Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Multiplexade isotermiska förstärkning baserat diagnostiska plattform för att upptäcka Zika, Chikungunya och Dengue 1

Published: March 13, 2018 doi: 10.3791/57051
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 1,3
1Foundation for Applied Molecular Evolution (FfAME), 2Florida Medical Entomology Laboratory, University of Florida, 3Firebird Biomolecular Sciences LLC

Summary

Aktuella multiplexed diagnostik att upptäcka Zika, chikungunya, denguefeber virus kräver komplexa provberedning och dyra instrumentering och är svåra att använda i låg resurs miljöer. Vi visar en diagnostik som använder isotermiska förstärkning med målet-specifika strand displaceable sonder att identifiera och särskilja dessa virus med hög känslighet och specificitet.

Abstract

Zika, denguefeber och chikungunya virus överförs av myggor, orsakar sjukdomar med liknande patientens symtom. Men de har olika nedströms patient-till-patient överföring potential, och kräver mycket olika patienten behandlingar. Alltså senaste Zika utbrott gör det angeläget att utveckla verktyg som snabbt diskriminerar dessa virus hos patienter och instängd myggor, välja rätt patient behandling, och för att förstå och hantera deras epidemiologi i realtid.

Tyvärr, nuvarande diagnostiska tester, inklusive de mottagande 2016 nödsituation använder auktoriseringar och påskyndat status, upptäcka viralt RNA av omvänd Transkription polymeras-kedjereaktion (RT-PCR), som kräver instrumentering, utbildade användare, och betydande provberedning. Således måste de skickas till ”godkänd” referenslaboratorier, som kräver tid. Faktiskt i augusti 2016, Center for Disease Control (CDC) frågade gravida kvinnor som hade varit biten av en mygga och utvecklat ett Zika-indikerande utslag vänta en oacceptabel 2 till 4 veckor före lärande oavsett om de var infekterade. Vi behöver mycket tester som kan göras på plats, med några resurser och av utbildade men inte nödvändigtvis legitimerad personal.

Denna video visar en analysmetod som uppfyller dessa specifikationer, arbetar med urin eller serum (för patienter) eller krossade mygga slaktkroppar (för miljömässiga övervakning), alla utan mycket provberedning. Mygga slaktkroppar Fångas på papper som transporterar kvaternära ammoniumsalter grupper (Q-papper) följt av ammoniak behandling för att hantera biologiska. Dessa sedan sätts direkt, utan RNA isolering, in i analysen rör som innehåller frystorkade reagenser som behöver ingen kedja av kylanläggningar. En modifierad form av omvänd Transkription loop-medierad isotermiska förstärkning med målet-specifika fluorescently märkta displaceable prober producerar avläsning, i 30 min, som en tre-Color fluorescens-signal. Detta visualiseras med en handhållen, batteridriven enhet med en orange filter. Framåt kontaminering förhindras med förslutna rör, och användningen av termolabila uracil DNA glykosylas (UDG) i närvaro av dUTP i förstärkning blandningen.

Introduction

Moskitburen virusinfektioner, bland annat denguefeber och chikungunya Zika virus är på uppgång och efterfrågan omedelbar hantering strategier. Denguefeber och chikungunya virus är redan endemisk i många tropiska regioner där Zika sprider sig nu i den västra halvklot1. Zikavirus, som denguefeber, är medlem av flavivirus -familjen och är infödd till Afrika med en asiatisk och två afrikanska genetiska härstamningar2. Även om identifiering av zikaviruset går tillbaka till 1947, förblev Zika infektion hos människa sporadisk för ett halvt sekel innan framväxande i Stillahavsområdet och Amerika. Det första rapporterade utbrottet av Zika feber inträffade på ön av Yap i Mikronesiens federerade stater i 2007, följt av franska Polynesien i 2013 och 2014. Det första större utbrottet i Amerika uppstod under 2015 i Brasilien.

Zika, denguefeber och chikungunya virus överförs främst av Aedes aegypti och Aedes albopictus. Zika har dock ytterligare nedströms människa till människa överföringsmöjligheter, sannolikt sprids genom sexuell kontakt, mor-till-fostret interaktion, och via amning3,4,5. Zika feber var först tros orsaka endast mild sjukdom. Det var dock senare knutna Guillain-Barrés syndrom hos vuxna, mikrocefali hos nyfödda, och kroniska muskuloskeletala sjukdomar som får sista månader till år. Diagnos av Zika sjukdom kan vara svårt, eftersom symptomen på en Zika infektion är liknande dem i andra mygga-spread virus6. Gemensamma samtidiga infektioner av dessa virus gör differentialdiagnos ännu mer utmanande7,8. Därför behövs snabb och pålitlig detektering av nukleinsyror från Zika och andra virus att förstå epidemiologi i realtid, att initiera kontroll och förebyggande åtgärder, och att hantera patientvården9.

Aktuella diagnostiska tester för dessa virus inkluderar serologiska tester, virusisolering, virus sekvensering och PCR-omvänd-Transkription (RT-PCR). Serologiska standardmetoder lider ofta otillräcklig känslighet och resultaten kan kompliceras av korsreaktivitet hos patienter som tidigare har blivit smittad av andra flavivirus.

Nukleinsyra testning förblir därför det mest tillförlitliga sättet att identifiera och särskilja dessa virus. Upptäckt av Zika och andra moskitburen virus utförs oftast med RT-PCR eller realtid RT-PCR i mängd biologiska vätskor, såsom serum, urin, saliv, sperma, bröstmjölk och cerebral vätska10,11. Urin och saliv prover är generellt att föredra över blod, sedan de ställer ut mindre PCR-hämning, högre virusbelastning, virus närvaro för längre tidsperioder och ökad användarvänlighet insamling och hantering av12,13. RT-PCR-baserade diagnostiska tester, består dock omfattande provberedningssteg och dyra termisk cykling utrustning, vilket gör det mindre optimalt för den point-of-care.

Omvänd Transkription loop-medierad isotermiska amplifiering (RT-lampa) har vuxit fram som ett kraftfullt RT-PCR-alternativ på grund av dess höga känslighet och specificitet14, dess tolerans för hämmande ämnen i biologiska prover15, och operation på inre temperatur, vilket avsevärt sänker assay komplexitet och tillhörande kostnader, vilket gör den lämplig för låg resurs miljöer. RT-lampa, som det klassiskt genomföras, består av sex primers som binder till åtta olika regioner inom ramen för målet RNA. Det går på konstant temperatur mellan 60 ° C och 70 ° C, och använder ett omvänt transkriptas och ett DNA-polymeras med stark strand undantränger aktivitet.

Under de inledande skedena av RT-lampa bildar framåt och bakåt inre primers (FIP och BIP, figur 1A) tillsammans med yttre framåt och bakåt primers (F3 och B3) en hantel struktur, utsäde strukturen av exponentiell lampa förstärkning. Förstärkning ytterligare påskyndas av loop framåt och bakåt primers (LF och LB), som utformats för att binda de enda stranded regionerna av hantel och resulterar i bildandet av concatemers med flera upprepade loopar16. Klassisk lampa analyser utifrån grumlighet eller avläsning av DNA infoga färgämnen är inte helt lämpad för point-of-care detektion av Zika, där en viss nivå av multiplexing är önskas17,18,19. Multiplexing är inte lätt erhållas i dessa system eftersom de är benägna att generera falsk-positiv på grund av off-target kompletteringar.

För att hantera dessa frågor, lägger litteraturen en extra komponent i form av en ”strand-undantränger sond” den klassiska RT-lampa arkitektur20,21,22. Varje sond har en sekvens-specifik dubbel-strand och ett enkelsträngat priming-region. Sonden med enkelsträngat regionen är Taggad med en 5'-fluorophore och kompletterande sonden är modifierad med en 3'-änden törstsläckare. I avsaknad av ett mål observeras ingen fluorescens på grund av hybridisering av kompletterande sonden strandar, som ger den fluorophore och törstsläckare i närheten. I närvaro av ett mål, enkelsträngat portion av fluorescerande sonden binder till dess komplement på målet, och förlängs sedan med en strand undantränger polymeras. Ytterligare polymeras förlängning av omvänd primrar orsakar separation av törstsläckare strand från dess kompletterande fluorescently märkt strand, att tillåta utsläpp av fluorescens ()figur 1B). Med denna design genereras signalen efter hantel bildandet, minska risken för falskt positiva signaler.

Dubbelsträngat portion av strand-undantränger sonden kan vara valfri sekvens, och när multiplexing tillämpas samma sekvens kan användas med olika fluorophore-törstsläckare par. Med denna arkitektur, virus-förorenat urin, serum eller mygga infördes direkt prover squished på papper till analysen utan provberedning. Tre-Color fluorescens Läs-outs mänskliga ögat genererades inom 30-45 min och signaler var visualiserat av en 3D-tryckt observation ruta som använder en blå LED och en apelsin filter. Frystorkning RT-lampa reagenserna aktiverad distribution av detta kit till lägre resursinställningar utan behov av kylning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: Myggor var de enda djur som direkt används i denna studie. Förfarandena för att hantera kycklingar, vars blod användes till foder infekterade myggor, godkändes som IACUC protokoll nr 201507682 vid University of Florida institutionella djurens vård och användning Committee.Virus förökningen och mygga infektion studierna var utförs vid anläggningen i BSL-3 Florida medicinsk entomologi laboratoriet i Vero Beach, utfördes FL. RT-lampa experimenten i BSL-2 laboratoriet delas av FfAME och Firebird biomolekylära vetenskaper LLC i Alachua, FL.

1. utformningen av Primers och Strand undantränger sonder

  1. Extrahera viral sekvenser för denguefeber 1 från Broad Institute databas23; sekvenser för Zika och chikungunya från NIAID patogen virusdatabasen och analys resurs24.
    1. Skapa flera sekvens linjeföring (MSAs) för sekvenser av intresse med hjälp av programvara muskel v3.8.3125. Använda genererade MSAs för att söka efter lampa primers uppsättningar inom ett bevarat målet, och undvika icke-relevanta eller oavsiktliga mål, såsom distinktioner mellan subtyper av ett mål.
  2. Följ Designregler för lampa primers som beskrivs online (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/), och tillåta användning av blandade baser i grundfärger att täcka virus divergens26. För att undvika korsreaktivitet primer uppsättningar, jämför genererade lampa grundfärger i NCBI RNA virus databasen med NCBI BLAST27. Jämföra varje set att eliminera primers som skulle dimerize i en multiplex assay med NCBI BLAST samt.
  3. Skärmen dubbelsträngat portion av strand-undantränger sonden mot virala genomsekvens och mygga genomiska sekvensen. Ändra 5'-ände mål bindande sond med fluorescein amidite (FAM), HEX färgämne och 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) färgämne för Zika, chikungunya och Dengue 1, respektive.
    1. Inkludera en positiv kontroll primer för urinprov. Design lampa grundfärger att rikta mänskligt mitokondrie-DNA. Etiketten strand-undantränger sond med TET på 5'-änden. Etiketten törstsläckare sonder som är delvis komplementära till varje fluorescently märkt sond med törstsläckare (t.ex., Iowa svart-FQ) på 3'-änden (tabell 1).

2. virus isolerar och infekterad mygga prover

  1. Användning isolat av zikaviruset (Puerto Rico stam), Chikungunya virus (La Réunion eller Brittiska Jungfruöarna stam) och Dengue serotyp-1-virus (Key West stam). Bestämma viral titrar med plack assay28 eller kvantitativ RT-PCR-29. Extrahera viral RNAs med kommersiellt tillgängliga RNA extraktion kits.
    Notera: Tabell 2 representerar de virala titrarna av varje virusisolat som används i denna studie.
  2. Följ den artikel som publicerades av Yaren et al. för ett detaljerat protokoll om infektionen av Ae. aegypti honor med Zika och chikungunya virus20. Se tabell 2 för viral titern av mygga provet angripits zikavirus.

3. RT-lampa tillsammans med termolabila Uracil DNA glykosylas

  1. 10 x primer mix förberedelse.
    1. Förbereda 100 µM stamlösningen av varje grundfärg och sond (se steg 1) genom att lägga till nuclease gratis vatten. Vortex väl och förvaras vid-20 ° C fram till användning.
    2. För 10 X Primer mix för varje Zika, denguefeber 1 eller mitokondrie DNA mål, mix 16 µL av FIP, 16 µL BIP, märkt 2 µL av F3, 2 µL av B3, 5 µL LF, 2 µL av LB, 3 µL av LB-fluorescerande probe, 4 µL av törstsläckare sond , och 50 µL nuclease-fritt vatten för att ge totalt 100 µL volym.
    3. För 10 X Primer mix för Chikungunya, blanda 16 µL av FIP, 16 µL BIP, 2 µL av F3, 2 µL av B3, 5 µL av LB, 2 µL av LF, märkt 3 µL av LF-fluorescerande sond, 4 µL av törstsläckare sonden och 50 µL nuclease-fritt vatten för att ge totalt 100 µL volym.
      Obs: Den sond koncentrationen som beskrivs ovan använder 300 nM final fluorescerande sonden och 400 nM törstsläckare sonden. Alternativt, Använd 80 nM fluorescently märkt sonden och 200 nM för dess törstsläckare probe för realtidsanalys.
  2. Tillsätt 5 µL 10 X primer mix (för 3-plex, tillsätt 5 µL av varje 10 X primer mix), 5 µL 10 X isotermiska förstärkning buffert (1 X buffert sammansättning: 20 mM Tris-HCl buffert pH 8,8, 50 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 8 mM MgSO4 0,1% Tween-20, 1 mM DTT), 7 µL av dNTP blandning (10 mM dATP, dCTP och dGTP, 5 mM av dTTP och dUTP), 16 enheter av DNA-polymeras, 15 enheter av omvänt transkriptas, 80 enheter av rekombinant ribonukleasinhibitor, 2 enheter av termolabila UDG, 1-2 µL av varierande mängder av vi RAL RNAs och vatten för att få den totala volymen upp till 50 µL i en 0,25 mL PCR röret (se Tabell för material).
  3. Inkludera negativa kontrollen analyser i detta skede genom att ersätta viral RNA volym med vatten. Inkubera prover mellan 65-68 ° C i 45 min till 1 h och sedan analysera genom att köra 5 µL av varje prov på 2,5% agarosgel i 1 X TBE buffert innehållande etidiumbromid (0,4 µg/mL). Använd en 25 bp eller 50 bp DNA stege som markör på gelen.
    Obs: Tillägg av en specifik mall för icke-målorganismer är valfritt.
  4. För att upptäcka förekomsten av patogena RNA, testa varje primer och dess nr-mall kontroll av varierande temperatur och/eller magnesium koncentrationen, eftersom varje RT-lampa primer set var ämnad att arbeta i varierande temperaturer (65 ° C till 68 ° C) eller magnesium koncentrationer (6-10 mM slutlig). Förbereda experiment vid rumstemperatur.

4. RT-lampa använder Viral RNA-spetsade urin

  1. Testa RT-lampa grundfärger i varierande slutliga koncentrationer av urin (0%, 10%, 20% och 50%) i 50 µL totala reaktionsvolym. För 10% slutliga urinens koncentration, tillsätt 1 µL av viralt RNA till 5 µL av urin. För 20% slutliga urinens koncentration, tillsätt 1 µL av viralt RNA till 10 µL av urin. För 50% slutliga urinens koncentration, tillsätt 1 µL av viralt RNA till 25 µL av urin.
  2. För övervakning i realtid av RT-lampa i 10% av urinen, använda en realtids PCR-instrumentet (se Tabell för material) med olika fluorophore filter.
    1. För att läsa fluorescens signaler från FAM-märkt amplikoner för Zika, använda ett filter som alltifrån 483 till 533 nm. för HEX-märkt amplikoner för chikungunya, använder ett filter som alltifrån 523 till 568 nm. för TAMRA-märkt amplikoner för denguefeber 1, använder ett filter som sträcker sig från 558 till 610 nm. och för TET-märkt amplikoner för mitokondrie-DNA, använder ett filter som alltifrån 523 till 568 nm.
      Obs: FAM har excitation och utsläpp maxima 495 nm och 520 nm, respektive. HEX har excitation och utsläpp maxima av 538 nm och 555 nm, respektive. TAMRA har excitation och utsläpp maxima av 559 nm och 583 nm, respektive. TET har excitation och utsläpp maxima av 522 nm och 539 nm, respektive.
  3. Användning 96 brunnar tätning plattan med en klar plast ark, inkubera prover på 65-68 ° C i 60-90 min och sedan registrera fluorescensen varje 30 s med den lätta apparat. Initialt Använd 80 nM fluorescently märkt sonder, och sedan testa 300 nM fluorescently märkt sonder.
    1. Bestämma detektionsgränsen för varje mål genom att lägga till seriellt spädas viral RNAs i slutliga urinens koncentration av 10%.
      Obs: Använd realtid RT-lampa för att bestämma optimal temperatur, magnesium koncentration, fluorescently märkt sonden koncentration och reaktionstid.
  4. För att visualisera den fluorescens som genereras av strand displaceable sonder av ögat, använder en blå LED-ljuskälla från en ljus apparat med excitation vid 470 nm (någon gelelektrofores låda med inbyggd blå ljuskälla kommer att arbeta, se tabell material), och spela in bilden med en mobiltelefon kamera vid rumstemperatur i mörkret.
    Obs: Använd 300 nM fluorescently märkt sonder, när visualisering av alla tre färger av ögat med blå LED behövs.

5. RT-lampa på detektion av Zika-infekterade myggor med Q-papper-teknik

  1. Förbereda Kvartära ammonium-modifierade filterpapper (Q-papper), enligt tidigare publicerade metoder med smärre ändringar30.
    1. Sänk ner 1 g cellulosa filterpapper cirklar (se Tabell för material) med en diameter på 3,5 cm i 50 mL 1,8% av NaOH vattenlösning för 15 min för aktivering.
    2. Samla aktiverade papper cirklar av dammsugarfilter och sedan doppa dem i 40 mL vattenlösning (2,3-epoxipropyl) trimetylammoniumformiat klorid (0.28 g) över natten i rumstemperatur.
      Notera: Behåll förhållandet massa (2,3-epoxipropyl) trimetylammoniumformiat klorid filterpapper 0,28 till 1.
    3. Samla det resulterande katjoniska papperet av dammsugarfilter och neutralisera med 50 mL 1% ättiksyra.
    4. Tvätta papperet tre gånger med etanol och lufttorka under en huv med konstant luftflöde.
  2. Skär Q-pappersark i små rektanglar (3 x 4 mm) med ett papper punch eller sax. Krossa Ae. aegypti kvinnliga myggor potentiellt infekterade med Zika på varje papper med en mikro mortelstöt.
  3. Lägg till varje papper 20 µL av 1 M vattenlösning ammoniaklösning (pH ≈ 12) och vänta 5 min. Tvätta sedan varje papper en gång med 20 µL av 50% EtOH och en gång med 20 µL av nuclease-gratis vatten. Lufttorka papperet i BSL-2 biosäkerhet skåp för ca 1 h.
    Obs: Vid denna punkt, prov kan förvaras vid-20 ° C över natten fram till användning.
  4. Med pincett, placera varje papper i 100 µL av RT-lampa reaktionsblandningen och inkubera vid 65-68 ° C i 45 min. se till att helt dränka papperet i lösningen; Det bör inte vara flytande. Läs och registrera fluorescensen uppkommer zikavirus med blå LED-ljuskälla och orange eller gul filter.

6. frystorka den RT-lampa reagenser för 100 µL reaktionsvolym

  1. Förbereda 10 X lampa primer blandningen enligt avsnitt 3.1, och förbereda dNTP blandning innehållande dUTP enligt avsnitt 3.2. Lagra primer blandning och dNTP vid-20 ° C fram till användning.
  2. Förbereda 10 mL av enzymet dialys buffert att ta bort glycerol, genom att blanda 100 µL av 1 M Tris-HCl pH 7.5, 500 µL 1 m KCl, 2 µL 0,5 M EDTA, 100 µL 10% Triton x-100, 100 µL 0,1 M DTT och 9.198 mL nuclease-gratis vatten. Lagra dialys bufferten vid 4 ° C.
    Obs: Se till att filtrera (0,2-micron filter) Alla reagens buffertlösningar tidigare använda och lagra dem vid 4 ° C.
    1. Använda ett ultrafiltrering membran med 10 kDa cut-off gräns (se Tabell för material). Placera 350 µL av dialys buffert, 4 µL av 32 enheter av DNA-polymeras, 2 µL av 30 enheter av omvänt transkriptas och 2 µL av 80 enheter av RNase inhibitor i ultrafiltrering membran och centrifugera vid 14 000 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
    2. Lägga till en annan 350 µL av dialys buffert i ultrafiltrering membran och centrifugera (14 000 x g) för en annan 5 min. Tom samling röret och upprepa det här steget, sedan Centrifugera (14 000 x g) i 3 min.
    3. För eluering, Invertera membranet och placera i en ny samling tub. Snurra på 1 000 x g under 2 min. mått elutionsvolymen; om mindre än 8 µL, föra volymen upp till 8 µL genom att lägga till dialys buffert. Lagra elueringen vid 4 ° C, och genast fortsätta till nästa steg.
      Obs: Detta protokoll är enda tube frystorka den, men Förbered minst 10 reaktionsrören i taget med samma ultrafiltrering membranet och använder samma mängd dialys buffert.
  3. Blanda 10 µL 10 X lampa primer om singleplex (Lägg till 10 µL av varje 10 X primer mix för 3-plex,), 14 µL av dNTP blandning, 8 µL av dialyseras enzym mix, 2 µL av 2 enheter av termolabila UDG och 66 µL nuclease gratis vatten (för 3-plex Använd 46 µL) i en 0,5 mL mikrocentrifug rör och lämna locket öppnas. Lägg istället en annan lock punkteras med en nål så att ånga fly.
  4. Genast frysa rören vid-80 ° C i 2 h och lyophilize röret för 4 h. Cover frystorka den kammaren med aluminiumfolie om skydd från ljus. När reagenser torkas, bort punkterad locken, Stäng ursprungliga locket och förvara rören med frystorkade reagenser vid 4 ° C i mörker.
    Obs: Reagenser kan vara förpackat i frystorkat skick över natten, om det behövs.

7. testa frystorkade RT-lampa reagens på urin och mygga prover som innehåller Zika

  1. Använda följande objekt från kit (se Tabell för material) för Zika: en 3D-tryckt Observera låda med orange filter (lång pass filter, cut-på ~ 540 nm), 2 AAA-batterier för att observera box, frystorkade reaktionsrören märkt ZV för Zika detektering, och 1.1 X rehydrering buffert i 1,5 mL skruvlock rör.
  2. Förbereda 50 mL 1.1 X rehydrering buffert genom att blanda 5,5 mL 10 X isotermiska förstärkning buffert som kommer tillsammans med DNA-polymeras (se Tabell för material), 3,3 mL 100 mm MgSO4, 110 µL 0,5 M DTT och 41.09 mL nuclease-gratis vatten. Blanda väl, alikvotens 1 mL av denna lösning till 1,5 mL skruvlock rör och förvaras vid 4 ° C fram till användning.
  3. Tillsätt 90 µL 1,1 X rehydrering buffert i varje reaktionsröret (0,5 mL). Se till att vätskan fyller botten av röret som innehåller de frystorkade reagenserna (lös upp dem med blanda genom att skaka, sedan kort snurra ner (1000 x g)). Tillsätt 10 µL av urinprov spetsade med viral RNA reaktion rören (se avsnitt 4.1 för detaljer).
    1. Om testning myggor, lägga till en rektangel av Q-papper håller slaktkroppar i mygga (som förberett i stegen beskrivs i avsnitt 5.2 och 5.3), tillsammans med 10 µL renat vatten istället för urinprov.
      Obs: Alternativt, lägga till 10 µL av saliv eller serum prover i stället för urin. Om proverna är extraherad DNA eller RNA, tillsätt 2-5 µL av provet i återfuktad blandning och komplett med nuclease-fritt vatten till 10 µL av slutliga provvolymen.
  4. Stäng locket på reaktionsrören. Placera dem i en värme block och badkar (eller inkubator) förinställd på 65-68 ° C. Inkubera i 30-45 min, men inte mer än 1 h. Efter inkubation, ta bort röret från värmen. För att förhindra kontaminering av framtida analyser, säkerställa att dessa rör förblir stängd.
  5. Placera reaktionsrören i rutan Observera; temperaturen kommer att falla för den omgivande temperaturen (helst 25 ° C). Slå på strömbrytaren på baksidan av rutan Observera. Observera prov genom det orange filtret och fånga bilden av en mobiltelefon-kamera som hålls på avstånd där bilden fyller 80% av synfältet.
    Obs: Bättre visualisering uppnås i låga ljus miljön.
  6. Efter visualisering är klar, Stäng av. Förvaras mörkt, helst med kylning, förseglade rören om senare visualisering behövs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Inledningsvis bedömdes föreställningar av varje RT-lampa primer (tabell 1) med dess motsvarande viral RNA substrat samt negativa kontroller med gelelektrofores. RT-lampa primers var avsedda att NS5 målregionen (RNA-beroende RNA-polymeras) för Zika och Dengue 1 och nsP2 region (icke-strukturella protein P2) för Chikungunya. Det var total-RNA extraherade från viral bestånd odlade i afrikanska green monkey njurceller (Vero) mallar. I ett fall var total nukleinsyra (DNA och RNA) ur en Chikungunya-smittad kvinna Ae. aegypti (tabell 2).

Figur 2A visar några representativa resultat med RT-lampa utförs med dessa prover. I både singleplex och multiplexade (3-plexed) fall visas RT-lampa produkter som en stege av concatemers när den körs på agarosgel. Negativ kontrollprover som innehåller vatten som provet gav endast banden för primers själva, inklusive icke-specifik målkontrollen där total nukleinsyra extraherade från en icke-infekterade Ae. aegypti kvinnliga användes mygga som mall.

För att hitta optimala RT-lampa förhållanden, testades olika magnesium koncentrationer och inkubation temperaturer. Det konstaterades att högre koncentrationer av magnesium och lägre temperaturer kan generera icke-specifik amplikoner, ger upphov till falsklarm. Därför användes 8 mM av magnesium och inkubation vid 65 ° C i alla experiment från därefter på (figur 2B).

Gelelektrofores kräver öppnandet av reaktionsröret, som kan ge upphov till föroreningen av nästa uppsättning experiment av tidigare genererade amplikoner, vilket leder till falskt positiva. För att förhindra den framåt kontamineringen, ersattes dTTP av lika förhållanden av dTTP och dUTP, så att dUTP skulle införlivas i RT-lampa amplikoner. Detta visar den möjliga kontaminerande amplikon till ett substrat för uracil-DNA glykosylas (UDG) under utarbetandet av någon efterföljande RT-lampa reaktioner31,32. När en termolabila version av UDG används, kan dU-innehållande amplikoner smältas i rumstemperatur som RT-lampa proverna ställs in, och UDG kommer att inaktiveras under isotermiska förstärkning. Reaktionsröret kan dessutom öppnas för en efterföljande analys, när det behövs. Förutom användning av UDG matsmältningen genererar en arkitektur som använder displaceable sonder fluorescens som kan läsas utan att behöva öppna reaktionsröret.

Figur 3A levererar resultatet av detektionsgränsen (LOD) för Zika använder fluorescerande sonder inriktning Zika RNA. Seriell utspädning studier visade att så låg som 1,42 pfu kunde detekteras inom 30 min i ett singleplex assay eller en 3-plexed analyser. När prover späddes ytterligare till 0,71 pfu, observerades en fluorescerande signal efter 40 min för en singleplex analys, och efter 50 min för 3-plexed blandningar. Förutom i realtid RT-lampa, fluorescens var visualiserat efter 35 min genom ett orange filter, efter prover var utsatt till blått LED-ljus med en magnetisering våglängd på 470 nm (figur 3B). Likaså detektionsgränser mättes på 37,8 kopior och 1,22 pfu för Chikungunya och Dengue 1, respektive (figur 3 c-D).

Att bestämma optimala urinens koncentration, Zika virus-RNA (2,85 pfu) lades till varierande koncentrationer av en autentisk mänsklig urinprov (0%, 10%, 20% och 50%). Förmodligen på grund av dess elektrolyter, var RT-lampa signalen försenad från 15 till 35 min när 50% urin användes i analysen. 10% urin var fast besluten att vara optimalt på grund av att presentera en lägre bakgrund. I avsaknad av Zika mål, ingen amplifiering observerades vid någon koncentration, men högre bakgrund fluorescens observerades i prover med högre urinens koncentration (figur 3E).

Om du vill att multiplexering med Läs-outs av olika fluorescens färger, 80 nM strand displaceable sonder var märkt med olika fluorophores (FAM för Zika, HEX för Chikungunya och TAMRA för denguefeber 1), men tillsammans med den samma törstsläckare (Iowa svart-FQ) med en koncentration av 200 nM. Cell kultur-extraherade viral RNAs (2,85 pfu för Zika, 242 viral RNA-kopior för Chikungunya och 1,22 pfu för denguefeber 1) användes som mål, utspädd i 10% urin. Realtid analys av fluorescens data visade en fördröjning i signal generation (ca 10 min) för 3-plexed analyser där primers för alla mål var närvarande. I singleplex fall, däremot, slutfördes reaktionen inom 10-15 min (figur 4A-C). När fluorescens var visualiserat med en blå LED och apelsin filter, observerades skillnader i signalstyrka för olika fluorophores, där FAM-märkt amplikoner var de mest synliga. Detta är förväntat, sedan excitation vid 470 nm är närmast till högst av FAM excitation spektrumet (figur 4 d).

Att aktivera visualisering av alla tre färger med en enda LED excitation våglängd (470 nm), koncentrationerna av displaceable sonder höjdes till 300 nM och den kompletterande törstsläckare sond till 400 nM. I singleplex fall slutfördes signal generation inom 10 min för Zika, 20 min för Chikungunya och 40 min för denguefeber 1. I 3-plexed-analyser, men det var ytterligare försenat 20 min i alla analyser ()figur 5A- C). Dock aktiverat offer i tid till signal generation visualisering av alla tre färger med blå LED-lampa med orange filter. Grön fluorescens observeras för Zika med hjälp av sonder 5'-änden märkt med FAM, ljus grön-gul fluorescens tilldelas Chikungunya där sonden är 5'-änden märkt med HEX, och orange-röd fluorescens används för denguefeber 1, där dess sonden är 5'-änden märkt med TAMRA (figur 5 d).

För att testa mygga prover med möjlig Zika infektion, laboratorium-infekterade Ae. aegypti kvinnliga myggor (tabell 2) krossades på en rektangel av Q-papper, följt av ammoniak behandling att sterilisera viruset och binda de exponerade viral RNA på positivt laddade Q-papper. Papperet var kort tvättas med etanol att ta bort pterin föreningar som finns i mygga slaktkroppar som kan störa fluorescens avläsning33,34. Q-papper innehållande myggor var sedan direkt nersänkt i RT-lampa blandningen, och efter inkubation vid 65 ° C i 30 min, ljust grön fluorescens observerades i närvaro av zikaviruset (figur 6).

Att leverera den Upptäck kit utan en kedja av kylanläggningar, och att göra analysen enkel för att använda, RT-lampa reagenser var frystorkade och åtföljs av en rehydrering buffert och en 3D-tryckt observation låda som använder en 470 nm avger ledde och ett orange filter (figur 7a). med 9 volymer av rehydrering buffert och 1 volymdel urinprov, synlig grön fluorescens kan genereras inom 30 min och bilden kan fångas av någon mobiltelefon kamera (bild 7B). Alternativt, mygga prover på Q-papper kan användas av samma analysen genom att lägga till 1 volymdel vatten istället för urinprov.

Figure 1
Figur 1: lampa Assay Design (A) RT-lampa primers och bildandet av en hantel struktur av en strand undantränger DNA-polymeras. (B) införande av strand-undantränger sonder att tillåta multiplexering och fluorescens avläsning och övervaka RT-lampa framsteg i realtid. Omtryckt med tillåtelse från Yaren et al. 201720. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Gel elektrofores analys av amplikoner. (A) testning lampa grundfärger i singleplex eller multiplex (3-plex) format med lämpliga positiva och negativa kontroller. Positiva kontroller omfattar renat viral RNA med följande titrar: 2,85 pfu för Zika (ZV), 242 genomisk kopior för Chikungunya (CH) och 1,22 pfu för denguefeber 1 (D1). NTC-z, NTC-c och NTC-d står för ingen mall kontroll för Zika, Chikungunya och Dengue 1 grundfärger i singleplex format, respektive. NSC står för icke-specifik målkontrollen där totala xNA (DNA och RNA) utvinns från sjukdomsfri Ae. aegypti. M står för markör (50 baspar DNA stege). (B) optimering av assay villkor genom att testa ett intervall av RT-lampa inkubation temperaturer (från 55 ° C till 70 ° C) och MgSO4 koncentrationer (från 4 mM till 10 mM) i multiplex format i avsaknad av rikta RNA. Omtryckt med tillåtelse från Yaren et al. 201720. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: RT-lampa i realtid. (A) Singleplex och multiplexade detektionsgräns (LOD) för Zika (ZV) med 80 nM FAM-märkt strand-undantränger sond i realtid med hjälp av realtids PCR-instrumentet (kanal 483-533 nm). Prover inkuberades vid 65° C för ca 50 min. (B) fluorescens observerades dock en apelsin filter följt av excitation av proverna vid 470 nm med blått ljus. Prover från A användes för visualisering. (C) analys i realtid för LOD på Chikungunya (CH) målet med 80 nM av HEX-bärande lampa sonder i singleplex format med fluorescens kanal 523-568 nm på en realtids PCR-instrumentet. (D) analys i realtid för LOD på denguefeber 1 (D1) mål med 80 nM av TAMRA räntebärande lampa sonder i singleplex format med fluorescens kanal 558-610 nm på en realtids PCR-instrumentet. (E) bestämning av maximal urin i RT-lampa reaktion. En serie final urinkoncentrationer (0%-50%) testades med 80 nM FAM-märkt sonden i närvaro av 2,85 pfu av Zika vRNA.NTC = ingen mall kontroll på alla paneler. Omtryckt med tillåtelse från Yaren et al. 201720. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Singleplex och multiplex virus upptäckten i urinen med 80 nM sond. (A) Zika detektion i 10% urin i singleplex och multiplex-format med 2,85 pfu Zika (ZV) viral RNA med FAM-märkt sond (80 nM). (B) Chikungunya detektion i 10% urin i singleplex och multiplex-format med 242 kopior av Chikungunya (CH) viral RNA med HEX-märkt sond (80 nM). (C) denguefeber 1 detektion i 10% urin i singleplex och multiplex-format med 1,22 pfu av denguefeber 1 (D1) viral RNA med TAMRA-märkt sond (80 nM). (D) visualisering av RT-lampa reaktioner genom orange filter efter excitation vid 470 nm med blå LED-ljus. Omtryckt med tillåtelse från Yaren et al. 201720. NTC = ingen mall kontroll på alla paneler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Singleplex och multiplex virus upptäckten i urinen med 300 nM sond. (A) Zika detektion i 10% urin i singleplex och multiplex-format med 2,85 pfu Zika (ZV) viral RNA med FAM-märkt sond (300 nM). (B) Chikungunya detektion i 10% urin i singleplex och multiplex-format med 242 kopior av Chikungunya (CH) viral RNA med HEX-märkt sond (300 nM). ()C) denguefeber 1 detektion i 10% urin i singleplex och multiplex-format med 1,22 pfu av Dengue1 (D1) viral RNA med TAMRA-märkt sond (300 nM). (D) visualisering av RT-lampa reaktioner genom orange filter efter excitation vid 470 nm med blå LED-ljus. Som positiv kontroll i urin experiment, en lampa primer ange inriktning mänskliga mitokondrie-DNA (mtDNA) användes med TET-märkt sond (300 nM). NTC = ingen mall kontroll på alla paneler. Omtryckt med tillåtelse från Yaren et al. 201720. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Arbetsflöde för Zika upptäckt av infekterad mygga prover med Q-papper-teknik med friska och Zika-infekterade Ae. aegypti (ZV 9, tabell 2). Omtryckt med tillåtelse från Yaren et al. 201720. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: rutan observerar. (A) de observerar box använder två AAA-batterier i basen. Dessa batterier power fyra blå LED-lampor som lyser upp proverna hölls i 0,5 mL rören placeras i de fyra hålen. LED-lampor är aktiverade med en switch. Proverna är visualiserade genom det orange filtret. (B) fluorescens i observation box. Från vänster till höger: negativ, positiv för Zika, negativa och positiva för Zika. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Mål virus Namn Sekvens (5' - 3') Längd Startpositionen Slutpositionen
Zika ZV-F3 GAGACTGCTTGCCTAG 16 9905 9920
ZV-B3 CTGGGGTCTTGTCTTC 16 10145 10130
ZV-LF CAGTTGGAACCCAGTCAAC 19 10028 10010
ZV-LB GTGGAACAGAGTGTGGATTG 20 10093 10112
ZV-FIP CCATGGATTGACCAGGTAGTTTTTTCGACTGATGGCCAATG 41 9974 10053
ZV-BIP ACCACTGARGACATGCTTGTTTTTCATGTGGTCGTTYTCC 40 10070 10129
ZV-LB_NatTail FAM-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
GTGGAACAGAGTGTGGATTG		 60 10093 10112
Chikungunya CH-F3 CGTCAACGTACTCCTAAC 18 2891 2908
CH-B3 ACGTTGGCTTTRTTTTGG 18 3094 3077
CH-LF AGCGTCTTTATCCACGGG 18 2968 2951
CH-LB AYGCATCRATAATGGCGGG 19 3025 3043
CH-FIP GAAGTTTCCTTTCGGTGGGTTTTTGGAAGACACTYTCYGG 40 2932 2993
CH-BIP AAGGAGTGGGAGGTGGATTTTTTCAYTTGGTGACTGCAG 39 3006 3063
CH-LF_NatTail HEX-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
AGCGTCTTTATCCACGGG		 58 2968 2951
Dengue-1 D1-F3 ACAGCYCTGAATGAYATGG 19 9583 9601
D1-B3 GCAGTTTCTCTCAGGC 16 9803 9788
D1-LF CACTTGYTGCCARTCATTCC 20 9666 9647
D1-LB CCATGCCGYAACCAAG 16 9727 9742
D1-FIP CTGGTGGAARTGGTGTGATTTTTTGGGAACCTTCAAAAGG 40 9628 9693
D1-BIP GAAGGAYGGGAGGGAAATAGTTTTTTTAGCCCTRCCCA
CAAG		 42 9702 9763
D1-LB_NatTail TAMRA-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
CCATGCCGYAACCAAG		 56 9727 9742
Mitokondrie-DNA MtDNA-F3 AGCCTACGTTTTCACAC 17 9183 9199
MtDNA-B3 GCGCCATCATTGGTAT 16 9410 9395
MtDNA-LB GCCTAGCCATGTGATTTCAC 20 9322 9341
MtDNA-LF GGCATGTGATTGGTGGGT 18 9254 9237
MtDNA-FIP GTCATGGGCTGGGTTTTACTTTTTCTACCTGCACGACAAC 40 9213 9228
MtDNA-BIP CTCAGCCCTCCTAATGACCTTTTTGAGCGTTATGGAGTGG 40 9359 9344
MtDNA-LB_NatTail TET-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG
GCCTAGCCATGTGATTTCAC		 60 9322 9341
Gemensamma törstsläckare CTGACCTGACGGACTGAACGGATGGCTGAGCGCA
AACCCG-Iowa svart FQ		 40

Tabell 1: Primers och strand displaceable sonder. Omtryckt med tillåtelse från Yaren et al. 201720. Sekvenser i fetstil representerar regionen dubbelsträngat i strand undantränger sonder. FAM-märkt (ses som grön fluorescens), HEX-märkt (sett ljus grön-gul fluorescens), TAMRA-märkt (ses som orange-röd fluorescens), och TET-märkt (ses som gul fluorescens) sonder tilldelades till upptäcka Zika, Chikungunya, denguefeber 1, och mitokondrie-DNA i urin, respektive. FAM har excitation och utsläpp maxima vid 495 nm och 520 nm, respektive. HEX har excitation och utsläpp maxima på 538 nm och 555 nm, respektive. TAMRA har excitation och utsläpp maxima på 559 nm och 583 nm, respektive. TET har de excitation och utsläpp maxima på 522 nm och 539 nm, respektive. Om du vill aktivera användningen av en enda törstsläckare för alla fluorophores, användes Iowa svart-FQ på grund av sortimentet brett absorption (420-620 nm).

Virus, stam (GenBank anslutningen nummer) Familj/släkte Viral titrar
Zikaviruset (ZV), Puerto Rico (PRVABC59, KU501215.1) Flaviviridae/Flavivirus grupp IV, positiv ssRNA 2,85 x 108 pfu/mL
Chikungunya virus (CH), Brittiska Jungfruöarna (asiatiska stammen, KJ451624) Togaviridae/Alphavirus grupp IV, positiv ssRNA 2,42 x 108 genomen/mL
Chikungunya virus (CH), La Reunion (Indiska oceanen härstamning, LR2006-OPY1, KT449801) Togaviridae/Alphavirus grupp IV, positiv ssRNA 1,89 x 108 genomen/mL
Chikungunya virus (CH), La Reunion extraherade totala NA från Aedes aegypti kvinnliga (Indiska oceanen härstamning, LR2006-OPY1, KT449801) Togaviridae/Alphavirus grupp IV, positiv ssRNA 3,85 x 105 genomen/mL
Denguefeber serotyp 1 (d-1), Key West (FL) (JQ675358) Flaviviridae/Flavivirus grupp IV, positiv ssRNA 1.22 x 106 pfu/mL
Zika (ZV) mygga identitet, stam Benet titer pfu/mL
ZV 9, Puerto Rico 4,76 x 103

Tabell 2: Viral titrar i cellodlingar och infekterad mygga. PFU: plaque-forming unit. Omtryckt med tillåtelse från Yaren et al. 201720.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mygga blodburna virus Zika, denguefeber och chikungunya hotar folkhälsan och senaste Zika utbrott höjdpunkt behovet av låg kostnad point-of-care upptäckt alternativ för patientens diagnostik, samt för mygga övervakning. Isotermiska förstärkning metoder utvecklades som prisvärt alternativ till PCR-baserat system. Särskilt, har RT-lampa-baserade plattformar tillämpats för att upptäcka ett brett utbud av patogener. Användning av isotermiska plattformar har dock främst begränsat till enda måldetektering. Metoden redovisas här använder en modifierad RT-lampa för att möjliggöra samtidiga upptäckt av tre olika mål i en enda reaktionsblandning, som körs på en rad måttliga temperaturer (65-68 ° C), visat sig vara särskilt praktiskt eftersom högre temperaturer än 60 ° C återge Zika och andra virus icke-infektiös30,35.

Vidare visar data som presenteras här att RT-lampa kan tolerera hämmande ämnen som kan finnas i olika biologiska vätskor15. Detta tillåter viral RNAs kan förstärkas utan ett extra steg av RNA rening genom att direkt lägga provet i reaktionsblandningen. Beroende på vilken typ av prov får de maximal volymen av provet måste vara beslutsam att inte hämma reaktionen och inte orsaka bakgrund fluorescens (falskt positiva). Studien presenteras här fokuserar på användning av 10% slutlig volym för urinprov. Saliv-och serumprover kan dock också tillämpas på analysen i samma sätt20. Detektionsgränser befanns vara långt över de rapporterade virusbelastning i patientens urin13, liksom virusinfekterade myggor20,36,37.

Mygga övervakning har oftast en lägre prioritet för folkhälsan resurser, så en billig multiplexed kit att kartlägga ett hushåll eller ett offentligt område skulle ha särskilt värde. Därför ändrades detta kit genom tillsats av Q-papper att tillåta påvisande av virus i mygga slaktkroppar. Q-papper innehåller höga halter av kovalent bifogade kvaternära ammoniumsalter grupper, som tillåter fångst av viral nukleinsyra på dess yta genom coulombic interaktioner. Trots att det var en oro att Q-papper kan hämma RT-lampa, konstaterades det att genom att lägga till Q-papper redovisade mygga slaktkroppar direkt i RT-lampa blandning, framgångsrika virus upptäckten skulle kunna uppnås inom 30 minuter. För framgångsrika signal generation, Q-papper måste vara små nog (t.ex., storlek 3 x 4 mm för 100 µL reaktionsvolym) att dränkas i RT-lampa reaktionsblandningen. Om det är för stor för reaktionsröret, eller börjar flytande istället för återstående nedsänkt i vätskan, reaktionen får inte ske och resultatet kan visas som falska negativa.

För framgångsrik identifiering och differentiering av varje virus ange varje primer måste följa riktlinjerna för RT-lampa primer design, Designregler för undantränger sonder, och inkluderar ett urval av fluorophores för multiplexering. Varje primer som behöver kontrolleras mot olika mål att undvika korsreaktivitet. Dessutom magnesium koncentration och inkubation temperatur behöver optimeras för varje set. Metoder som presenteras här använder fluorescens utläsningar synliga genom ögat, som var fulländad genom att införa strand displaceable sonder till RT-lampa arkitektur. Tre distinkta färger kan visualiseras i en multiplex assay när olika fluorophores tilldelades till varje mål virus. Detta ger fördelar jämfört med befintliga isotermiska Zika detektionsmetoder, eftersom de flesta publicerade metoder beroende enda måldetektering och användningen av infoga eller fluorescens färgämnen, som inte är sekvens-specifika och är benägna att generera icke-specifika amplikoner.

Ett avgörande steg att överväga är fastställandet av den slutliga koncentrationen av fluorescently märkt tränger sonder. Det konstaterades att 80 till 100 nM undantränger sonder kan generera fluorescens signaler inom 15-20 min, medan tid signalera försenades när 300 nM sonden koncentration användes. Reaktionstid försenades ytterligare när analyserna var kör i en multiplex mode. Anledningen till att byta från 80 nM till 300 nM var att möjliggöra visualisering av alla tre fluorophores som använder en enda LED-källa. Blå LED med excitation vid 470 nm är lämplig för FAM-märkt sonder, men är mindre lämplig för HEX - eller TAMRA-märkt sonder. Därför gjordes ett offer på inkubationstiden för att kunna visualisera alla tre målen.

Ett av problemen med RT-lampa är framåt kontaminering. RT-lampan genererar stora mängder amplikon i en kort inkubationstid och amplikoner enkelt kunde släppas som aerosoler. För att minska problemet, ingick dUTP tillsammans med andra dNTP följt av UDG matsmältningen under assay set-up. Det är viktigt att använda en värme-labila version av UDG, eftersom det är nödvändigt att inaktivera UDG för att förhindra nedbrytning av nygenererad RT-lampa amplikoner.

Att tillåta distribution av satsen utan kylning, alla komponenter i den analys som behövs för att vara frystorkade och kit kompletteras med rehydrering buffert. Därför, någon glycerol som är närvarande i kommersiellt tillgängliga enzymer togs bort genom ultrafiltrering eftersom glycerol inte kan tas bort genom att frystorka den. På en hög koncentration i en blandning, kan glycerol störa enzymaktivitet. Det enda enzym som inte ingår i glycerol borttagningen var det termolabila UDG. UDG är ett litet enzym med molekylvikt på 24,6 kDa, vilket gör det olämpligt för ultrafiltrering experiment. Därför lades det till frystorka den blandningen som köpt. Kvarstående glycerol påverkade inte analysens resultat.

En av begränsningarna av fluorescerande RT-lampa tekniken är användningen av den enda LED-källan. När analyser var kör i singleplex eller multiplex format, behövdes högre koncentrationer av undantränger sonder för signal visualisering av alla mål. Men medför den här ändringen förseningar i tid-till-signal generation. Ett möjligt sätt att lösa detta kan vara användningen av två LED källor att bättre tillgodose de andra fluorophores (HEX och TAMRA). På så sätt kunde lägre sonden koncentration användas för att generera en signal med kortare inkubationstider.

En annan begränsning som behöver övervägas är att döma fluorescens färg av ögat i ett svagt upplyst miljö. Det är lättare om ett enda mål i en singleplex eller multiplex format, eftersom primers utformades inte för att interagera med varandra. Analysen skulle bli svårare att tolka om flera mål fanns i ett enda test tube, såsom en pool av myggor eller en patient med mer än en virusinfektion. Detta skulle kräva en ändring av avläsning arkitektur, såsom digital display snarare än att döma av ögat.

En möjlig framtida strategi skulle vara att öka nivån på multiplexing genom att skapa en större panel av myggor arboviruses. Detta kräver noggrann primer design för att undvika primer-primer interaktioner, och kan kräva användning av modifierad nukleinsyra analoger såsom själv undvika molekylär igenkänning system (SAMRS) och artificiellt expanderade genetisk informationssystem (AEGIS) till bättre plats för hög multiplexing38. Därför skulle lösningen för signal avläsning i ett högre multiplex system vara att använda en enda fluorophore för varje tränger sond, och att tilldela en unik fördrivna sekvens för varje mål och fånga de fördrivna sonderna på en fast yta av DNA hybridisering. Detta skulle skapa en array-formaterade plattform med en enda fluorophore och LED att excitera, men att döma förekomsten av varje mål skulle baseras på dess position i matris39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Flera av författarna och deras institutioner egna immateriella som förknippas med denna analys.

Acknowledgments

Arbetet stöds delvis av FDOH-7ZK15 och NIAID 1R21AI128188-01. Forskning som redovisas i denna publikation var stöds delvis av nationella institut för allergi och infektionssjukdomar, och delvis av biomedicinsk forskning Program av Florida Department of Health. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis de officiella utsikt över NIH eller Florida Department of Health. Dynamiska kombinatorisk kemi LLC är erkänt för deras stöd och bidrag till detta projekt.

Denguefeber 1 virus (stam BOL-KW010) var vänligt tillhandahålls av Florida Institutionen för hälsa presidiet av laboratorier. Zikaviruset och den asiatiska stammen av Chikungunyaviruset tillhandahölls nådigt av Centers for Disease Control och Prevention. Den indiska Ocean stammen av Chikungunyaviruset var vänligen tillhandahållen av Robert Tesh (World Reference Center för framväxande virus och Arboviruses, genom den University of Texas Medical Branch i Galveston, Texas) till den UF-FMEL. Vi tackar S. Bellamy, B. Eastmond, S. Ortiz, D. Velez, K. Wiggins, R. ZimLer och K. Zirbel för hjälp med infektion studierna. Vi tackar också M. S. Kim för att tillhandahålla Q-papper.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS Major Science MBE-150 Gel electrophoresis
G:BOX F3 Syngene G:BOX F3 Gel imaging
LightCycler 480 Instrument II, 96-well Roche Applied Science 05 015 278 001 Real-time PCR
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane Millipore Sigma UFC501096 ultrafiltraton membrane for dialysis
Eppendorf 5417C Centrifuge Marshall Scientific EP-5417C centrifuge
Myblock Mini Drybath Benchmark Scientific BSH200 drybath
FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System Labconco 7934020 lyophilizer
all priers and probes IDT custom RT-LAMP primers and probes
dNTP set Bioline BIO-39049
Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) Promega U1191
Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase New England Biolabs M0538L enzyme
WarmStart RTx Reverse Transcriptase New England Biolabs M0380L enzyme
RNase Inhibitor, Murine New England Biolabs M0314L enzyme
Antarctic Thermolabile UDG New England Biolabs M0372L enzyme
50bp DNA Step Ladder Promega G4521 marker
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Roche Applied Science 4729692001 real-time RT-LAMP analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
  2. Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636 (2014).
  3. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
  4. Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clin Microbiol Rev. 29, (2016).
  5. Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
  6. Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
  7. Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
  8. Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
  9. Shukla, S., Hong, S. -Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685 (2016).
  10. Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295 (2016).
  11. Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
  12. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. Journal of Clinical Virology. 68, 53-55 (2015).
  13. Gourinat, A. C., O'Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M. Detection of zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 21, (2015).
  14. Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28, (2000).
  15. Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
  16. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
  17. Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
  18. Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
  19. Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
  20. Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
  21. Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
  22. Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
  23. Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
  24. Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
  25. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
  26. Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
  27. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
  29. Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
  30. Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
  31. Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
  32. Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605 (2016).
  33. Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
  34. Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
  35. Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
  36. Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22 (2010).
  37. Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226 (2015).
  38. Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
  39. Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , 62,381,759 (2016).

Tags

Biokemi fråga 133 Point-of-care diagnostics multiplexed isotermiska förstärkning loop-medierad isotermiska förstärkning Zika upptäckt avläsning av fluorescens inga RNA-extraktion mygga övervakning virus upptäckten
Multiplexade isotermiska förstärkning baserat diagnostiska plattform för att upptäcka Zika, Chikungunya och Dengue 1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yaren, O., Alto, B. W., Bradley, K.… More

Yaren, O., Alto, B. W., Bradley, K. M., Moussatche, P., Glushakova, L., Benner, S. A. Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1. J. Vis. Exp. (133), e57051, doi:10.3791/57051 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter