Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Published: March 13, 2018 doi: 10.3791/57051
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 1,3
1Foundation for Applied Molecular Evolution (FfAME), 2Florida Medical Entomology Laboratory, University of Florida, 3Firebird Biomolecular Sciences LLC

Summary

Huidige multiplexed diagnostiek te detecteren Zika, chikungunya, dengue virussen vereisen complexe monstervoorbereiding en dure instrumentatie en moeilijk te gebruiken in omgevingen met lage resource. Laten we een diagnose die gebruikmaakt van isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte strand verschuifbare sondes op te sporen en deze virussen onderscheiden met hoge gevoeligheid en specificiteit.

Abstract

Zika, dengue en chikungunya virussen worden overgebracht door muggen, ziekten met soortgelijke patiënt symptomen veroorzaken. Echter ze hebben verschillende downstream patiënt-te-patiënt transmissie mogelijkheden, en vereisen zeer verschillende behandelingen van de patiënten. Dus, recente Zika uitbraken maken het dringend noodzakelijk dat het ontwikkelen van hulpmiddelen die deze virussen bij patiënten snel te discrimineren en gevangen muggen, selecteert u de juiste behandeling van de patiënt, en te begrijpen en beheren van hun epidemiologie in real-time.

Helaas, huidige diagnostische tests, met inbegrip van die ontvangende 2016 noodsituatie gebruik vergunningen en fast track status, detecteren virale RNA door omgekeerde transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR), waarvoor instrumentatie, opgeleid gebruikers, en bereiding van de grote monsters. Aldus, moeten zij worden verzonden naar "goedgekeurde" referentielaboratoria, waarvoor van tijd. Inderdaad, in augustus 2016, het Center for Disease Control (CDC) vroeg zwangere vrouwen die was gebeten door een mug en een uitslag Zika-vermelding een onaanvaardbaar 2 tot 4 weken vóór leren wachten of ze besmet werden ontwikkeld. We moeten heel veel tests die kunnen worden gedaan op de site, met weinig middelen en door opgeleide maar niet noodzakelijkerwijs gelicentieerde personeel.

Deze video toont een bepaling dat voldoet aan deze specificaties, met urine of serum (voor patiënten) of geplette muggen karkassen (voor milieu bewaking), werkt alles zonder veel bereiding van de monsters. Mosquito karkassen worden vastgelegd op papier uitvoering quaternaire ammoniumzouten groepen (Q-papier) gevolgd door ammoniak behandeling voor het beheer van gevaren. Deze zijn vervolgens rechtstreeks, zonder RNA isolatie, gestoken assay buizen met gevriesdroogde reagentia moeten geen ketting van koeling. Een gewijzigde vorm van omgekeerde transcriptie lus-gemedieerde isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte fluorescently tagged verschuifbare sondes produceert uitlezing, in 30 min, als een signaal van de drie kleuren fluorescentie. Dit wordt gevisualiseerd met een handheld, batterij-aangedreven apparaat met een oranje filter. Voorwaartse besmetting is met verzegelde buizen, en het gebruik van thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG) in aanwezigheid van dUTP in het mengsel versterking verhinderd.

Introduction

Muggen overgebrachte virusinfecties, met inbegrip van Zika-virus, dengue en chikungunya zijn op de opkomst en vraag onmiddellijk beheersstrategieën. Dengue en chikungunya virussen zijn al endemisch in veel van de tropische gebieden waar Zika nu in het westelijk halfrond1zich verspreidt. Zika virus, zoals dengue, deel uitmaakt van de Flavivirus -familie en is inheems in Afrika met een Aziatische en twee Afrikaanse genetische lineages2. Hoewel de identificatie van de Zika-virus uit 1947 dateert, bleef Zika infectie bij de mens sporadische voor een halve eeuw vóór de opkomst in de Stille Oceaan en Amerika. De eerste gemelde uitbraak van Zika koorts vond plaats op het eiland Yap in de Federale Staten van Micronesia in 2007, gevolgd door Frans-Polynesië in 2013 en 2014. De eerste grote uitbraak in Amerika vond plaats in 2015 in Brazilië.

Zika, dengue en chikungunya virussen zijn vooral overgedragen door Aedes aegypti en Aedes albopictus. Zika heeft echter extra downstream mens-tot-mens transmissie mogelijkheden, waarschijnlijk wordt verspreid via seksueel contact, moeder-naar-foetus interactie, en via de borstvoeding3,4,5. Zika koorts werd voor het eerst geloofde alleen milde ziekte veroorzaken. Het was echter later Guillain-Barré syndroom bij volwassenen, microcefalie in pasgeborenen en chronische spier-en ziekten die laatste maanden tot jaren kunnen zijn gekoppeld. Diagnose van Zika ziekte kan lastig zijn, omdat de symptomen van een infectie Zika vergelijkbaar met die van andere mug-spread virussen6 zijn. Voorkomende co-infecties van deze virussen maken differentiële diagnose nog grotere uitdaging7,8. Snelle en betrouwbare detectie van de nucleïnezuren van Zika en andere virussen is daarom nodig om te begrijpen van de epidemiologie in real-time, bij het starten van de controle- en preventiemaatregelen, en het beheren van patiëntenzorg9.

Huidige diagnostische tests voor deze virussen omvatten serologische tests, isolatie van het virus, virus sequencing en omgekeerde-transcriptie PCR (RT-PCR). Standaard serologische benaderingen vaak lijden aan ontoereikende gevoeligheid en resultaten kunnen worden bemoeilijkt door Kruisallergie bij patiënten die eerder zijn door andere flavivirussen besmet.

Nucleïnezuur testen blijft daarom de meest betrouwbare manier om te ontdekken en te onderscheiden van deze virussen. Detectie van Zika en andere door muggen overgebrachte virussen wordt meestal uitgevoerd met behulp van de RT-PCR of RT-PCR in real time in verscheidenheid van biologische vloeistoffen, zoals serum, urine, speeksel, sperma, moedermelk en cerebrale vloeistof10,11. Urine en speeksel monsters zijn over het algemeen de voorkeur over bloed, omdat zij vertonen minder PCR-inhibitie, hogere virale belasting, virus aanwezigheid voor langere tijd, en het verhoogde gebruiksgemak verzamelen en verwerken van12,,13. RT-PCR-gebaseerde diagnostische tests, bestaat echter uit uitgebreide steekproef voorbereiding stappen en dure thermische fietsen apparatuur, waardoor het minder optimaal voor de point-of-care.

Omgekeerde transcriptie lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) heeft ontpopt als een krachtige RT-PCR alternatief vanwege de hoge gevoeligheid en specificiteit14, zijn tolerantie voor remmende stoffen in biologische monsters15, en werking op interne temperatuur, die aanzienlijk verlaagt assay complexiteit en bijkomende kosten, waardoor het geschikt is voor omgevingen met lage resource. RT-LAMP, omvat zoals het klassiek wordt uitgevoerd, zes inleidingen die zich aan acht verschillende regio's binnen het doeldocument RNA binden. Het draait bij een constante temperatuur tussen 60 ° C en 70 ° C, en gebruikt een reverse-transcriptase en een polymerase van DNA met sterke strand verdringt activiteit.

Tijdens de eerste stadia van de RT-LAMP vormen voorwaartse en achterwaartse interne inleidingen (FIP en BIP, figuur 1A) samen met de buitenste voorwaartse en achterwaartse inleidingen (F3 en B3) een halter-structuur, de zaad-structuur van de exponentiële versterking van de LAMP. Versterking verder wordt versneld door de lus voorwaartse en achterwaartse inleidingen (LF en LB), die zijn ontworpen om het binden van de enkele gestrande regio's van de halter, en resulteert in de vorming van concatemers met meerdere herhalende lussen16. Klassieke LAMP testen op basis van troebelheid of uitlezing door DNA intercalating kleurstoffen is niet geheel geschikt voor point-of-care detectie van Zika, waar sommige multiplexing is gewenst17,18,19. Multiplex is niet gemakkelijk verkregen in deze systemen, zoals ze gevoelig zijn voor het genereren van vals-positieven te wijten aan uit-target amplifications.

Voor het beheren van deze kwesties, wordt extra materiaal in de vorm van een "deel-verdringt probe" in de literatuur toegevoegd aan de klassieke RT-LAMP het platform20,21,22. Elke sonde heeft een reeks specifieke dubbele-strand en een single-stranded priming-regio. De sonde met de single-stranded regio is gelabeld met een 5'-fluorophore, en de aanvullende sonde wordt gewijzigd met een quencher van 3'-eind. Bij gebrek aan een doel, wordt geen fluorescentie waargenomen als gevolg van de kruising van de strengen van complementaire sonde, waardoor de fluorophore en de quencher in de nabijheid. In aanwezigheid van een doel, het single-stranded gedeelte van de fluorescente sonde bindt aan het complement op de doelgroep, en vervolgens door een strand verdringt polymerase is uitgebreid. Verdere uitbreiding van de polymerase door omgekeerde inleidingen zorgt ervoor dat de scheiding van het quencher deel van haar aanvullende fluorescently geëtiketteerde strand, waardoor de uitstoot van fluorescentie ()figuur 1B). Met dit ontwerp, wordt het signaal gegenereerd na de vorming van de halter, vermindering van de kans op vals-positieve signalen.

Het double-stranded gedeelte van de sonde strand-verdringt kan een willekeurige tekenreeks, en wanneer multiplexing wordt toegepast, dezelfde volgorde kan worden gebruikt met verschillende fluorophore-quencher-paren. Met deze het platform, virus-besmette urine, serum of mug kennisgemaakt monsters squished op papier rechtstreeks met de bepaling zonder bereiding van de monsters. Drie kleuren fluorescentie read-outs zichtbaar voor het menselijk oog werden gegenereerd binnen 30-45 min en signalen waren gevisualiseerd door een 3D-gedrukte observatie-box die gebruikmaakt van een blauwe LED en een oranje filter. Trekkers van de RT-LAMP reagentia ingeschakeld implementatie van deze kit te verlagen van broninstellingen zonder behoefte aan koeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: Muggen waren de enige dieren die direct gebruikt in deze studie. De procedures voor het beheren van kippen, wiens bloed te voeden de besmette muggen werd gebruikt, werden goedgekeurd als IACUC Protocol #201507682 door de Universiteit van Florida institutionele dierenverzorgers en gebruik Committee.Virus voortplanting en mug infectie studies waren uitgevoerd op de BSL-3 faciliteit van het Florida medische entomologie laboratorium in Vero Beach, werden FL. RT-LAMP experimenten uitgevoerd in het laboratorium van de BSL-2 gedeeld door FfAME en Firebird Biomoleculaire Wetenschappen LLC in Alachua, FL.

1. ontwerp van Primers en Strand verdringt sondes

  1. Uittreksel van virale opeenvolgingen voor Dengue 1 uit de brede Instituut database23; sequenties voor Zika en chikungunya van de NIAID Virus Pathogen Database en analyse Resource24.
    1. Maak meerdere reeks aanpassingen (MSAs) voor reeksen van belang met behulp van software spier v3.8.3125. Gegenereerde MSAs gebruiken om te zoeken naar LAMP inleidingen sets binnen een geconserveerde regio van het doel, en het vermijden van niet-relevante of onbedoelde doelen, zoals het onderscheid tussen de subtypes van een doel.
  2. Volg de regels voor het ontwerp voor LAMP inleidingen als beschreven online (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/), en laat het gebruik van gemengde bases in inleidingen ter dekking van de virus divergentie26. Om te voorkomen dat een Kruisallergie van primer sets, gegenereerd vergelijk LAMP inleidingen tot de NCBI RNA virus database met behulp van de NCBI BLAST27. Vergelijk elke set te elimineren inleidingen die in een multiplexed assay met behulp van NCBI BLAST ook zou dimerize.
  3. Het scherm van het double-stranded gedeelte van de sonde strand-verdringt tegen elke virale genoom en mug genomic volgorde. 5'-uiteinden van doel bindende sonde met fluoresceïne amidite (FAM), HEX kleurstof en 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) kleurstof voor Zika, chikungunya en Dengue 1, respectievelijk wijzigen.
    1. Omvatten een primer van de positieve controle instellen voor urine monsters. LAMP inleidingen te richten op menselijke mitochondriaal DNA ontwerpen. Label strand-verdringt sonde met TET op 5'-eind. Label quencher sondes die gedeeltelijk aanvulling op elk fluorescently label sonde met quencher (bijvoorbeeld, Iowa zwart-FQ) op 3'-eind (tabel 1).

2. virus isoleert en besmette mug monsters

  1. Gebruik isoleert van Zika-virus (Puerto Rico-stam), Chikungunya-virus (La Réunion of British Virgin Islands-stam) en Dengue serotype-1 virus (Key West-stam). Virale titers met plaque assay28 of kwantitatieve RT-PCR29bepalen. Uittreksel virale RNAs met behulp van commercieel beschikbare RNA extractie kits.
    Opmerking: Tabel 2 geeft de virale titers van elke virusisolaat dat gebruikt in deze studie.
  2. Volg het artikel gepubliceerd door Yaren et al. voor een gedetailleerde protocol over de besmetting van Ae. aegypti vrouwtjes met Zika en chikungunya virussen20. Zie tabel 2 voor de virale titer van het monster van de mug met Zika-virus besmet.

3. RT-LAMP in combinatie met Thermolabile Uracil DNA Glycosylase

  1. 10 x primer mix voorbereiding.
    1. Bereiden van 100 µM-stockoplossing van elke primer en sonde (zie stap 1) door toevoeging van nuclease gratis water. Vortex goed en winkel bij-20 ° C tot gebruik.
    2. Voor de 10 X Primer mix voor elke Zika, Dengue 1 of mitochondriaal DNA doel, mix 16 µL van FIP, 16 µL BIP, 2 µL van F3, 2 µL van B3, 5 µL van LF, 2 µL van LB, 3 µL van LB-belichting fluorescerende aangeduid met sonde, 4 µL van quencher sonde , en 50 µL nuclease-vrij te geven van een totaal van 100 µL volume water.
    3. Voor 10 X Primer mix voor Chikungunya, meng 16 µL van FIP, 16 µL BIP, 2 µL van F3, 2 µL van B3, 5 µL van LB, 2 µL van LF, Label 3 µL van LF-belichting fluorescerende sonde, 4 µL van quencher sonde en 50 µL nuclease-vrij te geven van een totaal van 100 µL volume water.
      Opmerking: De sonde concentratie beschreven hierboven gebruikt 300 nM van definitieve fluorescente sonde en 400 nM van quencher sonde. U kunt ook gebruik 80 nM van fluorescently geëtiketteerde sonde en 200 nM voor de quencher probe voor real-time analyse.
  2. Voeg 5 µL van 10 X primer mix (voor 3-plex, voeg 5 µL van elk 10 X primer mix), 5 µL van 10 X isotherme amplificatie buffer (1 X buffer samenstelling: 20 mM Tris-HCl buffer pH 8,8, 50 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 8 mM MgSO4 0,1% Tween-20, 1 mM DTT), 7 µL van dNTP mengsel (10 mM van de dATP, dCTP en dGTP; 5 mM van de dTTP en dUTP), 16 eenheden van de Polymerase van DNA, 15 eenheden van Reverse-Transcriptase, 80 eenheden van recombinante ribonuclease remmer, 2 eenheden van thermolabile UDG, 1-2 µL van wisselende hoeveelheden van vi RAL RNAs en water toe zodat het totale volume maximaal 50 µL in een 0,25 mL PCR buis (Zie Tabel van materialen).
  3. Negatieve controle tests in dit stadium neemt door het vervangen van virale RNA volume met water. Incubeer monsters tussen 65-68 ° C gedurende 45 minuten tot 1 uur, vervolgens analyseren door het uitvoeren van 5 µL van elk monster op 2,5% agarose gel in 1 X TBE buffer met ethidiumbromide (0.4 µg/mL). Gebruik een 25 bp of 50 bp DNA-ladder als markering op de gel.
    Opmerking: Toevoeging van een specifieke sjabloon van de doelsoort is optioneel.
  4. Voor het detecteren van de aanwezigheid van pathogene RNA, testen elke set primer en de neen-template controle door het variëren van de temperatuur en/of magnesium concentratie, aangezien elke RT-LAMP primer set is ontworpen om te werken in wisselende temperaturen (65 ° C tot 68 ° C) of magnesium concentraties (6 tot 10 mM definitieve). Bereiden de experimenten bij kamertemperatuur.

4. RT-LAMP met behulp van virale RNA-Spiked Urine

  1. RT-LAMP inleidingen in verschillende eindconcentraties van urine (0%, 10%, 20% en 50%) in 50 µL van totale reactie volume test. Voor 10% laatste urine concentratie, voeg toe 1 µL van virale RNA aan 5 µL van urine. Toevoegen voor definitieve urine concentratie van 20%, 1 µL van virale RNA naar 10 µL van urine. Voor 50% laatste urine concentratie, voeg toe 1 µL van virale RNA aan 25 µL van urine.
  2. Voor real-time bewaking van RT-LAMP in 10% van de urine, een real-time PCR-instrument te gebruiken (Zie Tabel van materialen) met verschillende fluorophore filters.
    1. Fluorescentie signalen om uit te lezen waarbij FAM-label voor Zika, gebruikt u een filter variërend van 483 tot 533 nm; gebruik voor HEX-geëtiketteerden waarbij voor chikungunya, een filter variërend van 523 tot 568 nm; voor TAMRA-geëtiketteerden waarbij voor Dengue 1, gebruikt u een filter variërend van 558 tot 610 nm; en voor TET-geëtiketteerden waarbij voor mitochondriaal DNA, het gebruik van een filter variërend van 523 tot 568 nm.
      Opmerking: FAM heeft excitatie en emissie-maxima van 495 nm en 520 nm, respectievelijk. HEX heeft excitatie en emissie-maxima van 538 nm en 555 nm, respectievelijk. TAMRA heeft excitatie en emissie-maxima van 559 nm en 583 nm, respectievelijk. TET heeft excitatie en emissie-maxima van 522 nm en 539 nm, respectievelijk.
  3. Gebruik 96-wells-platen zegel de plaat met een doorzichtige plastic folie, incubeer monsters bij 65-68 ° C gedurende 60-90 minuten en opnemen van de fluorescentie elke 30 s met behulp van de lichte cycler. In eerste instantie gebruiken 80 nM van fluorescently geëtiketteerde sondes, en vervolgens test de 300 nM van fluorescently geëtiketteerde sondes.
    1. Bepalen aantoonbaarheidsgrens voor elk doel door toevoeging van serieel verdund virale RNAs in definitieve urine concentratie van 10%.
      Opmerking: Gebruik real-time RT-LAMP om het bepalen van de optimale temperatuur, magnesium concentratie, fluorescently geëtiketteerde sonde concentratie en reactietijd.
  4. Gebruiken om te visualiseren de fluorescentie gegenereerd door strand verschuifbare sondes door oog, een blauwe LED lichtbron van een lichte cycler met excitatie bij 470 nm (gel elektroforese box met ingebouwde blauwe lichtbron zal werken, zie tabel van materialen), en het opnemen van de afbeelding met een mobiele telefooncamera bij kamertemperatuur in het donker.
    Opmerking: Gebruik 300 nM van fluorescently geëtiketteerde sondes, wanneer visualisatie van alle drie kleuren door oog met behulp van de blauwe LED is nodig.

5. RT-LAMP op detectie van Zika-geïnfecteerde muggen met behulp van Q-papier technologie

  1. Quaternaire ammonium gemodificeerde filtreerpapier (Q-papier), volgens eerder gepubliceerde methoden met lichte wijzigingen30voor te bereiden.
    1. Ga 1 g van cellulose filtreerpapier cirkels (Zie Tabel van materialen) met een diameter van 3,5 cm in 50 mL 1,8% van waterige NaOH-oplossing voor 15 min voor activering.
    2. Verzamelen van geactiveerde papier cirkels door vacuüm filtratie en vervolgens onder te dompelen hen in 40 mL van een waterige oplossing van (2,3-epoxypropyl) trimethylammoniumformiaat chloride (0,28 g) 's nachts bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Houd de massaverhouding van (2,3-epoxypropyl) trimethylammoniumformiaat chloride filtreerpapier 0.28 tegen 1.
    3. De resulterende kationische papier verzamelen door vacuüm filtratie en neutraliseren met 50 mL voor 1 of meer gewichtspercenten azijnzuur.
    4. Het papier driemaal met ethanol wassen en drogen onder een kap met constante luchtstroom.
  2. Q-vellen in kleine rechthoeken (3 x 4 mm) met een papier punch of schaar te knippen. Crush Ae. aegypti vrouwelijke muggen potentieel besmet met Zika op elk papier met een micro stamper.
  3. Voeg aan elke papier 20 µL van 1 M waterige ammoniakoplossing (pH ≈ 12) en 5 min wachten. Daarna wassen elk papier eenmaal met 20 µL van 50% EtOH en eenmaal met 20 µL nuclease-gratis water. Het drogen van het papier in BSL-2 bioveiligheid kabinet gedurende ongeveer 1 uur.
    Opmerking: Op dit punt, monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C's nachts tot gebruik.
  4. Pincet gebruikt, plaatst u elk papier in 100 µL van de RT-LAMP reactiemengsel en Incubeer bij 65-68 ° C gedurende 45 min. Make sure to volledig onderdompelen het papier in de oplossing; het moet niet zweven. Afgelezen en genoteerd van de fluorescentie die voortvloeien uit Zika-virus met behulp van blauwe LED-lichtbron en oranje of gele filter.

6. lyofilisatie van RT-LAMP reagentia voor 100 µL van reactie Volume

  1. 10 X LAMP primer mengsel volgens punt 3.1 voor te bereiden, en voor te bereiden dNTP mengsel met dUTP volgens punt 3.2. Primer mengsel en dNTPs bij-20 ° C bewaren tot gebruik.
  2. Bereiden van 10 mL enzym dialyse buffer van glycerol verwijderen door het mengen van 100 µL van 1 M Tris-HCl pH 7.5, 500 µL van 1 M KCl, 2 µL van 0.5 M EDTA, 100 µL van 10% Triton X-100, 100 µL van 0,1 M DTT en 9.198 mL nuclease-gratis water. Winkel de dialyse buffer bij 4 ° C.
    Opmerking: Zorg ervoor om te filteren (0.2 micron filters) alle reagens bufferoplossingen voorafgaand aan gebruik en bewaar ze bij 4 ° C.
    1. Gebruik van een membraan van ultrafiltratie met 10 kDa cut-off limiet (Zie Tabel van materialen). Plaats van 350 µL van dialyse buffer, 4 µL van 32 stuks van de Polymerase van DNA, 2 µL van 30 eenheden van Reverse-Transcriptase en 2 µL van 80 eenheden van RNase remmer in ultrafiltratie membraan en centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
    2. Voeg een ander 350 µL van dialyse buffer aan de ultrafiltratie membraan en centrifuge (14.000 x g) voor een ander 5 min. leeg de collectie buis en herhaal deze stap, dan centrifugeren (14.000 x g) gedurende 3 minuten.
    3. Voor de elutie, omkeren van het membraan en plaats in een nieuwe collectie buis. Spin bij 1.000 x g gedurende 2 min. maatregel het elutievolume; Als minder dan 8 µL, zodat het volume tot 8 µL door dialyse buffer toe te voegen. Slaan de elutie bij 4 ° C, en onmiddellijk overgaan tot de volgende stap.
      Opmerking: Dit protocol is voor één buis lyofilisatie, maar ten minste 10 reactie buizen voor te bereiden op een moment met behulp van de dezelfde ultrafiltratie membraan en gebruiken dezelfde hoeveelheid dialyse buffer.
  3. Meng 10 µL van 10 X LAMP primer als singleplex (voor 3-plex, voeg toe 10 µL van elk 10 X primer mix), 14 µL van dNTP mengsel, 8 µL van dialyzed enzym mix 2 µL van 2 eenheden van thermolabile UDG en 66 µL van nuclease gratis water (voor 3-plex gebruik van 46 µL) in een tube van 0,5 mL microcentrifuge en laat het deksel open. In plaats daarvan, het toevoegen van een andere deksel doorboord met een naald om damp te ontsnappen.
  4. Onmiddellijk bevriezen de buizen bij-80 ° C gedurende 2 uur, en lyophilize de buis voor 4 h. Cover de lyofilisatie kamer met aluminiumfolie voor bescherming tegen licht. Wanneer de reagentia worden gedroogd, verwijderen van de geperforeerde deksels, sluit het oorspronkelijke deksel en opslaan van de buizen met gelyofiliseerd reagentia bij 4 ° C in het donker.
    Opmerking: Reagentia kunnen worden gelyofiliseerd 's nachts, indien nodig.

7. testen gelyofiliseerd RT-LAMP reagentia op Urine en Mosquito monsters met Zika

  1. Gebruik de volgende items uit de kit (Zie de Tabel van materialen) voor Zika: een 3D-gedrukte observeren doos met oranje filter (lange pass filter, knippen-op ~ 540 nm), 2 AAA-batterijen voor het observeren van vak gelyofiliseerd reactie buizen ZV gelabeld voor Zika detectie, en 1.1 X rehydratie Buffer in 1,5 mL schroef top buizen.
  2. Bereid 50 mL 1.1 X rehydratie buffer door het mengen van 5,5 mL 10 X isotherme amplificatie buffer die wordt geleverd samen met Polymerase van DNA (Zie de Tabel van materialen), 3,3 mL 100 mM MgSO4110 µL van 0.5 M DTT en 41.09 mL nuclease-gratis water. Meng goed, aliquoot 1 mL van deze oplossing 1,5 mL schroef top buizen, en bewaren bij 4 ° C tot gebruik.
  3. 90 µL van 1,1 X rehydratie buffer toevoegen aan elke reactiebuis (0,5 mL). Ervoor zorgen dat de vloeistof vult de onderkant van de buis met de gelyofiliseerd reagentia (Los mee mengen door schudden, vervolgens kort spin down (1.000 x g)). Voeg 10 µL van urine monster verrijkt met virale RNA de reactie buizen (zie punt 4.1 voor meer informatie).
    1. Als het testen van muggen, voegt een rechthoek van Q-papier bedrijf mug karkassen (zoals opgesteld in de stappen beschreven in de punten 5.2 en 5.3), samen met 10 µL gezuiverd water in plaats van de urine monsters.
      Opmerking: U kunt ook toevoegen 10 µL van speeksel of serum monsters in plaats van de urine. Als de monsters geëxtraheerde DNA of RNA, 2-5 µL van het monster in gerehydrateerd mengsel toevoegen en compleet met 10 µL van eindmonster volume nuclease-gratis water.
  4. Sluit het deksel van de reactie-buizen. Plaats ze in een warmte blok/bad (of incubator) vooraf ingesteld op 65-68 ° C. Incubeer gedurende 30-45 minuten, maar niet meer dan 1 h. Na incubatie, de buis van de warmte te verwijderen. Om te voorkomen dat besmetting van toekomstige tests, ervoor zorgen dat deze buizen gesloten blijven.
  5. Plaats reactie buizen in het observeren; de temperatuur zal dalen tot de kamertemperatuur (bij voorkeur 25 ° C). Zet de schakelaar aan de achterkant van het observeren vak. Observeren van monster door de donkeroranje filter en de opname door de camera van een mobiele telefoon die wordt gehouden op een afstand waar de afbeelding 80% van het gezichtsveld vult.
    Opmerking: Betere visualisatie wordt bereikt in lage lichte omgevingen.
  6. Nadat visualisatie is voltooid, schakel de switch. Bewaar de verzegelde buizen in het donker, bij voorkeur met koeling, als later visualisatie nodig is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De prestaties van elke RT-LAMP primer (tabel 1) met de overeenkomstige virale RNA substraat, alsook de negatieve controles werden in eerste instantie beoordeeld door gelelektroforese. RT-LAMP inleidingen werden ontworpen om doel NS5 (RNA-afhankelijke RNA-polymerase) voor Zika en Dengue 1, en nsP2 regio (niet-structurele eiwitten P2) voor Chikungunya. Sjablonen waren totaal RNA geëxtraheerd uit virale voorraden gekweekte in Afrikaanse groene aap nier (Vero) cellen. In één geval, totale nucleïnezuur (DNA en RNA) werd gewonnen uit een Chikungunya-geïnfecteerde vrouwelijke Ae. aegypti (tabel 2).

Figuur 2A toont dat enkele representatieve resultaten met RT-LAMP uitgevoerd met deze voorbeelden. In zowel singleplex als multiplexed (3-plexed) gevallen weergegeven RT-LAMP producten als een ladder van concatemers wanneer uitvoert op agarose gel. Negatieve controlemonsters met water als voorbeeld gaf alleen de bands voor inleidingen zelf, met inbegrip van de niet-specifieke doelbesturingselement waar totaal nucleïnezuur geëxtraheerd uit een niet-besmette Ae. aegypti vrouwelijke werd mug gebruikt als sjabloon.

Om te zoeken naar optimale omstandigheden van de RT-LAMP, werden verschillende magnesium concentraties en incubatie temperaturen getest. Bleek dat de hogere concentraties van magnesium en lagere temperaturen aspecifieke waarbij, die aanleiding geven tot valse positieven kunnen genereren. Daarom, 8 mM van magnesium en incubatie bij 65 ° C werden gebruikt in alle experimenten voortaan (figuur 2B).

Gelelektroforese vereist de opening van de reactiebuis, die aanleiding om de verontreiniging van de volgende reeks experimenten door eerder gegenereerde waarbij geven kan, wat leidt tot valse positieven. Om te voorkomen dat de voorwaartse besmetting, werd de dTTP vervangen door gelijke verhoudingen van dTTP en dUTP, zodat dUTP zou worden opgenomen in de RT-LAMP waarbij. Hiermee schakelt u de mogelijke besmetting van amplicon in een substraat voor uracil-DNA glycosylase (UDG) tijdens de voorbereiding van elke latere RT-LAMP reacties31,-32. Wanneer een thermolabile versie van UDG wordt gebruikt, kan dU-bevattende waarbij bij kamertemperatuur worden verteerd en de RT-LAMP monsters worden opgezet, de UDG zal worden geïnactiveerd tijdens isotherme amplificatie. Bovendien, de reactiebuis kan worden geopend voor een stroomafwaartse analyse, wanneer nodig. Naast het gebruik van UDG spijsvertering genereert een architectuur met verschuifbare sondes fluorescentie die kan worden gelezen zonder de noodzaak om de reactiebuis open.

Figuur 3A levert het resultaat van de limiet aantoonbaarheidsgrens (LOD) voor Zika met behulp van fluorescerende sondes targeting Zika RNA. Seriële verdunning studies toonden dat zo laag als 1.42 pfu kon worden opgespoord binnen 30 minuten in een singleplex-test of een 3-plexed testen. Wanneer monsters werden verder verdund tot 0.71 pfu, werd een fluorescerende signaal waargenomen na 40 min voor een singleplex assay en na 50 min voor 3-plexed mengsels. Naast de real-time RT-LAMP, fluorescentie werd gevisualiseerd na 35 min door een donkeroranje filter, nadat de monsters werden blootgesteld blauw LED zaklamp met een excitatie golflengte van 470 nm (figuur 3B). Evenzo detectiegrenzen werden gemeten op 37.8 kopieën en 1,22 pfu voor Chikungunya en Dengue 1, respectievelijk (Figuur 3 c-D).

Om te bepalen van de optimale urine concentratie, Zika virale RNA (2,85 pfu) toevoegde aan uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar van een authentieke menselijke urine monster (0%, 10%, 20% en 50%). Vermoedelijk vanwege haar elektrolyten, werd het signaal van de RT-LAMP vertraagd van 15 naar 35 min toen 50% urine werd gebruikt in de test. 10% urine was vastbesloten om optimaal als gevolg van een lagere achtergrond presenteren. Bij gebrek aan Zika doelstellingen, geen versterking werd waargenomen bij concentraties, maar hogere achtergrond fluorescentie werd waargenomen in monsters met een hogere concentratie van de urine (de 3E figuur).

Multiplexing met read-outs van verschillende fluorescentie kleuren, 80 nM van strand verschuifbare sondes werden aangeduid met verschillende fluorophores (FAM voor Zika, HEX voor Chikungunya en TAMRA voor Dengue 1), maar zodat vergezeld door de zelfde quencher (Iowa zwart-FQ) met een concentratie van 200 nM. Cel cultuur-geëxtraheerde virale RNAs (2,85 pfu voor Zika 242 virale RNA kopieën voor Chikungunya en 1,22 pfu voor Dengue 1) werden gebruikt als doelen, verdund in urine van 10%. Real-time analyse van de gegevens van de fluorescentie toonde een vertraging in het signaal generatie (ongeveer 10 min) voor 3-plexed testen waar inleidingen voor alle doelen aanwezig waren. Ingeval van singleplex, aan de andere kant, was de reactie voltooid binnen 10-15 min (figuur 4A-C). Wanneer fluorescentie werd gevisualiseerd met behulp van een blauwe LED en donkeroranje filter, werden verschillen in signaalsterkte waargenomen voor verschillende fluorophores, waar de FAM-geëtiketteerden waarbij de opvallendste waren. Dit is te verwachten, sinds excitatie bij 470 nm is het dichtst bij het maximum van de FAM excitatie spectrum (Figuur 4 d).

Om de visualisatie van alle drie kleuren met een enkele LED excitatie golflengte (470 nm), de concentraties van verschuifbare sondes werden verhoogd tot 300 nM en de aanvullende quencher sonde tot 400 nM. In singleplex gevallen, was binnen 10 min. voor Zika, 20 min. voor Chikungunya en 40 min voor Dengue 1 signaal generatie voltooid. In 3-plexed testen, echter het werd verder vertraagd door 20 min in alle testen ()figuur 5A- C). Niettemin, offer tijdig aan signaal generatie ingeschakeld de visualisatie van alle drie kleuren blauw LED-lamp met oranje filter. Groene fluorescentie wordt waargenomen voor Zika sondes 5'-einde gemarkeerd met FAM, licht groen-gele fluorescentie is toegewezen aan Chikungunya waar de sonde is 5'-einde gemarkeerd met HEX, en oranje-rood fluorescentie wordt gebruikt voor Dengue 1, waar de sonde 5'-eind label is gebruiken met TAMRA (figuur 5D).

Voor het testen van mug monsters met mogelijke Zika besmetting, laboratorium-besmet Ae. aegypti vrouwelijke muggen (tabel 2) werden verpletterd op een rechthoek van Q-papier, gevolgd door ammoniak behandeling om het virus te steriliseren en te binden de blootgestelde virale RNA op positief geladen Q-papier. Het papier werd kort gewassen met ethanol te verwijderen pterin verbindingen aanwezig in mug karkassen die met fluorescentie uitlezing33,34 interfereren kunnen. Q-papieren met muggen waren vervolgens rechtstreeks ondergedompeld in het mengsel van de RT-LAMP, en na incubatie bij 65 ° C gedurende 30 minuten, helder groen fluorescentie werd waargenomen in aanwezigheid van Zika-virus (Figuur 6).

Om de detectie kit zonder een keten van koel, en de bepaling om gemakkelijk te maken te gebruiken, waren de RT-LAMP reagentia gelyofiliseerde vorm en vergezeld van een rehydratie buffer en een 3D-gedrukte observatie-vak waarin een 470 nm uitstoten geleid en een oranje filter (figuur 7A). met behulp van 9 volumes voor rehydratie buffer en 1 hoeveelheid urine monster, zichtbaar groene fluorescentie kan worden gegenereerd binnen 30 min en de opname kan gemaakt worden door elke mobiele telefooncamera (figuur 7B). Mosquito steekproeven op Q-papier, kunnen anderzijds door toevoeging van 1 deel water in plaats van de urine monster door de dezelfde bepaling te worden gebruikt.

Figure 1
Figuur 1: Assay-Design LAMP (A) RT-LAMP primers en vorming van een halter structuur door een strand verdringt polymerase van DNA. (B) invoering van strand-verdringt sondes om multiplexing en fluorescentie uitlezing en voortgang van de RT-LAMP in real-time. Overgenomen met toestemming van Yaren et al. 201720. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Gel elektroforese analyse van waarbij. (A) testen LAMP inleidingen in singleplex of multiplex (3-plex) opmaken met juiste positieve en negatieve controles. Positieve controles omvatten gezuiverde virale RNA met volgende titers: 2,85 pfu voor Zika (ZV), 242 genomic kopieën voor Chikungunya (CH) en 1,22 pfu voor Dengue 1 (D1). NTC-z, NTC-c en NTC-d staan voor geen controle van de sjabloon voor Zika, Chikungunya en Dengue 1 inleidingen in singleplex formaat, respectievelijk. NSC staat voor aspecifieke doelbesturingselement waar totaal xNA (DNA en RNA) wordt gewonnen uit infectie-vrije Ae. aegypti. M staat voor marker (50 basenpaar DNA ladder). (B) optimalisatie van assay voorwaarden door het testen van een bereik van RT-LAMP incubatie temperaturen (van 55 ° C tot 70 ° C) en MgSO4 concentraties (van 4 mM tot 10 mM) in multiplex formaat bij gebrek aan target RNA. Overgenomen met toestemming van Yaren et al. 201720. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: RT-LAMP in real-time. (A) Singleplex en multiplexed limit aantoonbaarheidsgrens (LOD) voor Zika (ZV) met 80 nM FAM-geëtiketteerden strand-verdringt sonde in real-time met behulp van real-time PCR-instrument (kanaal 483-533 nm). Monsters werden geïncubeerd bij 65° C voor ongeveer 50 min. (B) fluorescentie werd waargenomen wel een donkeroranje filter, gevolgd door de excitatie van de monsters bij 470 nm met blauw licht. Monsters van A werden gebruikt voor visualisatie. (C) Real-time analyse voor LOD op Chikungunya (CH) doel met behulp van 80 nM van HEX-bevattende LAMP sondes in singleplex-formaat met behulp van fluorescentie kanaal van 523-568 nm op een real-time PCR-instrument. (D) Real-time analyse voor LOD op Dengue 1 (D1) doelen met behulp van 80 nM TAMRA dragende LAMP sondes in singleplex-formaat met behulp van fluorescentie kanaal van 558-610 nm op een real-time PCR-instrument. (E) bepaling van maximale urine gehalte in de reactie van de RT-LAMP. Een reeks definitieve urine concentraties (0%-50%) werden getest met behulp van 80 nM FAM-geëtiketteerden sonde in aanwezigheid van 2,85 pfu van Zika vRNA.NTC = geen sjabloon controle op alle panelen. Overgenomen met toestemming van Yaren et al. 201720. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Singleplex en multiplex virusdetectie in urine met behulp van 80 nM sonde. (A) Zika detectie in 10% urine in singleplex en multiplex formaat 2,85 pfu van virale RNA Zika (ZV) met sonde FAM-label (80 nM). (B) detectie van de Chikungunya in 10% urine in singleplex en multiplex formaat met behulp van 242 kopieën van Chikungunya (CH) virale RNA met HEX-geëtiketteerden sonde (80 nM). (C) Dengue 1 detectie in 10% urine in singleplex en multiplex formaat met behulp van 1,22 pfu van Dengue 1 (D1) virale RNA met TAMRA-geëtiketteerden sonde (80 nM). (D) Visualization of RT-LAMP reacties door oranje filter na excitatie bij 470 nm met blauw LED-licht. Overgenomen met toestemming van Yaren et al. 201720. NTC = geen sjabloon controle op alle panelen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Singleplex en multiplex virusdetectie in urine met behulp van 300 nM sonde. (A) Zika detectie in 10% urine in singleplex en multiplex formaat 2,85 pfu van virale RNA Zika (ZV) met sonde FAM-label (300 nM). (B) detectie van de Chikungunya in 10% urine in singleplex en multiplex formaat met behulp van 242 kopieën van Chikungunya (CH) virale RNA met HEX-geëtiketteerden sonde (300 nM). ()C) Dengue 1 detectie in 10% urine in singleplex en multiplex formaat met behulp van 1,22 pfu van Dengue1 de virale RNA (D1) met TAMRA-geëtiketteerden sonde (300 nM). (D) Visualization of RT-LAMP reacties door oranje filter na excitatie bij 470 nm met blauw LED-licht. Als positieve controle in urine experimenten, een primer van de LAMP instellen gericht op menselijke mitochondriaal DNA (mtDNA) werd gebruikt met TET-geëtiketteerden sonde (300 nM). NTC = geen sjabloon controle op alle panelen. Overgenomen met toestemming van Yaren et al. 201720. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Workflow voor Zika detectie van een geïnfecteerde mug monsters met behulp van Q-papier technologie met gezonde en Zika-geïnfecteerde Ae. aegypti (ZV 9, tabel 2). Overgenomen met toestemming van Yaren et al. 201720. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: het vak observeren. (A) The observing vak gebruikt twee AAA-batterijen in de base. Deze batterijen macht vier blauwe LED-lampjes die verlichting van de monsters in 0,5 mL buizen geplaatst in de vier gaten gehouden. De LED-lichten zijn ingeschakeld met een schakelaar. De monsters worden gevisualiseerd door de oranje filter. (B) fluorescentie in observatie vak. Van links naar rechts: negatief, positief voor Zika, negatieve en positieve voor Zika. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Doel virus Naam Volgorde (5' - 3') Lengte Startpositie Eindpositie
Zika ZV-F3 GAGACTGCTTGCCTAG 16 9905 9920
ZV-B3 CTGGGGTCTTGTCTTC 16 10145 10130
ZV-LF CAGTTGGAACCCAGTCAAC 19 10028 10010
ZV-LB GTGGAACAGAGTGTGGATTG 20 10093 10112
ZV-FIP CCATGGATTGACCAGGTAGTTTTTTCGACTGATGGCCAATG 41 9974 10053
ZV-BIP ACCACTGARGACATGCTTGTTTTTCATGTGGTCGTTYTCC 40 10070 10129
ZV-LB_NatTail FAM-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
GTGGAACAGAGTGTGGATTG		 60 10093 10112
Chikungunya CH-F3 CGTCAACGTACTCCTAAC 18 2891 2908
CH-B3 ACGTTGGCTTTRTTTTGG 18 3094 3077
CH-LF AGCGTCTTTATCCACGGG 18 2968 2951
CH-LB AYGCATCRATAATGGCGGG 19 3025 3043
CH-FIP GAAGTTTCCTTTCGGTGGGTTTTTGGAAGACACTYTCYGG 40 2932 2993
CH-BIP AAGGAGTGGGAGGTGGATTTTTTCAYTTGGTGACTGCAG 39 3006 3063
CH-LF_NatTail HEX-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
AGCGTCTTTATCCACGGG		 58 2968 2951
Dengue-1 D1-F3 ACAGCYCTGAATGAYATGG 19 9583 9601
D1-B3 GCAGTTTCTCTCAGGC 16 9803 9788
D1-LF CACTTGYTGCCARTCATTCC 20 9666 9647
D1-LB CCATGCCGYAACCAAG 16 9727 9742
D1-FIP CTGGTGGAARTGGTGTGATTTTTTGGGAACCTTCAAAAGG 40 9628 9693
D1-BIP GAAGGAYGGGAGGGAAATAGTTTTTTTAGCCCTRCCCA
CAAG		 42 9702 9763
D1-LB_NatTail TAMRA-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
CCATGCCGYAACCAAG		 56 9727 9742
Mitochondriaal DNA MtDNA-F3 AGCCTACGTTTTCACAC 17 9183 9199
MtDNA-B3 GCGCCATCATTGGTAT 16 9410 9395
MtDNA-LB GCCTAGCCATGTGATTTCAC 20 9322 9341
MtDNA-LF GGCATGTGATTGGTGGGT 18 9254 9237
MtDNA-FIP GTCATGGGCTGGGTTTTACTTTTTCTACCTGCACGACAAC 40 9213 9228
MtDNA-BIP CTCAGCCCTCCTAATGACCTTTTTGAGCGTTATGGAGTGG 40 9359 9344
MtDNA-LB_NatTail TET-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
GCCTAGCCATGTGATTTCAC		 60 9322 9341
Gemeenschappelijke quencher CTGACCTGACGGACTGAACGGATGGCTGAGCGCA
AACCCG-Iowa zwarte FQ		 40

Tabel 1: Primers en strand verschuifbare sondes. Overgenomen met toestemming van Yaren et al. 201720. Sequenties vetgedrukt vertegenwoordigen de double-stranded regio van strand verdringt sondes. FAM-label (gezien als groene fluorescentie), HEX-label (gezien zo licht groen-gele fluorescentie), TAMRA-label (gezien als oranjerode fluorescentie), en met het TET-label (gezien als gele fluorescentie) sondes werden toegewezen aan detecteren Zika, Chikungunya, Dengue 1, en mitochondriaal DNA in urine, respectievelijk. FAM heeft excitatie en emissie-maxima op 495 nm en 520 nm, respectievelijk. HEX heeft excitatie en emissie-maxima op 538 nm en 555 nm, respectievelijk. TAMRA heeft excitatie en emissie-maxima op 559 nm en 583 nm, respectievelijk. TET heeft de excitatie en emissie-maxima op 522 nm en 539 nm, respectievelijk. Opdat het gebruik van een enkele quencher voor alle fluorophores, werd Iowa zwart-FQ gebruikt als gevolg van zijn brede absorptie bereik (420-620 nm).

Virus, stam (GenBank toetreding nummer) Familie/geslacht Virale titers
Zika virus (ZV), Puerto Rico (PRVABC59, KU501215.1) Flavivirus/Flavivirus groep IV, positief, ssRNA 2.85 x 108 pfu/mL
Chikungunya-virus (CH), Britse Maagdeneilanden (Aziatische afkomst, KJ451624) Togaviridae/Alphavirus groep IV, positief, ssRNA 2.42 x 108 genomen/mL
Chikungunya-virus (CH), La Reunion (Indische Oceaan bloedlijn, LR2006-OPY1, KT449801) Togaviridae/Alphavirus groep IV, positief, ssRNA 1.89 x 108 genomen/mL
Chikungunya-virus (CH), La Reunion geëxtraheerd totale nb van Aedes aegypti vrouwelijke (Indische Oceaan bloedlijn, LR2006-OPY1, KT449801) Togaviridae/Alphavirus groep IV, positief, ssRNA 3.85 x 105 genomen/mL
Knokkelkoorts serotype 1 (D-1), Key West (FL) (JQ675358) Flavivirus/Flavivirus groep IV, positief, ssRNA 1.22 x 106 pfu/mL
Zika (ZV) mug identiteit, stam Been titer pfu/mL
ZV 9, Puerto Rico 4.76 x 103

Tabel 2: virale titers in celculturen en besmette mug. Pfu: plaque-vormende eenheid. Overgenomen met toestemming van Yaren et al. 201720.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Muggen overgebrachte virussen waaronder Zika, dengue en chikungunya bedreigen de volksgezondheid en de recente Zika uitbraken hoogtepunt de behoefte aan goedkope point-of-care detectie alternatieven voor diagnostische gegevens van de patiënt, alsmede voor mosquito toezicht. Isotherme amplificatie methoden werden ontwikkeld als betaalbare alternatieven voor PCR-gebaseerde systemen. RT-LAMP-gebaseerde platforms zijn in het bijzonder toegepast op te sporen van een breed scala van ziekteverwekkers. Echter is het gebruik van isothermische platforms hoofdzakelijk beperkt tot één Doelsector Detectie. De methode gemeld hier maakt gebruik van een gemodificeerde RT-LAMP zodat simultane detectie van drie verschillende doelstellingen in een enkele reactiemengsel, die op een scala aan matige temperaturen (65-68 ° C) draait, bewezen te zijn vooral handig omdat temperaturen hoger dan 60 ° C renderen Zika en andere virussen niet-infectieuze30,35.

Verder, hier gepresenteerde gegevens blijkt dat RT-LAMP kan tolereren remmende stoffen die kunnen voorkomen in verschillende biologische vloeistoffen15. Hierdoor virale RNAs kan worden versterkt zonder een extra stap van RNA zuivering door direct het toevoegen van het monster in het reactiemengsel. Afhankelijk van het soort monster mag de maximale hoeveelheid monster moet worden bepaald dat niet remmen de reactie en geen achtergrond fluorescentie (valse positief). De studie gepresenteerd hier richt zich op het gebruik van 10% eindvolume voor urine monsters. Speeksel en serum monsters kunnen echter ook worden toegepast op de bepaling in de dezelfde manier20. Detectiegrenzen bleken te zijn ruim boven de gerapporteerde virale ladingen in patiënt urine13, evenals virus-geïnfecteerde muggen20,36,,37.

Mosquito toezicht heeft meestal een lagere prioriteit voor de volksgezondheid bronnen, dus een goedkope multiplexed kit enquête een huishouden of een openbare ruimte speciale waarde zou hebben. Daarom is deze kit werd gewijzigd door de toevoeging van Q-papier om de detectie van virussen in de mug karkassen. Q-papier bevat hoge niveaus van covalent bijgevoegde quaternaire ammoniumzouten groepen, waarmee de verovering van virale nucleic zuren op het oppervlak door middel van coulombic interacties. Ook al was het een punt van zorg dat Q-papier RT-LAMP kan remmen, bleek het dat door het toevoegen van Q-papier vervoeren mug karkassen rechtstreeks in de RT-LAMP mengsel, succesvolle virusdetectie kan worden bereikt binnen 30 min. Voor succesvolle signaal generatie, Q-papier moet klein genoeg (b.v.formaat als 3 x 4 mm voor 100 µL reactie volume) om te worden ondergedompeld in het reactiemengsel RT-LAMP. Het is te groot voor de reactiebuis, of begint in plaats van de resterende ondergedompeld in de vloeistof zweven, de reactie niet mag plaatsvinden als resultaten worden weergegeven als valse negatieven.

Voor succesvolle detectie en differentiatie van elk virus Stel elke primer moet richtsnoeren voor de RT-LAMP primer design, de regels voor het ontwerp voor verdringt sondes, en omvatten een keuze van fluorophores voor multiplexing. Elke primer ingesteld moet worden gescreend tegen verschillende doelen om te voorkomen dat Kruisallergie. Bovendien, magnesium concentratie en incubatie temperatuur moet worden geoptimaliseerd voor elke set. Methoden die hier gepresenteerd gebruiken fluorescentie uitlezingen zichtbaar met het blote oog, die werd bereikt door de invoering van strand verschuifbare sondes naar RT-LAMP architectuur. Drie verschillende kleuren kunnen worden gevisualiseerd in een multiplexed assay wanneer verschillende fluorophores werden toegewezen aan elk doel-virus. Dit biedt voordelen ten opzichte van bestaande isothermische Zika detectiemethoden, aangezien de meeste van de gepubliceerde methoden afhankelijk zijn van één Doelsector Detectie en het gebruik van intercalating of fluorescentie kleurstoffen, die niet sequentie-specifiek zijn en zijn vatbaar voor het genereren van aspecifieke waarbij.

Een belangrijke stap om te overwegen is de bepaling van de uiteindelijke concentratie van fluorescently geëtiketteerde verdringt sondes. Bleek dat 80 tot 100 nM verdringt sondes fluorescentie signalen binnen 15-20 min kan genereren, overwegende dat de tijd om het signaal werd vertraagd wanneer 300 nM van sonde concentratie werd gebruikt. Reactietijd werd verder vertraagd wanneer de tests werden uitgevoerd in een multiplexed mode. De reden voor het overschakelen van 80 nM tot 300 nM was om de visualisatie van alle drie fluorophores met behulp van een enkele LED bron. Blauw LED met excitatie bij 470 nm is geschikt voor FAM-geëtiketteerden sondes, maar is minder geschikt voor HEX - of TAMRA-geëtiketteerden sondes. Dus, een offer werd gemaakt op de incubatietijd voor zitten kundig voor alle drie doelen visualiseren.

Een van de problemen met RT-LAMP is de voorwaartse besmetting. RT-LAMP genereert amplicon grote hoeveelheden in een korte incubatietijd en waarbij kunnen gemakkelijk worden vrijgegeven als aërosolen. Om te verhelpen dit probleem, werd dUTP opgenomen samen met andere dNTPs gevolgd door UDG spijsvertering tijdens assay set-up. Het is belangrijk om het gebruik van een hitte-labiele versie van UDG, aangezien het noodzakelijk naar de inactivering van UDG om te voorkomen dat de vertering van de nieuw gegenereerde RT-LAMP waarbij.

Als u wilt dat de verdeling van de kit zonder koeling, alle onderdelen van de bepaling moest worden gelyofiliseerde vorm en de kit aangevuld met een buffer rehydratie. Daarom is elke glycerol aanwezig in de handel verkrijgbare enzymen verwijderd door ultrafiltratie omdat glycerol kan niet worden verwijderd door lyofilisatie. Bij een hoge concentratie in een mengsel verstoren glycerol enzymactiviteit. Het enige enzym niet opgenomen in het verwijderingsproces glycerol was de thermolabile UDG. UDG is een kleine enzym met molecuulgewicht van 24.6 kDa, waardoor het ongeschikt voor ultrafiltratie experimenten. Daarom werd het toegevoegd aan het mengsel van lyofilisatie als gekocht. De residuele glycerol beïnvloedde niet negatief resultaat van de test.

Een van de beperkingen van deze TL RT-LAMP-techniek is het gebruik van de LED bron. Wanneer testen werden uitgevoerd in singleplex of multiplex formaat, waren hogere concentraties van verdringt sondes nodig voor signaal visualisatie van alle doelen. Deze wijziging veroorzaakt echter vertragingen in de generatie van de tijd-aan-signaal. Een mogelijke manier om dit te overwinnen zou het gebruik van twee LED bronnen beter aan de andere fluorophores (HEX en TAMRA). Op deze manier kan lagere concentratie van de sonde worden gebruikt voor het genereren van een signaal met kortere incubatietijd pauzes.

Een andere beperking waarmee rekening moet is de fluorescentie kleur beoordelen door oog in een slecht verlichte omgeving. Het is makkelijker als een enkel doel aanwezig in een singleplex of multiplex-indeling, is aangezien inleidingen werden ontworpen niet voor interactie met elkaar. De bepaling zou moeilijker te interpreteren als meerdere doelen in een enkele assay-buis, zoals een zwembad of een patiënt met meer dan één virale infectie en muggen aanwezig waren. Dit vereist een verandering van uitlezing architectuur, zoals een digitaal display in plaats van te beoordelen met het blote oog.

Een mogelijke toekomstige benadering zou zijn om het verhogen van het niveau van multiplex door het creëren van een grotere panel van muggen overgebrachte arboviruses. Dit vereist zorgvuldige primer ontwerpen om te voorkomen dat primer-primer interacties, en mogelijk het gebruik van gemodificeerde nucleic zuur-analogen zoals zelf het vermijden van moleculaire systemen (SAMRS) en kunstmatig genetische informatiesysteem (AEGIS) uitgebreid tot beter geschikt voor hoge niveau van multiplex38. Dienovereenkomstig, zou de oplossing voor signaal uitlezing in een hogere multiplex systeem te gebruiken een één fluorophore voor elke displacing sonde, en voor het toewijzen van een unieke ontheemde volgorde voor elke doelstelling en vastleggen van de ontheemde sondes op een harde ondergrond door DNA hybridisatie. Dit zou leiden tot een matrix-indeling platform met een enkele fluorophore en LED te prikkelen, maar te oordelen van de aanwezigheid van elk doel zou gebaseerd zijn op haar positie in de matrix39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Verscheidene van de auteurs en hun instellingen eigen intellectuele eigendom die zijn gekoppeld aan deze test.

Acknowledgments

Het werk werd gedeeltelijk ondersteund door FDOH-7ZK15 en NIAID 1R21AI128188-01. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Allergy and Infectious Diseases, en gedeeltelijk door de biomedische Research programma van Florida Department of Health. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de NIH of Florida Department of Health. Dynamische combinatoriële chemie LLC is erkend voor hun steun en hun bijdrage aan dit project.

Knokkelkoorts 1 virus (stam BOL-KW010) werd vriendelijk geleverd door het Florida departement van gezondheid Bureau van laboratoria. Zika-virus en de Aziatische afkomst van chikungunya-virus werden genadig verstrekt door de Centers voor Disease Control and Prevention. De bloedlijn van de Indische Oceaan van chikungunya-virus werd beschikbaar gesteld door Robert Tesh (World Reference Center voor opkomende virussen en Arboviruses, door de Universiteit van Texas Medical Branch in Galveston, Texas) aan de UF-FMEL. Wij danken S. Bellamy, B. Eastmond S. Ortiz, D. Velez, K. Wiggins, R. ZimLer en K. Zirbel voor hulp bij de studies van de infectie. Wij danken ook M. S. Kim voor het verstrekken van Q-papier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS Major Science MBE-150 Gel electrophoresis
G:BOX F3 Syngene G:BOX F3 Gel imaging
LightCycler 480 Instrument II, 96-well Roche Applied Science 05 015 278 001 Real-time PCR
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane Millipore Sigma UFC501096 ultrafiltraton membrane for dialysis
Eppendorf 5417C Centrifuge Marshall Scientific EP-5417C centrifuge
Myblock Mini Drybath Benchmark Scientific BSH200 drybath
FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System Labconco 7934020 lyophilizer
all priers and probes IDT custom RT-LAMP primers and probes
dNTP set Bioline BIO-39049
Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) Promega U1191
Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase New England Biolabs M0538L enzyme
WarmStart RTx Reverse Transcriptase New England Biolabs M0380L enzyme
RNase Inhibitor, Murine New England Biolabs M0314L enzyme
Antarctic Thermolabile UDG New England Biolabs M0372L enzyme
50bp DNA Step Ladder Promega G4521 marker
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Roche Applied Science 4729692001 real-time RT-LAMP analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
  2. Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636 (2014).
  3. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
  4. Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clin Microbiol Rev. 29, (2016).
  5. Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
  6. Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
  7. Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
  8. Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
  9. Shukla, S., Hong, S. -Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685 (2016).
  10. Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295 (2016).
  11. Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
  12. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. Journal of Clinical Virology. 68, 53-55 (2015).
  13. Gourinat, A. C., O'Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M. Detection of zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 21, (2015).
  14. Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28, (2000).
  15. Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
  16. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
  17. Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
  18. Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
  19. Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
  20. Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
  21. Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
  22. Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
  23. Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
  24. Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
  25. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
  26. Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
  27. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
  29. Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
  30. Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
  31. Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
  32. Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605 (2016).
  33. Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
  34. Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
  35. Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
  36. Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22 (2010).
  37. Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226 (2015).
  38. Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
  39. Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , 62,381,759 (2016).

Tags

Biochemie kwestie 133 Point-of-care diagnostiek multiplexed isotherme amplificatie lus-gemedieerde isotherme amplificatie Zika detectie fluorescentie uitlezing geen RNA extractie mug toezicht virusdetectie
Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yaren, O., Alto, B. W., Bradley, K.… More

Yaren, O., Alto, B. W., Bradley, K. M., Moussatche, P., Glushakova, L., Benner, S. A. Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1. J. Vis. Exp. (133), e57051, doi:10.3791/57051 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter