Summary
In diesem Artikel ist eine kostengünstige, optimierte und einfache Protokoll beschrieben die verwendet die Evans-blauer Farbstoff-Methode zur Bewertung von Plasma Extravasation in den Organen der FVBN Mäuse, die für den Einsatz in anderen Sorten, Arten, und andere Organe oder Gewebe angepasst werden kann.
Abstract
Vaskuläre Leck oder Plasma Paravasation, hat eine Reihe von Ursachen, und möglicherweise eine schwerwiegende Folge oder Symptom einer entzündlichen Reaktion. Diese Studie kann letztlich führen zu neue Erkenntnisse über die Ursachen des oder neue Wege zu hemmen oder Plasma Extravasation zu behandeln. Es ist wichtig, dass Forscher die richtigen Werkzeuge, einschließlich der besten Methoden zur Verfügung, für das Studium Plasma Extravasation. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll mit der Evans blauen Farbstoff Methode, für die Beurteilung der Plasma Extravasation in den Organen der FVBN Mäuse. Dieses Protokoll ist absichtlich einfach, so groß wie möglich, aber bietet hohe Datenqualität. Evans blauen Farbstoff wurde gewählt, vor allem weil es einfach für den durchschnittlichen Labor zu verwenden. Wir haben dieses Protokoll verwendet, Hinweise und Unterstützung für die Hypothese, dass das Enzym Neprilysin das Gefäßsystem gegen Plasma Extravasation schützen kann. Jedoch kann dieses Protokoll experimentell eingesetzt und leicht abgestimmt für den Einsatz in anderen Stämme von Mäusen oder in anderen Arten, in vielen verschiedenen Organen oder Geweben, für Studien, die anderen Faktoren verbunden, die wichtig zu verstehen sein können, zu verhindern oder zu behandeln sind Plasma Extravasation. Dieses Protokoll wurde umfassend optimiert und modifiziert von bestehenden Protokolle und vereint Zuverlässigkeit, Benutzerfreundlichkeit, Wirtschaft, und allgemeine Verfügbarkeit von Material und Ausrüstung, machen dieses Protokoll überlegen für die durchschnittliche Labor in verwenden Quantifizierung der Plasma Extravasation von Organen.
Introduction
Vaskuläre Leck in den Organen bezieht sich auf Paravasation, oder Austritt von Blutplasma durch Lücken in dem Endothel der produziert nach Kapillare Venolen in den Organen. Dieses Plasma Extravasation oder erhöhten vaskulären Permeabilität, die an irgendeiner Art von einer entzündlichen Reaktion entstehen, kann schwerwiegende Folgen haben. So ist es wichtig, dass dieses Phänomen, seine Ursachen, Modulatoren und folgen, sind studiert und verstanden, und ebenso, dass Ermittler gute tools und Protokolle, um sie zu studieren. Die endothelialen Lücken können über eine Reihe von Reizen hergestellt werden, aber in der Regel entstehen durch die Einwirkung von Peptid Neurotransmitter und/oder Tachykinins auf der gefäßendothelien. Die großen natürlich vorkommende Vermittler dieses Prozesses, führt zu erhöhten Plasma Paravasation, gehört die Undecapeptide Tachykinin Neuropeptid, Substanz P1.
Methoden zu untersuchen und vaskulären Permeabilität oder Plasma Paravasation, Messen, die die albuminbindung Eigenschaft von Evans blauen Farbstoff verwenden, sind entwickelt worden, und sind in der Regel bekannt für ihre Genauigkeit, Einfachheit, Wirtschaftlichkeit, Sicherheit und Möglichkeit, dass die Bestimmung des Plasma Extravasation aus mehreren Geweben auf einmal wenn ja gewünscht2,3,4,5,6,7,8,9 . Dieses Evans blau-Protokoll für die Beurteilung der Plasma Extravasation in den Organen von FVBN Mäusen verwendet alle diese, aber fügt einige wichtigen Änderungen, mit denen es in der Regel nützlich und anpassungsfähig für zukünftige Studien, mit durchschnittlichen Labor, das führt oder wird Führen Sie wichtige Studien der Faktoren im Zusammenhang mit Plasma Extravasation oder vaskulären Permeabilität. In diesem Protokoll ist Substanz P, die Mäuse bei 1 Nmol/kg, eingeführt, die die Extravasation des Plasmas durch 1.5-fold ergänzt. Dies erhöht die Empfindlichkeit des Protokolls, woraus leichter beobachtbar und erhältlich resultiert. Andere Faktoren, die Einfluss auf Durchlässigkeit, wie verschiedene andere Peptide, Chemikalien oder einige Formen von toxischen Verletzungen oder verwendet werden können von anderen Labors, wie gewünscht untersucht. Halsschlagader-Injektionen werden in diesem Protokoll systemisch, einzuführen Evans blau und Substanz P verwendet, die terminal Operation erfordert. Halsschlagader Injektionen5,7,10, sind auch nach Berücksichtigung der erforderlichen terminal Operationstechniken jedoch einfacher zu meistern und führen zur Produktion von konsistentere Ergebnisse als andere venöse Injektionen, Schwanz Vene Spritzen4,9. Obwohl es für Evans blau von Retro-Orbital venösen Sinus-Injektionen zu liefernden möglich sind, wurden keine Hinweise in der Literatur gefunden, dass diese Art der Lieferung von Evans blau verwenden. Das hohe Maß an Expertise und Praxis reproduzierbar beherrschen diese Technik stark begrenzt jedoch wie bei Heck-Vene-Injektionen, seine Verwendung für erfolgreiche Evans blau-Injektionen. Im Gegensatz dazu bietet die alternative Halsschlagader Injektionsverfahren wie in unserem Protokoll beschrieben eine technisch erhältlich Lösung. Ein entscheidender Verfahren zur Perfusion der Maus Venen durchgeführt nur, nachdem das Opfer der Evans blau durchblutet Maus, entfernt überschüssige Evans blau färben und hat in diesem Protokoll standardisiert worden. Zuvor beschriebene Methoden der Perfusion wurden sorgfältig geprüft und geändert, um das vorliegende Verfahren zu erhalten. Andere Modifikationen, die hier beschrieben sind alle optimierten, unkompliziert und kostengünstig.
Es gibt einige wichtigeren Einschränkungen der Evans-blauer Farbstoff-Methode. Geringer Empfindlichkeit, manchmal verbunden mit dieser Methode kann beispielsweise einige grobe pathologischen und histologischen Zusatzprüfung von Geweben aus Evans blau injiziert Tiere verhindern. Diese und andere Einschränkungen führten jedoch zur Entwicklung von alternativen Methoden und Modelle, die jedoch nach wie vor Evans blau verwenden. Die Messung von Evans blau durch Fluoreszenz (und nicht von Visual-Palette) Spektroskopie kann erhöhen die Empfindlichkeit der Methode. Darüber hinaus war Fluoreszenzmikroskopie Evans blau gefärbten Gewebe entwickelt, damit für die Beobachtung der vaskulären Leck in deutlicher Standorte11. Auch Ganzkörper-imaging und Scannen von einem lebenden Tier zuvor mit Evans blau12 ermöglicht die Untersuchung von Evans blau Konzentrationen in kontinuierlicher Weise injiziert, anstatt an einer gewählten Zeit Punkt des Experiments. Allerdings ist diese Methode erfordert die Verfügbarkeit von geeigneten bildgebenden Einrichtungen, und kann sehr teuer sein. Änderungen bei Evans blau und in einem in Vitro Modell durchgeführt, haben wie z. B. in einer Zelle Kultur oder Küken chorioallantoic Modell13 (CAM) auch beschrieben worden. Diese Modelle werden durch Fluoreszenz und intravitalen14 Mikroskopie, überwacht und erlauben die Quantifizierung der vaskulären Permeabilität Veränderungen im Laufe der Zeit aber können werfen Fragen nach präzise Modellierung der in Vivo -Bedingungen und möglicherweise auch teuer.
Es wurden andere Methoden entwickelt, um zu bestimmen und zu quantifizieren, vaskuläre Leck oder Durchlässigkeit, die nicht die Verwaltung von Evans blau beinhalten. Diese Methoden können eine geeignete fluoreszierendes Molekül (z. B. Albumin oder Fluorescein) oder ein isotopisch beschriftete oder anderweitig tagged Molekül, Tiere Leben beschäftigen (oder um Zell-Kultur oder chorioallantoic (CAM) Modelle13, gefolgt von nicht-invasive Bildgebung (PET-Scanning, MRI, intravitalen Mikroskopie, ganze Körper-Scan) oder durch invasive Bildgebung (Fluoreszenz-Mikroskopie)3,12,15. Obwohl diese Techniken eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen Evans blau Methoden anbieten können, haben sie auch Nachteile, die ihre erhebliche Komplexität, erforderliche Know-how, Ressourcen und hohen monetären Kosten beinhalten können.
Neprilysin16 (Peptidase Enzyms NEP, auch bekannt als CD10, MME oder Enkephalinase) ist vorgeschlagen worden, zu beteiligen, Hemmung der Plasma Paravasation, mindestens im Teil, durch die enzymatischen Metabolismus und Inaktivierung von endogene Substanz p. In Geweben, in denen die Zelle Oberfläche Peptidase NEP auftritt, kann es also eine Abschwächung der Wirkung der Substanz P, vermutlich durch die Peptidase Aktivität der NEP
Zunächst haben wir für die Substanz P-induzierte Plasma Extravasation Nutzung dieses modifizierte Evans blau-Protokoll mit FVBN Wildtyp (WT) und NEP-Knockout (KO)-Mäusen getestet. NEP Beteiligung an Substanz P-augmented Plasma Extravasation wurde aus diesen anfänglichen Studien vermutet, und wir beschreiben diese und weitere Experimente mit NEP Rolle im Plasma Extravasation. Im Mittelpunkt dieser Handschrift ist nicht NEP oder seiner Rolle im Plasma Paravasation, allerdings eher die Plasma Extravasation Experimente selbst. Die NEP-Ergebnisse sind repräsentativ für die Art der Ergebnisse, die durch Einsatz des modifizierten Protokolls erzielt werden können. Die Evans blau-Methode zur Messung der Plasma Extravasation wurden optimiert und verändert, wie im Detail unten für FVBN Mäuse beschrieben.
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Protocol
Alle geltende internationalen, nationalen und/oder institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren (Mäuse) folgten in den Experimenten in dieser Handschrift beschrieben.
Diese Methode verwendet FVBN Erwachsener Mäuse, im Alter von 16-20 Wochen, optimal für die Zwecke dieser Studie zu sein gefunden. Tag1 umfasst die Schritte 1-5 und Tag2 umfasst Schritte 6 und 7 (Abbildung 1).
1. Ausrüstung Vorbereitung
- Sichern Sie eine ausreichende Versorgung mit steril, Einweg-Spritzen und Nadeln, wenn Ketamin/Xylazin als die Betäubung verwendet wird (wie empfohlen). Wenn Isofluran als die Betäubung verwendet wird, überprüfen Sie die Sauerstoffflasche und des Flüssigkeitsspiegels Isofluran, stellen Sie sicher, es gibt ausreichende Versorgung für das Experiment vor dem Start. Auch montieren Sie die Atmung Schaltungen Nosecone und bringen Sie sie zum Feld Induktion; Legen Sie neue Holzkohle Kanister auf Atmung Schaltungen. Bereiten Sie die Induktion-Box von der Sauerstoffzufuhr und Feststellung, dass die zweite Stufe ca. 50 Psi liest.
- Schalten Sie das Heizkissen auf 37 ° C.
- Die rektale Temperatur-Sonde für die Operation vorbereiten.
(2) Maus-Vorbereitung
Dieser Schritt umfasst die Anästhesie, Haarentfernung und Positionierung (FVBN Mäuse-Erwachsenenalter 16-20 Wochen).
- Wiegen Sie die Mäuse und nehmen Sie die Gewichte auf.
- Die Mäuse zu betäuben.
- Ketamin und Xylazin IP zu verwalten (80-100 mg/kg und 7,5-16 mg/kg, beziehungsweise). Es wird jedoch empfohlen, mit niedrigeren Dosen von Ketamin und Xylazin beginnen (über 30 mg/kg und 6 mg/kg, beziehungsweise).
- Aufrechterhaltung der Narkose mit etwa 0,1 - 0,25 Mal erste Dosen von Ketamin/Xylazin während der Operation. Ketamin und Xylazin waren die Narkose Bevollmächtigten der Wahl in dieser Studie mehr Reproduzierbarkeit und Überlebensfähigkeit beobachtet wurden. Die Narkose Bevollmächtigten Wahl in anderen Studien finden, um anders zu sein. Wenn Isofluran verwendet wird, setzen Sie die Maus in eine Induktion Kammer und Isofluran auf 5 % schalten Sie ein, bis die Maus das volle Bewusstsein verliert. Verwenden Sie dann eine nasale Nosecone auf 1,5-2,5 % Isofluran für den Rest des Verfahrens festgelegt.
- Überwachen Sie die Mäuse Alle 2-3 min durch Zehe Prise zu überprüfen, für die entsprechende Tiefe der Narkose.
- Rasieren Sie die ventralen Halsbereich der Maus.
- Platzieren Sie den Mauszeiger in Rückenlage auf dem vorgeheizten Pad. Die Pfoten und Füße von der Maus an die chirurgische Oberfläche mit Klebeband zu sichern.
- Platzieren Sie künstliche Träne Salbe auf die Augen Austrocknen während der Operation zu verhindern.
3. chirurgische Details
- Machen Sie einen 1 cm Schnitt am rechten ventralen Hals über der Halsschlagader.
- Wenden Sie ein oder zwei Tropfen von Lidocain (1-2 %) in der Schnitt-Bereich für Schmerztherapie und Vasodilatation zu fördern. Warten Sie 2 Minuten für die Lidocain wirksam werden.
- Aussetzen und den richtigen internen Halsschlagader über stumpfe Dissektion zu isolieren. Binden Sie die Vene aus mit 4: 0 Naht und einfahren Sie sanft rostral Ende des Gefäßes mit einer Gefäßklemme. Schneiden Sie ein Loch, mit feinen Schere, ca. 3 mm unten oder kaudalen, die Krawatte, etwa auf halbem Weg durch den Durchmesser der Vene.
- Markieren Sie einen PV-1 polyvinyl Katheter 1,5 cm vom Ende stecken Sie ihn in die Halsschlagader durch das Loch mit einem Schiff Dilatator und Fädeln Sie den Katheter am kaudalen Ende des Schiffes, ca. 1,5 cm.
- Binden Sie den Katheter sicher innerhalb der kaudalen Teil des Schiffes (unter dem Schnitt), mit 4: 0 Seide. Binden Sie die rostral Teil des Schiffes an der Außenseite des Katheters mit der losen Enden des Nahtmaterials die verwendet wurde, um die rostral Halsschlagader im Schritt 3.3 zu binden.
- Tack die Haut locker zusammen zurück, um den Katheter mit 4: 0 Seide um Auskühlung und Austrocknung des Gewebes zu verhindern.
- Verbinden Sie den Katheter mit eine Spritze mit heparinisierten Kochsalzlösung (10 U/mL) und spülen Sie des Katheters.
(4) Injektionen
- Injizieren Sie die Evans blau-Lösung (50 μL einer 30 mg/mL Lösung in normaler, unheparinized Kochsalzlösung 0,9 % oder ca. 50 mg/kg) in der Halsschlagader Katheter, gefolgt von einem kleinen Volumen von heparinisierten Kochsalzlösung zu spülen Sie die Linie.
- 2 min später, Substanz P (100 μl einer Lösung von 0,3 μM in normaler, unheparinized Kochsalzlösung 0,9 % oder 1 Nmol/kg), gefolgt von einem kleinen Volumen von heparinisierten Kochsalzlösung zu spülen Sie die Linie zu injizieren. Substanz P ergänzt die Extravasation der Plasmaproteine durch die endotheliale Schicht; in diesem Protokoll induziert es routinemäßig eine Aufwertung der Plasma Extravasation Werte von ca. 1,5-facher erleichtert Plasma Extravasation Werte zu messen.
- Nach Injektion der Substanz P warten Sie 18 min.. Während dieser Zeit wird der Evans blauen Farbstoff equilibrate und zirkulieren.
- Beenden Sie das Experiment 18 min nach der Injektion von Substanz P (20 min nach der Injektion Evans blau) durch Verzicht auf die Maus mit zervikale Dislokation. Es ist wahrscheinlich, dass die Maus direkt Zervikal ausgerenkt, ohne zuvor eine Überdosis Betäubungsmittel, wie die Maus ist wahrscheinlich noch gut betäubt von der Operation. Jedoch, wenn es notwendig ist, kann eine Überdosis Narkosemittel Ketamin/Xylazin, Isofluran oder Pentobarbital gegeben werden gefolgt von zervikale Dislokation.
(5) Isolation der Organe
- Aufschneiden der Brusthöhle der Maus und Schwerkraft-perfundieren (aus einer Höhe von ca. 51 cm oder 20") das Herz und die Blutgefäße mit 50 mL Natriumcitrat 50 mM, pH 3,5. pH 3,5 bewahrt vermutlich Evans blau Bindung an Albumin.
- Verbrauchsteuern Sie 1-5 zuständigen Organe (Gewebe) mit einem sezierenden Skalpell (z.B. Harnblase, Niere, Magen, Leber, Bauchspeicheldrüse, proximalen oder distalen Colon, Ileum, Zwölffingerdarm, Flanke Haut, Ohren, Rute, Herz und/oder Lunge) und entfernen Sie alle restlichen Inhalte zu, wenn anwesend.
- Spülen Sie die Organe bei Raumtemperatur (RT) Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, 8,0 g NaCl und 0,20 g KCl in 1 L, pH 7.4).
- Tupfen Sie die Organe mit Gewebe, jedes Organ in zwei Hälften schneiden und wiegen jeweils die Hälfte (nass Gewichten in g).
- Trocknen Sie eine Hälfte des Gewebes in einem Trockenschrank bei 150 ° C, auf Folie, für 48 h.
- Legen Sie die andere Hälfte in eine einheitliche Lautstärke (bis zu 200 µL) von Formamid in ein Microfuge Rohr für 48 h (und bis zu 72 h) Gewebe, die Evans blau zu extrahieren.
6. Messung des Gewebes OD
- Entfernen Sie 50 µL Evans blau angereichertes Formamid (nach 48-72 h RT Inkubation) aus Microfuge Rohr und Ort in einem Brunnen einer 96-Well Polystyrol Platte. Achten Sie darauf, dass Sie nicht Gewebe Stücke zusammen mit der Formamid übertragen.
- Platz 50 µL des neuen, reinen Formamid in jeder der zwei leeren Brunnen der 96-Well-Platte für die Rohlinge.
- Messung und Aufzeichnung der OD-620 von jedem Bohrloch 96-Well-Platte auf eine Extinktion Platte Leser. 620 nm ist die Absorption von Evans Blue max.
7. Berechnung der Plasma Extravasation
- Das trockene Gewebe wiegen die Hälfte in den Ofen für 48 h wurde.
- Berechnen Sie die nassen Gewicht/Dry-Gewichts-Verhältnis für die spezifische Orgel aus jeder einzelnen Maus, beginnend mit dem Frischgewicht dieses Gewebes halb (erhaltene in Schritt 5.4), dividiert durch das Trockengewicht dieses gleichen Gewebes halb (erhaltene in Schritt 7.1).
- Berechnen Sie dem Trockengewicht (in g) des Gewebes Hälfte in Formamid dividiert das Frischgewicht des Gewebes Hälfte davor war in Formamid (in Schritt 5.4 erhaltenen) durch Nässe gelegt: Trockengewicht Verhältnis für die spezifische Orgel von Interesse (gerechnet in Schritt 7.2).
- Berechnen Sie die korrigierte OD620 Werte. Beginnend mit der OD-620 Wert aus jeder experimentellen Brunnen von den 96-Well-Platte (mit Evans blau angereichertes Formamid aus jedem Gewebe, erwarb Schritt 6.3), subtrahieren die leeren gut OD620 Wert (der OD620 Mittelwert die zwei Brunnen mit reinen Formamid, zubereitet im Schritt 6.2, OD620 Werte in Schritt 6.3) von jedem experimentellen Wert.
- Berechnen Sie den Plasma Extravasation Wert durch Division der korrigierten OD620 (berechnet in Schritt 7.4) durch das Trockengewicht des Gewebes die Hälfte in Formamid (berechnet in Schritt 7.3). Die Einheiten der Plasma Extravasation werden OD620/g Trockengewicht.
- Daten analysieren und ausdrücklich als Mittelwert ± SEM statistisch vergleichen Gruppen von t-Test oder Einweg Varianzanalyse und Scheffé Multiple-Vergleichstest (lycofs01.lycoming.edu), je nach Bedarf.
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Representative Results
In Abbildung 1ist eine schematische Darstellung des Verfahrens gezeigt, die gefunden wurde, um die zuverlässige und konsistente Substanz P-induzierte Plasma Extravasation Werte von den Organen der FVBN Mäuse zur Folge haben. Dieser Vorgang dauert in der Regel zwei Tage Arbeit, getrennt durch mindestens 48 h der Wartezeit. Es ist möglich, noch mehr zu verbreiten, geschieht dies konsequent für alle Experimente zu vergleichen. Zum Beispiel nach die Organen am 1. Tag isoliert sind, können die Organe Flash-werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° C gelagert; auf sorgfältig Auftauen der Organe (innerhalb von ein paar Tagen bis zu 1 Woche), können sie mit PBS-Puffer gewaschen und vor dem Rest des Protokolls ausgelöscht. Auch, obwohl das Trocknen des Gewebes durchgeführt werden sollte, wie angegeben (bei 150 ° C für 48 h), die Gewinnung von Evans Blau des Gewebes kann Hälfte in Formamid von 48-72 h, verlängert werden, solange die Zeit in Formamid konsistent für alle Experimente ist.
Dargestellt in Abbildung 2 und Tabelle 1 zeigt Daten Substanz P-induzierte Plasma Extravasation von urinausscheidende Blase FVBN Wildtyp (WT) und NEP Knockout (KO) Mäuse17, welche waren in erster Linie aufgrund des Labors langjähriges Interesse an NEP und die Regelungen und die Aktionen von ausgewählten Neuropeptide18,19. NEP KO Mäusen ausdrücklich nicht NEP in jedem Gewebe. NEP äußerten jedoch innerhalb der Harnblase von WT-Mäusen, wenn auch auf niedrigem Level20,21,22. Abbildung 2 und Tabelle 1 deuten darauf hin, dass es ein Unterschied in Substanz P-induzierte Plasma Extravasation von urinausscheidende Blase aus diesen zwei Gruppen von Mäusen. Dies impliziert eine Rolle für die NEP in Substanz P-induzierte Plasma Extravasation aus der Harnblase, da der Ausdruck der NEP möglicherweise der Hauptunterschied in der urinausscheidenden Blase von WT und NEP KO Mäusen ist.
Weil die Originaldaten Substanz P-induzierte Plasma Extravasation in der Harnblase (Abbildung 2 und Tabelle 1) eine mögliche Rolle für NEP vorgeschlagen, haben wir beschlossen, die Beteiligung der NEP im Plasma Extravasation in einem anderen mehr in vollem Umfang zu untersuchen Orgel. Zuerst erstellt wir eine doppelt Transgene Maus Overexpress NEP fast universell23. Diese entwickelte Maus erlaubt einen Vergleich der Daten zwischen drei Arten von FVBN Mäuse: WT Mäuse16, die natürlich express eine begrenzte Anzahl von NEP in vielen Geweben; NEP KO Mäusen17, die keine NEP in jedem Gewebe Ausdrücken; und unsere doppelt transgenen NEP Overexpressor Mäuse23, welche Overexpress NEP in fast allen Geweben bei der Verabreichung von Doxycyclin. Mäuse sind erlaubt freien Zugang zu Doxycyclin-haltigen Chow für 1 Woche vor der Operation (Abb. 1); Doxycyclin-Dosis beträgt 1 mg/kg Chow, ungefärbt. Der Bau dieser doppelt Transgene Mäuse, die NEP overexpress hat detailliert, mit Beschreibung der NEP-Assays, Western und NEP mRNA qPCR23.
Mit diesen 3 Arten von Mäusen zeigt dieses Protokoll eine Rolle für NEP im Plasma Extravasation in Geweben einschließlich der Zwölffingerdarm23 (Abbildung 3 und Tabelle 2). In diesen Experimenten der NEP-Überexpression in den doppelt transgenen Mäusen der NEP-Overexpressor eingeschaltet wurde durch die Fütterung, für 1 Woche vor dem Tag 1, chow mit Doxycyclin (ungefärbt; 1 mg Doxycyclin/mg Chow, Abbildung 3ein). Als Kontrolle wurden einige WT und NEP KO Mäuse auch ungefärbt Doxycyclin Chow in der Vorwoche Tag1 (Abbildung 3b und 3 c) gefüttert.
Um die Rolle der NEP im Plasma Extravasation bis in den Zwölffingerdarm FVBN Mäuse, die Expression von NEP in den Zwölffingerdarm FVBN WT und NEP (doppelt Transgen) bestätigen Overexpressor Mäusen gefüttert Doxycyclin Chow wurde von westlichen Analyse mit einem polyklonalen Antikörper gegen bestätigt menschlichen NEP (die mit Maus NEP cross-reacts)23. Diese Analyse bestätigt, dass WT Duodenums moderate Mengen des Proteins NEP Ausdrücken, aber die NEP Overexpressor Duodenums express 2-3 X die Beträge der NEP von WT Duodenums ausgedrückt. Die NEP KO Mäuse ausdrücklich per definitionem kein NEP in den Zwölffingerdarm.
Abbildung 1: Allgemeine Schema des Protokolls für die Messung von Substanz P-induzierte Plasma Extravasation. Schematische Darstellung des Protokolls für die Messung von Substanz P-induzierte Plasma Extravasation von den Organen der FVBN Mäuse (Alter 16-20 Wochen). Dieses Protokoll beinhaltet die Messung der Gewebe Plasma Extravasation von der Evans-blauer Farbstoff-Methode durch Injektion in die Halsschlagader und beinhaltet exogen verabreichten Substanz P, um erweiterte und leicht gemessenen Plasma Extravasation zu erhalten Werte, in Einheiten von OD620/g Trockengewicht. Das beschriebene Protokoll hat sich als einheitliche Substanz P-induzierte Plasma Extravasation Werte aus verschiedenen Organen von FVBN Mäusen führen und dauert mindestens zwei Tage Arbeit. Tag1 und Tag 2 sind getrennt von mindestens 48 h Wartezeit für Gewebe zu trocknen und zu extrahieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Substanz P-induzierte Plasma Extravasation aus der Harnblase von WT und NEP KO Mäusen. Harnblase Plasma Extravasation von FVBN Mäusen (ohne vorherige Doxycyclin) ergänzt durch Substanz P Verwaltung und ausgedrückt als OD620 nm/g Trockengewicht. Urinausscheidende Blase wurden isoliert von FVBN Wildtyp (WT; weißer Balken, n = 12) oder FVBN NEP Knockout (KO; schwarze Balken, n = 7) Mäuse und das Protokoll für Plasma Extravasation gemäß obigen unterzogen. Individuelle Werte sind in Tabelle 1angegeben. Linien über die Balken stellen den Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Die Werte für WT und NEP KO tendierte gegen ein signifikanter Unterschied p = 0,051 durch t-Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Substanz P-induzierte Plasma Extravasation von den Zwölffingerdarm WT, NEP KO und NEP Overexpressor Mäuse. (A-C) Zwölffingerdarm Plasma Extravasation von Substanz P Verwaltung ergänzt und ausgedrückt als OD620/g Trockengewicht. (A) Duodenums wurden isoliert von FVBN WT Mäuse ohne vorherige Doxycyclin (-; weiße bar, n = 5), NEP KO Mäusen ohne vorherige Doxycyclin (-; leichten grauen Balken, n = 5), NEP Ovexpressor doppelt Transgene Mäuse ohne vorherige Doxycyclin (DT-; dunklen grauen Balken, n = 5) oder NEP Ovexpressor doppelt transgener Mäuse mit vorheriger Doxycyclin (DT +; schwarz bar, n = 4) und das Protokoll für Plasma Extravasation gemäß obigen unterzogen. Linien über die Balken stehen für SEM Obwohl die NEP KO (-) Werte höher als die WT (-) oder DT (-) Werte, tendierte war dieser Unterschied statistisch nicht signifikant. Zwölffingerdarm Plasma Extravasation Werte wurden nur mit der Gruppe von Doxycyclin gefüttert, NEP Ovexpressor doppelt Transgene Mäuse (DT +), im Vergleich zu allen anderen deutlich zurückgegangen (* p < 0,05, Analyse der Varianz). (B, C) Zwölffingerdarm Plasma Extravasation Werte von WT und NEP KO Mäusen waren nicht nennenswert von Doxycyclin Verwaltung (p < 0,05). (B) WT Mäuse ohne Doxycyclin (WT-; weißer Balken, n = 5) und WT-Mäuse mit Doxycyclin (WT +; mittlere graue Balken, n = 7). (C) NEP-KO-Mäusen ohne Doxycyclin (KO-; hellgrauen Leiste, n = 5) und NEP KO mit Doxycyclin (KO +; mittlere graue Balken, n = 2). Einzelwerte dargestellt als Verbundwerkstoff in A, B und C, sind in Tabelle 2dargestellt. Reproduziert mit geringfügigen Änderungen von Springer Journal Artikel23 mit freundlicher Genehmigung von Springer Science + Business Media. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Genotyp | Sex | nass/trocken-Gewichts-Verhältnis der Harnblase | Gewicht der Harnblase halb nass (g; in 85 μl Formamid) | Trockengewicht der Harnblase halb berechnet (g) | OD-620 nm - leer | OD-620 nm/g Trockengewicht (Harnblase) |
| WT | F | 4.737 | 0.0038 | 0,0008 | 0.0150 | 18.750 |
| WT | M | 4.632 | 0,0045 | 0.0010 | 0.0100 | 10.000 |
| WT | F | 4.700 | 0,0048 | 0.0010 | 0.0280 | 28.000 |
| WT | F | 4,625 | 0,0068 | 0,0015 | 0.0230 | 15.333 |
| WT | F | 4.546 | 0.0077 | 0.0017 | 0.0400 | 23.529 |
| WT | M | 4.800 | 0.0094 | 0.0020 | 0.0570 | 28.500 |
| WT | M | 5.500 | 0,0095 | 0.0017 | 0.0240 | 14.118 |
| WT | F | 4.316 | 0.0098 | 0,0023 | 0.0660 | 28.696 |
| WT | M | 5.061 | 0.0121 | 0.0024 | 0.0400 | 16.667 |
| WT | M | 5.061 | 0.0192 | 0.0038 | 0.0330 | 8.684 |
| Meine +/-SEM (der Einträge in Spalte oben) | 4.798 + /-0.105 | 0.0088 + / 0.0014 | 0,0018 + 0,0003 / | 0.0336 + / 0.0056 | 19.228 + / 2.393 | |
| KO | M | 4.316 | 0.0196 | 0,0045 | 0.1610 | 35.778 |
| KO | M | 4.600 | 0.0134 | 0.0029 | 0.1020 | 35.172 |
| KO | M | 4.377 | 0.0104 | 0.0024 | 0.0410 | 17.083 |
| KO | M | 4.727 | 0.0258 | 0.0055 | 0.1410 | 25.636 |
| KO | F | 4.539 | 0,0025 | 0,0006 | 0.0250 | 41.667 |
| KO | M | 4.457 | 0.0149 | 0.0033 | 0.1420 | 43.030 |
| Meine +/-SEM (der Einträge in Spalte oben) | 4.503 + / 0,062 | 0.0144 + / 0.0032 | 0.0032 + / 0.0007 | 0.1020 + / 0.0233 | 33.061 + / 4.065 |
Tabelle 1: Substanz P-induzierte Plasma Extravasation aus der Harnblase von einzelnen WT und NEP KO Mäusen. Plasma Extravasation Werte aus FVBN Mäuse (ohne vorherige Doxycyclin) wurden individuell ausgedrückt als OD620 nm/g Trockengewicht von FVBN WT (n = 12) oder NEP KO (n = 7) Mäuse und das Protokoll für Plasma Extravasation gemäß obigen unterzogen. Keine geschlechtsspezifischen Unterschiede zeigten sich im Plasma Extravasation Werte. Urinausscheidende Blase wurden isoliert; Einzelwerte sind für das berechnete nass/trocken-Gewicht-Verhältnis der Harnblase, dem Frischgewicht der Harnblase gegeben, die Hälfte in Formamid, die berechneten Trockengewicht der Harnblase in Formamid (angegeben in g), die korrigierte OD620 nm (Probe OD620 nm die Hälfte abzüglich der meanOD620 Nmof trocknen die Rohlinge (reine Formamid) und den berechneten Plasma Extravasation Wert in OD620 nm/g Gewicht (die korrigierte OD620 nm, geteilt durch die berechnete Trockengewicht). Die daraus resultierende Plasma Extravasation Werte wurden zur Abbildung 2zu konstruieren.
| Genotyp und Doxycyclin Chow, ohne (-) oder mit (+) | Sex | nass/trocken-Gewichts-Verhältnis von Zwölffingerdarm | Gewicht der Zwölffingerdarm halb nass (g; in 85 μl Formamid) | Trockengewicht der Zwölffingerdarm halb berechnet (g) | OD-620 nm - leer | OD620 nm/g Trockengewicht (Zwölffingerdarm) |
| WT- | M | 4.927 | 0.0307 | 0.0062 | 0.0640 | 10.272 |
| WT- | F | 4,912 | 0.0172 | 0,0035 | 0.0460 | 13.138 |
| WT- | M | 5.333 | 0.0281 | 0.0053 | 0.0960 | 18.221 |
| WT- | F | 5,433 | 0,0375 | 0.0069 | 0.1010 | 14,634 |
| WT- | M | 5,179 | 0.0287 | 0.0055 | 0.0430 | 7,759 |
| Meine +/-SEM (der Einträge in Spalte oben) | 5.157 + /-0.105 | 0.0284 + / 0.0033 | 0.0055 + / 0,0006 | 0.0700 + / 0.0122 | 12.805 + / 1.798 | |
| WT + | M | 5.342 | 0.0542 | 0.0101 | 0.1520 | 14.981 |
| WT + | M | 5.653 | 0.0477 | 0.0084 | 0.1120 | 13.272 |
| WT + | M | 5.700 | 0.0564 | 0.0099 | 0.1110 | 11.218 |
| WT + | F | 5.542 | 0.0498 | 0.0090 | 0.1430 | 15.914 |
| WT + | F | 5.723 | 0.0266 | 0.0046 | 0.0470 | 10.112 |
| WT + | F | 5.186 | 0.0262 | 0.0051 | 0.0470 | 9.304 |
| WT + | M | 5.543 | 0.0342 | 0.0062 | 0.0480 | 7.779 |
| Meine +/-SEM (der Einträge in Spalte oben) | 5.527 +/-0,075 | 0.0422 + /-0.0049 | 0.0076 + / 0,0009 | 0.0943 + / 0.0175 | 11.797 + / 1.142 | |
| KO- | F | 5,763 | 0.0209 | 0.0036 | 0.0690 | 19.025 |
| KO- | M | 4.232 | 0.0164 | 0.0039 | 0.1010 | 26.061 |
| KO- | M | 4.810 | 0.0227 | 0.0047 | 0.0880 | 18.647 |
| KO- | F | 5.650 | 0.0363 | 0.0064 | 0.0600 | 9.339 |
| KO- | M | 5.212 | 0.0178 | 0.0034 | 0.0640 | 18.739 |
| Meine +/-SEM (der Einträge in Spalte oben) | 5.133 + /-0.282 | 0,0228 + / 0,0035 | 0.0044 +/-0,0005 | 0.0764 + / 0.0078 | 18.362 + / 2.659 | |
| KO + | M | 5.128 | 0.0193 | 0.0038 | 0.0600 | 15.941 |
| KO + | M | 5.030 | 0.0459 | 0.0091 | 0.1980 | 21.697 |
| + /-Bereichs (Einträge in Spalte oben) bedeuten | 5.079 + /-0.049 | 0.0326 + / 0.0133 | 0.0065 + / 0.0027 | 0.1290 + / 0.0690 | 18.819 + 2,878 / | |
| DT- | M | 5.426 | 0.0322 | 0.0059 | 0.0775 | 13.058 |
| DT- | M | 4.255 | 0.0360 | 0,0085 | 0,0895 | 10.579 |
| DT- | M | 4.818 | 0.0306 | 0.0064 | 0.1460 | 22.989 |
| DT- | M | 5.189 | 0.0197 | 0.0038 | 0.0380 | 10.010 |
| DT- | F | 5.500 | 0.0256 | 0.0047 | 0.0390 | 8.379 |
| Meine +/-SEM (der Einträge in Spalte oben) | 5.038 + / 0.229 | 0.0288 + / 0.0028 | 0.0059 + / 0,0008 | 0.0780 + / 0.0198 | 13.003 + / 2.3607 | |
| DT + | M | 5.008 | 0.0694 | 0.0139 | 0.0270 | 1.948 |
| DT + | M | 4.750 | 0.0660 | 0.0139 | 0.0070 | 0.504 |
| DT + | M | 5.495 | 0.0587 | 0.0107 | 0.0692 | 6.478 |
| DT + | M | 5.233 | 0.0542 | 0.0104 | 0.0620 | 5.986 |
| Meine +/-SEM (der Einträge in Spalte oben) | 5.121 + /-0.159 | 0.0621 + / 0.0034 | 0.0122 + / 0.0010 | 0.0413 + / 0.0147 | 3.729 + / 1.478 |
Tabelle 2: Substanz P-induzierte Plasma Extravasation von des Duodenums der einzelnen WT, NEP KO und NEP Overexpressor Mäuse. Plasma Extravasation Werte aus FVBN Mäusen (mit oder ohne vorherige Doxycyclin) wurden individuell ausgedrückt als OD620 nm/g Trockengewicht von FVBN WT Mäuse (n = 5 ohne, und n = 7 mit Doxycyclin), NEP KO Mäuse (n = 5 ohne, und n = 2 mit Doxycyclin), und NEP Overexpressor doppelt Transgene Mäuse (n = 5 ohne, und n = 4 mit Doxycyclin). Mäuse wurden das Protokoll für Plasma Extravasation wie oben beschrieben unterzogen. Keine geschlechtsspezifischen Unterschiede zeigten sich im Plasma Extravasation Werte. Duodenums wurden isoliert; einzelne Werte, die bei der Berechnung der Plasma Paravasation verwendet wurden wie bei Tabelle 1beschrieben. Die daraus resultierende Plasma Extravasation Werte wurden zur Abbildung 3A-Czu konstruieren.
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Discussion
Wie oben besprochen, kann das Studium der Plasma Extravasation letztlich neue Erkenntnisse über die Ursachen des oder führen neue Wege zu hemmen oder Plasma Extravasation zu behandeln. Der erfolgreiche Einsatz des Protokolls Plasma Extravasation (oben), wurde mit Evans blau färben, im aktuellen Manuskript nachgewiesen. Obwohl die gezeigten Daten wieder die Hypothese, dass NEP kann das Gefäßsystem schützen gegen Plasma Paravasation, dies ist ein sekundäres Ziel derzeit mit dem primären Ziel, um ein optimiertes Protokoll vorzulegen, welche leicht im durchschnittlichen Labor kann die Zukunftsstudie von Plasma Extravasation. Das Protokoll berichtet hier konzentriert auf die Anpassungsfähigkeit an zukünftige Studien mit unterschiedlichen Zielen, Tiere, Organe und andere Bedingungen und ist besonders hilfreich, da dieses Protokoll ist einfach zu bedienen, zuverlässig, wirtschaftlich und berücksichtigt die allgemeinen Verfügbarkeit von gängigen Materialien, Reagenzien und kompetentes Personal. Es wird darauf hingewiesen, jedoch, dass dieses Protokoll eine ganze Menge Wiederholungen pro Gruppe von Tieren (8-12 Wiederholungen vorgeschlagen erfordert), statistisch valide Ergebnisse zu erzielen.
Es wurden zahlreiche Studien und Berichte über Versuche, vaskulären Permeabilität und Plasma Extravasation zu messen. Bei weitem die meisten dieser Berichte detailliert Permutationen von Methoden zusammen mit der Evans-blauer Farbstoff-Methode um zu untersuchen, Plasma Extravasation und vaskulären Permeabilität2,3,6,11, 12,13. Es wurden weniger Berichte der vaskulären Permeabilität Methoden die Evans blau in allen3,13,15,24zu integrieren, nicht; Diese anderen Methoden sind im Allgemeinen weniger zugänglich für das durchschnittliche Labor erfordern komplizierte Methoden, spezielle Ausrüstung und Personal, und sind in der Regel teuer.
Die Entwicklung des Protokolls Evans blau beteiligt, die Prüfung von vielen verschiedenen Permutationen und Modifikationen. Frühe Experimente konzentrierten sich auf Versuche, Evans blau durch die Maus Schweif Vene injizieren. Jedoch Rute Vene Injektionen war technisch anspruchsvoll und führte zu inkonsistenten Ergebnissen, erfordern die Einbeziehung der Halsschlagader Injektionen und terminal Operationstechniken, die oben beschriebenen. Viele Vorversuchen wurden auch fertig versucht, entsprechende Konzentrationen von Evans blau und Substanz p. finden Die genaue Höhe der Evans blau nicht erwies sich zwingend notwendig, solange es unter etwa 200 mg/kg (im Vergleich zu 50 mg/kg derzeit verwendet), aber die Menge der Substanz P in diesen Experimenten verwendeten wichtig war. Nach viel experimentieren, 1 Nmole/kg erwies sich die ideale Konzentration von exogen zusätzliche Substanz P, ein 1,5-facher Vergrößerung der Folge (und somit leichter messbare) Plasma Extravasation Werte. Auch festgestellt wurde, dass ausreichend Zeit für die Evans blau zu equilibrate gelassen werden muss (> 10 min). Durchblutung der Blutgefäße entfernen überschüssige Evans blau, nach Opfer der Maus aber vor der Orgel Isolierung erwies sich ein wesentlicher Bestandteil dieses Protokolls, im Gegensatz zu anderen Protokollen, die nicht diesen Perfusion Schritt4enthalten. Die Perfusat (geliefert von einem sanften Schwerkraft Gradienten) ist 50 mL einer pH 3,5-Lösung (die Bindung von Evans blau und Albumin fördert); Paraformaldehyd, weit verbreitet in vielen anderen Evans blau Protokolle6,10,25, entfällt in diesem Protokoll. Ein weiterer Faktor, der in diesem Protokoll aufgelöst wurde ist, dass der Farbstoff in Doxycyclin Chow verwendet die OD620 nm Messung von Evans blau in Geweben aus dem Verdauungstrakt Track stört. So war es notwendig, ungefärbten Doxycyclin Chow in den oben genannten Experimenten zu verwenden. Außerdem ist eine wichtige und nützliche Erkenntnis, dass fast jedes Organ der Maus zufrieden stellend isoliert und über dieses Protokoll untersucht.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren wollen Andy Poczobutt und Dr. Jori Leszczynski für ihre wertvolle Hilfe und Bearbeitungen dieses Manuskriptes danken. Unterstützt durch Zuschüsse aus den nationalen Herz-, Lungen- und Blood Institute (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 und RO3 HL095439) und das Department of Veterans Affairs (Verdienst Review).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
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