Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Multiplex isotermisk forstærkning baseret diagnostiske Platform til at opdage Zika, Chikungunya og Dengue 1

Published: March 13, 2018 doi: 10.3791/57051
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 1,3
1Foundation for Applied Molecular Evolution (FfAME), 2Florida Medical Entomology Laboratory, University of Florida, 3Firebird Biomolecular Sciences LLC

Summary

Nuværende multipleksede diagnostics hen til opdager Zika, chikungunya og dengue virus kræver komplekse forberedelsen og dyre instrumentering, og er vanskelige at bruge i lavt ressource miljøer. Vi viser en diagnose, der bruger isotermisk forstærkning med target-specifikke strand displaceable sonder til at registrere og skelne disse vira med høj følsomhed og specificitet.

Abstract

Zika, denguefeber og chikungunya virus overføres af myg, forårsager sygdomme med lignende patientens symptomer. Men de har forskellige downstream patient til patient transmission potentialer, og kræver meget forskellige patientbehandlingen. Således, de seneste Zika udbrud gør det tvingende nødvendigt at udvikle værktøjer, som hurtigt diskriminerer disse vira hos patienter og fanget myg, at vælge den rigtige patient behandling, og for at forstå og administrere deres epidemiologi i realtid.

Desværre, nuværende diagnostiske test, herunder de modtagende 2016 nødsituation bruge godkendelser og fast-track status, opdage viral RNA ved reverse transkription polymerase kæde reaktion (RT-PCR), som kræver instrumentation, uddannet brugere, og betydelig prøveforberedelse. Således, de skal sendes til "godkendte" referencelaboratorier, der kræver tid. Faktisk, i August 2016, Center for Disease Control (CDC) spurgte gravide kvinder der var blevet bidt af en myg og udviklet en Zika-angivelse udslæt vente en uacceptabel 2 til 4 uger før læring, uanset om de var smittet. Vi har brug meget for test, der kan ske på stedet, med få ressourcer, og af uddannede, men ikke nødvendigvis autoriseret personale.

Denne video viser en analyse, der opfylder disse specifikationer, arbejder med urin eller serum (for patienter) eller knust myg kroppe (om miljømæssige overvågning), alle uden megen forberedelse af prøver. Myg slagtekroppe er fanget på papir transporterer kvaternære ammonium grupper (Q-papir) efterfulgt af ammoniak behandling for at håndtere biologiske. Disse er derefter direkte, uden RNA isolering, bragt i assay rør der indeholder frysetørret reagenser, der behøver ingen kæde af køleanlæg. En modificeret form af reverse transkription loop-medieret isotermisk forstærkning med target-specifikke fluorescently mærket displaceable sonder producerer udlæsning i 30 min, som en trefarvet fluorescens signal. Dette er visualiseret med en håndholdt, batteridrevet enhed med et orange filter. Fremad kontaminering forhindres med forseglet rør, og brugen af termolabile uracil DNA glycosylase (UDG) under tilstedeværelse af dUTP i forstærkning blanding.

Introduction

Myg-bårne virusinfektioner, herunder dengue, chikungunya og Zika virus er på anledning og kræve øjeblikkelig forvaltningsstrategier. Dengue og chikungunya-virus er endemisk i mange af de tropiske regioner hvor Zika nu spreder sig i den vestlige halvkugle1. Zika virus, ligesom dengue, er medlem af familien Flaviviridae og er naturligt hjemmehørende til Afrika med en asiatisk og to afrikanske genetiske lineages2. Selv om identifikation af virussen Zika daterer sig tilbage til 1947, forblev Zika infektion hos mennesker sporadisk for et halvt århundrede før fremvækst i Stillehavet og Amerika. Den første rapporterede udbrud af Zika feber opstod på øen bjæffe i Mikronesiens Forenede Stater i 2007, efterfulgt af Fransk Polynesien i 2013 og 2014. Det første store udbrud i Amerika opstod i 2015 i Brasilien.

Zika, chikungunya og dengue virus er primært overføres af Aedes aegypti og Aedes albopictus. Zika har dog yderligere downstream menneske til menneske transmission muligheder, sandsynligvis spredes gennem seksuel kontakt, moderen til fosteret interaktion, og via amning3,4,5. Zika feber var først menes at forårsage kun mild sygdom. Men det blev senere tilknyttet Guillain-Barre syndrom hos voksne, microcephalus i nyfødte og kroniske muskel sygdomme, der kan sidste måneder til år. Diagnosticering af Zika sygdom kan være udfordrende, da symptomerne på en Zika infektion ligner dem af andre myg-spredning virus6. Fælles co-infektioner af disse vira gøre differentialdiagnosticering endnu mere udfordrende7,8. Derfor, hurtig og pålidelig detektion af nukleinsyrer fra Zika og andre vira er nødvendig for at forstå epidemiologi i realtid, at indlede kontrol og forebyggende foranstaltninger, og til at administrere patientpleje9.

Nuværende diagnostiske test for disse vira omfatter serologiske tests, virusisolation, virus sekvensering og omvendt-transskription PCR (RT-PCR). Standard serologiske metoder lider ofte under utilstrækkelig følsomhed og resultaterne kan være kompliceret af krydsreaktivitet i patienter, der er tidligere blevet smittet af andre flavivira.

Derfor forbliver nukleinsyre test den mest pålidelige måde at registrere og skelne disse vira. Påvisning af Zika og andre myg-bårne vira er normalt udføres ved hjælp af RT-PCR eller real-time RT-PCR i bred vifte af biologiske væsker, såsom serum, urin, spyt, sæd, modermælk og cerebral væske10,11. Urin og spyt prøver er generelt foretrækkes over blod, da de udviser mindre PCR-hæmning, højere viral belastning, virus tilstedeværelse for længere perioder, og øget brugervenlighed indsamling og håndtering af12,13. RT-PCR-baserede diagnostiske tests, omfatter imidlertid omfattende stikprøve præparationstrin og dyre termisk Cykling udstyr, hvilket gør det mindre optimal for punkt af pleje.

Reverse transkription loop-medieret isotermisk forstærkning (RT-lampe) opstået som en kraftfuld RT-PCR alternativ på grund af sin høje følsomhed og specificitet14, dens tolerance over for hæmmende stoffer i biologiske prøver15, og operation på indre temperatur, som væsentligt sænker assay kompleksitet og omkostninger, hvilket gør den velegnet til miljøer med lav ressource. RT-lampe, består som den implementeres klassisk, af seks primere, som binder til otte forskellige regioner inden for mål RNA. Det kører på konstante temperaturer mellem 60 ° C og 70 ° C, og bruger en reverse transkriptase og en DNA-polymerase med stærk strand fortrænger aktivitet.

I de indledende faser af RT-lampe danner fremad- og bagudrettet interne primere (FIP og BIP, figur 1A) sammen med ydre fremad- og bagudrettet primere (F3 og B3) en håndvægt struktur, frø opbygning af eksponentielle lampe forstærkning. Forstærkning er yderligere accelereret af de sløjfe frem og tilbage primere (LF og LB), som er designet til at binde de enkelt strandede regioner af dumbbell, og resulterer i dannelsen af concatemers med flere gentagne sløjfer16. Klassisk lampe-undersøgelser baseret på turbiditet eller udlæsning af DNA intercalating farvestoffer er ikke helt egnet for punkt af pleje påvisning af Zika, hvor nogle niveau af multiplexing er ønskede17,18,19. Multiplexing opnås ikke nemt i disse systemer, som de er tilbøjelige til at generere falske-positiver på grund af off-target redegoerelser.

For at håndtere disse spørgsmål, tilføjer litteraturen en ekstra komponent i form af en "strand-fortrænger sonde" til klassisk RT-lampe arkitektur20,21,22. Hver sonde har en sekvens-specifikke dobbelt-strenget region og en enkeltstrenget priming region. Sonden med regionen enkeltstrenget er markeret med en 5'-fluorophore, og den supplerende sonden er ændret med en 3'-enden quencher. I mangel af et mål, er uden fluorescens observeret på grund af hybridisering af de supplerende sonde tråde, som bringer fluorophore og quencher i umiddelbar nærhed. I overværelse af et mål, enkeltstrenget del af fluorescerende sonden binder sig til sit supplement på målet, og derefter udvides med en strand, fortrænger polymerase. Yderligere polymerase udvidelse af reverse primere forårsager adskillelse af quencher strand fra dets komplementære fluorescently mærket strand, giver mulighed for emission af fluorescens ()figur 1B). Med dette design, er signalet genereret efter håndvægt dannelse, at reducere chancerne for falsk-positive signaler.

Den dobbelt-strenget del af strand-fortrænger sonden kan være enhver sekvens, og når multiplexing er anvendt, den samme sekvens kan anvendes med forskellige fluorophore-quencher par. Med denne arkitektur, virus-inficeret urin, serum eller myg var prøver squished på papiret direkte introduceret til assay uden forberedelse af prøver. Trefarvet fluorescens udlæsning synlige for menneskelige øje blev genereret i 30-45 min, og signaler blev visualiseret ved en 3D-trykt observation boks, der bruger en blå LED og en orange filter. Frysetørring RT-lampe reagenser aktiveret installation af dette kit til at sænke ressourceindstillinger uden behov for køling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Myg var de eneste dyr, der direkte anvendes i denne undersøgelse. Procedurer til at håndtere kyllinger, hvis blod blev brugt til at fodre de inficerede myg, blev godkendt som IACUC protokol #201507682 ved University of Florida institutionelle dyrs pleje og brug Committee.Virus udbredelse og myg infektion undersøgelser var udført i BSL-3 facility i Florida medicinsk entomologi laboratorium i Vero Beach, blev FL. RT-lampe eksperimenter udført i BSL-2 laboratoriet deles af FfAME og Firebird biomolekylære videnskaber LLC i Alachua, FL.

1. design af primere og Strand fortrænger sonder

  1. Uddrag viral sekvenser for Dengue 1 fra bred Institut database23; sekvenser for Zika og chikungunya fra NIAID Virus patogen Database og analyse ressource24.
    1. Oprette flere sekvens alignments (MSAs) for sekvenser af interesse ved hjælp af software muskel v3.8.3125. Brug genereret MSAs at søge efter lampe primere sæt i et bevaret område af målet, og undgå ikke-relevante eller utilsigtede mål, såsom sondringer mellem undertyper af et mål.
  2. Følg designreglerne for lampe primere som beskrevet online (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/), og tillade brug af blandet baser i primere til at dække virus divergens26. For at undgå krydsreaktivitet af primer sæt, Sammenlign genereret lampe primere til NCBI RNA-virus database ved hjælp af NCBI BLAST27. Undersøg hvert sæt til at fjerne primere, der ville dimerize i en multiplex analyse ved hjælp af NCBI BLAST så godt.
  3. Skærmen den dobbelt-strenget del af strand-fortrænger sonden mod enhver viral genomet sekvens og myg genomisk sekvens. Ændre 5'-enden af target bindende sonde med fluorescein amidite (FAM), HEX farvestof og 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) farvestof til Zika, chikungunya og Dengue 1, henholdsvis.
    1. Omfatte en positiv kontrol primer til urinprøver. Design lampe primere til at målrette menneskelige mitokondrie-DNA. Label strand-fortrænger sonde med TET på 5'-enden. Label quencher sonder, der er delvist supplement til hver fluorescently mærket sonde med quencher (fx, Iowa sort-FQ) 3'-enden (tabel 1).

2. virus isolerer og inficerede myg prøver

  1. Brug isolerer Zika virus (Puerto Rico stamme), Chikungunya virus (La Réunion eller britiske Jomfruøer stamme) og Dengue serotype 1-virus (Key West stamme). Bestemme viral titers ved hjælp af plaque assay28 eller kvantitativ RT-PCR29. Uddrag viral RNA'er ved hjælp af kommercielt tilgængelige RNA udvinding kits.
    Bemærk: Tabel 2 repræsenterer de virale titers af hver isolatet anvendes i denne undersøgelse.
  2. Følg artiklen blev offentliggjort af Yaren et al. for en detaljeret protokol om infektion af Ae. aegypti hunner med Zika og chikungunya virus20. Se tabel 2 for viral titer af myg prøven inficeret med Zika virus.

3. RT-LAMPEN kombineret med termolabile Uracil DNA Glycosylase

  1. 10 x primer mix forberedelse.
    1. Forberede 100 µM stamopløsning af hver primer og sonde (Se trin 1) ved at tilføje nukleasen gratis vand. Vortex godt og opbevares ved-20 ° C indtil brug.
    2. 10 X Primer blanding for hver Zika, Dengue 1 eller mitokondriel DNA mål, mix 16 µL af FIP, 16 µL BIP, 2 µL af F3, 2 µL af B3, 5 µL af LF, 2 µL af LB, 3 µL af LB-fluorescerende mærket sonde, 4 µL af quencher sonde , og 50 µL nukleasen-gratis vand til at give alt 100 µL volumen.
    3. For 10 X Primer mix for Chikungunya, bland 16 µL af FIP, 16 µL BIP, 2 µL af F3, 2 µL af B3, 5 µL af LB, 2 µL af LF, mærket 3 µL af LF-fluorescerende sonde, 4 µL af quencher sonde og 50 µL nukleasen-gratis vand til at give alt 100 µL volumen.
      Bemærk: Sonden koncentrationen beskrevet ovenfor bruger 300 nM af endelige fluorescerende sonde og 400 nM af quencher sonde. Alternativt, brug 80 nM fluorescently mærket sonde og 200 nM af dens quencher sonden for tidstro analyse.
  2. Tilsæt 5 µL af 10 X primer mix (For 3-plex, tilføje 5 µL af hver 10 X primer mix), 5 µL af 10 X isotermisk forstærkning buffer (1 X buffer sammensætning: 20 mM Tris-HCl buffer pH 8,8, 50 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 8 mM MgSO4 0,1% Tween-20, 1 mM DTT), 7 µL af dNTP blanding (10 mM af dATP, dCTP og dGTP, 5 mM af dTTP og dUTP), 16 enheder af DNA Polymerase, 15 enheder af Reverse transkriptase, 80 enheder af rekombinant ribonuklease-inhibitor, 2 enheder af termolabile UDG, 1-2 µL af varierende mængder af vi RAL RNA'er, og vand for at bringe den samlede mængde op til 50 µL i en 0,25 mL PCR rør (Se Tabel af materialer).
  3. Omfatte negativ kontrol-assays på nuværende tidspunkt ved at erstatte viral RNA volumen med vand. Inkuber prøver mellem 65-68 ° C i 45 min til 1 time, derefter analysere ved at køre 5 µL af hver prøve på 2,5% agarosegel i 1 X TBE buffer indeholdende ethidiumbromid (0,4 µg/mL). Bruge en 25 bp eller 50 bp DNA ladder som markør på gelen.
    Bemærk: Tilføjelse af en ikke-målarter bestemt skabelon er valgfri.
  4. Til påvisning af forekomst af patogene RNA, test hver primer sæt og no-skabelon kontrollen ved varierende temperatur eller magnesium koncentrationen, da hver RT-lampe primer sæt var designet til at arbejde i varierende temperaturer (65 ° C til 68 ° C) eller magnesium koncentrationer (6-10 mM endelige). Forberede eksperimenter ved stuetemperatur.

4. RT-lampe ved hjælp af Viral RNA-Spiked urin

  1. Teste RT-lampe primere i varierende endelige koncentrationer af urin (0%, 10%, 20% og 50%) i 50 µL af samlede reaktion volumen. For 10% endelige urin koncentration, tilføje 1 µL af viral RNA til 5 µL af urin. Til 20% sidste urin koncentration, tilføje 1 µL af viral RNA til 10 µL af urin. 50% endelige urin koncentration, tilføje 1 µL af viral RNA til 25 µL af urin.
  2. Real-time overvågning af RT-lampe i 10% af urin, bruge en real-time PCR instrument (Se Tabel af materialer) med forskellige fluorophore filtre.
    1. For at læse fluorescens signaler fra FAM-mærket amplikoner for Zika, bruge et filter, der spænder fra 483 til 533 nm; HEX-mærket amplikoner for chikungunya, bruge et filter, der spænder fra 523 til 568 nm; for TAMRA-mærket amplikoner for Dengue 1, bruger et filter, der spænder fra 558 til 610 nm; og for TET-mærket amplikoner til mitokondrie-DNA, bruge et filter, der spænder fra 523 til 568 nm.
      Bemærk: FAM har excitations- og maxima af 495 nm og 520 nm, henholdsvis. HEX har excitations- og maxima af 538 nm og 555 nm, henholdsvis. TAMRA har excitations- og maxima af 559 nm og 583 nm, henholdsvis. TET har excitations- og maxima af 522 nm og 539 nm, henholdsvis.
  3. Brug 96-brønd plader og forsegle pladen med en klar plastfolie, derefter inkuberes prøver på 65-68 ° C til 60-90 min. og optage fluorescens hver 30 s ved hjælp af den lette cycler. I første omgang bruge 80 nM af fluorescently mærket sonder, og derefter prøve 300 nM af fluorescently mærket sonder.
    1. Bestemme påvisningsgrænsen for hvert mål ved at tilføje seriefremstillede fortyndet viral RNA'er i endelige urin koncentration på 10%.
      Bemærk: Brug real-time RT-lampe til at bestemme optimal temperatur, magnesiumkoncentrationen, fluorescently mærket sonde koncentration og reaktionstid.
  4. For at visualisere fluorescens oprettes ved strand displaceable sonder ved øjet, bruge en blå LED lys kilde fra en lys cycler med excitation på 470 nm (enhver gel elektroforese boks med indbygget blå lyskilde vil arbejde, se tabel over materialer), og registrere billedet med en celle foretage en opringning kamera ved stuetemperatur i mørke.
    Bemærk: Brug 300 nM fluorescently mærket sonder, når visualisering af alle tre farver af øjet ved hjælp af blå LED er nødvendig.

5. RT-lampe på påvisning af Zika-inficerede myg ved hjælp af Q-papir teknologi

  1. Forberede kvaternære ammonium-modificerede filtrerpapir (Q-papir), ifølge tidligere udgivne metoder med mindre ændringer30.
    1. Fordyb 1 g af cellulose filtrerpapir kredse (Se Tabel af materialer) med diameter på 3,5 cm i 50 mL på 1,8% af vandig NaOH opløsning i 15 min. for aktivering.
    2. Indsamle aktiveret papir cirkler af vakuum filtrering og derefter nedsænke dem i 40 mL vandig opløsning (2,3-epoxypropyl) trimethylammoniumformiat chlorid (0,28 g) natten over ved stuetemperatur.
      Bemærk: Hold masse forholdet mellem (2,3-epoxypropyl) trimethylammoniumformiat chlorid til filtrerpapir 0,28 til 1.
    3. Indsamle de resulterende kationiske papir af vakuum filtrering, og neutralisere med 50 mL af 1% eddikesyre.
    4. Vaske papir tre gange med ethanol og lufttørre under en hætte med konstant luftstrøm.
  2. Skære Q-papir ark ind i små rektangler (3 mm x 4 mm) ved hjælp af et papir punch eller saks. Knuse Ae. aegypti kvindelige myg potentielt inficeret med Zika på hver papir med en mikro pistil.
  3. Føje til hver papir 20 µL 1 M vandige ammoniakopløsning (pH ≈ 12) og vente i 5 min. Derefter vaskes hver papir engang med 20 µL af 50% EtOH og en gang med 20 µL nukleasen-gratis vand. Lufttørre papir i BSL-2 biosikkerhed kabinet for omkring 1 h.
    Bemærk: På dette punkt, prøver kan opbevares ved-20 ° C natten over, indtil brug.
  4. Brug af pincet, placere hver papir i 100 µL af RT-lampe reaktionsblandingen og inkuberes ved 65-68 ° C i 45 min. Sørg for at helt nedsænkes papir i løsning; Det bør ikke være flydende. Læse og optage fluorescens udspringer Zika virus ved hjælp af blå LED lys kilde og orange eller gule filter.

6. ingot af RT-lampe reagenser til 100 µL af reaktion volumen

  1. Forbered 10 X lampe primer blanding i punkt 3.1, og Forbered dNTP blanding indeholdende dUTP efter punkt 3.2. Butik primer blanding og dNTP'er ved-20 ° C indtil brug.
  2. Forberede 10 mL af enzymet dialyse buffer til at fjerne glycerol, ved at blande 100 µL 1 M Tris-HCl pH 7,5, 500 µL 1 m KCl, 2 µL af 0,5 M EDTA, 100 µL af 10% Triton X-100, 100 µL af 0,1 M DTT og 9.198 mL nukleasen-gratis vand. Butik dialyse buffer ved 4 ° C.
    Bemærk: Sørg for at filtrere (0,2-micron filtre) alle buffer reagens løsninger før brug og gem dem ved 4 ° C.
    1. Bruge en ultrafiltrering membran med 10 kDa cut-off grænse (Se Tabel af materialer). Placere 350 µL af dialyse buffer, 4 µL af 32 enheder af DNA Polymerase, 2 µL af 30 enheder af Reverse transkriptase og 2 µL af 80 enheder af RNase hæmmer i ultrafiltrering membran og centrifugeres ved 14.000 x g i 5 min. ved 4 ° C.
    2. Tilføje en anden 350 µL af dialyse buffer til ultrafiltrering membran og centrifuge (14.000 x g) til en anden 5 min. Tom collection tube og Gentag dette trin, derefter centrifugeres (14.000 x g) i 3 min.
    3. For eluering, invertere membranen og sted i en ny collection tube. Spin på 1.000 x g i 2 min. foranstaltning eluering volumen; Hvis mindre end 8 µL, bringe volumen op til 8 µL ved at tilføje dialyse buffer. Gemme eluering ved 4 ° C, og straks gå videre til næste trin.
      Bemærk: Denne protokol er for enkelt rør ingot, men forberede mindst 10 reaktion rør ad gangen ved hjælp af den samme ultrafiltrering membran og bruge den samme mængde af dialyse buffer.
  3. Bland 10 µL af 10 X lampe primer, hvis singleplex (for 3-plex, tilføje 10 µL af hver 10 X primer mix), 14 µL af dNTP blanding, 8 µL af dialysebehandling enzym mix, 2 µL af 2 enheder af termolabile UDG og 66 µL af nukleasen frit vand (for 3-plex bruge 46 µL) i en 0,5 mL microcentrifuge rør og lad låget åbnes. I stedet tilføje et andet låg punkteret med en nål for at tillade vapor at flygte.
  4. Straks fryse rør ved-80 ° C i 2 timer, og lyophilize tube for 4 h. dække ingot kammer med aluminiumsfolie for beskyttelse mod lys. Når reagenser er tørret, skal du fjerne de punkteret låg, slutning den oprindelige låg og gemme rør med frysetørret reagenser ved 4 ° C i mørke.
    Bemærk: Reagenser kan blive frysetørret natten over, hvis det er nødvendigt.

7. test frysetørret RT-lampe reagenser på urin og myg prøver indeholdende Zika

  1. Brug følgende emner fra sættet (Se Tabel af materialer) for Zika: en 3D-trykt observere kasse med orange filter (lang pass filter, cut-på ~ 540 nm), 2 AAA batterier til observere boks, frysetørret reaktion rør mærket ZV til Zika påvisning, og 1,1 X rehydrering Buffer i 1,5 mL skrue toppen rør.
  2. Forberede 50 mL af 1,1 X rehydrering buffer ved at blande 5,5 mL 10 X isotermisk forstærkning buffer, der kommer sammen med DNA Polymerase (Se Tabel af materialer), 3,3 mL 100 mM MgSO4, 110 µL af 0,5 M DTT, og 41.09 mL nukleasen-gratis vand. Bland godt, alikvot 1 mL af denne opløsning til 1,5 mL skrue toppen rør, og opbevares ved 4 ° C indtil brug.
  3. Tilføje 90 µL af 1,1 X rehydrering buffer til hver reaktion tube (0,5 mL). Sikre, at væsken fylder bunden af røret indeholder de frysetørrede reagenser (opløses dem med blanding af rysten, derefter kortvarigt spin ned (1.000 x g)). Tilsæt 10 µL af urinprøve spiket med viral RNA til reaktion rør (Se afsnit 4.1 for detaljer).
    1. Hvis test myg, tilføje et rektangel af Q-papir holder myg kroppe (som udarbejdet i trinene beskrevet i afsnit 5.2 og 5.3), sammen med 10 µL renset vand i stedet for urinprøver.
      Bemærk: Alternativt, tilføje 10 µL af spyt eller serum prøver i stedet for urin. Hvis prøverne er ekstraherede DNA eller RNA, tilføje 2-5 µL af prøven i rehydreret blandingen og komplet med nukleasen-gratis vand til 10 µL af slutprøven volumen.
  4. Luk låget af reaktion rør. Placere dem i en varme blok/badekar (eller inkubator) pre-sæt på 65-68 ° C. Inkuber i 30-45 min, men ikke mere end 1 h. Efter inkubationen fjernes røret fra varmen. For at forhindre forurening af fremtidige assays, sikre, at disse rør forbliver lukket.
  5. Sted reaktion rør i boksen observere; temperaturen vil falde til stuetemperatur (helst 25 ° C). Tænd kontakten på bagsiden af boksen observere. Observere prøven gennem den orange filter og fange billedet af en mobiltelefon-kamera, som holdes i en afstand, hvor billedet fylder 80% af synsfeltet.
    Bemærk: Bedre visualisering er opnået i lave lys miljøer.
  6. Efter visualisering er afsluttet, slukke for switchen. Gemme de lukkede rør i mørke, helst med køling, hvis senere visualisering er nødvendig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oprindeligt blev opførelser af hver RT-lampe primer (tabel 1) med dens tilsvarende viral RNA-substratet samt negative kontroller vurderet af gelelektroforese. RT-lampe primere var designet til target NS5 region (RNA-afhængig RNA polymerase) for Zika og Dengue 1 og nsP2 region (ikke-strukturelle protein P2) for Chikungunya. Skabeloner var total RNA ekstraheret fra viral bestande kulturperler i afrikanske green monkey nyre (Vero) celler. I ét tilfælde, samlede nukleinsyre (DNA og RNA) blev udvundet fra en Chikungunya-smittet kvinde Ae. aegypti (tabel 2).

Figur 2A viser nogle repræsentative resultater med RT-lampe udført med disse prøver. I både singleplex og multipleksede (3-plexed) tilfælde vises RT-lampe produkter som en stige af concatemers når kører på agarosegel. Negative kontrolprøver som indeholder vand, som prøven gav kun bandene for primere, selv, herunder ikke-specifikke destinationskontrolelementet hvor samlede nukleinsyre udvundet fra en ikke-inficerede Ae. aegypti kvindelige blev myg brugt som skabelon.

For at finde optimale RT-lampe betingelser, blev forskellige magnesium koncentrationer og inkubation temperaturer testet. Det konstateredes, at højere magnesium koncentrationer og lavere temperaturer kunne generere uspecifikke amplikoner, giver anledning til falske positiver. Derfor, 8 mM af magnesium og inkubation ved 65 ° C blev brugt i alle forsøg fra da af (figur 2B).

Gelelektroforese kræver åbningen af reaktion rør, som kan give anledning til kontaminering af den næste række eksperimenter af tidligere genererede amplikoner, fører til falske positiver. For at forhindre den fremad forurening, blev dTTP erstattet af lig nøgletal af dTTP og dUTP, således at dUTP ville blive indarbejdet i RT-lampe amplikoner. Dette viser den mulige forurener amplikon i et substrat for uracil-DNA glycosylase (UDG) under forberedelsen af enhver efterfølgende RT-lampe reaktioner31,32. Når der bruges en termolabile version af UDG, kan dU-holdige amplikoner fordøjes ved stuetemperatur, som RT-lampe prøver sættes, og UDG vil blive inaktiveret under isotermiske forstærkning. Derudover kan reaktion røret åbnes for en downstream analyse, når det er nødvendigt. Ud over brugen af UDG fordøjelse genererer en arkitektur, der bruger displaceable sonder fluorescens, der kan læses uden at skulle åbne reaktion tube.

Figur 3A leverer resultatet af detektionsgrænsen (LOD) for Zika ved hjælp af fluorescerende sonder målretning Zika RNA. Seriel fortynding undersøgelser viste, at undersøgelser, så lavt som 1,42 pfu kunne påvises inden for 30 min i en singleplex analyse eller en 3-plexed. Når prøverne blev yderligere fortyndet til 0.71 pfu, blev en fluorescerende signal observeret efter 40 min for en singleplex analyse, og efter 50 min for 3-plexed blandinger. Ud over real-time RT-lampe, fluorescens blev visualiseret efter 35 min gennem et orange filter, efter prøver blev udsat til blå LED lys med en excitation boelgelaengden 470 nm (figur 3B). På samme måde, detektionsgrænser blev målt på 37,8 kopier og 1,22 pfu for Chikungunya og Dengue 1, henholdsvis (figur 3 c-D).

Til at bestemme den optimale urin koncentration, Zika viral RNA (2,85 pfu) blev føjet til varierende koncentrationer af en autentisk menneskelige urinprøve (0%, 10%, 20% og 50%). Formentlig på grund af dens elektrolytter, var RT-lampe signal forsinket fra 15 til 35 min. når 50% urin blev brugt i analysen. 10% urin blev fast besluttet på at være optimal på grund af præsenterer en lavere baggrund. I mangel af Zika mål, ingen forstærkning blev observeret ved enhver koncentration, men højere baggrund fluorescens blev observeret i prøver med højere urin koncentrationen (figur 3).

For at tillade multiplexing med udlæsning af forskellige fluorescens farver, 80 nM af strand displaceable sonder blev mærket med forskellige fluorophores (FAM for Zika, HEX for Chikungunya og TAMRA for Dengue 1), men ledsaget af den samme quencher (Iowa sort-FQ) med en koncentration på 200 nM. Celle kultur-udvundet viral RNA'er (2,85 pfu for Zika, 242 viral RNA kopier for Chikungunya og 1,22 pfu for Dengue 1) blev brugt som mål, fortyndet i 10% urin. Realtid analyse af fluorescens data viste en forsinkelse i signalet generation (ca 10 min) til 3-plexed assays hvor primere for alle mål var til stede. I singleplex tilfælde, på den anden side blev reaktionen afsluttet inden for 10-15 min (figur 4A-C). Når fluorescens blev visualiseret ved hjælp af en blå LED og orange filter, blev forskelle i signalstyrke observeret for forskellige fluorophores, hvor FAM-mærket amplikoner var den mest synlige. Det ventes, siden excitation på 470 nm er tættest på maksimale FAM excitation spektrum (figur 4D).

At aktivere visualisering af alle tre farver med et enkelt LED excitation bølgelængde (470 nm), koncentrationen af displaceable sonder blev forhøjet til 300 nM og den supplerende quencher sonde til 400 nM. I singleplex tilfælde, blev signal generation afsluttet inden for 10 min for Zika, 20 min for Chikungunya og 40 min. for Dengue 1. I 3-plexed assays, men det blev yderligere forsinket af 20 min i alle assays ()figur 5A- C). Ikke desto mindre aktiveret offer i tid til signal generation visualisering af alle tre farver med blå LED-lys med orange filter. Grøn Fluorescens er observeret for Zika ved hjælp af sonder 5'-enden mærket med FAM, lys grøn-gul Fluorescens er tildelt Chikungunya hvor sonden er 5'-enden mærket med HEX, og orange-rød fluorescens bruges til Dengue 1, hvor dens sonden er 5'-enden mærket med TAMRA (fig. 5 d).

For at teste myg prøver med mulig Zika infektion, laboratorium-inficeret Ae. aegypti kvindelige myg (tabel 2) blev knust på et rektangel af Q-papir, efterfulgt af ammoniak behandling til at sterilisere virussen og binde den udsatte viral RNA til positivt ladede Q-papir. Papiret var kortvarigt vaskes med ethanol hen til ophæve pterin forbindelser til stede i myg slagtekroppe, der kan interferere med fluorescens udlæsning33,34. Q-papirer indeholdende myg blev derefter direkte nedsænket i RT-lampe blanding, og efter inkubation ved 65 ° C i 30 min, lyse grønne fluorescens blev observeret i overværelse af Zika virus (figur 6).

At levere detection kit uden en kæde af køle og gøre analysen let for at bruge, RT-lampe reagenser blev frysetørret og ledsaget af en rehydrering buffer og en 3D-trykt observation boks, der bruger en 470 nm udsender førte og en orange filter (figur 7a). ved hjælp af 9 rumfang af rehydrering buffer og 1 rumfang af urinprøve, synlig grøn fluorescens kan genereres inden for 30 min og billedet kan være fanget af hvilken som helst celle foretage en opringning kamera (figur 7B). Alternativt, myg prøver på Q-papir kan bruges af den samme analyse ved at tilføje 1 mængde vand i stedet for urinprøve.

Figure 1
Figur 1: lampe Assay Design (A) RT-lampe primere og dannelsen af en håndvægt struktur af en streng fortrænger DNA polymerase. (B) indførelse af strand-fortrænger sonder til at tillade multiplexing og fluorescens udlæsning og overvåge RT-lampe fremskridt i realtid. Genoptrykt med tilladelse fra Yaren et al. 201720. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Gel elektroforese analyse af amplikoner. (A) test lampe primere i singleplex eller multipleks (3-plex) format med ordentlig positive og negative kontroller. Positiv kontrol omfatter renset viral RNA med følgende titers: 2,85 pfu for Zika (ZV), 242 genomisk kopier for Chikungunya (CH) og 1,22 pfu for Dengue 1 (D1). NTC-z, NTC-c og NTC-d står for ingen skabelon kontrol for Zika, Chikungunya og Dengue 1 primere i singleplex format, henholdsvis. NSC står for uspecifik destinationskontrolelementet hvor samlede xNA (DNA og RNA) er udvundet fra infektionsfri Ae. aegypti. M står for markør (50 basepar DNA ladder). (B) optimering af assay betingelser ved at teste en vifte af RT-lampe inkubation temperaturer (fra 55 ° C til 70 ° C) og MgSO4 koncentrationer (fra 4 mM til 10 mM) i multiplex format i mangel af målrette RNA. Genoptrykt med tilladelse fra Yaren et al. 201720. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: RT-lampe i real-time. (A) Singleplex og multipleksede grænse detektionsgrænsen (LOD) for Zika (ZV) ved hjælp af 80 nM FAM-mærket strand-fortrænger sonden i realtid ved hjælp af real-time PCR instrument (kanal 483-533 nm). Prøverne blev inkuberet ved 65° C for ca. 50 min. (B) fluorescens blev observeret selv et orange filter efterfulgt af excitation af prøver på 470 nm med blåt lys. Prøver fra A blev brugt til visualisering. (C) Real-time analyser for LOD på Chikungunya (CH) Målet med 80 nM af HEX-bærende lampe sonder i singleplex format ved hjælp af fluorescens kanal af 523-568 nm på en real-time PCR instrument. (D) Real-time analyser for LOD på Dengue 1 (D1) mål ved hjælp af 80 nM af TAMRA-bærende lampe sonder i singleplex format ved hjælp af fluorescens kanal 558-610 nm på en real-time PCR instrument. (E) fastsættelsen af maksimale urin indhold i RT-lampe reaktion. En række endelige urinkoncentrationer (0%-50%) blev testet ved hjælp af 80 nM FAM-mærket sonden i overværelse af 2,85 pfu af Zika vRNA.NTC = ingen skabelon kontrol på alle paneler. Genoptrykt med tilladelse fra Yaren et al. 201720. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Singleplex og multiplex viruspåvisning i urin ved hjælp af 80 nM sonde. (A) Zika påvisning i 10% urin i singleplex og multiplex-format ved hjælp af 2,85 pfu Zika (ZV) viral RNA med FAM-mærket sonde (80 nM). (B) Chikungunya påvisning i 10% urin i singleplex og multiplex-format ved hjælp af 242 kopier af Chikungunya (CH) viral RNA med HEX-mærket sonde (80 nM). (C) Dengue 1 påvisning i 10% urin i singleplex og multiplex-format ved hjælp af 1,22 pfu af Dengue 1 (D1) viral RNA med TAMRA-mærket sonde (80 nM). (D) visualisering af RT-lampe reaktioner gennem orange filter efter excitation på 470 nm med blåt LED lys. Genoptrykt med tilladelse fra Yaren et al. 201720. NTC = ingen skabelon kontrol på alle paneler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Singleplex og multiplex viruspåvisning i urin ved hjælp af 300 nM sonde. (A) Zika påvisning i 10% urin i singleplex og multiplex-format ved hjælp af 2,85 pfu Zika (ZV) viral RNA med FAM-mærket sonde (300 nM). (B) Chikungunya påvisning i 10% urin i singleplex og multiplex-format ved hjælp af 242 kopier af Chikungunya (CH) viral RNA med HEX-mærket sonde (300 nM). ()C) Dengue 1 påvisning i 10% urin i singleplex og multiplex-format ved hjælp af 1,22 pfu af Dengue1 (D1) viral RNA med TAMRA-mærket sonde (300 nM). (D) visualisering af RT-lampe reaktioner gennem orange filter efter excitation på 470 nm med blåt LED lys. Som positiv kontrol i urin eksperimenter, en lampe primer angive målretning menneskelige mitokondrie-DNA (mtDNA) blev brugt med TET-mærket sonde (300 nM). NTC = ingen skabelon kontrol på alle paneler. Genoptrykt med tilladelse fra Yaren et al. 201720. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Arbejdsgang for Zika påvisning af inficerede myg prøver ved hjælp af Q-papir teknologi med sunde og Zika-inficerede Ae. aegypti (ZV 9, tabel 2). Genoptrykt med tilladelse fra Yaren et al. 201720. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: boksen observere. (A) at observere boks bruger to AAA-batterier i basen. Disse batterier power fire blå LED-lys, der lyser prøverne afholdt i 0,5 mL rør placeret i de fire huller. LED-lys er tændt med en switch. Prøverne er visualiseret gennem den orange filter. (B) Fluorescens i observation boks. Fra venstre mod højre: negative og positive for Zika, negative og positive for Zika. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Target virus Navn Rækkefølge (5' - 3') Længde Startposition Endestop
Zika ZV-F3 GAGACTGCTTGCCTAG 16 9905 9920
ZV-B3 CTGGGGTCTTGTCTTC 16 10145 10130
ZV-LF CAGTTGGAACCCAGTCAAC 19 10028 10010
ZV-LB GTGGAACAGAGTGTGGATTG 20 10093 10112
ZV-FIP CCATGGATTGACCAGGTAGTTTTTTCGACTGATGGCCAATG 41 9974 10053
ZV-BIP ACCACTGARGACATGCTTGTTTTTCATGTGGTCGTTYTCC 40 10070 10129
ZV-LB_NatTail FAM-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
GTGGAACAGAGTGTGGATTG		 60 10093 10112
Chikungunya CH-F3 CGTCAACGTACTCCTAAC 18 2891 2908
CH-B3 ACGTTGGCTTTRTTTTGG 18 3094 3077
CH-LF AGCGTCTTTATCCACGGG 18 2968 2951
CH-LB AYGCATCRATAATGGCGGG 19 3025 3043
CH-FIP GAAGTTTCCTTTCGGTGGGTTTTTGGAAGACACTYTCYGG 40 2932 2993
CH-BIP AAGGAGTGGGAGGTGGATTTTTTCAYTTGGTGACTGCAG 39 3006 3063
CH-LF_NatTail HEX-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
AGCGTCTTTATCCACGGG		 58 2968 2951
Dengue-1 D1-F3 ACAGCYCTGAATGAYATGG 19 9583 9601
D1-B3 GCAGTTTCTCTCAGGC 16 9803 9788
D1-LF CACTTGYTGCCARTCATTCC 20 9666 9647
D1-LB CCATGCCGYAACCAAG 16 9727 9742
D1-FIP CTGGTGGAARTGGTGTGATTTTTTGGGAACCTTCAAAAGG 40 9628 9693
D1-BIP GAAGGAYGGGAGGGAAATAGTTTTTTTAGCCCTRCCCA
CAAG		 42 9702 9763
D1-LB_NatTail TAMRA-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
CCATGCCGYAACCAAG		 56 9727 9742
Mitokondrie-DNA MtDNA-F3 AGCCTACGTTTTCACAC 17 9183 9199
MtDNA-B3 GCGCCATCATTGGTAT 16 9410 9395
MtDNA-LB GCCTAGCCATGTGATTTCAC 20 9322 9341
MtDNA-LF GGCATGTGATTGGTGGGT 18 9254 9237
MtDNA-FIP GTCATGGGCTGGGTTTTACTTTTTCTACCTGCACGACAAC 40 9213 9228
MtDNA-BIP CTCAGCCCTCCTAATGACCTTTTTGAGCGTTATGGAGTGG 40 9359 9344
MtDNA-LB_NatTail TET-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
GCCTAGCCATGTGATTTCAC		 60 9322 9341
Fælles quencher CTGACCTGACGGACTGAACGGATGGCTGAGCGCA
AACCCG-Iowa sort FQ		 40

Tabel 1: primere og strand displaceable sonder. Genoptrykt med tilladelse fra Yaren et al. 201720. Sekvenser i fed repræsenterer den dobbelt-strenget region strand fortrænger sonder. FAM-mærket (ses som grønne fluorescens), HEX-mærket (set som lys grøn-gul fluorescens), TAMRA-mærket (ses som orange-røde fluorescens), og TET-mærket (ses som gult fluorescens) sonder blev tildelt til at opdage Zika, Chikungunya, Dengue 1, og mitokondrie-DNA i urinen, henholdsvis. FAM har excitations- og maxima på 495 nm og 520 nm, henholdsvis. HEX har excitations- og maxima på 538 nm og 555 nm, henholdsvis. TAMRA har excitations- og maxima på 559 nm og 583 nm, henholdsvis. TET har excitations- og maksima på 522 nm og 539 nm, henholdsvis. For at aktivere brugen af en enkelt quencher for alle fluorophores, blev Iowa sort-FQ brugt på grund af sin brede absorption vifte (420-620 nm).

Virus, stamme (GenBank stammesamlingsnummer) Familie/slægt Viral titers
Zika virus (ZV), Puerto Rico (PRVABC59, KU501215.1) Flaviviridae/Flavivirus gruppe IV, positiv, ssRNA 2,85 x 108 pfu/mL
Chikungunya virus (CH), britiske Jomfruøer (asiatisk afstamning, KJ451624) Togaviridae/Alphavirus gruppe IV, positiv, ssRNA 2,42 x 108 genomer/mL
Chikungunya virus (CH), La Reunion (indiske Ocean slægt, LR2006-OPY1, KT449801) Togaviridae/Alphavirus gruppe IV, positiv, ssRNA 1.89 x 108 genomer/mL
Chikungunya virus (CH), La Reunion udvundet samlede NA fra Aedes aegypti kvindelige (indiske Ocean afstamning, LR2006-OPY1, KT449801) Togaviridae/Alphavirus gruppe IV, positiv, ssRNA 3,85 x 105 genomer/mL
Dengue serotype 1 (D-1), Key West (FL) (JQ675358) Flaviviridae/Flavivirus gruppe IV, positiv, ssRNA 1.22 x 106 pfu/mL
Zika (ZV) myg identitet, stamme Ben titer pfu/mL
ZV 9, Puerto Rico 4.76 x 103

Tabel 2: Viral titers i cellekulturer og inficerede myg. PFU: plak-dannende enhed. Genoptrykt med tilladelse fra Yaren et al. 201720.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Myg-bårne vira herunder Zika, chikungunya og dengue truer folkesundheden og de seneste Zika udbrud fremhæve behovet for lavpris-punkt af pleje påvisning alternativer for patientens diagnostik samt for myg overvågning. Isotermisk forstærkning metoder blev udviklet som overkommelige alternativer til PCR-baserede systemer. Især, er RT-lampe-baserede platforme blevet anvendt til påvisning af en bred vifte af patogener. Brugen af isotermisk platforme har imidlertid primært begrænset til enkelt target detection. Metoden rapporteret her bruger en modificeret RT-lampe til at tillade samtidige påvisning af tre forskellige mål i en enkelt reaktionsblanding, der kører på en række moderate temperaturer (65-68 ° C), vist sig for at være praktisk, især fordi temperaturer højere end 60 ° C render Zika og andre vira ikke-infektiøse30,35.

Data præsenteres her viser yderligere, at RT-lampe er i stand til at tolerere hæmmende stoffer, som kan være til stede i forskellige biologiske væsker15. Dette giver mulighed for viral RNA'er skal forstærkes uden et ekstra trin i RNA oprensning af direkte tilføje prøven i reaktionsblandingen. Afhængigt af typen prøve tilladt den maksimale volumen af prøven skal bestemmes ikke hæmme reaktionen og ikke forårsage baggrund fluorescens (falsk positiv). Undersøgelsen præsenteret her fokuserer på brugen af 10% endelige mængden til urinprøver. Spyt og serum prøver kan imidlertid også anvendes på analysen i de samme måde20. Detektionsgrænser fandtes for at være godt over de rapporterede viral belastninger i patientens urin13, samt virus-inficerede myg20,36,37.

Myg overvågning har normalt en lavere prioritet for folkesundheden ressourcer, så en billig multipleksede kit til at kortlægge en husholdning eller et offentligt område ville have særlig værdi. Derfor, dette kit blev ændret ved tilsætning af Q-papir til giver mulighed for påvisning af virus i myg slagtekroppe. Q-papir indeholder høje niveauer af kovalent vedlagte kvaternære ammonium grupper, som tillader opsamling af viral nukleinsyrer på dens overflade gennem coulombic interaktioner. Selv om det var en bekymring, Q-papir kan hæmme RT-lampe, konstateredes det, at ved at tilføje Q-papir regnskabsmæssige myg slagtekroppe direkte i RT-lampe blandingen, vellykket virus opdagelse kunne nås indenfor 30 min. For vellykket signal generation, Q-papir skal være lille nok (fxstørrelse som 3 x 4 mm til 100 µL reaktion volumen) at blive nedsænket i reaktionsblandingen RT-lampe. Hvis det er for stor til reaktion røret, eller starter flydende i stedet for resterende nedsænket i væsken, reaktionen kan ikke finde sted, og resultatet kan vises som falske negativer.

Succesfuld registrering og differentiering af hver virus indstille hver primer skal følge retningslinjerne for RT-lampe primer design, designreglerne for fortrænge sonder, og omfatter et udvalg af fluorophores for multiplexing. Hver primer sæt skal være Afskærmet mod forskellige mål for at undgå krydsreaktivitet. Derudover magnesium koncentration og inkubering temperatur skal optimeres for hvert sæt. Metoder præsenteres her bruge fluorescens udlæsninger synlige med det blotte øje, som blev gennemført ved at indføre strand displaceable sonder til RT-lampe arkitektur. Tre forskellige farver kan visualiseres i en multiplex assay, når forskellige fluorophores blev tildelt til hvert mål virus. Dette giver fordele i forhold til eksisterende isotermisk Zika påvisningsmetoder, da de fleste af de offentliggjorte metoder stole på enkelt target registrering og brug af intercalating eller fluorescens farvestoffer, der er ikke sekvens-specifikke og er tilbøjelige til at generere ikke-specifik amplikoner.

Et afgørende skridt til at overveje, er fastsættelsen af den endelige koncentration af fluorescently mærket fortrænger sonder. Det blev konstateret, at 80 til 100 nM fortrænger sonder kunne generere fluorescens signaler inden for 15-20 min, mens tid at signalere blev forsinket når 300 nM af sonden koncentration blev brugt. Reaktionstid blev yderligere forsinket da assays blev kørt i en multiplex mode. Grund til at skifte fra 80 nM til 300 nM var at aktivere visualisering af alle tre fluorophores ved hjælp af et enkelt LED kilde. Blå LED med excitation på 470 nm er velegnet til FAM-mærket sonder, men er mindre egnet til HEX - eller TAMRA-mærket sonder. Derfor foregik et offer på inkubationstiden at visualisere alle tre mål.

Et af problemerne med RT-lampe er fremad forurening. RT-lampe genererer store mængder af amplikon i en kort inkubationstiden, og amplikoner kan meget let blive frigivet som aerosoler. For at afhjælpe dette problem, var dUTP inkluderet sammen med andre dNTP'er efterfulgt af UDG fordøjelsen under assay set-up. Det er vigtigt at bruge en varme-labil version af UDG, da det er nødvendigt at inaktivere UDG for at forhindre fordøjelsen af nyligt genererede RT-lampe amplikoner.

For at tillade fordelingen af kit uden køling, alle dele af analysen skulle være frysetørret og sættet suppleret med en rehydrering buffer. Derfor, enhver til stede i kommercielt tilgængelige enzymer glycerol fjernet ved ultrafiltrering fordi glycerol ikke kan fjernes ved ingot. I en høj koncentration i en blanding, kan glycerol interferere med enzymaktivitet. Kun enzymet ikke inkluderet i processen til fjernelse af glycerol var den termolabile UDG. UDG er en lille enzym med molekylevægt af 24.6 kDa, hvilket gør det uegnet til ultrafiltrering eksperimenter. Det var derfor tilføjes ingot blandingen som købt. De resterende glycerol påvirkede ikke negativt assay's resultat.

En af begrænsningerne i denne fluorescerende RT-lampe teknik er brugen af den enkelte LED kilde. Når assays blev kørt i singleplex eller multiplex format, var højere koncentrationer af fortrænger sonder nødvendige for signal visualisering af alle mål. Men denne ændring medfører forsinkelser i at tidssignal generation. En mulig måde at løse dette kunne være anvendelsen af to LED kilder til bedre at kunne rumme de andre fluorophores (HEX og TAMRA). Denne måde, kunne lavere sonde koncentration bruges til at generere et signal med kortere inkuberingstider.

En anden begrænsning, der kræver overvejelse er at dømme fluorescens farve med det blotte øje i et svagt oplyste miljø. Det er lettere, hvis et enkelt mål er til stede i en singleplex eller multiplex format, da primere var designet ikke at interagere med hinanden. Analysen vil være sværere at fortolke hvis flere mål var til stede i en enkelt assay rør, såsom en pulje af myg eller en patient med mere end en virusinfektion. Dette ville kræve en ændring af læse-out arkitektur, som en digital skærm i stedet for at dømme ved øjet.

En mulig fremtidig strategi ville være at øge niveauet for multiplexing ved at skabe en større panel af myg-bårne arboviruses. Dette kræver omhyggelig primer design for at undgå primer-primer interaktioner, og kan kræve brug af modificerede nukleinsyre analoger såsom selv at undgå molekylære anerkendelse systemer (SAMRS) og kunstigt udvidet genetisk informationssystem (AEGIS) til bedre plads til højt niveau af multiplexing38. Derfor ville løsning for signal læse-out i en højere multiplex system være at bruge en enkelt fluorophore for hver fortrænger sonde, og til at tildele en unik fordrevne sekvens for hvert mål og fange de fordrevne sonder på en solid overflade af DNA hybridisering. Dette ville skabe en array-formateret platform med en enkelt fluorophore og LED til at begejstre, men at dømme tilstedeværelsen af hvert mål ville være baseret på sin position i array39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Flere af forfatterne og deres institutioner egen intellektuel ejendomsret knyttet til dette assay.

Acknowledgments

Værket var delvist understøttet af FDOH-7ZK15 og NIAID 1R21AI128188-01. Forskning rapporteret i denne publikation blev delvist understøttet af nationale institutter for allergi og smitsomme sygdomme, og dels af biomedicinsk forskning Program fra Florida Department of Health. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af NIH eller Florida Department of Health. Dynamisk kombinatorisk kemi LLC er anerkendt for deres støtte og bidrag til dette projekt.

Dengue 1 virus (stamme BOL-KW010) var venligst leveret af Florida Department af sundhed Præsidiet af laboratorier. Zika virus og den asiatisk afstamning af chikungunya virus var nådigt fastsat af Centers for Disease Control og forebyggelse. Det Indiske Ocean afstamning af chikungunya-virus blev venligst leveret af Robert Tesh (World Reference Center for Emerging vira og Arboviruses, gennem University of Texas Medical branche i Galveston, Texas) til UF-FMEL. Vi takker S. Bellamy, B. Eastmond, S. Ortiz, D. Velez, K. Wiggins, R. ZimLer og K. Zirbel for bistand med infektion undersøgelser. Vi takker også M. S. Kim for at levere Q-papir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS Major Science MBE-150 Gel electrophoresis
G:BOX F3 Syngene G:BOX F3 Gel imaging
LightCycler 480 Instrument II, 96-well Roche Applied Science 05 015 278 001 Real-time PCR
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane Millipore Sigma UFC501096 ultrafiltraton membrane for dialysis
Eppendorf 5417C Centrifuge Marshall Scientific EP-5417C centrifuge
Myblock Mini Drybath Benchmark Scientific BSH200 drybath
FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System Labconco 7934020 lyophilizer
all priers and probes IDT custom RT-LAMP primers and probes
dNTP set Bioline BIO-39049
Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) Promega U1191
Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase New England Biolabs M0538L enzyme
WarmStart RTx Reverse Transcriptase New England Biolabs M0380L enzyme
RNase Inhibitor, Murine New England Biolabs M0314L enzyme
Antarctic Thermolabile UDG New England Biolabs M0372L enzyme
50bp DNA Step Ladder Promega G4521 marker
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Roche Applied Science 4729692001 real-time RT-LAMP analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
  2. Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636 (2014).
  3. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
  4. Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clin Microbiol Rev. 29, (2016).
  5. Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
  6. Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
  7. Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
  8. Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
  9. Shukla, S., Hong, S. -Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685 (2016).
  10. Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295 (2016).
  11. Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
  12. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. Journal of Clinical Virology. 68, 53-55 (2015).
  13. Gourinat, A. C., O'Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M. Detection of zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 21, (2015).
  14. Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28, (2000).
  15. Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
  16. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
  17. Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
  18. Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
  19. Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
  20. Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
  21. Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
  22. Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
  23. Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
  24. Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
  25. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
  26. Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
  27. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
  29. Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
  30. Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
  31. Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
  32. Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605 (2016).
  33. Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
  34. Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
  35. Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
  36. Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22 (2010).
  37. Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226 (2015).
  38. Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
  39. Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , 62,381,759 (2016).

Tags

Biokemi sag 133 punkt af care diagnostics multipleksede isotermisk forstærkning loop-medieret isotermisk forstærkning Zika påvisning fluorescens udlæsning ingen RNA udvinding myg overvågning påvisning af virus
Multiplex isotermisk forstærkning baseret diagnostiske Platform til at opdage Zika, Chikungunya og Dengue 1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yaren, O., Alto, B. W., Bradley, K.… More

Yaren, O., Alto, B. W., Bradley, K. M., Moussatche, P., Glushakova, L., Benner, S. A. Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1. J. Vis. Exp. (133), e57051, doi:10.3791/57051 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter