meer, als dit gebeurt consequent voor alle experimenten worden vergeleken. Bijvoorbeeld, nadat de organen zijn geïsoleerd op dag 1, kunnen de organen flash in vloeibare stikstof bevroren en opgeslagen bij-80 ° C; na het ontdooien de organen zorgvuldig (binnen een paar dagen tot 1 week), kunnen ze worden gewassen in PBS en uitgewist voordat de rest van het protocol. Ook, hoewel het drogen van weefsels gebeuren moet zoals (bij 150 ° C gedurende 48 h), de winning van Evans blauw van het weefsel helft in formamide verlengd worden van 48-72 uur, zolang de tijd in formamide consistent zijn voor alle experimenten is.
Weergegeven in Figuur 2 en tabel 1 is gegevens demonstreren stof P-geïnduceerde plasma extravasation uit de urine blazen van FVBN wild type (WT) en NEP knock-out (KO) muizen17, die waren beschikbaar is voornamelijk te wijten aan van dit laboratorium reeds lang bestaande belangen in NEP en de verordening en de acties van de geselecteerde neuropeptides18,19. NEP KO muizen doen niet NEP uitdrukken in elk weefsel. Echter wordt NEP uitgedrukt in de urineblaas WT muizen, zij het op een laag niveau20,21,22. Figuur 2 en tabel 1 suggereren is er een verschil in stof P-geïnduceerde plasma extravasation uit de urine blazen van deze twee groepen muizen. Dit betekent een rol voor NEP stof P-geïnduceerde plasma extravasation van de urineblaas, aangezien de uitdrukking van NEP potentieel het grootste verschil in de urine blazen van WT en NEP KO muizen is.
Omdat de oorspronkelijke gegevens voorgesteld een mogelijke rol voor NEP in stof P-geïnduceerde plasma extravasation in de urineblaas (Figuur 2 en tabel 1), besloten hebben we te vollediger onderzoeken de betrokkenheid van NEP in plasma extravasation in een andere orgel. Ten eerste, we gemaakt een dubbel transgene muis te overexpress NEP bijna universeel23. Deze gemanipuleerde muis toegestaan een vergelijking van de gegevens van de drie soorten FVBN muizen: WT muizen16, die natuurlijk het uitdrukken van een beperkte hoeveelheid van de NEP in vele weefsels; NEP KO muizen17, waarin express geen NEP in elk weefsel; en onze dubbel transgene NEP overexpressor muizen23, welke NEP overexpress in bijna alle weefsels op beheer van de doxycycline. Muizen zijn gratis toegang hebben tot doxycycline-bevattende chow voor 1 week vóór de operatie (Figuur 1); Doxycycline dosis is 1 mg/kg chow, ongekleurd. De bouw van deze dubbel transgene muizen die NEP overexpress heeft zijn gedetailleerd, met beschrijving van NEP testen, westerns en NEP mRNA qPCR23.
Met deze 3 types van muizen, dit protocol ziet u een rol voor NEP in plasma extravasation in weefsel, met inbegrip van de twaalfvingerige darm23 (afbeelding 3 en tabel 2). In deze experimenten, de NEP-overexpressie in de dubbel transgene NEP overexpressor muizen was ingeschakeld door het voederen van dieren, voor 1 week vóór dag 1, chow met doxycycline (ongekleurd; 1 mg doxycycline/mg chow, Figuur 3een). Als een besturingselement, werden sommige WT en NEP KO muizen ook de undyed grof doxycycline chow gevoed tijdens de week voorafgaand aan de dag 1 (Figuur 3b en 3 c).
Om te bevestigen de rol van NEP in plasma extravasation tot in de twaalfvingerige darm van FVBN muizen, de uitdrukking van NEP in de twaalfvingerige darm FVBN WT en NEP (dubbel transgene) overexpressor muizen gevoed doxycycline chow werd bevestigd door westelijke analyse met een polyclonal antilichaam tegen menselijke NEP (die cross-reacts met muis NEP)23. Deze analyse bevestigd dat WT duodenums express matige hoeveelheden van de NEP-proteïne, maar de NEP overexpressor duodenums express 2-3 x de bedragen van NEP uitgedrukt door de WT-duodenums. De NEP KO muizen, doen per definitie, niet express NEP in de twaalfvingerige darm.
Figuur 1: algemene schema van protocol voor het meten van plasma stof P-geïnduceerde extravasation. Schematische voorstelling van het protocol voor het meten van plasma stof P-geïnduceerde extravasation van de organen van FVBN muizen (leeftijd 16-20 weken). Dit protocol omvat het meten van weefsel plasma extravasation door de methode blauwe kleurstof Evans via injectie in de halsslagader, en bevat exogenously door de overheid gereguleerde stof P, voor vergrote en gemakkelijk gemeten plasma extravasation waarden, in eenheden van OD620/g drooggewicht. Het beschreven protocol leiden tot consistente stof P-geïnduceerde plasma extravasation waarden uit verschillende organen van FVBN muizen is gebleken, en duurt minimaal twee dagen van het werk. Dag 1 en dag 2 zijn gescheiden door ten minste 48u van tijd te wachten voor weefsels te droog en te halen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Extravasation van de stof P-geïnduceerde plasma van de urineblaas WT en NEP KO muizen. Urineblaas plasma extravasation van FVBN muizen (zonder voorafgaande doxycycline) aangevuld met stof P administratie en uitgedrukt als OD620 nm/g drooggewicht. De urine blazen werden geïsoleerd uit FVBN wild type (WT; witte balk, n = 12) of FVBN NEP-knock-out (KO; zwarte balk, n = 7) muizen en onderworpen aan het protocol voor plasma extravasation zoals beschreven hierboven. Afzonderlijke waarden worden in tabel 1gegeven. Lijnen boven de balken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM). De WT en NEP KO waarden trended naar een significant verschil-p = 0.051 door t-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Stof P-geïnduceerde plasma extravasation vanaf de twaalfvingerige darm van WT NEP KO en NEP overexpressor muizen. (A-C) Duodenale plasma extravasation aangevuld met stof P administratie en uitgedrukt als OD620/g drooggewicht. (A) Duodenums werden geïsoleerd van FVBN WT Muizen zonder voorafgaande doxycycline (-; witte bar, n = 5), NEP KO Muizen zonder voorafgaande doxycycline (-; licht grijze balk, n = 5), NEP ovexpressor dubbel transgene muizen zonder voorafgaande doxycycline (DT-; donker grijze balk, n = 5) of NEP ovexpressor dubbel transgene muizen met voorafgaande doxycycline (DT +; zwarte bar, n = 4) en onderworpen aan het protocol voor plasma extravasation zoals beschreven hierboven. Lijnen boven de balken vertegenwoordigen de SEM. Hoewel de NEP KO (-) waarden trended hoger dan de WT (-) of de DT (-) waarden, was dit verschil niet statistisch significant. Duodenale plasma extravasation waarden werden aanzienlijk verlaagd alleen met de groep van doxycycline gevoed, NEP ovexpressor dubbel transgene muizen (DT +), in vergelijking met alle anderen (* p < 0,05, variantie-analyse). (B, C) Duodenale plasma extravasation waarden van WT en NEP KO muizen niet aanzienlijk beïnvloed door het beheer van de doxycycline (p < 0,05). (B) WT Muizen zonder doxycycline (WT-; witte balk, n = 5) en WT muizen met doxycycline (WT +; middellange grijze balk, n = 7). (C) NEP KO Muizen zonder doxycycline (KO-, licht grijze balk, n = 5) en NEP KO met doxycycline (KO +; middellange grijze balk, n = 2). Afzonderlijke waarden weergegeven als een vierkleurendruk in A, B en C, zijn gegeven in tabel 2. Gereproduceerd met kleine wijziging van Springer tijdschrift artikel23 met toestemming van Springer Science + Business Media. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Genotype | geslacht | nat/droog/massaverhouding van urineblaas | gewicht van de urineblaas half NAT (g; in 85 μL formamide) | half droog gewicht van de urineblaas berekend (g) | OD 620 nm - leeg | OD 620 nm/g droge gewicht (blaas) |
| WT | F | 4.737 | 0.0038 | 0,0008 | 0.0150 | 18.750 |
| WT | M | 4.632 | 0.0045 | 0.0010 | 0.0100 | 10.000 |
| WT | F | 4.700 | 0.0048 | 0.0010 | 0.0280 | 28.000 |
| WT | F | 4.625 | 0.0068 | 0.0015 | 0.0230 | 15.333 |
| WT | F | 4.546 | 0.0077 | 0.0017 | 0.0400 | 23.529 |
| WT | M | 4.800 | 0.0094 | 0.0020 | 0.0570 | 28.500 |
| WT | M | 5.500 | 0.0095 | 0.0017 | 0.0240 | 14.118 |
| WT | F | 4.316 | 0.0098 | 0.0023 | 0.0660 | 28.696 |
| WT | M | 5.061 | 0.0121 | 0,0024 | 0.0400 | 16.667 |
| WT | M | 5.061 | 0.0192 | 0.0038 | 0.0330 | 8.684 |
| +/-SEM (van vermeldingen in de kolom hierboven) betekenen | 4.798 +/-0.105 | 0.0088 +/-0.0014 | 0,0018 +/-0.0003 | 0.0336 +/-0,0056 | 19.228 +/-2.393 | |
| KO | M | 4.316 | 0.0196 | 0.0045 | 0.1610 | 35.778 |
| KO | M | 4.600 | 0.0134 | 0.0029 | 0.1020 | 35.172 |
| KO | M | 4.377 | 0.0104 | 0,0024 | 0.0410 | 17.083 |
| KO | M | 4.727 | 0.0258 | 0.0055 | 0.1410 | 25.636 |
| KO | F | 4.539 | 0.0025 | 0.0006 | 0.0250 | 41.667 |
| KO | M | 4.457 | 0.0149 | 0.0033 | 0.1420 | 43.030 |
| +/-SEM (van vermeldingen in de kolom hierboven) betekenen | 4.503 +/-0.062 | 0.0144 +/-0.0032 | 0.0032 +/-0.0007 | 0.1020 +/-0.0233 | 33.061 +/-4.065 |
Tabel 1: stof P-geïnduceerde plasma extravasation van de urineblaas van individuele WT en NEP KO muizen. Plasma extravasation waarden van FVBN muizen (zonder voorafgaande doxycycline) werden individueel uitgedrukt als OD620 nm/g droge gewicht, van FVBN WT (n = 12) of NEP KO (n = 7) muizen en onderworpen aan het protocol voor plasma extravasation zoals beschreven hierboven. Geen sekseverschillen zijn duidelijk in de plasma extravasation waarden. De urine blazen werden geïsoleerd; afzonderlijke waarden worden gegeven voor de berekende nat/droog gewichtsverhouding van de urineblaas, het natte gewicht van de urineblaas helft in formamide, de berekende droog gewicht van de urineblaas helft in formamide (bepaalde in g), de gecorrigeerde OD620 nm (monster OD620 nm minus de meanOD620 nmof droog de spaties (pure formamide) en de berekende plasma extravasation waarde in OD620 nm/g gewicht (de gecorrigeerde OD620 nm, gedeeld door het berekende drooggewicht). De resulterende plasma extravasation waarden werden gebruikt voor de bouw van Figuur 2.
| Genotype en doxycycline chow, zonder (-) of met (+) | geslacht | nat/droog/massaverhouding van twaalfvingerige darm | gewicht van de twaalfvingerige darm half NAT (g; in 85 μL formamide) | half droog gewicht van de twaalfvingerige darm berekend (g) | OD 620 nm - leeg | OD620 nm/g droge gewicht (twaalfvingerige darm) |
| WT- | M | 4.927 | 0.0307 | 0.0062 | 0.0640 | 10.272 |
| WT- | F | 4,912 | 0.0172 | 0.0035 | 0.0460 | 13.138 |
| WT- | M | 5.333 | 0.0281 | 0.0053 | 0.0960 | 18.221 |
| WT- | F | 5.433 | 0.0375 | 0.0069 | 0.1010 | 14.634 |
| WT- | M | 5.179 | 0.0287 | 0.0055 | 0.0430 | 7.759 |
| +/-SEM (van vermeldingen in de kolom hierboven) betekenen | 5.157 +/-0.105 | 0.0284 +/-0.0033 | 0.0055 +/-0.0006 | 0.0700 +/-0.0122 | 12.805 +/-1.798 | |
| WT + | M | 5.342 | 0.0542 | 0.0101 | 0.1520 | 14.981 |
| WT + | M | 5.653 | 0.0477 | 0.0084 | 0.1120 | 13.272 |
| WT + | M | 5.700 | 0.0564 | 0.0099 | 0.1110 | 11.218 |
| WT + | F | 5.542 | 0.0498 | 0.0090 | 0.1430 | 15.914 |
| WT + | F | 5.723 | 0.0266 | 0.0046 | 0.0470 | 10.112 |
| WT + | F | 5.186 | 0.0262 | 0.0051 | 0.0470 | 9.304 |
| WT + | M | 5.543 | 0.0342 | 0.0062 | 0.0480 | 7.779 |
| +/-SEM (van vermeldingen in de kolom hierboven) betekenen | 5.527 +/-0,075 | 0.0422 +/-0.0049 | 0.0076 +/-0.0009 | 0.0943 +/-0.0175 | 11.797 +/-1.142 | |
| KO- | F | 5.763 | 0.0209 | 0.0036 | 0.0690 | 19.025 |
| KO- | M | 4.232 | 0.0164 | 0.0039 | 0.1010 | 26.061 |
| KO- | M | 4.810 | 0.0227 | 0.0047 | 0.0880 | 18.647 |
| KO- | F | 5.650 | 0.0363 | 0.0064 | 0.0600 | 9.339 |
| KO- | M | 5.212 | 0.0178 | 0.0034 | 0.0640 | 18.739 |
| +/-SEM (van vermeldingen in de kolom hierboven) betekenen | 5.133 +/-0.282 | 0.0228 +/-0.0035 | 0.0044 +/-0.0005 | 0.0764 +/-0.0078 | 18.362 +/-2.659 | |
| KO + | M | 5.128 | 0.0193 | 0.0038 | 0.0600 | 15.941 |
| KO + | M | 5.030 | 0.0459 | 0.0091 | 0.1980 | 21.697 |
| +/-Reeks (posten in kolom hierboven) betekenen | 5.079 +/-0.049 | 0.0326 +/-0.0133 | 0.0065 +/-0.0027 | 0.1290 +/-0.0690 | 18.819 +/-2.878 | |
| DT- | M | 5.426 | 0.0322 | 0.0059 | 0.0775 | 13.058 |
| DT- | M | 4.255 | 0.0360 | 0.0085 | 0.0895 | 10.579 |
| DT- | M | 4.818 | 0.0306 | 0.0064 | 0.1460 | 22.989 |
| DT- | M | 5.189 | 0.0197 | 0.0038 | 0.0380 | 10.010 |
| DT- | F | 5.500 | 0.0256 | 0.0047 | 0.0390 | 8.379 |
| +/-SEM (van vermeldingen in de kolom hierboven) betekenen | 5.038 +/-0.229 | 0.0288 +/-0.0028 | 0.0059 +/-0,0008 | 0.0780 +/-0.0198 | 13.003 +/-2.3607 | |
| DT + | M | 5.008 | 0.0694 | 0.0139 | 0.0270 | 1.948 |
| DT + | M | 4.750 | 0.0660 | 0.0139 | 0.0070 | 0.504 |
| DT + | M | 5.495 | 0.0587 | 0.0107 | 0.0692 | 6.478 |
| DT + | M | 5.233 | 0.0542 | 0.0104 | 0.0620 | 5.986 |
| +/-SEM (van vermeldingen in de kolom hierboven) betekenen | 5.121 +/-0.159 | 0.0621 +/-0.0034 | 0.0122 +/-0.0010 | 0.0413 +/-0.0147 | 3.729 +/-1.478 |
Tabel 2: stof P-geïnduceerde plasma extravasation van de duodenums van individuele WT NEP KO en NEP overexpressor muizen. Plasma extravasation waarden van FVBN muizen (met of zonder voorafgaande doxycycline) werden individueel uitgedrukt als OD620 nm/g droge gewicht, van FVBN WT muizen (n = 5 zonder, en n = 7 met doxycycline), NEP KO muizen (n = 5 zonder, en n = 2 met doxycycline), en NEP overexpressor dubbel transgene muizen (n = 5 zonder, en n = 4 met, doxycycline). Muizen werden onderworpen aan het protocol voor plasma extravasation zoals hierboven beschreven. Geen sekseverschillen zijn duidelijk in de plasma extravasation waarden. Duodenums werden geïsoleerd; afzonderlijke waarden gebruikt bij de berekening van plasma extravasation waren zoals beschreven voor tabel 1. De resulterende plasma extravasation waarden werden gebruikt voor de bouw van Figuur 3A-C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals hierboven is besproken, kan de studie van plasma extravasation uiteindelijk leiden tot nieuwe kennis over de oorzaken van of nieuwe manieren om te remmen of plasma extravasation behandelen. Het succesvolle gebruik van het plasma extravasation protocol (zie hierboven), is met behulp van Evans blauwe kleurstof, aangetoond in het huidige manuscript. Hoewel de gegevens getoond weer aan de hypothese dat NEP de therapieën kan beschermen tegen plasma extravasation, dit is een secundair doel op dit moment met het primaire doel te presenteren van een geoptimaliseerde protocol die gemakkelijk kan worden gebruikt in de gemiddelde laboratorium voor de toekomstige studie van plasma extravasation. Het protocol hierin gemeld richt zich op aanpassingsvermogen aan toekomstige studies met verschillende doelen, dieren, organen en andere voorwaarden, en is vooral handig omdat dit protocol is eenvoudig te gebruiken, betrouwbaar, zuinig en rekening wordt gehouden met de algemene beschikbaarheid van gewone materialen, reagentia en bekwaam personeel. Opgemerkt wordt, echter dat dit protocol een behoorlijke hoeveelheid herhalingen per groep van dieren (8-12 herhalingen voorgesteld vergt) om statistisch geldige resultaten te verkrijgen.
Er zijn talloze studies en verslagen, waarin pogingen om vasculaire permeabiliteit en plasma extravasation te meten. Verreweg de meeste van deze verslagen detail permutaties van methoden die worden gebruikt samen met de methode van de blauwe kleurstof Evans te onderzoeken plasma extravasation en vasculaire permeabiliteit2,3,6,11, 12,,13. Er zijn minder meldingen van vasculaire permeabiliteit methoden die niet Evans blauw op alle3,13,15,24 nemen; deze andere methodes zijn over het algemeen minder toegankelijk voor de gemiddelde laboratorium, waarbij ingewikkelde methoden, gespecialiseerde apparatuur en personeel, en zijn over het algemeen duur.
De ontwikkeling van het bovenstaande Evans blauw-protocol betrokken het testen van vele verschillende permutaties en wijzigingen. Vroege experimenten waren gericht op pogingen om te injecteren Evans blauwe via de muis staart ader. Echter, staart ader injecties bleek technisch uitdagend en resulteerde in inconsistente resultaten, waardoor de opname van de halsslagader injecties en terminal chirurgische technieken hierboven beschreven. Vele voorbereidende experimenten waren ook gedaan proberen te vinden van de juiste concentraties van Evans blauw en stof P. De exacte hoeveelheid Evans blauw bleek niet te zijn absoluut noodzakelijk, zolang het was onder ongeveer 200 mg/kg (vergeleken met 50 mg/kg gebruikt momenteel), maar de hoeveelheid stof P gebruikt in deze experimenten belangrijk was. Na veel experimenten, 1 nmole/kg bleek de ideale concentratie van exogenously toegevoegde stof P, resulterend in een 1.5-fold vergroting van (en dus gemakkelijker meetbaar) plasma extravasation waarden. Ook bleek dat voldoende tijd moet worden toegestaan voor de Evans-blauw naar equilibreer (> 10 min). Perfusie van de bloedvaten te verwijderen overtollige Evans blauw, na het offer van de muis, maar vóór de orgel isolatie, bleek te zijn een essentieel onderdeel van het huidige protocol, in tegenstelling tot andere protocollen die niet deze perfusie stap4 bevatten. Het perfusaat (geleverd door een zachte zwaartekracht verloop) is 50 mL van een oplossing van het pH 3.5 (die moedigt binding van Evans blauw en albumine); Paraformaldehyde, voorkomende in vele andere Evans blauwe protocollen6,10,25, wordt weggelaten in het huidige protocol. Een andere factor die is opgelost in dit protocol is dat de kleurstof gebruikt in doxycycline chow met de meting van OD620 nm voor Evans blue in de weefsels van de voedselbehoefte track interfereert. Zo bleek het noodzakelijk gebruik van ongeverfde doxycycline chow in de bovenstaande experimenten. Ook is een belangrijk en nuttig vinden dat bijna elk orgaan van de muis op bevredigende wijze is geïsoleerd en via dit protocol onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank Andy Poczobutt en Dr. Jori Leszczynski voor hun waardevolle hulp en de wijzigingen in dit manuscript. Ondersteund door subsidies ontvangen van de National Heart, Lung en Blood Institute (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 en RO3 HL095439) en het Department of Veterans' Affairs (verdienste Review).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. Substance P. Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin. Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).
- Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals. Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury. Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).
- Figini, M., et al. Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas. Am J Physiol. 272 (4), Pt 1 785-793 (1997).
- Awad, A. S., et al. Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).
- Lu, B., et al. The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase. Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).
- Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D'Orleans-Juste, P., Regoli, D. Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats. Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Saria, A., Lundberg, J. M. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).
- Fricke, I. B., et al. In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis - the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson's disease. Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).
- Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin. Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).
- Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).
- Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. Neutral endopeptidase modulates septic shock. Ann N Y Acad Sci. 780, Mar 22 156-163 (1996).
- Dempsey, E. C., et al. Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia. Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).
- Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism. Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).
- Chu, P., Arber, D. A. Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma. Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).
- Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study. Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).
- Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. A new tumor marker for bladder cancer. Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).
- Wick, M. J., et al. Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern. Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).
- Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats. J Appl Physiol. 107 (4), (1985) 1348-1356 (2009).
- Scholzen, T. E., et al. Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis. J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).
