Summary
Corrente multiplexed diagnostica per rilevare virus dengue, chikungunya e Zika richiedono preparazione campioni complessi e costosi strumentazione e sono difficili da utilizzare in ambienti di risorse in esaurimento. Vi mostriamo una diagnostica che utilizza amplificazione isotermica con sonde displaceable strand mirate per rilevare e distinguere questi virus con alta sensibilità e specificità.
Abstract
Zika, dengue e chikungunya virus vengono trasmessi dalle zanzare, che causano malattie con sintomi simili del paziente. Tuttavia, hanno potenzialità di trasmissione paziente--paziente a valle diversi e richiedono trattamenti pazienti molto diversi. Così, recenti focolai di Zika rendono urgente di sviluppare strumenti che discriminano rapidamente questi virus in pazienti e intrappolato le zanzare, per selezionare il corretto trattamento del paziente e per comprendere e gestire la loro epidemiologia in tempo reale.
Purtroppo, attuale test diagnostici, tra cui quelli emergenza 2016 ricevente utilizzare autorizzazioni e fast track stato, rilevare RNA virale da reazione a catena della polimerasi d'inversione della trascrizione (RT-PCR), che richiede strumentazione, addestrato gli utenti, e preparazione del campione considerevole. Così, essi devono essere inoltrati ai laboratori di riferimento "approvato", che richiede tempo. Infatti, in agosto 2016, il Center for Disease Control (CDC) stava chiedendo donne incinte che era stato morso da una zanzara e ha sviluppato un'eruzione che indica Zika aspettare un'inaccettabile 2 a 4 settimane prima di imparare se sono stati infettati. Abbiamo molto bisogno di test che può essere fatto sul posto, con poche risorse e da personale addestrato ma non necessariamente con licenza.
Questo video dimostra un'analisi che soddisfa queste specifiche, lavorando con urina o siero (per pazienti) o carcasse di zanzara schiacciata (per sorveglianza ambientale), tutto senza molta preparazione del campione. Carcasse di zanzara vengono catturate su carta che trasportano gruppi ammonio quaternario (Q-carta) seguite da trattamento con ammoniaca per gestire rischi biologici. Questi sono quindi direttamente, senza isolamento del RNA, messi in provette contenenti i reagenti liofilizzati che hanno bisogno di nessuna catena di refrigerazione. Una forma modificata di trascrizione d'inversione ciclo-amplificazione isotermica mediata da con mirate fluorescente contrassegnati spostabile sonde produce della lettura, in 30 min, come un segnale di fluorescenza in tre colori. Questo viene visualizzato con un dispositivo palmare, alimentato a batteria con un filtro arancione. Contaminazione di avanti è evitata con provette sigillate e l'uso di uracile termolabile DNA glicosilasi (UDG) in presenza di dUTP nella miscela di amplificazione.
Introduction
Le infezioni virali trasmesse dalle zanzare, incluse dengue e chikungunya virus di Zika sono sulle strategie di gestione immediata ascesa e la domanda. Dengue e chikungunya virus sono già endemico in molte regioni tropicali dove Zika sta ormai dilagando in emisfero occidentale1. Virus di Zika, come dengue, è un membro della famiglia Flaviviridae ed è originario dell'Africa con una asiatica e due stirpi genetici africano2. Anche se l'identificazione del virus Zika risale al 1947, Zika infezione in esseri umani è rimasto sporadico per mezzo secolo prima di emergere nel Pacifico e nelle Americhe. Il primo focolaio segnalato di Zika febbre si è verificato su Isola di Yap, Stati federati di Micronesia nel 2007, seguita da Polinesia francese nel 2013 e nel 2014. Il primo focolaio principale nelle Americhe si è verificato nel 2015 in Brasile.
I virus di Zika, chikungunya e dengue sono principalmente trasmessi da Aedes aegypti e Aedes albopictus. Tuttavia, Zika ha trasmissione umano--umana a valle ulteriori possibilità, probabilmente viene diffuso attraverso il contatto sessuale, l'interazione madre-di-feto e tramite l'allattamento3,4,5. Zika febbre prima credeva di causare una malattia solo lieve. Tuttavia, fu più tardi associato con la sindrome di Guillain-Barré in adulti, microcefalia in neonati e malattie del sistema muscoloscheletrico cronici che possono durare mesi e anni. Diagnosi di malattia di Zika può essere difficile, poiché i sintomi di un'infezione di Zika sono simili a quelli di altri di zanzara-diffondere virus6. Co-infezioni comuni di questi virus fanno diagnosi differenziale ancora più impegnativo7,8. Pertanto, rilevazione rapida e affidabile degli acidi nucleici da Zika e altri virus è necessario per comprendere l'epidemiologia in tempo reale, per avviare il controllo e le misure preventive e di gestire la cura paziente9.
Test diagnostici correnti per questi virus includono analisi sierologiche, isolamento del virus, sequenziamento del virus e PCR d'inversione-trascrizione (RT-PCR). Gli approcci sierologici standard spesso soffrono di sensibilità inadeguata e risultati possono essere complicati da reattività crociata in pazienti che sono stati infettati in precedenza da altri flavivirus.
Di conseguenza, degli acidi nucleici testing rimane il modo più affidabile per rilevare e distinguere questi virus. Rilevamento di Zika e altri virus zanzara è di solito eseguita mediante RT-PCR o RT-PCR in tempo reale in varietà di fluidi biologici, come siero, urina, saliva, sperma, latte materno e fluido cerebrale10,11. Campioni di urina e saliva sono generalmente preferiti sopra anima, poiché esibiscono meno PCR-inibizione, più alti carichi virali, presenza di virus per lunghi periodi di tempo e una maggiore facilità di raccolta e gestione delle12,13. Test diagnostici basati su RT-PCR, tuttavia, comprendere la procedura di preparazione del campione vasto e costose attrezzature ciclismo termica, rendendolo meno ottimale per il point-of-care.
Retrotrascrizione amplificazione isotermica mediata da loop (RT-LAMP) è emerso come una potente alternativa di RT-PCR, grazie alla sua elevata sensibilità e specificità14,15, campioni di relativa tolleranza per sostanze inibitorie in biologico e operazione singola temperatura, che significativamente si abbassa tenore complessità e costi associati, che lo rende adatto per ambienti di risorse in esaurimento. RT-LAMP, come classicamente è implementato, comprende sei iniettori che si legano a otto regioni distinte all'interno del RNA dell'obiettivo. Funziona a temperature costanti tra 60 ° C e 70 ° C e utilizza una trascrittasi inversa e una polimerasi del DNA con filo forte spostando attività.
Durante le fasi iniziali di RT-LAMP, avanti e indietro interni iniettori (FIP e BIP, Figura 1A) con primer esterno avanti e indietro (F3 e B3) formano una struttura con manubri, la struttura di seme di amplificazione esponenziale di lampada. Amplificazione è ulteriormente accelerato tramite i ciclo avanti e indietro gli iniettori (LF e LB), che sono progettati per associare le singole regioni non recuperabili di dumbbell, e risultati nella formazione di concatemeri con ripetere più cicli16. LAMPADA classica analisi basata su torbidità o lettura di DNA intercalanti coloranti non è completamente adatta per rilevazione di point-of-care di Zika, dove un certo livello di multiplazione è voluto17,18,19. Multiplexing non è facilmente ottenuti in questi sistemi, come sono inclini a generare falsi positivi a causa di amplificazioni fuori bersaglio.
Per gestire questi problemi, la letteratura aggiunge un componente supplementare sotto forma di una "filo-spostando la sonda" il21,20,di architettura classica RT-LAMP22. Ogni sonda è una regione del doppio filamento di sequenza-specifico e una regione di adescamento singolo filamento. La sonda con la regione di singolo filamento è etichettata con un fluoroforo 5' e la sonda complementare viene modificata con un quencher estremità 3'. In assenza di un obiettivo, fluorescenza non è osservata a causa di ibridazione dei fili sonda complementare, che porta il fluoroforo e quencher in stretta vicinanza. In presenza di un bersaglio, la porzione di filamento singolo della sonda fluorescente si lega al suo complementare sul bersaglio e viene quindi esteso da un filamento spostando della polimerasi. Ulteriore estensione della polimerasi di iniettori d'inversione provoca la separazione del filo del quencher dal suo filone fluorescente contrassegnati complementari, consentendo l'emissione di fluorescenza (Figura 1B). Con questo disegno, il segnale viene generato dopo la formazione di dumbbell, riducendo le possibilità di falsi positivi segnali.
La parte di double-stranded della sonda strand-spostando può essere qualsiasi sequenza, e quando viene applicato il multiplexing, la stessa sequenza può essere utilizzata con coppie diverse fluorophore-quencher. Con questa architettura, contaminati dal virus dell'urina, siero o zanzara campioni schiacciati sulla carta sono stati introdotti direttamente il dosaggio senza preparazione del campione. Letture di tre colori di fluorescenza visibile all'occhio umano sono stati generati all'interno di 30-45 min, e i segnali sono stati visualizzati da una finestra di osservazione 3D-stampato che utilizza un LED blu e un filtro arancione. Liofilizzazione i reagenti RT-LAMP attivata la distribuzione di questo kit per abbassare le impostazioni delle risorse senza la necessità di refrigerazione.
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Protocol
Nota: Le zanzare erano gli unici animali direttamente utilizzati in questo studio. Le procedure per la gestione di polli, il cui sangue è stato utilizzato per alimentare le zanzare infette, sono state approvate come IACUC protocollo n. 201507682 dalla propagazione University of Florida istituzionali cura degli animali e uso Committee.Virus e gli studi di infezione zanzara erano eseguite presso l'impianto di BSL-3 del laboratorio di entomologia medica Florida a Vero Beach, FL. RT-LAMP esperimenti sono stati eseguiti in laboratorio BSL-2 ha condiviso la foto di FfAME e Firebird LLC di Scienze Biomolecolari a Alachua, FL.
1. disegno di primer e Strand spostando le sonde
- Estrarre sequenze virali per Dengue 1 dal database Broad Institute23; sequenze per Zika e chikungunya dal NIAID Virus patogeno Database e analisi delle risorse24.
- Creare allineamenti multipli di sequenza (MSAs) per sequenze di interesse utilizzando software muscolo v3.8.3125. Utilizzare MSAs generato per la ricerca di set di primer lampada all'interno di una regione conservata del bersaglio ed evitare obiettivi non pertinenti o non intenzionali, come distinzioni tra sottotipi di un bersaglio.
- Seguire le regole di progettazione per gli iniettori lampada come descritto online (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/) e consentire l'uso di basi miste nei primers per coprire il virus divergenza26. Per evitare la cross-reattività dei set di primer, confrontare generato lampada primer per il database di virus del RNA di NCBI utilizzando NCBI BLAST27. Confrontare ogni set per eliminare gli iniettori che sarebbero dimerizzano in un'analisi multiplex utilizzando NCBI BLAST pure.
- Schermo la parte di double-stranded della sonda strand-spostando contro qualsiasi sequenza del genoma virale e la sequenza genomic zanzara. Modificare la 5'-estremità della sonda di associazione di destinazione con fluorescina amidite (FAM), tintura HEX e 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) tintura per Zika, chikungunya e Dengue 1, rispettivamente.
- Includono un set per campioni di urina di primer di controllo positivo. Disegnare primers lampada target DNA mitocondriale umano. Etichetta strand-spostando la sonda con TET estremità 5'. Sonde di quencher di etichetta che sono parzialmente complementari a ciascuno fluorescente etichettati sonda con quencher (ad es., Iowa nero-FQ) 3'-estremità (tabella 1).
2. virus isolati e infettati zanzara campioni
- Uso degli isolati del virus di Zika (ceppo di Puerto Rico), virus di Chikungunya (ceppo La Réunion o Isole Vergini britanniche) e virus di febbre rompiossa sierotipo-1 (ceppo di Key West). Determinare i titoli virali mediante placca dosaggio28 o di RT-PCR quantitativa29. Estrarre RNA virale utilizzando disponibili in commercio kit di estrazione di RNA.
Nota: La tabella 2 rappresenta i titoli virali di ogni virus isolato utilizzato in questo studio. - Seguire l'articolo pubblicato da Yaren et per un protocollo dettagliato circa l'infezione di Ae. aegypti femmine con Zika e chikungunya virus20. Vedere la tabella 2 per il titolo virale del campione zanzara infettato con il virus di Zika.
3. RT-LAMP accoppiato con uracile termolabile DNA glicosilasi
-
10 x preparazione della miscela di primer.
- Preparare soluzione stock di 100 µM di ogni primer e sonde (Vedi punto 1) aggiungendo acqua gratuita nucleasi. Vortice bene e conservare a-20 ° C fino all'utilizzo.
- Per 10 mix di Primer X per ogni Zika, Dengue 1 o bersaglio di DNA mitocondriale, mix 16 µ l di FIP, 16 µ l BIP, 2 µ l di F3, 2 µ l di B3, 5 µ l di LF, 2 µ l di LB, 3 µ l di LB-fluorescente etichettati sonda, 4 µ l di sonda quencher e 50 µ l di acqua priva di nucleasi per un totale di 100 µ l di volume.
- Per 10 X Primer mix per Chikungunya, mescolare 16 µ l di FIP, 16 µ l BIP, 2 µ l di F3, 2 µ l di B3, 5 µ l di LB, 2 µ l di LF, 3 µ l di LF-fluorescente etichettati come sonda, 4 µ l di sonda quencher e 50 µ l di acqua priva di nucleasi per un totale di 100 µ l di volume.
Nota: La sonda concentrazione descritta sopra usi 300 nM di finale sonda fluorescente e 400 nM della sonda quencher. In alternativa, utilizzare 80 nM di sonda fluorescente contrassegnata e 200 nM di sua sonda quencher per analisi in tempo reale.
- Aggiungere 5 µ l di miscela primer: 10x (per 3-plex, aggiungere 5 µ l di ogni 10 X mix di primer), 5 µ l di tampone di amplificazione isotermica 10x (1x buffer di composizione: tampone 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 50 mM KCl, 10mm (NH4)2SO4, 8mm MgSO4 0.1% Tween-20, 1 millimetro DTT), 7 µ l di miscela di dNTP (10 millimetri di dATP, dCTP e dGTP; 5mm di dTTP e dUTP), 16 unità di DNA polimerasi, 15 unità di trascrittasi inversa, 80 unità di inibitore ricombinante ribonucleasi, 2 unità di UDG termolabile, 1-2 µ l di quantità variabili di vi RAL RNAs e acqua per portare il volume totale fino a 50 µ l in un mL 0,25 PCR tube (Vedi Tabella materiali).
- Comprendono le analisi di controllo negativo in questa fase da sostituendo virale RNA volume con acqua. Incubare i campioni tra 65-68 ° C per 45 min a 1 h, quindi analizzare mediante l'esecuzione di 5 µ l di ogni campione su gel di agarosio al 2,5% in 1 tampone di X TBE contenente bromuro di etidio (0,4 µ g/mL). Utilizzare un 25 bp o scala del DNA di 50 bp come marcatore sul gel.
Nota: Aggiunta di un modello specifico non bersaglio è facoltativa. - Per rilevare la presenza di RNA patogeno, testare ogni set di primer ed il relativo controllo no-modello variando la concentrazione di temperatura e/o magnesio, poiché ogni set di primer RT-LAMP è stato progettato per funzionare a temperature variabili (65 ° C a 68 ° C) o magnesio concentrazioni (da 6 a 10 mM finale). Preparare gli esperimenti a temperatura ambiente.
4. RT-lampada usando urina a spillo RNA virale
- Primer RT-lampada di prova in varie concentrazioni finali di urina (0%, 10%, 20% e 50%) in 50 µ l di volume di reazione totale. Per concentrazione di urina finale del 10%, aggiungere 1 µ l di RNA virale a 5 µ l di urina. Per la concentrazione di urina finale del 20%, aggiungere 1 µ l di RNA virale a 10 µ l di urina. Per concentrazione di urina finale del 50%, aggiungere 1 µ l di RNA virale a 25 µ l di urina.
- Per monitorare in tempo reale RT-LAMP nel 10% delle urine, utilizzare uno strumento PCR in tempo reale (Vedi Tabella materiali) con fluoroforo diversi filtri.
- Per leggere i segnali di fluorescenza da ampliconi FAM-etichettati per Zika, utilizzare un filtro che vanno da 483 a 533 nm; per ampliconi HEX-etichettati per chikungunya, utilizzare un filtro che vanno da 523 a 568 nm; per ampliconi TAMRA-etichettati per Dengue 1, utilizzare un filtro che vanno da 558 a 610 nm; e per ampliconi TET-etichetta per il DNA mitocondriale, utilizzare un filtro che vanno da 523 a 568 nm.
Nota: FAM ha maxima di eccitazione e di emissione di 495 nm e 520 nm, rispettivamente. HEX è maxima di eccitazione e di emissione di 538 nm e 555 nm, rispettivamente. TAMRA ha maxima di eccitazione e di emissione di 559 nm e 583 nm, rispettivamente. TET ha maxima di eccitazione e di emissione di 522 nm e 539 nm, rispettivamente.
- Per leggere i segnali di fluorescenza da ampliconi FAM-etichettati per Zika, utilizzare un filtro che vanno da 483 a 533 nm; per ampliconi HEX-etichettati per chikungunya, utilizzare un filtro che vanno da 523 a 568 nm; per ampliconi TAMRA-etichettati per Dengue 1, utilizzare un filtro che vanno da 558 a 610 nm; e per ampliconi TET-etichetta per il DNA mitocondriale, utilizzare un filtro che vanno da 523 a 568 nm.
- Uso 96 pozzetti e sigillo la piastra con un foglio di plastica trasparente, quindi incubare i campioni a 65-68 ° C per 60-90 min e registrare la fluorescenza ogni 30 s utilizzando il ciclatore luce. Inizialmente utilizzare 80 nM di sonde fluorescente identificate e poi prova il 300 nM di sonde fluorescente contrassegnate.
- Determinare il limite di rilevamento per ogni destinazione aggiungendo in serie diluito RNA virale nella concentrazione di urina finale del 10%.
Nota: Utilizzare in tempo reale RT-LAMP per determinare la temperatura ottimale, la concentrazione di magnesio, sonda fluorescente contrassegnati concentrazione e tempo di reazione.
- Determinare il limite di rilevamento per ogni destinazione aggiungendo in serie diluito RNA virale nella concentrazione di urina finale del 10%.
- Per visualizzare la fluorescenza generata dalle sonde displaceable strand dall'occhio, utilizzare una sorgente di luce LED blu da un ciclatore luce con eccitazione a 470 nm (qualsiasi casella di elettroforesi del gel con built-in fonte di luce blu sarà lavorare, vedere tabella dei materiali) e registrare l'immagine con una cellulare fotocamera a temperatura ambiente al buio.
Nota: Uso 300 nM di sonde fluorescente contrassegnate, quando è richiesta la visualizzazione di tutti i tre colori dall'occhio utilizzando LED blu.
5. RT-lampada sul rilevamento delle zanzare Zika-infetto utilizzando tecnologia Q-Paper
- Preparare quaternario d'ammonio-modificato filtro carta (Q-carta), secondo i metodi precedentemente pubblicati con lievi modifiche30.
- Immergere 1 g di cerchi di carta da filtro di cellulosa (Vedi Tabella materiali) con un diametro di 3,5 cm in 50 mL di 1,8% di soluzione acquosa di NaOH per 15 min per l'attivazione.
- Raccogliere la carta attivata cerchi di filtrazione sotto vuoto e poi immergerli in 40 mL di soluzione acquosa di cloruro di (2,3-epossipropil) trimetilammonio (0,28 g) durante la notte a temperatura ambiente.
Nota: Mantenere il rapporto massa di (2,3-epossipropil) trimetilammonio cloruro di carta da filtro a 0.28-1. - Raccogliere la carta cationica risultante dalla filtrazione sotto vuoto e neutralizzare con 50 mL di 1% di acido acetico.
- Lavare la carta tre volte con etanolo e asciugare all'aria sotto un cofano con flusso d'aria costante.
- Tagliare i fogli di carta Q in piccoli rettangoli (3 x 4 mm) utilizzando un pugno di carta o forbici. Schiacciare le zanzare femmina Ae. aegypti potenzialmente infettate con Zika su ogni carta con un pestello di micro.
- Aggiungere a ogni carta 20 µ l di soluzione di ammoniaca acquosa 1 M (pH ≈ 12) e aspettare per 5 min. Poi lavare ogni carta una volta con 20 µ l di 50% EtOH e una volta con 20 µ l di acqua priva di nucleasi. Asciugare la carta in BSL-2 di biosicurezza per circa 1 h.
Nota: A questo punto, campioni possono essere conservati a-20 ° C durante la notte fino all'utilizzo. - Con una pinzetta, posizionare ogni carta in 100 µ l di miscela di reazione di RT-LAMP e incubare a 65-68 ° C per 45 min. Assicuratevi di immergere completamente la carta nella soluzione; esso non dovrebbe essere mobile. Leggere e registrare la fluorescenza derivanti da virus di Zika con sorgente luminosa a LED blu e filtro di colore arancio o giallo.
6. liofilizzazione di RT-LAMP reagenti per 100 µ l di Volume di reazione
- Preparare 10 X lampada primer miscela conformemente al punto 3.1 e preparare la miscela di dNTP contenenti dUTP conformemente al punto 3.2. Conservare la miscela di primer e dNTPs a-20 ° C fino all'utilizzo.
- Preparare 10 mL di tampone di dialisi enzimatico per rimuovere glicerolo, mescolando 100 µ l di 1 M Tris-HCl pH 7.5, 500 µ l di 1 M KCl, 2 µ l di EDTA 0.5 M, 100 µ l di 10% Triton X-100, 100 µ l di 0,1 M DTT e 9,198 mL di acqua priva di nucleasi. Memorizzare nel buffer di dialisi a 4 ° C.
Nota: Assicurarsi di filtro (filtri da 0,2 micron) tutte le soluzioni di reagente tampone prima dell'utilizzo e conservare a 4 ° C.- Utilizzare una membrana di ultrafiltrazione con limite di cut-off di 10 kDa (Vedi Tabella materiali). Posto 350 µ l di tampone di dialisi, 4 µ l di 32 unità della DNA polimerasi, 2 µ l di 30 unità della trascrittasi inversa e 2 µ l di 80 unità di inibitore di RNAsi in membrana di ultrafiltrazione e centrifugare a 14.000 x g per 5 min a 4 ° C.
- Aggiungere un altro 350 µ l di tampone di dialisi alla membrana di ultrafiltrazione e centrifugare (14.000 x g) per 5 min, un altro vuoto del tubo di raccolta e ripetere questo passaggio, quindi centrifugare (14.000 x g) per 3 min.
- Per l'eluizione, la membrana e posizionarlo in un nuovo tubo di raccolta. Spin a 1.000 x g per 2 minuti misura il volume di eluizione; Se meno di 8 µ l, portare il volume fino a 8 µ l con l'aggiunta di buffer di dialisi. Memorizzare l'eluizione a 4 ° C e procedere immediatamente al passaggio successivo.
Nota: Questo protocollo è per liofilizzazione tubo singolo, ma preparare almeno 10 provette di reazione contemporaneamente utilizzando la stessa membrana di ultrafiltrazione e utilizzare la stessa quantità di tampone di dialisi.
- Mescolare 10 µ l di primer X lampada 10 se singleplex (per 3-plex, aggiungere 10 µ l di ogni 10 X mix di primer), 14 µ l di miscela di dNTP, 8 µ l di miscela di enzima dializzati, 2 µ l di 2 unità degli UDG termolabile e 66 µ l di nucleasi acqua (per 3-plex gratis utilizzare 46 µ l) in un tubo del microcentrifuge 0,5 mL e lasciare il coperchio aperto. Al contrario, aggiungere un altro Coperchio perforato con un ago per consentire la fuoriuscita di vapore.
- Immediatamente congelare le provette a-80 ° C per 2 h e lyophilize il tubo per 4 h. coperchio della camera di liofilizzazione con foglio di alluminio per la protezione dalla luce. Quando i reagenti vengono essiccati, rimuovere i coperchi forati, chiudere il coperchio originale e conservare le provette con i reagenti liofilizzati a 4 ° C al buio.
Nota: I reagenti possono essere liofilizzati durante la notte, se necessario.
7. test liofilizzato RT-LAMP reagenti su Urine e campioni di zanzara contenenti Zika
- Utilizzare i seguenti elementi del kit (Vedi la Tabella materiali) per Zika: una finestra di osservazione 3D-stampato con filtro arancione (filtro passa-lungo, taglio-su ~ 540 nm), 2 batterie AAA per l'osservazione di casella, liofilizzato etichettate ZV per rilevamento Zika, le provette di reazione e 1.1 tubi di X reidratazione Buffer in 1,5 mL con tappo a vite.
- Preparare 50 mL di 1.1 X buffer di reidratazione mescolando 5,5 mL di tampone di amplificazione isotermica che arriva con DNA polimerasi 10x (Vedi la Tabella materiali), 3,3 mL di 100mm MgSO4, 110 µ l di 0,5 M DTT e 41,09 mL di acqua priva di nucleasi. Mescolare bene, aliquotare 1 mL di questa soluzione per provette da 1,5 mL tappo a vite e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
- Aggiungere 90 µ l di tampone di reidratazione X 1,1 a ciascuna provetta di reazione (0,5 mL). Assicurarsi che il liquido riempie il fondo della provetta contenente i reagenti liofilizzati (dissolvenza con miscelazione agitando, poi brevemente rotazione verso il basso (1.000 x g)). Aggiungere 10 µ l di campione di urina addizionato con RNA virale per le provette di reazione (vedere sezione 4.1 per dettagli).
- Se il test zanzare, aggiungere un rettangolo di Q-carta holding carcasse zanzara (come preparato nei passaggi descritti nelle sezioni 5.2 e 5.3), insieme a 10 µ l di acqua invece di campioni di urina purificata.
Nota: In alternativa, aggiungere 10 µ l di campioni di saliva o siero invece di urina. Se i campioni sono estratti DNA o RNA, aggiungere 2-5 µ l del campione nell'impasto reidratato e completare con acqua priva di nucleasi a 10 µ l di volume del campione finale.
- Se il test zanzare, aggiungere un rettangolo di Q-carta holding carcasse zanzara (come preparato nei passaggi descritti nelle sezioni 5.2 e 5.3), insieme a 10 µ l di acqua invece di campioni di urina purificata.
- Chiudere il coperchio delle provette di reazione. Metterli in una vasca/blocco di calore (o incubatrice) pre-impostati di 65-68 ° C. Incubare per 30-45 min, ma non più di 1 h. Dopo l'incubazione, togliere il tubo dal fuoco. Per evitare la contaminazione dei saggi di futuri, assicurare che questi tubi rimangono chiusi.
- Provette di reazione del luogo nella casella di osservazione; la temperatura scenderà a temperatura ambiente (preferibilmente 25 ° C). Accendere l'interruttore sul retro della finestra di osservazione. Osservare il campione attraverso il filtro arancio e catturare l'immagine di un cellulare fotocamera che si tiene a distanza dove l'immagine riempia l'80% del campo di vista.
Nota: Migliore visualizzazione avviene in ambienti scarsamente illuminati. - Al termine della visualizzazione, spegnere l'interruttore. Conservare le provette sigillate al buio, preferibilmente con refrigerazione, se è richiesta la visualizzazione successiva.
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Representative Results
Inizialmente, le prestazioni di ogni primer RT-LAMP (tabella 1) con il suo corrispondente virale RNA substrato così come controlli negativi sono state valutate mediante elettroforesi in gel. Primer RT-LAMP sono stati progettati per NS5 regione target (RNA polimerasi RNA-dipendente) Zika e Dengue 1 e nsP2 regione (proteine non strutturali P2) per Chikungunya. Modelli erano RNA totale Estratto da stock virali coltivati in cellule di rene (Vero) cercopiteco africano. In un caso, totale di acidi nucleici (DNA e RNA) è stata estratta da una femmina di Chikungunya-infettati Ae. aegypti (tabella 2).
La Figura 2A Mostra che alcuni risultati rappresentativi con RT-LAMP eseguita con questi campioni. In casi di multiplex (3-plexed) e singleplex, RT-LAMP prodotti appaiono come una scala di concatemeri quando esegue su gel di agarosio. Campioni di controllo negativo contenente acqua come campione ha dato solo le bande per gli iniettori stessi, compreso il controllo di destinazione non specifico dove totale dell'acido nucleico Estratto da un non infetti Ae. aegypti femminile zanzara è stata utilizzata come modello.
Per trovare le condizioni ottimali di RT-LAMP, magnesio diverse concentrazioni e a temperature di incubazione sono state testate. È stato trovato che le più alte concentrazioni di magnesio e temperature più basse potrebbero generare ampliconi non specifici, dando luogo a falsi positivi. Di conseguenza, 8 millimetri di magnesio e di incubazione a 65 ° C sono stati utilizzati in tutti gli esperimenti da allora in poi (Figura 2B).
Elettroforesi del gel richiede l'apertura del tubo di reazione, che può dar luogo alla contaminazione della prossima serie di esperimenti di ampliconi generati in precedenza, portando a falsi positivi. Per evitare la contaminazione in avanti, dTTP è stato sostituito dai rapporti uguali di dTTP e dUTP, affinché dUTP verrebbero incorporate nel ampliconi RT-LAMP. Questo trasforma la possibile contaminazione amplicone in un substrato per l'uracil-DNA glicosilasi (UDG) durante la preparazione di eventuali successive RT-LAMP reazioni31,32. Quando si utilizza una versione termolabile degli UDG, contenenti dU ampliconi possono essere digerito a temperatura ambiente come i campioni di RT-LAMP vengono istituiti, e tale gruppo trasformandolo verrà disattivato durante l'amplificazione isotermica. Inoltre, il tubo di reazione possa essere aperti per un'analisi a valle, quando necessario. Oltre all'utilizzo di digestione UDG, un'architettura utilizzando sonde displaceable genera fluorescenza che può essere letto senza la necessità di aprire il tubo di reazione.
Figura 3A consegna il risultato del limite di rilevabilità (LOD) per Zika utilizzando sonde fluorescenti Zika RNA di targeting. Diluizione seriale gli studi hanno mostrato che in basso come pfu 1,42 potrebbe essere rilevata entro 30 min in un dosaggio di singleplex o un plexed di 3 dosaggi. Quando i campioni sono stati ulteriormente diluiti a 0.71 pfu, un segnale fluorescente è stato osservato dopo 40 min per un dosaggio di singleplex e dopo 50 min per miscele 3-plexed. Oltre a Real-Time RT-LAMP, fluorescenza è stata visualizzata dopo 35 min attraverso un filtro arancione, dopo i campioni sono stati esposti per blu luce LED con una lunghezza d'onda di eccitazione di 470 nm (Figura 3B). Allo stesso modo, i limiti di rilevazione sono stati misurati a 37,8 copie e pfu 1.22 per Chikungunya e Dengue 1, rispettivamente (Figura 3-D).
Per determinare la concentrazione ottimale dell'urina, RNA virale Zika (2,85 pfu) è stato aggiunto alle concentrazioni varianti di un campione di urina umana autentica (0%, 10%, 20% e 50%). Presumibilmente a causa della sua elettroliti, il segnale di RT-LAMP fu ritardato da 15 a 35 min quando urina 50% è stato usato nell'analisi. 10% urina è stata determinata per essere ottimale dovuto che presenta una priorità bassa più bassa. In assenza di obiettivi Zika, nessuna amplificazione è stata osservata a qualsiasi concentrazione, ma più alta fluorescenza di fondo è stata osservata nei campioni con concentrazione di urina maggiore (Figura 3E).
Per consentire il funzionamento in multiplex con letture di colori diversi di fluorescenza, 80 nM di sonde displaceable strand sono stati etichettati con diversi fluorofori (FAM per Zika, esadecimale per Chikungunya e TAMRA per Dengue 1), ma accompagnato dalla stessa quencher (Iowa nero-FQ) con una concentrazione di 200 nM. Cella cultura-estratta RNA virale (2,85 pfu per Zika, 242 copie di RNA virale per Chikungunya e 1.22 pfu per Dengue 1) sono stati utilizzati come bersagli, diluiti in urina di 10%. Analisi in tempo reale i dati di fluorescenza ha mostrato un ritardo nella generazione del segnale (circa 10 min) per dosaggi 3-plexed, dove erano presenti gli iniettori per tutte le destinazioni. In casi di singleplex, d'altra parte, la reazione è stata completata entro 10-15 min (fig. 4A-C). Quando fluorescenza è stata visualizzata utilizzando un LED blu e filtro arancione, sono state osservate differenze nell'intensità del segnale per diversi fluorofori, dove FAM-labeled ampliconi sono stati il più visibile. Questo è previsto, dato che di eccitazione a 470 nm è più vicina al massimo dello spettro di eccitazione di FAM (Figura 4).
Per abilitare la visualizzazione di tutti i tre colori con una lunghezza d'onda di eccitazione LED singola (470 nm), le concentrazioni di sonde displaceable erano aumentato a 300 nM e il quencher complementari sonda a 400 nM. In casi di singleplex, generazione del segnale è stata completata entro 10 min per Zika, 20 min per Chikungunya e 40 min per Dengue 1. Nelle analisi di 3-plexed, tuttavia, è stato ulteriormente ritardato di 20 min in tutti i saggi (Figura 5A- C). Tuttavia, sacrificio in tempo per la generazione del segnale attivata la visualizzazione di tutti i tre colori con LED blu luce filtro arancione. Fluorescenza verde è osservato per Zika usando sonde 5'-estremità etichettata con FAM, luce di fluorescenza verde-giallo viene assegnato a Chikungunya dove la sonda è 5'-estremità etichettata con HEX e fluorescenza rosso-arancio è utilizzato per Dengue 1, dove la sua sonda è 5'-estremità con l'etichetta con TAMRA (Figura 5).
Per analizzare campioni di zanzara con infezione possibile Zika, laboratorio affetti da Ae. aegypti zanzare femminile (tabella 2) sono state schiacciate su un rettangolo di Q-carta, seguita da trattamento con ammoniaca per sterilizzare il virus e per associare l'esposto virale RNA su carica positiva Q-carta. La carta è stato brevemente lavata con etanolo per rimuovere pterina composti presenti nelle carcasse di zanzara che potrebbero interferire con la fluorescenza della lettura33,34. Q-documenti contenenti zanzare quindi sono stati sommersi direttamente nella miscela RT-LAMP e dopo incubazione a 65 ° C per 30 min, brillante fluorescenza verde è stata osservata in presenza di virus di Zika (Figura 6).
A consegnare il kit di rilevazione senza una catena di refrigerazione e per rendere l'analisi facile da usare, i reagenti RT-LAMP sono stati liofilizzati e accompagnati da un buffer di reidratazione e una scatola di osservazione 3D-stampato che utilizza un 470 nm emettitori LED e un filtro arancione (Figura 7a). con 9 volumi di tampone di reidratazione e 1 volume di campione di urina, fluorescenza verde visibile può essere generato entro 30 min e l'immagine possa essere catturato da qualsiasi cellulare fotocamera (figura 7B). In alternativa, i campioni di zanzara su Q-carta possono essere utilizzati dall'analisi della stessa con l'aggiunta di 1 volume di acqua invece di campione di urina.
Figura 1: progetto di Assay lampada (A) primer RT-LAMP e formazione di una struttura di manubrio da un filamento spostando la polimerasi del DNA. (B) introduzione di strand-spostando le sonde per consentire la lettura di multiplexing e fluorescenza e per monitorare i progressi di RT-LAMP in tempo reale. Ristampato con il permesso da Yaren et al 201720. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Gel analisi elettroforesi degli ampliconi. (A) primer test lampada in singleplex o multiplex (3-plex) formattare con adeguati controlli positivi e negativi. Positivi i controlli includono RNA virale purificato con i seguenti titoli: 2.85 pfu per Zika (ZV), 242 copie genomiche per Chikungunya (CH) e pfu 1.22 per Dengue 1 (D1). NTC-z, NTC-c e NTC-d stand per nessun controllo del modello per primer Zika, Chikungunya e Dengue 1 in formato singleplex, rispettivamente. NSC sta per controllo non specifico target cui totale xNA (DNA e RNA) viene Estratto da senza infezione Ae. aegypti. M sta per marcatore (scala di 50 coppie di basi del DNA). (B) ottimizzazione del dosaggio condizioni testando una temperature di incubazione gamma di RT-LAMP (da 55 ° C a 70 ° C) e MgSO4 concentrazioni (da 4 mM a 10 mM) in multiplex formato in assenza di RNA di destinazione. Ristampato con il permesso da Yaren et al 201720. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: RT-LAMP in tempo reale. (A) Singleplex e multiplex limite di rilevabilità (LOD) per Zika (ZV) usando 80 nM strand-spostando FAM-labeled sonda in tempo reale utilizzando strumenti in tempo reale di PCR (canale 483-533 nm). I campioni sono stati incubati a 65° C per circa 50 min (B) fluorescenza è stata osservata anche se un filtro arancione, seguito dall'eccitazione dei campioni a 470 nm con luce blu. Campioni dalla A sono stati utilizzati per la visualizzazione. (C) analisi in tempo reale per LOD sul bersaglio di Chikungunya (CH) utilizzando 80 nM di HEX-cuscinetto lampada sonde in singleplex formato utilizzando il canale di fluorescenza del 523-568 nm su uno strumento PCR in tempo reale. (D) analisi in tempo reale per LOD su bersagli di Dengue 1 (D1) utilizzando 80 nM di TAMRA-cuscinetto lampada sonde in singleplex formato utilizzando il canale di fluorescenza del 558-610 nm su uno strumento PCR in tempo reale. (E) determinazione del contenuto di urina massima nella reazione di RT-LAMP. Una gamma di concentrazioni di urina finale (0%-50%) sono stati testati utilizzando 80 nM FAM-labeled sonda in presenza di 2,85 pfu di Zika vRNA.NTC non = nessun controllo del modello su tutti i pannelli. Ristampato con il permesso da Yaren et al 201720. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Singleplex e multiplex di rilevamento di virus nelle urine mediante sonda di 80 nM. (A) Zika rilevazione nelle urine di 10% in formato singleplex e multiplex utilizzando 2,85 pfu di RNA virale Zika (ZV) con sonda marcata con FAM (80 nM). (B) rilevazione di Chikungunya nelle urine di 10% in formato singleplex e multiplex utilizzando 242 copie di RNA virale Chikungunya (CH) con sonda marcata con HEX (80 nM). (C) Dengue 1 rilevazione nelle urine di 10% in formato singleplex e multiplex utilizzando 1,22 pfu di RNA virale Dengue 1 (D1) con sonda marcata con TAMRA (80 nM). (D) reazioni visualizzazione di RT-LAMP attraverso filtro arancione dopo l'eccitazione a 470 nm con luce LED blu. Ristampato con il permesso da Yaren et al 201720. NTC non = nessun controllo del modello su tutti i pannelli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Singleplex e multiplex di rilevamento di virus nelle urine mediante sonda di 300 nM. (A) Zika rilevazione nelle urine di 10% in formato singleplex e multiplex utilizzando 2,85 pfu di RNA virale Zika (ZV) con sonda marcata con FAM (300 nM). (B) rilevazione di Chikungunya nelle urine di 10% in formato singleplex e multiplex utilizzando 242 copie di RNA virale Chikungunya (CH) con sonda marcata con HEX (300 nM). (C) Dengue 1 rilevazione nelle urine di 10% in formato singleplex e multiplex utilizzando 1,22 pfu di Dengue1 il RNA virale (D1) con sonda marcata con TAMRA (300 nM). (D) reazioni visualizzazione di RT-LAMP attraverso filtro arancione dopo l'eccitazione a 470 nm con luce LED blu. Come controllo positivo in esperimenti di urina, un primer di lampada impostato destinazione umana del DNA mitocondriale (mtDNA) è stato usato con sonda marcata con TET (300 nM). NTC non = nessun controllo del modello su tutti i pannelli. Ristampato con il permesso da Yaren et al 201720. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Flusso di lavoro per il rilevamento di Zika di campioni di zanzara infetta utilizzando la tecnologia Q-carta con sani e affetti da Zika Ae. aegypti (ZV 9, tabella 2). Ristampato con il permesso da Yaren et al 201720. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: finestra di osservazione. (A) l'osservazione casella utilizza due batterie AAA nella base. Queste batterie alimentano quattro luci LED blu che illuminano i campioni conservati in 0,5 mL tubi collocati nei quattro fori. Le luci LED siano accesi con un interruttore. I campioni sono visualizzati attraverso il filtro arancio. (B) in scatola di osservazione di fluorescenza. Da sinistra a destra: negativo, positivo per Zika, negativo e positivo per Zika. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Obiettivo virus | Nome | Sequenza (5' - 3') | Lunghezza | Posizione iniziale | Posizione finale | |||
| Zika | ZV-F3 | GAGACTGCTTGCCTAG | 16 | 9905 | 9920 | |||
| ZV-B3 | CTGGGGTCTTGTCTTC | 16 | 10145 | 10130 | ||||
| ZV-LF | CAGTTGGAACCCAGTCAAC | 19 | 10028 | 10010 | ||||
| ZV-LB | GTGGAACAGAGTGTGGATTG | 20 | 10093 | 10112 | ||||
| ZV-FIP | CCATGGATTGACCAGGTAGTTTTTTCGACTGATGGCCAATG | 41 | 9974 | 10053 | ||||
| ZV-BIP | ACCACTGARGACATGCTTGTTTTTCATGTGGTCGTTYTCC | 40 | 10070 | 10129 | ||||
| ZV-LB_NatTail |
FAM-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG GTGGAACAGAGTGTGGATTG |
60 | 10093 | 10112 | ||||
| Chikungunya | CH-F3 | CGTCAACGTACTCCTAAC | 18 | 2891 | 2908 | |||
| CH-B3 | ACGTTGGCTTTRTTTTGG | 18 | 3094 | 3077 | ||||
| CH-LF | AGCGTCTTTATCCACGGG | 18 | 2968 | 2951 | ||||
| CH-LB | AYGCATCRATAATGGCGGG | 19 | 3025 | 3043 | ||||
| CH-FIP | GAAGTTTCCTTTCGGTGGGTTTTTGGAAGACACTYTCYGG | 40 | 2932 | 2993 | ||||
| CH-BIP | AAGGAGTGGGAGGTGGATTTTTTCAYTTGGTGACTGCAG | 39 | 3006 | 3063 | ||||
| CH-LF_NatTail |
HEX-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG AGCGTCTTTATCCACGGG |
58 | 2968 | 2951 | ||||
| Febbre rompiossa-1 | D1-F3 | ACAGCYCTGAATGAYATGG | 19 | 9583 | 9601 | |||
| D1-B3 | GCAGTTTCTCTCAGGC | 16 | 9803 | 9788 | ||||
| D1-LF | CACTTGYTGCCARTCATTCC | 20 | 9666 | 9647 | ||||
| D1-LB | CCATGCCGYAACCAAG | 16 | 9727 | 9742 | ||||
| D1-FIP | CTGGTGGAARTGGTGTGATTTTTTGGGAACCTTCAAAAGG | 40 | 9628 | 9693 | ||||
| D1-BIP | GAAGGAYGGGAGGGAAATAGTTTTTTTAGCCCTRCCCA LUCA |
42 | 9702 | 9763 | ||||
| D1-LB_NatTail |
TAMRA-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG CCATGCCGYAACCAAG |
56 | 9727 | 9742 | ||||
| DNA mitocondriale | MtDNA-F3 | AGCCTACGTTTTCACAC | 17 | 9183 | 9199 | |||
| MtDNA-B3 | GCGCCATCATTGGTAT | 16 | 9410 | 9395 | ||||
| MtDNA-LB | GCCTAGCCATGTGATTTCAC | 20 | 9322 | 9341 | ||||
| MtDNA-LF | GGCATGTGATTGGTGGGT | 18 | 9254 | 9237 | ||||
| MtDNA-FIP | GTCATGGGCTGGGTTTTACTTTTTCTACCTGCACGACAAC | 40 | 9213 | 9228 | ||||
| MtDNA-BIP | CTCAGCCCTCCTAATGACCTTTTTGAGCGTTATGGAGTGG | 40 | 9359 | 9344 | ||||
| MtDNA-LB_NatTail |
TET-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG GCCTAGCCATGTGATTTCAC |
60 | 9322 | 9341 | ||||
| Comune quencher | CTGACCTGACGGACTGAACGGATGGCTGAGCGCA AACCCG-Iowa nero FQ |
40 | ||||||
Tabella 1: primer e sonde displaceable strand. Ristampato con il permesso da Yaren et al 201720. Sequenze in grassetto rappresentano la regione di double-stranded del filamento spostando le sonde. FAM-etichettati (visto come fluorescenza verde), HEX-etichettati (visto come luce di fluorescenza verde-giallo), TAMRA-etichettati (visto come fluorescenza rosso-arancio) e TET-etichettati (visto come fluorescenza giallo) sonde sono state assegnate a rilevare Zika, Chikungunya, Dengue 1, e DNA mitocondriale nelle urine, rispettivamente. FAM ha maxima di eccitazione e di emissione a 495 nm e 520 nm, rispettivamente. HEX ha maxima di eccitazione e di emissione a 538 nm e 555 nm, rispettivamente. TAMRA ha maxima di eccitazione e di emissione a 559 nm e 583 nm, rispettivamente. TET ha la maxima di eccitazione e di emissione a 522 nm e 539 nm, rispettivamente. Per abilitare l'utilizzo di un singolo quencher per tutti i fluorofori, Iowa nero-FQ è stato utilizzato grazie alla sua gamma ampia assorbimento (420-620 nm).
| Virus, ceppo (numero di accessione GenBank) | Famiglia/genere | Titoli virali |
| Virus di Zika (ZV), Portorico (PRVABC59, KU501215.1) | Flaviviridae/Flavivirus gruppo IV, positivo, ssRNA | 2,85 x 108 pfu/mL |
| Virus di Chikungunya (CH), Isole Vergini britanniche (ceppo asiatico, KJ451624) | Togaviridae/Alphavirus gruppo IV, positivo, ssRNA | 2,42 x 108 genomi/mL |
| Virus di Chikungunya (CH), La Reunion (Oceano Indiano lignaggio, LR2006-OPY1, KT449801) | Togaviridae/Alphavirus gruppo IV, positivo, ssRNA | 1.89 x 108 genomi/mL |
| Virus di Chikungunya (CH), La Reunion estratte NA totale da Aedes aegypti femminile (Oceano Indiano lignaggio, LR2006-OPY1, KT449801) | Togaviridae/Alphavirus gruppo IV, positivo, ssRNA | 3.85 x 105 genomi/mL |
| Sierotipo dengue 1 (D-1), Key West (FL) (JQ675358) | Flaviviridae/Flavivirus gruppo IV, positivo, ssRNA | 1.22 x 106 pfu/mL |
| Identità di zanzara Zika (ZV), ceppo | Gamba titolo pfu/mL | |
| ZV 9, Puerto Rico | 4.76 x 103 |
Tabella 2: titoli virali in colture cellulari e zanzara infetta. PFU: unità formanti placca. Ristampato con il permesso da Yaren et al 201720.
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Discussion
Zanzara virus compreso Zika, chikungunya e dengue minacciano la salute pubblica ed evidenziazione di focolai Zika risale la necessità di alternative di rilevazione di point-of-care di basso costo per la diagnostica del paziente, nonché per la sorveglianza di zanzara. Come alternative a prezzi accessibili ai sistemi basati su PCR sono stati sviluppati metodi di amplificazione isotermica. In particolare, sono state applicate piattaforme basate su RT-lampada per rilevare un'ampia gamma di agenti patogeni. Tuttavia, l'uso di piattaforme isotermiche è stato limitato principalmente alla individuazione del bersaglio singolo. Il metodo segnalato qui utilizza un RT-LAMP modificate per consentire la rilevazione simultanea di tre differenti target in una miscela di reazione singola, che corre a una gamma di temperature moderate (65-68 ° C), dimostrata di essere particolarmente conveniente perché temperature superiori ai 60 ° C il rendering Zika e altri virus non infettive30,35.
Inoltre, i dati presentati qui indicano che RT-LAMP è in grado di tollerare una inibizione di sostanze che potrebbero essere presenti in vari fluidi biologici15. Questo consente di RNA virale essere amplificati senza un ulteriore passaggio di purificazione RNA aggiungendo direttamente il campione nella miscela di reazione. A seconda del tipo di campione, il volume massimo di campione permesso deve essere determinato da non inibire la reazione e non causare fluorescenza di fondo (falso positivo). Lo studio qui presentato si concentra sull'uso di volume finale di 10% per i campioni di urina. Tuttavia, campioni di saliva e siero possono essere applicati anche per il dosaggio nella stessa maniera20. Limiti di rilevazione sono stati trovati per essere ben di sopra i carichi virali segnalati nel paziente urina13, così come le zanzare infettate da virus20,36,37.
Sorveglianza di zanzara ha solitamente una priorità più bassa per le risorse di salute pubblica, in modo un poco costoso multiplexed kit per una famiglia di indagine o di un'area pubblica avrebbe valore speciale. Di conseguenza, questo kit è stato modificato con l'aggiunta di Q-carta per consentire il rilevamento di virus nella zanzara carcasse. Q-carta contiene alti livelli di gruppi di ammonio quaternario in covalenza collegato, che permette la cattura di acidi nucleici virali sulla sua superficie attraverso interazioni coulombiane. Anche se era una preoccupazione che Q-carta potrebbe inibire RT-LAMP, è stato trovato che con l'aggiunta di trasportare carcasse di zanzara Q-carta direttamente nella miscela di RT-LAMP, rilevamento di virus di successo potrebbe essere raggiunto entro 30 min. Per la generazione del segnale di successo, Q-carta deve essere piccolo abbastanza (ad es., dimensioni 3 x 4 mm per 100 µ l di reazione) per essere immerso nella miscela di reazione di RT-LAMP. Se è troppo grande per il tubo di reazione, o inizia a galleggiare invece di rimanere immersi nel liquido, la reazione non può avvenire e risultati possono apparire come falsi negativi.
Per il rilevamento di successo e la differenziazione di ogni virus, ogni primer set deve seguire le linee guida per il disegno dell'iniettore di RT-LAMP, le regole di progettazione per lo spostamento di sonde e comprendono una scelta di fluorofori per multiplexing. Ogni primer set deve essere schermato contro diversi obiettivi per evitare la cross-reattività. Inoltre, temperatura di incubazione e di concentrazione di magnesio devono essere ottimizzate per ogni set. Metodi presentati qui utilizzano letture di fluorescenza visibile dall'occhio, che è stato compiuto con l'introduzione di sonde displaceable strand per architettura RT-LAMP. Tre colori distinti possono essere visualizzati in un'analisi multiplex quando diversi fluorofori sono stati assegnati ad ogni obiettivo virus. Questo offre vantaggi rispetto ai metodi di rilevamento Zika isotermici esistenti, poiché la maggior parte dei metodi pubblicati si basano sull'individuazione del bersaglio singolo e l'uso di coloranti intercalanti o fluorescenza, che non sono sequenza-specifico e sono inclini a generare ampliconi aspecifici.
Un passo fondamentale da considerare è la determinazione della concentrazione finale di sonde dislocante fluorescente contrassegnate. Si è constatato che da 80 a 100 nM di spostamento sonde in grado di generare segnali di fluorescenza entro 15-20 min, considerando che era in ritardo tempo per segnalare quando 300 nM di concentrazione sonda è stato utilizzato. Tempo di reazione fu ulteriormente ritardato quando i test sono stati eseguiti in modo "multiplex". Il motivo per il passaggio da 80 nM a 300 nM è stato quello di abilitare la visualizzazione di tutti i tre fluorophores utilizzando una singola sorgente LED. LED blu con eccitazione a 470 nm è adatto per sonde FAM-etichetta, ma è meno adatto per sonde HEX - o TAMRA-labeled. Di conseguenza, un sacrificio è stato effettuato il tempo di incubazione per essere in grado di visualizzare tutti e tre gli obiettivi.
Uno dei problemi con RT-LAMP è contaminazione in avanti. RT-LAMP genera grandi quantità di amplicon in un tempo di incubazione breve, e ampliconi potrebbero essere facilmente rilasciato sotto forma di aerosol. Per attenuare questo problema, dUTP era incluso insieme con altri dNTP seguita da digestione UDG durante l'impostazione dell'analisi. È importante utilizzare una versione instabile al calore degli UDG, poiché è necessario inattivare UDG per impedire la digestione degli ampliconi RT-LAMP appena generato.
Per consentire la distribuzione del kit senza refrigerazione, tutti i componenti del dosaggio necessario essere liofilizzato e il kit completati con un buffer di reidratazione. Pertanto, qualsiasi glicerolo presente in enzimi disponibili in commercio è stato rimosso mediante ultrafiltrazione perché glicerolo non può essere rimosso mediante liofilizzazione. Ad un'alta concentrazione in una miscela, glicerolo può interferire con l'attività dell'enzima. L'unico enzima non incluso nel processo di rimozione di glicerolo era l'UDG termolabili. UDG è un enzima piccolo con peso molecolare di 24,6 kDa, che lo rende inadatto per esperimenti di ultrafiltrazione. Di conseguenza, è stato aggiunto alla miscela di liofilizzazione come acquistato. Il glicerolo residuo non ha influenzato negativamente il risultato del dosaggio.
Uno dei limiti di questa tecnica di RT-lampada fluorescente è l'uso della singola sorgente a LED. Quando le analisi sono state eseguite in singleplex o formato multiplex, concentrazioni più elevate di spostando le sonde erano necessari per la visualizzazione del segnale di tutti gli obiettivi. Tuttavia, questa modifica causa ritardi nella generazione del tempo-a-segnale. Uno dei modi per superare questo potrebbe essere l'utilizzo di due sorgenti LED per meglio accogliere l'altri fluorofori (HEX e TAMRA). In questo modo, concentrazione più bassa di sonda potrebbe essere utilizzato per generare un segnale con riduzione dei tempi di incubazione.
Un'altra limitazione che ha bisogno di considerazione sta giudicando la fluorescenza di colore dall'occhio in un ambiente scarsamente illuminato. È più facile se un singolo bersaglio è presente in un singleplex o multiplex formato, dato che gli iniettori sono stati progettati non per interagire con gli altri. Il test sarebbe più difficile da interpretare se bersagli multipli erano presenti in un tubo di dosaggio singolo, ad esempio un pool di zanzare o un paziente con più di una infezione virale. Ciò richiederebbe una modifica dell'architettura di lettura, come un display digitale, piuttosto che a giudicare dall'occhio.
Un possibile approccio futuro sarebbe quella di aumentare il livello di multiplazione creando un pannello più grande della zanzara arbovirus. Questo richiede un'attenta primer progettare per evitare interazioni di primer-primer e può richiedere l'uso di analoghi dell'acido nucleico modificati come self-evitare sistemi di riconoscimento molecolare (SAMRS) e artificialmente esteso sistema di informazioni genetiche (AEGIS) a meglio ospitare elevato livello di multiplazione38. Di conseguenza, la soluzione per la lettura del segnale in un sistema multiplex più alto sarebbe di utilizzare un fluoroforo unico per ogni sonda dislocante e di assegnare una sequenza univoca di sfollati per ogni destinazione e catturare le sonde spostate su una superficie solida di DNA ibridazione. Ciò creerebbe una piattaforma matrice-formattato con un fluoroforo unico e LED per eccitare, ma a giudicare la presenza di ogni destinazione sarebbe basata sulla sua posizione nella matrice39.
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Disclosures
Molti degli autori e delle loro istituzioni proprie proprietà intellettuale connesso con questo test.
Acknowledgments
Il lavoro è stato sostenuto in parte da FDOH-7ZK15 e NIAID 1R21AI128188-01. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta in parte dal National Institutes of Allergy e malattie infettive e in parte da Biomedical Research programma di Florida Department of Health. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH o Florida Department of Health. LLC di chimica combinatoria dinamico è riconosciuto per il loro sostegno e contributo a questo progetto.
Virus di febbre rompiossa 1 (ceppo BOL-KW010) è stato gentilmente fornito dal dipartimento di Florida salute Bureau dei laboratori. Virus di Zika e variante asiatica del virus chikungunya sono stati gentilmente forniti dai centri per controllo e la prevenzione. Il lignaggio di oceano indiano di chikungunya virus era gentilmente fornito da Robert Tesh (centro di riferimento mondiale per virus d'emersione e gli arbovirus, attraverso l'Università del Texas Medical Branch a Galveston, in Texas) per l'UF-FMEL. Ringraziamo S. Bellamy, B. Eastmond, S. Ortiz, D. Velez, K. Wiggins, ZimLer r. e K. Zirbel per assistenza con gli studi di infezione. Ringraziamo anche M. S. Kim per la fornitura di Q-carta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
References
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