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Immunology and Infection

Avaliação do citotóxicos e efeitos imunomoduladores de substâncias no pulmão humano de precisão de corte fatias

Published: May 9, 2018 doi: 10.3791/57042
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 4, 4, 5, 1,6, 1
1Fraunhofer Institute for Toxicology and Experimental Medicine (ITEM), German Center for Lung Research (DZL), Biomedical Research in Endstage and Obstructive Lung Disease Hannover (BREATH), Member of REBIRTH Cluster of Excellence, 2Institute for Pathology, Hannover Medical School, German Center for Lung Research (DZL), Biomedical Research in Endstage and Obstructive Lung Disease Hannover (BREATH), 3Division of Thoracic and Vascular Surgery, Klinikum Region Hannover (KRH), 4Department of Cardiothoracic, Transplantation and Vascular Surgery (HTTG), Hannover Medical School, German Center for Lung Research (DZL), Biomedical Research in Endstage and Obstructive Lung Disease Hannover (BREATH), 5Institute of Pharmacology and Toxicology, RWTH Aachen University, 6Institute for Immunology, Hannover Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Tendo em conta o princípio dos 3R, modelos respiratórios como alternativas para estudos animais estão evoluindo. Especialmente para a avaliação dos riscos das substâncias respiratórias, há uma falta de ensaios adequados. Aqui, descrevemos o uso de fatias de pulmão humano de precisão de corte para a avaliação de substâncias no ar.

Abstract

Doenças respiratórias em sua ampla diversidade precisam de sistemas de modelo apropriado para compreender os mecanismos subjacentes e permitir o desenvolvimento de novas terapias. Além disso, o registro de novas substâncias requer avaliação de risco adequada com sistemas de testes adequados para evitar o risco de indivíduos sendo prejudicado, por exemplo, no ambiente de trabalho. Essas avaliações de risco são geralmente realizadas em estudos com animais. Tendo em conta o princípio dos 3R e ceticismo público contra as experiências com animais, humanos métodos alternativos, tais como fatias de precisão de corte de pulmão (combustível), têm evoluído. O presente trabalho descreve a técnica ex vivo de PCLS humano para estudar o potencial de imunomoduladores de substâncias de baixo peso molecular, tais como hexachloroplatinate de amónio (HClPt). Medidos os pontos de extremidade incluem viabilidade e inflamação respiratória local, marcado por alterado secreção de citocinas e quimiocinas. Citocinas pró-inflamatórias, fator de necrose de tumor alfa (TNF-α), e alfa da interleucina 1 (IL-1 α) foram significativamente aumentado em PCLS humana após exposição a uma concentração de sub tóxica de HClPt. Mesmo que a técnica de PCLS foi otimizada substancialmente nas últimas décadas, sua aplicabilidade para o teste de imunomodulação ainda está em desenvolvimento. Portanto, os resultados aqui apresentados são preliminares, mesmo que eles mostram o potencial de PCLS humana como uma valiosa ferramenta na investigação respiratória.

Introduction

Doenças respiratórias como a asma alérgica, asma ocupacional, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), enfisema e infecções das vias aéreas superiores e inferiores estão em ascensão e representam um fardo de saúde em todo o mundo1,2. Sistemas de teste adequado são necessários, a fim de identificar alguns dos mecanismos básicos subjacentes a estas doenças, além de desenvolvimento e testes de substâncias adequadas. Pesquisa básica, bem como desenvolvimento de drogas pré-clínicos concentram-se em resultados adquiridos em ensaios em vitro ou na vivo . Estes ensaios, no entanto, têm suas limitações,3. Em primeiro lugar, em vitro ensaios utilizam células humanas que foram isoladas e removidas do tecido adjacente ou órgãos e, portanto, não são mais capazes de interagir com ou ser protegidos por outras células3. Em segundo lugar, os modelos animais muitas vezes não são traduzíveis para os seres humanos devido a diferenças na fisiologia e bioquímica de divergências4. Para minimizar estas limitações e no contexto da 3R (substituição, refinamento, redução) princípio5, novos modelos alternativos estão constantemente evoluindo.

Modelos alternativos de tecido 3D humano, tais como combustível, são um elo entre humanas em vitro e modelos complexos animais na vivo . PCLS refletem a heterogeneidade funcional com todos os tipos de células relevantes presentes no trato respiratório6. Além disso, a técnica PCLS tem a vantagem de preparação pode ser reproduzida de várias fatias finas de espessura precisa de um doador único tecido animal ou humana. Isto permite um controle interno, bem como diferentes concentrações ou drogas a serem testadas.

Desde a primeira introdução de fatias de pulmão humano cheio de ágar em 1994 por Fisher et al . 7 a técnica para fatiar e cultivo do tecido pulmonar foi substancialmente melhorada. Christian Martin et al . melhoraram a essa técnica para outras aplicações químicas e farmacológicas8. Nosso grupo foi introduzido para esta técnica por Christian Martin em 2007. Desde então, ampliou-se a aplicação de PCLS na investigação de testes de respostas funcionais, tais como as vias aéreas9,10 e vasoconstrição11, para imunológicos, farmacológicos12,13, e toxicológicas7 testes em várias espécies em vários laboratórios. Por exemplo, Schlepütz et al 14 investigado respostas das vias aéreas para diferenças de espécie e comparado ativação do neurônio periférico por estimulação de campo elétrico (EFS) ou por capsaicina em camundongos, ratos, cobaias, ovelhas, saguis e seres humanos. Eles encontraram várias espécies que têm padrões distintos, mas diferentes de broncoconstrição mediada por nervo e concluíram que os animais de laboratório comumente utilizados (camundongos e ratos) não reflectem sempre a resposta humana. Para testes de toxicidade pulmonar e reduzir o número de animais, neste contexto, Hess et al 15 previamente validado rato PCLS como alternativa ex vivo para estudos de toxicidade de inalação. Este estudo multicêntrico de pré-validação resultou no desenvolvimento de dois modelos de previsão usando PCLS com resultados promissores.

Além disso, em pesquisa básica, PCLS têm sido utilizados para elucidar o cálcio sinalização16, início respostas alérgicas17e infecção viral respostas18,19. Progresso técnico está em curso e ainda mais avanços estão sendo explorados. Por exemplo, o campo está aumentando o benefício de tecido humano pelo armazenamento e reutilização de tecidos congelados. Rosner et al descreveram uma técnica de congelamento e degelo PCLS murino que preserva a capacidade das vias aéreas de contrato mediante estimulação: portanto, a técnica prolonga a janela de tempo limitado, dentro do qual os tecidos permanecem viáveis e muito mais os ensaios podem ser aplicados ao longo do tempo para o mesmo doador de20. Além destes avanços da pesquisa, Lauenstein et al 21 recentemente investigado a avaliação do risco de vários produtos químicos que podem atuar como potenciais sensitizers para asma ocupacional em PCLS humana.

Asma ocupacional, cujas sintomas são obstrução do fluxo de ar e as vias aéreas hyperresponsiveness, semelhante à asma alérgica, é induzida pela exposição ao alto peso molecular (HMW)22 ou de baixo peso molecular (HBPM) substâncias23 (por exemplo, , compostos de platina) no ambiente de trabalho. Agentes de HBPM têm uma elevado potencial de sensibilização quando formando haptens e vincule a transportadora proteínas21. Registro de novos produtos químicos HMW ou HBPM exige avaliação de riscos em vitro e em vivo sobre seu potencial de sensibilização putativa (EG., OCDE diretriz 429)24. Os testes utilizados para determinar a sensibilização putativa potencial, no entanto, originalmente não foram concebidos para avaliação do risco de sensitizers respiratórias, mas para contatos sensitizers, embora parecia haver uma congruência para um pequeno subconjunto de substâncias25 . O trabalho de Lauenstein et al foi criado como parte do projecto da União Europeia Sens-it-iv, para desenvolver estratégias alternativas de testes para avaliação do risco de contato putativo ou pulmão sensitizers21. Para este projeto, focamos em testar a usabilidade de PCLS humano como uma ferramenta de teste de alternativa. Portanto, um conjunto de pontos de extremidade imunomodulador (por exemplo, viabilidade e citocina secreção) foi selecionado para determinar o potencial irritante ou inflamatório de substâncias químicas, como compostos de HBPM platina. Lauenstein et al . não encontrado nenhum padrão geral que poderia ser aplicado a todas as sensitizers respiratórias; Contudo, seu trabalho desde a Fundação por protocolos recentemente publicado26.

Em resumo, o protocolo aqui apresentado para a preparação e posterior exposição de PCLS humana fornece um método útil para a avaliação do pulmão potencialmente tóxicos e/ou imunomoduladores substâncias que podem estar envolvidas no desenvolvimento de respiratória doenças como a asma ocupacional.

Protocol

Experimentos com PCLS humana devem ser realizados de acordo com O código de ética da associação médica mundial e aprovados pelo Comitê de ética local (as experiências PCLS exemplares mostradas aqui foram aprovadas pelo Comitê de ética local do Hannover Faculdade de medicina; número 2701-2015). Consentimento escrito para a utilização de material de pulmão humano é exigido de todos os pacientes de doador ou seus parentes. Os resultados descritos neste manuscrito foram obtidos com fatias de tecido de doadores de diferentes idades, sexos, história médica e causa da ressecção, embora a maioria do tecido recebido foi de pacientes que sofrem de câncer de pulmão. Só o tecido livre de tumor foi usado para experimentos.

1. Generalidades preparação de PCLS humano e posterior exposição a produtos químicos

Nota: Duas pessoas são necessárias para encher um pulmão. Recomenda-se um registro atualizado de vacinação para hepatite A e B. Os pacientes são selecionados rotineiramente para HCV e HIV antes do transplante de pulmão. Se uma infecção activa com Mycobacterium tuberculosis é diagnosticada ou suspeita, o pulmão deve ser rejeitado. No entanto, todos os tecido pulmonar humano fresco e amostras derivadas dele devem ser tratadas como potencialmente infecciosas e correspondentes medidas de proteção devem ser tomadas (máscaras de filtro de partículas (FFP2), óculos de proteção, luvas) para garantir a segurança do equipe de funcionários. O procedimento leva 60-90 min.

  1. Confirme a integridade do lóbulo do pulmão humano.
    Nota: Uma lágrima na pleura impede enchimento homogêneo do tecido. Pulmão humano material deve ser desde o dia da ressecção. Períodos de armazenamento de cerca de 2 h à temperatura ambiente (RT) antes de enchê-la de agarose no gelo são tolerados. O tecido que usamos no presente protocolo é obtido de pacientes submetidos à ressecção. Não é de pacientes falecidos. Se o tecido foi armazenado no gelo, pré-aquecer a RT antes de preenchê-lo, caso contrário a agarose irá polimerizar-se imediatamente e sem enchimento homogêneo será possível.
    Cuidado: Certifique-se que todas as pessoas em contacto com o material humano nativo vestir roupas protetoras, consistindo de um jaleco, dois pares de luvas, chapéu, máscara facial e um par de óculos de segurança. Material humano é potencialmente infeccioso.
  2. Pesar, 7,5 g de agarose de baixo-coagulação e adicioná-lo a 250 mL de água bi-destilada. Ferva o agarose no microondas até a agarose é dissolvido. Calma, a cerca de 40 ° C, dependendo do ponto de fusão e gelificação do agarose.
    Nota: Vários frascos são necessários, dependendo do tamanho do lobo.
  3. Pré-aquecer e manter o meio de cultura (Tabela de materiais) a 37 ° C.
    Nota: Se a agarose é muito quente, vitaminas em meio de cultura vão perder eficácia e células serão danificadas. Se a temperatura da solução de agarose/médio é inferior a 37 ° C, o processo de coagulação começar e prejudicar o enchimento homogêneo do pulmão. Recomenda-se apenas uma faixa de temperatura de 37 ° C a 39 ° C.
  4. Coloque todos os materiais necessários ao seu alcance antes de começar: 5-10 grampos, cateter flexível de aproximadamente 1 m de comprimento, uma seringa apropriada (por exemplo, 50 mL) encaixe a conexão do cateter, e uma caixa de gelo cheio de gelo.
  5. Canule do brônquio principal/traqueia, inserindo o tubo do silicone e fixando-o com uma pinça orientado paralelo ao tubo, para que a braçadeira aperta o tecido juntos juntamente com o tubo do silicone sem Beliscá-lo fora. Verifique se o tubo do silicone é fixado no interior e não pode escapar durante o processo de enchimento. Feche todos os outros brônquios, vasos sanguíneos e lesões com grampos, para que nenhum agarose pode vazar durante o processo de enchimento.
  6. Misture uma quantidade equivalente de agarose a 3% baixa-coagulação com meio de cultura em um copo. Incutir a mistura para o pulmão, utilizando uma seringa de 50 mL. Antes de voltar a encher a seringa com o meio, braçadeira fecha o cateter com os dedos ou uma pinça para evitar bolhas de ar e refluxo de agarose. Preencha o lóbulo do pulmão até que ele é totalmente inflado. Com cuidado, tocar a pleura do pulmão do lado; a pleura deve ser mesmo e difícil.
    Nota: Dependendo do tamanho do lobo pulmonar, até 2 ou 3 L de solução de agarose/médio pode ser necessária.
  7. Repita as etapas 1.5-1.6 para cada brônquio, no caso de vários brônquios dentro de um único espécime.
  8. Ponha gelo para polimerização da agarose ao gel para 20-40 min, dependendo da quantidade de agarose incutiu o pulmão. Toca com cuidado a pleura em vários lados para verificar se é difícil e legal, indicando que a polimerização é completa, caso contrário, continuar a esperar. Deixe os patologistas irão cortar o pulmão em fatias, tirar suas amostras e armazenar o material de pulmão no gelo para o transporte.
  9. Corte o tecido de pulmão humano em lajes de 3-5cm com uma faca afiada.
    Nota: Use uma lâmina nova para cada pulmão para garantir a nitidez.
  10. Encha o cortador de tecido com solução salina equilibrada de 400 mL gelada Earle (EBSS). Imediatamente cortar núcleos do tecido cilíndrico fora as lajes de pulmão usando uma chave de fenda semi automatizado com uma ferramenta de retirada do dielétrico do diâmetro preferencial (por exemplo, 8mm, 10mm).
    Nota: Este diâmetro deve ser equivalente ao diâmetro do suporte do tecido dentro da máquina.
  11. Ajuste a espessura das fatias de pulmão para o valor da espessura desejada.
    Nota: Uma espessura de cerca de 250 µm é comumente usada em experimentos PCLS. O fabricante do cortador de tecido recomenda seu medidor de espessura de fatia de tecido para verificação da espessura da fatia. Alternativamente, toda a montagem combinada com microscopia confocal a coloração pode ser usada para determinar a espessura da fatia, como descrito por Brismar et al 27
  12. Transferi os núcleos de tecido para o suporte do tecido do cortador de tecido. Coloque o peso (parte do titular do tecido), no topo do núcleo de tecido. Defina a velocidade do braço e velocidade da lâmina para 6 sobre o cortador de tecido. Comece cortando o núcleo de tecido em combustível.
  13. Suplemento de 500 mL de Dulbecco comercialmente disponível modificado águia médio (DMEM): mistura de nutrientes F-12 DMEM/F12 (1:1), com 5 mL de penicilina (10.000 unidades/mL) e estreptomicina (10.000 µ g/mL). Armazene o meio de cultura por vários dias em condições estéreis em um frigorífico. Pré-aquecer somente o volume necessário do meio.
    Nota: A penicilina vai ser inativada se mantido a 37 ° C por períodos mais longos. Utilização livre de soro e tintura meio de cultura, como composição de soro varia de lote para lote e corantes, como o vermelho de fenol, pode interferir com os ensaios.
  14. Encha um prato de Petri (100 x 15 mm) com 25 mL de meio de cultura gelada. Médio deve ser drenado fora o cortador de tecido em um béquer, abrindo o grampo do cilindro de vidro. Transferi as fatias de um copo para a placa de Petri com meio de cultura usando um aplicador (por exemplo, loop de inoculação). Coloque o prato de Petri em uma incubadora (37 ° C, 5% de CO2, 100% de umidade). Permitir que o meio para se aquecer antes de etapas de lavagem.
    Nota: Todos os novos passos são executados sob condições estéreis.
  15. Coloque um coador de célula na caixa de Petri para lavar o combustível. Completamente remover o meio de cultura com uma pipeta de 10 mL serológico através do filtro de célula e adicionar 25 mL de meio fresco pré-aquecido de 37 ° C. Repita este passo 3 - 4 vezes cada 30 min.
    Nota: O filtro célula impede as fatias sendo sugado para a pipeta, para evitar qualquer dano para as fatias.
  16. Transferi com cuidado as fatias de pulmão em uma placa de cultura de 24 poços com um mínimo de 500 µ l do meio de cultura por duas fatias por bem. Expor o tecido do pulmão de substâncias (ver passos 3.1-3.4), por exemplo, por 24 h a 37 ° C, 5% de CO2.
    Nota: Para a transferência, de preferência use um laço do inoculation e deixe o carro de fatias no loop a fim de evitar danos aos tecidos. Não há mais separação das fatias é necessária, como só falta de suficiente meio fresco irá induzir a morte celular em fatias de tecido. Fatias podem se sobrepor ou tocam no poço: isto não tem qualquer influência na viabilidade do tecido.
  17. Colocar todo o material humano residual em um frasco plástico com um fixador (por exemplo, o formol 10% tamponado) pelo menos 24 h e queime isto no processo de eliminação.
    Atenção: O formol é tóxico, execute esta etapa sob um capuz.

2. histológica análise de combustível

  1. Preparar fitas de biópsia com duas almofadas de espuma embebidas em fixador (EG., 4% tamponada formaldeído). Coloque os PCLS entre as almofadas de espuma na gaveta biópsia e transferir imediatamente o tecido na solução fixador. Fix o tecido durante a noite em 4% tamponada formaldeído.
  2. Processe o tecido para parafina incorporação por desidratação amostras em etanol (70%, 90%, 100%, 100%, 100%, 100%) por 1h cada, seguido de lavagem em xileno (3 x 1 h) e parafina líquida (3 x 1 h) conforme protocolos padrão histopatologia.
  3. Transferi o combustível em um molde de encastre. Use um loop de inoculação. Incorpore o tecido PCLS em parafina líquida. Certifique-se de colocar o tecido uniformemente no molde quando a projeção do bloco de parafina.
  4. Corte o bloco de tecido contendo o combustível com um micrótomo rotativo até tem uma superfície plana e mesmo. Leve seriais seções da espessura desejada (ex., 4 µm), colocando individualmente no numeradas consecutivamente corrediças de vidro revestido (geralmente 25-30 seções podem ser tomadas) até o todo PCLS foi processado.
  5. Mancha de lâminas de vidro único (todas as seções de 8-10) com mancha de hematoxilina e eosina (H & E) para orientação. Selecione as seções para o experimento com base nas corrediças de orientação (as primeiras e o últimas 8 seções são geralmente incompletas).
    Nota: (Opcional) para armazenamento prolongado, os slides podem ser mergulhadas em parafina líquida para preservação.

3. preparação de soluções para as substâncias

Nota: Preparar soluções de trabalho e controles imediatamente antes da utilização.

Atenção: Lidar com substâncias de acordo com as instruções de segurança ou, se desconhecida, como potencialmente nocivos e siga as precauções de segurança de rotina.

  1. Dissolva substâncias solúveis em água diretamente em meio de cultura. Para produtos químicos insolúveis ou pouco solúveis, primeiro dissolva a substância em solventes apropriados dependendo da solubilidade da substância. Substâncias com hidrossolubilidade limitada (< 0,1 mg/mL) pode ser dissolvido, por exemplo, em DMSO ou etanol. Concentrações de solventes não-tóxico devem ser determinadas por titulação de antemão. Certifique-se que as substâncias não precipitar fora da solução quando diluído em meio.
    Nota: HClPt e sódio laureth soluções de sulfato de sódio (SLS) estão preparadas.
  2. Preparar a substância soluções estoque no 100-fold da concentração mais alta desejada no meio de cultura ou solvente. Pesa 12,5 mg HClPt e 34,4 mg SLS e preparar as soluções, dissolvendo os produtos químicos em 1 mL de meio de cultura.
    Nota: Nenhum solvente é necessário para estes produtos químicos.
  3. Prepare uma diluição final de 1: 100 em médio pré-aquecido. Em caso de uso prévio de solvente, essa abordagem resulta na mesma concentração final solvente para todas as concentrações da substância.
  4. Use a concentração final de solvente (por exemplo, 1%, como descrito no passo 3.3) para o tratamento de referência de PCLS. Nenhum controle solvente foi exigido para os produtos químicos mencionados na seção resultados.

4. positivas e negativas de referências para os ensaios de citotoxicidade

  1. Para todos os ensaios de viabilidade, prepare os seguintes controles positivos e negativos:
    1. Controle de tecido: incube PCLS em meio de cultura apenas como uma referência para PCLS não tratada por 24 h em condições de cultura celular (37 ° C, 5% de CO2, 100% de umidade).
    2. Controle do veículo (se necessário): incube PCLS com a concentração de solvente final como uma referência para PCLS tratados com veículo somente (consulte a etapa 3.4) por 24 h em condições de cultura celular (37 ° C, 5% de CO2, 100% de umidade).
    3. Controle positivo: incube PCLS com 1% de detergente em solução-tampão para 1 h a 4 ° C.
      Nota: Se PCLS tornar-se incolor, o tecido está morto. Total L-lactato desidrogenase (LDH) é determinado no sobrenadante, com uma absorção de aproximadamente 1,9-2.3 (ver passos 6.1-6.4). O tecido é utilizado para o ensaio de WST-1 (ver etapas 5.1-5.5), com uma absorção de aproximadamente 0.

5. medição da citotoxicidade induzida quimicamente em PCLS humana por WST-1 ensaio

Nota: O ensaio WST-1 é executado em uma placa de 24 com dois motores por bem. De preferência, use duplicatas para cada parâmetro e os resultados dessas duplicatas da piscina após a medição.

  1. Prepare a solução diluindo o reagente WST-1 médio imediatamente antes de começar. A quantidade necessária de solução de trabalho é de 250 µ l/poço de uma placa de 24. Portanto, misture 25 µ l de reagente com 225 µ l do meio de cultura para um poço.
  2. Após a incubação do combustível da etapa 1.16, descarte ou usar o sobrenadante para medições de citocinas ou outros testes, tais como o ensaio da LDH. O tecido remanescente é usado para a próxima etapa.
  3. Pipeta de 250 µ l da concentração do reagente WST-1 por trabalhar bem e incubar a placa a 37 ° C e 5% CO2 por 1 h. Certifique-se de que o combustível é totalmente coberto pelo reagente WST-1 durante a incubação.
  4. Colocar a placa em um agitador orbital (200 rpm) e agitar cuidadosamente durante 30 s para assegurar uma mistura completa do reagente WST-1. Pegue uma nova placa de 96 poços de fundo plano e pipetar 100 µ l em duplicatas do sobrenadante de cada poço da placa de 24 poços.
  5. Medir a absorção de cada poço a 450 nm (referência: 630 nm) usando um leitor de microplacas. Subtrair a absorção em 630 nm de 450 nm. Esses valores serão usados para o cálculo na etapa 5.6).
    Nota: Dados fiáveis para avaliação de citotoxicidade podem ser obtidos apenas tecido viável. Portanto, estes critérios de aceitação publicados por Hess et al 15 devem ser cumpridas em cada experimento. Se estes critérios não forem atendidos, o experimento deve ser repetido.
  6. Absorção do controle médio não tratada deve estar acima de 0,6, caso contrário que o experimento deve ser repetido. Se os dados de satisfazer este requisito, definir o valor de absorção do tecido controle de 100% e calcular a WST-1 redução das amostras tratadas em relação ao controle de tecido.

6. LDH ensaio

Nota: O ensaio LDH é executado em uma placa de 96 poços com 100 cultura µ l sobrenadante no total após o período pós-incubação.

  1. Após a incubação do combustível com ou sem os agentes de teste, tomar 50 µ l do sobrenadante da etapa 1.16 e transferi-lo em duplicatas para uma nova placa de 96 poços. Isso gera duplicatas de cada tratado bem de uma placa de 24.
  2. Prepare a solução de trabalho de reagente LDH imediatamente antes do ensaio. A solução consiste na solução de catalisador (liofilizado dissolvido em água bidestilada de 1 mL) e tingir a solução fornecida pelo fabricante. Para uma placa de 96 poços, misture 125 µ l de solução de catalisador com 6,25 mL da solução de corante.
    Cuidado: Não exponha a solução para direcionar a luz.
  3. Pipetar 50 µ l da solução de trabalho em cada bem já contendo 50 µ l do sobrenadante e incubar a placa por 20 min no RT no escuro. Mistura não mais é necessária.
  4. Medir a absorção de cada poço em 492 nm (referência: 630 nm) usando um leitor de microplacas. Subtrair a absorção em 630 nm de 492 nm. Esses valores serão usados para o cálculo na etapa 6.5.
    Nota: Dados fiáveis para avaliação de citotoxicidade podem ser obtidos apenas tecido viável. Absorção do controle tratados com detergente deve ser superior a 1.
  5. Para análise, defina o valor de absorção do controlo positivo da etapa 4.1 como 100% e calcular a liberação LDH em amostras tratadas em relação ao controlo positivo (ou seja, máxima liberação LDH).

7. microscópico ensaio da viabilidade com Confocal microscópio de varredura Laser (cLSM)

Nota: Para o ensaio de viabilidade microscópicas, dois do combustível normal de 250 µm de espessura estão manchadas em 250 µ l/poço de uma placa de 24. Como cada fatia é fotografada separadamente, não mais duplicatas são necessárias.

  1. Após a incubação de PCLS com ou sem itens de teste, descartar o sobrenadante ou usá-lo para medições de citocinas ou outros testes, tais como o ensaio da LDH. Use o tecido restante para o procedimento descrito aqui.
  2. Prepare o trabalho diluição de calceína-AM e ethidium homodímero 1 (EthD-1) com uma concentração de trabalho de ambos os reagentes de 4 µM em meio de cultura. Para este efeito, adicione 1 µ l de calceína-AM (4 mM) e 2 µ l de EthD-1 (2 mM) ao meio de cultura 997 µ l. Este volume é necessário para manchar 4 poços com dois PCLS cada.
    Nota: Evite a exposição dos reagentes para direcionar a luz.
  3. Pipeta de 250 µ l da diluição em cada trabalho bem e incubar a placa de 24 por 45 min em RT no escuro. Coloque a placa em um agitador orbital a 150 rpm, durante a incubação para garantir a melhor exposição do tecido para a solução de coloração.
  4. Depois de 45 min, descartar a solução de coloração e lavar o combustível com 1 mL de solução de reserva através de agitação a 150 rpm durante 3-5 min à RT no escuro. Repita duas vezes.
  5. Aplica 500 µ l de solução-tampão para cada poço contendo o PCLS manchada para evitar autofluorescência de meio de cultura. Para avaliação microscópica, realize pelo menos dois z-pilhas distribuídos aleatoriamente com um cLSM.
  6. Clique na aba Ocular para escolher um 10 X / 0,3 objectivo e clique em on-line para usar o cLSM como um microscópio de luz padrão para encontrar a superfície do combustível. Clique em Offline para sair a configuração ocular.
  7. Clique na guia de aquisição e ligue os lasers apropriados para o fluorophores.
    Nota: Nós usamos um laser de argônio com comprimento de onda de 488 nm para a polyanionic tintura calceína (comprimento de onda de excitação de 495 nm) e um laser aqui vai com um comprimento de onda de 543 nm para a deteção do complexo EthD-1/DNA (comprimento de onda de excitação de 533 nm). O laser de argônio geralmente deve ser executado em 30-50% da corrente máxima para permitir uma corrente de tubo de cerca de 5,7 A, como isto prolonga a vida útil do laser significativamente.
  8. Clique em Caminho de luz sob a guia de aquisição e configurar os filtros necessários e espelhos para o experimento.
    Nota: No presente estudo, um sistema baseado em filtro foi usado com um divisor de feixe principal dicroicas (EG., HFT 488/543) separando a excitação e emissão de luz. Através de um espelho refletindo que esta luz é direcionada para o divisor de feixe dicroicas secundário (por exemplo, 545 NFT) para mais separar a luz emitida da amostra em dois canais.
  9. Configurar banda passar filtros (por exemplo, BP 505-530 para o sinal de calceína e BP 560-615 para o sinal de complexo de DNA/EthD-1) que transmitem apenas um determinado intervalo de comprimentos de onda e atribuir o sinal de calceína ao canal 2 e o sinal de complexo de DNA/EthD-1 para o canal 3.
  10. Marque a caixa de Z-pilhas para definir os limites superiores e inferiores para o volume microscópico. Pressione o botão ao vivo para ver uma exibição ao vivo da camada correspondente na tela. Mova o foco de cima ou para baixo para encontrar a superfície do combustível com um sinal forte.
  11. Clique sobre a subseção de canais e marque a caixa Mostrar todos. Fechar a tabela pressionando o botão do canal correspondente sob a imagem ao vivo e ativar o canal de cor.
    Nota: A cor azul na imagem ao vivo irá indicar que não há nenhum sinal, Considerando que um sinal elevado aparecerá em branco e um sinal superexposto aparecerão em vermelho.
  12. Definir o pinhole para o canal vermelho de EthD-1 para 1 unidade arejada para o melhor trade-off entre eficiência de coleta de luz e seccionamento óptico e ajustar de acordo com o canal de calceína. Aumente o sinal detectado do ganho tal que parece branca, mas não com a imagem ao vivo com tabela de bloqueio ativado canal cor vermelho.
    Nota: O ganho de mestre não deve exceder 600 unidades.
  13. Aumentar ou diminuir o deslocamento digital para ajustar o plano de fundo, tal que aparece em azul na imagem ao vivo com tabela de bloqueio de cor canal ativado.
  14. Clique na guia Z-pilha em aquisição Multidimensional e usar o foco mudar para uma z-camada de interesse. Pressione Definir primeiro salvar esta posição para posterior aquisição. Deslocar lentamente o foco cima ou para baixo até um intervalo de 30 µm foi alcançado e pressione Definir ontem para salvar.
  15. Clique em Live novamente para desativar a imagem ao vivo e clique em Começar a experiência para iniciar a geração de imagens.
    Nota: O tecido viável é detectado através da fluorescência de calceína de corante a polyanionic. As células mortas são discriminadas pela formação do complexo de EthD-1 e ácidos nucleicos.

8. processamento de imagem

Nota: A recomendação do computador do software de renderização de imagem deve ter em conta, como este programa requer o hardware adequado.

  1. Carrega o arquivo LSM adquirido de viabilidade microscópica manchas de combustível (veja seção 7) no software de processamento de imagem. Salve-o como arquivo de .ims antes de prosseguir. Definir todos os parâmetros no Controlarar de tecido e aplicar estas a todas as imagens. Nenhuma outra alteração é permitidas.
  2. Use o botão de Volume para reconstrução da superfície do tecido viável (coloração de calceína) (Figura complementar 1A) e o botão de pontos para o núcleo de células mortas (Figura complementar 1 H). Durante a renderização de um canal, desligar o outro canal na janela de ajuste de exposição.
  3. Começar pelo volume de tecido vital de renderização: definir o canal da superfície, processar a imagem inteira, definir o fator de suave a 0,5 µm e usar intensidade absoluta de threshold (complementar a figura 1B, C). Pressione a seta azul para a frente.
  4. Ajustar o limiar de intensidade absoluta do volume reconstruído; intensidade de ruído e de fundo deve ser subtraída. Sobreposição de superfície é mostrada em cinza e a precisão de cobertura de superfície deve ser verificado (complementar a Figura 1). Depois de concluir o ajuste, pressione a seta azul para a frente. Na maioria das vezes esta etapa é necessária para o cálculo das configurações. Se o software não é capaz de calcular o volume, aumente o fator liso.
  5. Na última etapa, escolha um filtro. Use o filtro de esfericidade (com aproximadamente 10 µm) para processamento de superfície para filtrar os macrófagos no espaço alveolar (complementar figura 1E). Pressione o botão verde para a frente.
  6. Opticamente, ajustar a imagem de saída e estatísticas de exportação como arquivos. xls. O volume total (soma) será usado para posterior análise (Figura complementar 1F, G). Salvar as configurações e usá-los para todas as novas análises sobre z-pilhas tiradas no mesmo dia, com as mesmas configurações de cLSM (Figura complementar 1I).
  7. Reconstrua o canal vermelho (pontos) para o núcleo de células mortas. Aleatoriamente, medir o tamanho de ponto em µm dimensionamento na janela surpass; tamanho do ponto é aproximadamente de 5 µm. Mark Enable e definir o tamanho de ponto. Verificar se todos os pontos são marcados e cada ponto é contado apenas uma vez. Corrigi manualmente, se necessário (complementar a figura 1B, H, J). Pressione a seta azul para a frente.
  8. Pressione o botão verde para a frente para deixar o programa calcular/contagem o número total de pontos de acordo com os parâmetros definidos e exportar o resultado como arquivo. xls (Figura complementar 1 K, L, M). Para análise estatística ou gráfica da imagem, definir o número de núcleos de célula morta calculada em relação ao volume de tecido vital.

9. medição de citocinas e quimiocinas na PCLS humana

Nota: A resposta imune de citocinas e chemokine podem ser medida extracelularmente no sobrenadante de cultura e intracelular em tecidos lysates após o tempo de incubação. ELISA é medida em duplicatas em uma placa de 96 poços com 100 µ l/poço.

  1. Prepare uma solução de 1% de detergente misturando-se 5 mL de detergente com 495 mL da solução-tampão. A solução pode ser armazenada em RT durante vários meses.
  2. Misture a solução de detergente de 1% com inibidor de protease (PI) na proporção de 1: 500. A quantidade necessária depende da placa de cultura; por exemplo, use 500 µ l/poço para uma placa de 24. Para um bem, misture 1 µ l de PI com 499 µ l de solução de detergente.
  3. Prepare os tubos com 1 µ l de solução de PI e coletar 500 µ l do sobrenadante nesses tubos de cultura. Substitua imediatamente o médio na placa de 24 por solução de detergente de 500 µ l contendo PI como preparado na etapa 9.2. Lyse tecido por 1h, colocando a placa em 24 a 4 ° C. Pipetar o lisado em um novo tubo de tecido e armazenar esses tubos a-80 ° C até posterior análise.
    Nota: O protocolo de ELISA altamente depende do fabricante e as instruções do fabricante devem ser seguidas. Um protocolo padrão de ELISA é descrito a seguir.
  4. Realize o teste de ELISA para medir os níveis de citocinas no sobrenadante ou lisado de acordo com as instruções do fabricante. Para medir a IL-1 α e TNF-α, casaco a96 placa por pipetagem 100 µ l de captura anticorpo (para diluição siga as instruções do fabricante) e incubar durante a noite a RT
  5. Prepare o tampão de lavagem pela dissolução de um comprimido de tampão de lavagem em 1 L água bidestilada. Retire o anticorpo captura e tampão de lavagem pipeta 400 µ l em cada poço. Substitua este volume três vezes. Bloquear o prato adicionando a solução de bloqueio (por exemplo, 1% de BSA em solução-tampão, de acordo com as instruções do fabricante). Incube a RT por 1h.
    Nota: ELISA comercialmente disponível padrão exige 2 x 100 µ l de tecido sobrenadante ou lisado. As amostras devem ser descongeladas uma vez e apenas antes da utilização. Dependendo da sensibilidade do ensaio e sobre o cytokine lançado, as amostras devem ser diluídas antes da medição. Portanto, dilua a amostra no reagente fornecida pelo ensaio.
  6. Remover a solução de bloqueio e de adicionar amostras diluídas para a curva padrão (para diluição siga as instruções do fabricante) e 100 µ l do sobrenadante de tecido ou 100 µ l de tecido lisado em duplicatas coletadas no passo 9.3. Incubar durante 2 h em RT.
  7. Remova as amostras e o tampão de lavagem pipeta 400 µ l em cada poço. Substitua este volume três vezes. Pipetar 100 µ l deteção biotinilado (para diluição siga as instruções do fabricante) e incube por 2 h no RT
  8. Retire o anticorpo e o tampão de lavagem pipeta 400 µ l em cada poço. Substitua este volume três vezes. Adicionar 100 µ l/poço de streptavidin HRP-rotulado (para diluição siga as instruções do fabricante) e incube por 20 min no RT (verifique as instruções do fabricante).
  9. Retire o streptavidin e tampão de lavagem pipeta 400 µ l em cada poço. Substitua este volume três vezes.
  10. Adicione 100 µ l do substrato (recomendado pelo fabricante) e incube por 20 min no escuro (verifique as instruções do fabricante).
    Nota: Este passo é sensível à luz. Evite a exposição à luz do substrato e da placa.
  11. Pare a reação adicionando solução de paragem 50 µ l (1 M H2SO4). Medir a absorção de cada poço a 450 nm (referência: 570 nm) usando um leitor de microplacas. Subtrair a absorção em 570 nm de 450 nm.
    Nota: Não tratada e/ou controles de tecido veículo servem como controles negativos. Para induzir uma resposta imune no tecido pulmonar, use estimulação apropriada (por exemplo, 100 lipopolissacarídeo ng/mL (LPS)) como controle positivo. Incubar a dois poços com dois CLPS por alvéolo com 100 LPS ng/mL em meio de cultura, por exemplo, durante 24h e recolher o sobrenadante e tecido lisado conforme descrito no passo 9.3.
    Nota: Os resultados das medições são aceitas, se a absorção do mais alto padrão for igual ou superior a 1,0; caso contrário, a medição precisa de ser repetido. A curva padrão deve seguir o encaixe de curva sigmoidal dose-resposta.
  12. Concentrações de citocinas (pg) determinadas pelo ELISA na etapa 9.11 são normalizadas para o teor de proteínas total determinada no tecido lisado de cada amostra (ver seção 10).

10. a medição do teor de proteínas totais em PCLS humana

Nota: O combustível precisa ser lysed para medir a concentração de proteínas totais. Os lysates do tecido da etapa 9.3 são usados para esta etapa. O ensaio é realizado em uma placa de 96 poços plana com 25 µ l/poço de tecido lisado, pipetado em duplicatas.

  1. Prepare-se um padrão de BSA de 7 pontos com concentrações de BSA de 2.000 µ g/mL, 1.500 µ g/mL, 1.000 µ g/mL, 750 µ g/mL, 500 µ g/mL, 250 µ g/mL e 125 µ g/mL. Aplicar 25 µ l em duplicatas para cada padrão e usar a solução-tampão de 25 µ l como um espaço em branco em uma placa de 96 poços (use um prato com uma tampa da placa).
  2. Pipetar 25 µ l dos lysates (ver passo 9.3) de cada poço em duplicatas em uma placa de 96 poços. No total, 50 µ l de cada um, bem, é necessário. Preparar o reagente de trabalho da solução BCA por diluição BCA Reagente B 01:50 no reagente BCA A. Para uma placa de 96 poços usar 400 µ l de Reagente B e 20.000 µ l de reagente de A.
  3. Cuidadosamente Pipetar 200 µ l de reagente de trabalho em cada poço, evitando bolhas de ar. Coloque a placa em um agitador orbital (150 rpm) por 30 s para garantir a mistura adequada de lisados e reagente de trabalho e coloque uma tampa da placa no prato. Incube a placa a 37 ° C por 30 min no escuro. Medir a absorção de cada poço a 540-590 nm, usando um leitor de microplacas.
    Nota: Os resultados de medição são aceitas, se a absorção do mais alto padrão de BSA é igual ou superior a 0,8; caso contrário, a medição precisa de ser repetido. A curva padrão deve seguir o encaixe de curva sigmoidal dose-resposta.
  4. Para análise, calcule a curva de calibração usando uma equação de Marquardt 4-parâmetro após subtracção do branco. Calcule as concentrações de proteína das amostras desconhecidas usando a curva padrão.

Representative Results

Com o presente método de pesquisa, PCLS humanas foram preparados e expostos a cinco concentrações de substâncias industriais para avaliar efeitos imunomoduladores quimicamente induzida no material de pulmão humano. Tecido pulmonar foi exposto em condições submersas como cultura permanente por 24 h. toxicidade foi avaliada pela medição do LDH liberada, atividade mitocondrial e viabilidade microscópica de coloração. Além disso, o teor de proteínas totais para normalização e citocinas pró-inflamatórias foram medidos. Sempre que possível, 75 valores de concentração inibitória (IC) foram calculados pelo encaixe de curva sigmoidal não-linear. As substâncias de referência positiva, detergentes para citotoxicidade e LPS para a resposta inata cytokine, foram usadas para validação de cada execução. O IC75 transformados logaritmicamente [µM] valores (log de IC50) foram usados como "irritantes" concentrações para medições de liberação de citocinas subsequentes.

Figura 1 e Figura 2 mostram o procedimento de encher o pulmão humano material e exemplar H & E mancha de PCLS humana. Procedimentos rotineiros de higiene devem ser seguidas para evitar efeitos adversos sobre a saúde e garantir a segurança do pessoal de lidar com o material de pulmão humano. A técnica exige treinamento de pessoal e prática. Experientes patologistas que distinguem várias regiões (superior/inferior lóbulos e subpleurais contra mais central) e doentes contra áreas saudáveis são necessários para avaliar o estado patológico do material humano do pulmão. O combustível humano gerado deve ser usado para a preparação de H & seções finas E manchas, que podem ser re-avaliadas por um patologista. Esse procedimento ajuda os usuários a ganhar prática em discriminar diferentes áreas doentes e locais dentro dos pulmões.

A Figura 3 apresenta os resultados de medição para a atividade LDH e WST-1 em PCLS humano após incubação de 24h com SLS. O controle não tratado médio sem SLS, mostrado a 0 µ g/mL SLS, é um importante controle de qualidade. Valores devem ser inferiores a 20% para LDH comparado com detergente-lysed tecido e > 0,7 unidades de absorvância para o ensaio de WST-1. Esses controles de qualidade também servir como indicadores de viabilidade do tecido insuficiente. Capacidade de resposta do tecido humano para a solução de detergente, como substância tóxica eficaz, deve ser incluída como controle positivo. Isso deve resultar em um aumento de 300-500% (> 2,0 unidades de absorvância) de LDH em comparação com tecidos não tratados e em valores < 0,1 unidades de absorvância para o ensaio de WST-1. SLS resultou em uma redução dose-dependente da viabilidade celular, medida pelo aumento da LDH e diminuição da atividade metabólica no WST-1 ensaio em concentrações > 87 µ g/mL. Um modelo de concentração-resposta sigmoide foi montado para os dados, para que seja possível calcular valores IC75 ou IC50. Esses valores posteriormente podem ser usados para selecionar as concentrações para níveis de citocinas e chemokine: em concentrações altamente tóxicas, geralmente não ou apenas a diminuição de citocinas e quimiocinas podem ser detectadas. Portanto, não-tóxico ou apenas ligeiramente tóxicas concentrações (IC75) são recomendadas. É importante notar aqui que o aumento esperado da atividade LDH no sobrenadante de cultura de pilha é muitas vezes influenciado pela substância aplicada21. Frequentemente, as interferências ocorrem entre a atividade de substância e a enzima, levando a erros de interpretação dos resultados se o ensaio LDH foi o ensaio de citotoxicidade única usado. Assim, é importante e necessário realizar diversos ensaios de citotoxicidade para obter resultados fiáveis e válidos. Além disso, deve ser mencionado que a sensibilidade dos ensaios LDH e WST-1 é altamente comparável.

Na Figura 4, imagens microscópicas viabilidade de PCLS demonstram capacidade de resposta do tecido humano para detergente como substância tóxica eficaz. Os resultados são muito úteis para confirmar outros dados de viabilidade, mas isso requer equipamento adicional. Efeitos tóxicos são avaliados visualmente pela avaliação do tecido de calceína-positivo em relação ao núcleo de células EthD-1-positivo. Segmentos escolhidos aleatoriamente dentro parênquima geralmente resultam em dados comparáveis, Considerando que vias aéreas ou vasos sanguíneos devem ser evitados, como cavidades maiores podem mudar os resultados. De nossa experiência e com as configurações microscópicas descritas acima, um volume entre 1,5 x 106 e 5 x 106 µm3 do tecido controle é medido. Os valores dependem de qualidade material de pulmão, a qualidade do combustível e também sobre a doença da doação de tecido de pulmão. Mesmo que a viabilidade do tecido pulmonar humano varia entre os doadores, o número de núcleos de células mortas, comparado com tecido viável não deve exceder 15% do controle do tecido. Se o núcleo de células mortas é predominantemente presente no controle de tecido, no entanto, o experimento deve ser abandonado.

A Figura 5 exibe dados representativos para o efeito imunomodulador de HClPt e SLS no tecido de pulmão humano. As citocinas pró-inflamatórias IL-1 α e TNF-α são biomarcadores de inflamação, indicando o início do processo inflamatório após a exposição ao estímulo de substâncias. Ambas as citocinas foram medidas por ELISA. Extracelular de IL-1 α é geralmente baixa em PCLS humana, Considerando que a IL-1 α intracelular atinge níveis de 1.000 pg/mL e acima. Uma diminuição intracelular de IL-1 α indica processos citotóxicos em curso - e principalmente é observada após exposição de PCLS humana a substâncias químicas. Se o tecido é estimulado com LPS, um ativador do sistema imunológico inato e como tal o tratamento positivo controlar, então a maior parte da IL-1 α induzido só pode ser detectado intracelular após 24 h. Em contraste, a secreção de TNF-α induzida pela estimulação de LPS pode principalmente ser medida extracelularmente. O uso de um adequado controlo positivo, tais como LPS, demonstra a validade de um método. Com o presente método de pesquisa, PCLS humanas foram expostos a três concentrações de HClPt (32, 64 e 125 µ g/mL) ou duas concentrações de SLS (1 e 10 µ g/mL) por 24 h. Cytokine secreção foi determinada como uma soma das citocinas extracelulares e intracelulares normalizados para as concentrações de proteína total, conforme representado na Figura 5. Vale ressaltar aqui que o ensaio BCA é geralmente utilizado para a determinação do teor de proteína total, no entanto, ele também reflete citotoxicidade induzida por substância. Daí, em concentrações altamente tóxicas o conteúdo de proteína total não pode ser usado para normalização dos dados de citocina. Secreção de IL-1 α aumentou significativamente de 263 ± 38 pg/mg para 887 ± 216 pg/mg e de TNF-α de 263 ± 38 pg/mg para 1.160 ± 286 pg/mg (Figura 5A, B). Além disso, a secreção de IL-1 α e TNF-α induzida por LPS é apresentada em comparação com um controle de tecido unstimulated. Indução de citocinas pró-inflamatórias por padrões moleculares associados patógeno, tais como LPS, demonstra a validade de um método e é altamente recomendada para ser usado quando estiver trabalhando com PCLS humana investigar efeitos imunomoduladores. Para mais detalhes sobre os dados HClPt e SLS, refira por favor o estudo por Lauenstein et al 21

Figure 1
Figura 1 : Procedimento para pulmão humano material de enchimento. O pulmão humano é preparado imediatamente após a ressecção. O pulmão deve ser armazenado em temperatura ambiente para recheio consistente com agarose e para evitar a polimerização de agarose repentina durante o enchimento. O pulmão é posicionado horizontalmente, com os lóbulos espalhar-se para uma visão óptima do brônquio principal ou brônquios (A e B para closeup no brônquio). Os brônquios são canulados com um tubo flexível de silicone e fixados com braçadeiras (C). Após o enchimento procedimento e agarose polimerização no tecido, patologistas treinados o pulmão cortar fatias de sobre 3-5 cm de espessura (D). Destas fatias núcleos do tecido cilíndrico (Ø p. ex., 8 mm) são preparados com uma ferramenta de retirada do dielétrico (E). Estes núcleos de tecido são cortados com um cortador de tecido em combustível, que é imediatamente transferidos para meio-cheio de pratos de Petri para incubação em condições de cultura celular normal (E). Depois de várias etapas de lavagem a PCLS são transferidas para placas de cultura de células (por exemplo, placa de 24 com dois motores por bem e 500 µ l meio) para remover os restos de célula residual e mediadores celulares lançado (F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Determinação do estado de saúde de PCLS humana pela coloração H & E. O combustível nesta imagem, preparado a partir de um doador com um tumor de pulmão, mostra do tecido pulmonar intacto com parênquima alveolar, periférica airways (*) e os vasos sanguíneos (setas) no (A) visão geral. A maior ampliação, conduzindo a vias aéreas com epitélio respiratório ciliado intacto (setas) (B), uma estrutura alveolar intacta forrado com pneumócitos viáveis, incluindo um capilar com numerosas hemácias (setas) (C), espaços alveolares contendo macrófagos alveolares (CD68 imuno-histoquímica) (D), bem como os vasos sanguíneos com endotélio intacto (CD31 imuno-histoquímica) (E) pode ser observada. Só o tecido livre de tumor foi usado para o combustível, é por isso que não há áreas macroscopicamente doentes são visíveis. Em contraste com PCLS preparados a partir de doadores com outras doenças pulmonares, como enfisema ou fibrose, a estrutura alveolar não é interrompida e o combustível é apenas ligeiramente desfiado na fronteira externa, provavelmente devido as etapas de preparação. Escala barras indicam (A) de 1.000 µm e 50 µm (B–E), respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Determinação da citotoxicidade induzida pelo SLS em PCLS humano, medido pelo vazamento da enzima LDH em meio de cultura (A) e perda da atividade da enzima metabólica avaliada com o corante WST-1 (B). PCLS humanas foram expostas a concentrações crescentes de SLS. Um modelo de concentração-resposta sigmoide posteriormente foi montado para os dados, para que os valores IC75 ou IC50 (concentração inibitória na redução de 25% e 50% de viabilidade celular) podem ser calculadas (figuras certa). Os dados são apresentados como média ± SEM, n = 3-5. Absorvância do ensaio LDH foi medida em 492 nm (referência em 630 nm) e do ensaio WST-1 a 450 nm (referência em 630 nm). Os dados foram adaptados e modificados de Lauenstein et al 21 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Imagens representativas da tridimensional microscópica prestação manchando e imagem da humana PCLS. Tecido vivo controle e capacidade de resposta do tecido ao detergente, como substância tóxica eficaz, são mostrados após coloração de PCLS humana com calceína AM (amarelo) e EthD-1 (vermelhos). Pilhas de 30 µm foram tiradas com um objectivo de X 10 (A) e processadas (B). Barra de escala indica 100 µm. excitação comprimentos de onda 488 nm e 543 nm, emissão filtros BP 505-550 nm e LP 560 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Hexachloroplatinate de amónio (HClPt)-induzido a secreção de IL-1 α e TNF-α no PCLS humana após exposição de 24 h. PCLS foram expostas a concentrações de três (125 µ g/mL de HClPt, 64 µ g/mL e 32 µ g/mL) e duas concentrações diferentes (1 µ g/mL e 10 µ g/mL) de SLS. Extracelular e intracelular, IL-1 α (A) e (B) de TNF-α foram determinados por ELISA e normalizada para o teor de proteínas totais. Para mostrar a validade do método um positivo ativador do sistema imunológico inato, LPS, é mostrado como uma referência para o intracelular IL-1 α (A) e para a liberação de TNF-α (B) extracelular, normalizado para o teor de proteínas totais. Os dados são apresentados como média ± SEM, *p < 0,05 e * * *p < 0,001; HClPt e SLS: n = 9, IL-1 αLPS: n = 5, TNF-αLPS: n = 4 em duplicatas técnicas (teste de Mann-Whitney). Esta figura foi modificada de Lauenstein et al 21 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Supplementary Figure 1
Complementar Figura 1: detalhado processamento computacional para imagens de viabilidade microscópica coloração usando software de renderização. Passo a passo procedimento operacional para análise de imagem de imagens carregadas de LSM para processamento de superfície de tecido viável manchadas de calceína (A–G, eu) e detecção local de núcleos de células manchadas homodímero ethidium (H, J–M). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Supplementary Figure 2
Complementar Figura 2: visão geral de análise de imagem computacional de viabilidade microscópica coloração do tecido pulmonar humano. Tecido viável (amarelo) foi analisado pelo processamento de superfície (B–eu) e núcleo de células mortas (vermelho) foram detectado por detecção pontual (J–P). O modo de instantâneo foi usado para exportar a imagem (Q). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A técnica PCLS humana está bem estabelecida no nosso laboratório. O presente trabalho dá uma descrição da técnica e o seu uso para testar a toxicidade de substâncias em pulmão tecido ex vivo. Em geral, qualquer laboratório usando que esta técnica deve procurar criar um ensaio relacionados a definição de intervalos quantificáveis, estimativa de variabilidades e controles de qualidade, garantindo a validade do experimento. Possíveis procedimentos padrão poderiam ser, por exemplo, repetir a cada ponto de extremidade, por exemplo, o ensaio de citotoxicidade, num mínimo de três doadores biológicos (corridas individuais) com um mínimo de duas a três repetições técnicas por exemplo incluindo positivo e referências negativas. Pessoal de laboratório deve ser treinado para aumentar a consistência de ensaio e minimizar a variabilidade do ensaio.

Pontos de extremidade, frequentemente usados para avaliar efeitos imunomoduladores de substâncias no tecido pulmonar incluem citotoxicidade as medições utilizando ensaios diferentes (por exemplo, ensaio LDH, WST-1 ensaio, microscópico de coloração do ensaio), ensaios de liberação de citocinas, bem como mudanças no perfil de expressão e caracterização de alterações nas populações celulares por métodos de immunohistopathological6. Além disso, existem técnicas descrevendo a visualização das células, como células dendríticas pulmonares, em murino PCLS28 que também pode ser transferido para PCLS humana e, portanto, pode fornecer um insight mais detalhada sobre a composição celular antes e após o tratamento com substâncias citotóxicas putativos.

Este protocolo básico e técnica para a preparação de cortes de tecido de pulmão humano é comparável a técnicas que têm sido bem descritas em publicações29. Em suma, o material do órgão é obtido a partir de pacientes que sofrem de viver em risco de doenças crônicas como câncer de pulmão, que têm de se submeter à cirurgia para ressecção ou transplante. Os estudos devem ser aprovados pelo Comitê de ética local. Consentimento informado por escrito dos pacientes é necessário. Criação de um fluxo de trabalho entre a clínica e laboratorial é uma questão crítica e requer comunicação e definição de interfaces e infra-estrutura entre os dois locais. Material de pulmão humano tem que ser processados diretamente após a ressecção de preservar a viabilidade do tecido. Vale ressaltar que a técnica descrita aqui para PCLS humana pode ser aplicada para jovens e velhos pulmões e pulmões saudáveis e doentes. Nos EUA, por exemplo, é possível obter os pulmões de doadores de órgãos saudáveis que morreram em acidentes ou foram rejeitados cujos órgãos para transplante.

O primeiro passo crítico no protocolo é a inflação das vias aéreas e parênquima circundante com solução de agarose. Essa etapa é necessária para solidificar o tecido muito macio para o procedimento de corte posterior. A qualidade do material do pulmão humano, com base no plano de fundo de doença, é fundamental aqui. Só lóbulos com pleura intacta podem ser preenchidos. Tumores de estágio final perto do brônquio, por vezes, impedir o processo de enchimento. Antes de inflar o material humano, a temperatura da solução de agarose tem de ser cuidadosamente verificado. Muito sangue (ou outros líquidos, exsudatos) dentro do ser humano tecido pulmonar irá resultar em indesejável diluição de agarose e irá influenciar o processo de polimerização. Após a insuflação do tecido pulmonar e a coagulação de agarose no gelo, os pulmões são cortados em seções de 200 a 300 µm de espessura. Consistência do tecido é um problema muito crítico. Se o tecido estiver muito mole, corte de secções iguais é difícil. Mesmo se o micrótomo mesmo parâmetros são definidos para cada doador, a espessura das fatias entre doadores pode variar, devido ao indivíduo condições e mudanças durante a inflar de processo para cada pulmão. Enchimento não homogênea do tecido resultará em fatia de diferentes espessuras. Em vez de medir e padronizar a espessura das fatias, medição do teor de proteína total pode ser usada para monitorar indiretamente espessuras de fatia de pulmão. Várias doenças da fase final dificultam o processo de corte; por exemplo, navios são extremamente engrossados no tecido fibrótico e hipertensão pulmonar o sangue pode ser tão duro que corte dos cilindros de tecido é quase impossível e a lâmina do micrótomo precisa ser substituído muitas vezes.

Após a preparação do humano PCLS e intensivo de etapas de lavagem, que são necessárias para remover os resíduos de célula e lançado enzimas, tecido seções podem ser usadas para experimentos29. PCLS humanas são cultivadas em condições de cultura celular normal e expostos, por exemplo, produtos químicos, drogas ou lipopolissacarídeos. Contaminação ocasional de PCLS devido a infecções (desconhecidas) é uma edição especial na cultura de material de pulmão humano. Culturas de tecidos, apresentando infecções deve ser descartadas e o equipamento deve ser desinfectado cuidadosamente. Por outro lado, separação espacial entre os lugares de laboratório usados para a preparação de um lado e cultivo pode ajudar a evitar infecções-Cruz. No que diz respeito o equipamentos, o micrótomo pode vazar, e solta parafusos hexadecimais podem originar danos ao motor e parada do movimento da lâmina. Não todas as partes da segmentação de dados é feita de aço inoxidável, e então oxida se não secou imediatamente alterar a limpeza. Para superar problemas de equipamento, pode ser necessário ter pelo menos um dispositivo de backup.

Em publicações anteriores, agarose foi relatado para ser lavada e removido durante o intensivo de etapas de lavagem após a preparação. Na verdade, isso não é possível, não pode ser removido da agarose. Para a remoção completa da agarose, precisa ser re-derretido em altas temperaturas, que iria destruir o tecido. A agarose em alvéolos e vias aéreas não interfere com os pontos de extremidade descritos. Outros pontos de extremidade podem ser influenciados pela presença de agarose (Veja também limitações). A necessidade de preparar as secções de tecido muito fresco tem que ser enfatizado, como viabilidade de tecido é uma questão crítica na cultura. Broncoconstrição não é um parâmetro válido para viabilidade. Recomendamos o uso de pelo menos dois ou três ensaios de citotoxicidade independente para verificar a viabilidade do parênquima circundante; Isto tem que ser verificado em cada experimento,30. Controles de qualidade em ensaios de citotoxicidade servir como indicadores de viabilidade do tecido insuficiente. Portanto, é recomendável para avaliar a capacidade de resposta do tecido, por exemplo, para uma substância tóxica eficaz como um detergente em todos os ensaios de citotoxicidade. Com base em curvas dose-resposta, valores mínimos e máximos de absorção devem ser definidos para os ensaios de citotoxicidade e reuniram-se para experiências posteriores. Outras modificações ao protocolo dependem na maior parte dos produtos químicos aplicados e os pontos de extremidade de interesse. A aplicabilidade dos produtos químicos insolúveis ou altamente reativos é limitada. A maior concentração de solvente para DMSO é limitada a 1%. Concentrações mais elevadas podem ser usadas, mas podem resultar na pronuncia-se liberação de citocinas pró-inflamatórias, como IL-8. Por outro lado, o estímulo usado pode ser relativamente fraco. Neste caso, a quantidade de tecido pode ser aumentada de duas a quatro fatias por bem. Essa abordagem limita a viabilidade de 24 h.

Uma grande limitação de PCLS humano é que na Alemanha eles só podem ser preparados de material de pulmão humano doente. Pacientes que se submetem à cirurgia são normalmente mais de 50 anos e 80% dos pacientes que sofrem de câncer de pulmão são ou eram fumantes. Medicação dos pacientes, como glicocorticoides, também pode influenciar o resultado de experimentos usando o tecido humano. Portanto, é essencial para: i) validar cada experimento por referências positivas, verificar a viabilidade, a funcionalidade e sensibilidade do tecido individual e ii) validação cruzada os resultados usando o tecido de pulmão saudável, não-doentes, meia-idade animais de laboratório (primatas não-humanos, tais como cynomolgus e, se possível, rato, rato, cobaia). Melhor o resultado da patologia do tecido doente, melhor os resultados experimentais. Tecido fortemente doente dificilmente pode ser usado e mostra muitas vezes limitado a viabilidade, níveis de citocina inadequadamente baixa ou extremamente alta, infecções bacterianas ou fúngicas e menos broncoconstrição. Variação de doador-para-doador é superior comparada com resultados obtidos em animais de laboratório, refletindo a variabilidade individual dos seres humanos. Isso, no entanto, não é uma limitação em geral; Como mencionado acima, em outros países (por exemplo, os EUA), é possível obter os pulmões saudáveis de doadores de órgãos falecido rejeitados para transplante. Capacidade de resposta do tecido tem sido bem descrita para o primeiro até 48 h em experimentos de exposição aguda. Viabilidade e funcionalidade do tecido é reduzido, depois de muitos dias de cultura ou armazenamento a-80 ° C. É possível que a cultura humana do tecido pulmonar para até cerca de 14 dias. Viabilidade continua durante este tempo; no entanto, é observado um aumento na variabilidade, bem como uma perda de funcionalidade de várias populações de células, como macrófagos, nos tecidos, resultando na liberação de citocinas limitada em resposta a mitógenos. Uma outra limitação para alguns pontos de extremidade é a presença de agarose no tecido, dificultando, por exemplo, o isolamento de alta qualidade e suficientes quantidades de RNA31 ou a preparação de suspensões de célula única para citometria de fluxo subsequente e fenotipagem de células. A possibilidade de obter insights mecanicistas em respostas de célula única e funcionalidade, assim, é limitada.

Organotypic modelos de tecido, tais como PCLS humano, são considerados para ter um impacto elevado na pesquisa básica e não-clínicos. Pulmão humano material tem uma composição biológica que reflete de perto a arquitetura normal do órgão. Ele contém, por exemplo, células epiteliais brônquicas e alveolares residenciais, células musculares lisas, fibroblastos, células endoteliais, fibras nervosas e macrófagos. O tecido é viável e células respondem a vários estímulos. Nervo fibras, apesar de corte, pode ser localmente activada, levando a respostas reflexas terminal14. Consequentemente, este modelo ex vivo oferece a possibilidade de estudar a resposta imune inata celular, respostas de defesa, citocinas sinalização e indução de marcadores de superfície celular. Várias melhorias na técnica de cultivo e validação de pontos de extremidade permitem o uso de combustível humano na ciência translacional. Exemplos de abordagens futuras são: i) validação de novas metas no tecido de pulmão humano, ii) a avaliação das respostas imunes após a exposição, por exemplo, para produtos químicos, drogas, nanopartículas, etc., iii) suplementação de tecido pulmonar com células do sistema imunológico, tais como os linfócitos T, iv) identificação e modificação de padrões moleculares, por exemplo, após exposição a sensitizers respiratórias, doença de indução de substâncias ou compostos ativos inibindo vias; Além disso, v) remodelação das vias respiratórias e vi) neuronal Regulamento32. O campo científico está interessado nessas abordagens actuais e futuras com combustível. Além disso, há uma variedade de diferentes desenvolvimentos que irão ajudar a melhorar a técnica de combustível, como crio-preservação20e tecido33 para imitar o movimento natural do tecido durante a respiração ou mecânica de alongamento ventilação.

A vantagem principal de PCLS humano em comparação com outros modelos 3D é a presença de células do sistema imunológico e fibras nervosas. Experiências também podem ser executadas no rato, rato e primatas não-humanos, que são as espécies de animais que ainda são usadas com mais frequência em farmacologia e toxicologia. A complexidade do tecido pulmonar humano suporta a tradução dos resultados de animal para humano e de em vitro in vivo. No contexto dos ensaios alternativos existentes para a identificação de sensitizers respiratórias, PCLS humanas são muito complexas e não permitem insights sobre respostas de célula única. Ainda, citometria de fluxo e microscopia pode dar informação sobre respostas celulares, se o marcador bem celular é usado em combinação, por exemplo, com marcadores intracelulares, necrose ou apoptose. Existem ensaios publicados que tenham sido validados e relatados para ter sido usado para a identificação de sensitizers respiratórias. No entanto, os avanços no uso de combustível com todas suas vantagens sobre ensaios de célula única estão fazendo uma contribuição valiosa no sentido de que a técnica pode ser usada para rastreio de alto rendimento, conforme descrito por Watson et al 34 eles desenvolveram um ensaio do elevado-throughput screening para prever a toxicidade de vias aéreas em murino PCLS crio-preservados. Com seu formato PCLS miniaturizado de 96 poços, detectaram leituras semelhantes no líquido de lavagem murino, tornando PCLS um ensaio da elevado-produção viável.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar. ITEM de Fraunhofer é uma organização de pesquisa sem fins lucrativos pública independente para a investigação aplicada, realizando pesquisa de contrato em nome das indústrias de biotecnologia, farmacêutica, química e cosméticos. Financiamento do Instituto vem de projetos públicos nacionais e internacionais.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer o pre-trabalho sobre estratégias alternativas de testes para avaliação do risco com PCLS humana a Lan Lauenstein. Algumas das pesquisas foi apoiado por uma subvenção da Comissão Europeia no âmbito do 6. º programa-quadro deth SENS-IT-IV "Romance estratégias de testes para avaliação In Vitro de alérgenos".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm A. Hartenstein (Leipzig, Germany) SS04
Syringe Faust Lab Science (Klettgau, Germany) 9.410 050
Coring tools custom-made custom-made
Trimming Blade Handle (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205530001
Trimming Blades (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205500000
Microtome: Tissue Slicer Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) 303400-ADPT Krumdieck Tissue Slicer (MD6000)
Microtome blade Wilkinson Sword (Solingen, Germany) ENR-4027800011506
Tissue culture dishes Sigma (München, Germany) Z666246-420EA
Cell strainer filter (100 µm Nylon) Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) BD352360
Inoculation loop Copan Diagnostics (Murrieta, USA)  CD176S01
TPP Tissue culture plates 24wells Sigma (München, Germany) Z707791-126EA
Cassette Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 1000957
Nunc MaxiSorp flat-bottom Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) 44-2404-21
Nunc MicroWell 96-Well  Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 260836
Confocal Microscope Zeiss (Jena, Germany) Confocal LSM Meta 510
Image rendering software Bitplane AG (Zürich, Switzerland) IMARIS 7.6
LSM Image Browser Zeiss (Jena, Germany)
Multiwell-Reader Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) Tecan infinite F200Pro Plate Reader
Plate shaker Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) KM-2 Akku
BenchMark ULTRA Ventana Medical Systems (Tucson, USA) Automated IHC/ISH slide staining system
Assays
Cell Proliferation Reagent WST-1 Roche (Basel, Switzerland) 11644807001
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche (Basel, Switzerland) 11644793001
Microscopical vitality staining  Invitrogen (Carlsbad, USA) L-3224 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit
BCA Protein Assay Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 23225
ELISA assay kit R & D systems various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) DuoSet
Reagents
Agarose, low gelling temperature  Sigma (München, Germany) A9414-100G
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) Sigma (München, Germany) E2888-500ML
Penicillin and streptomycin Lonza (Verviers, Belgium) 17-602E
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) Gibco (Darmstadt, Germany) 11039-047 Culture medium
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) Lonza (Verviers, Belgium) BE17-513F   Buffer solution
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma (München, Germany) A9647-500G
Detergent Sigma (Saint Louis, USA) X100-100ML Triton X-100
Washing buffer Merck (Darmstadt Germany) 524653  0.05% Tween 20 in PBS

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References

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Avaliação do citotóxicos e efeitos imunomoduladores de substâncias no pulmão humano de precisão de corte fatias
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Neuhaus, V., Danov, O., Konzok, S., Obernolte, H., Dehmel, S., Braubach, P., Jonigk, D., Fieguth, H. G., Zardo, P., Warnecke, G., Martin, C., Braun, A., Sewald, K. Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices. J. Vis. Exp. (135), e57042, doi:10.3791/57042 (2018).

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