Summary
Geçerli Zika, chikungunya ve dang virüs karmaşık numune hazırlama ve pahalı araçları gerektirir ve düşük kaynak ortamlarda kullanmak zor tespit etmek için teşhis multiplexed. Algılamak ve yüksek duyarlılık ve özgüllük ile bu virüs ayırt etmek için hedef özgü strand displaceable probları ile izotermal amplifikasyon kullanan bir tanı gösteriyoruz.
Abstract
Zika, Dang ve chikungunya virüs hastalıklar ile benzer hasta belirtilere neden sivrisinekler tarafından iletilir. Ancak, onlar farklı akış aşağı hastaya iletim potansiyelleri var ve çok farklı hasta tedavi gerektirir. Böylece, son Zika salgınlar acil hızla bu virüsler hastalarda ayırımcılık araçları geliştirmek için yapmak ve doğru hasta tedavi seçin ve anlamak ve onların gerçek zamanlı Epidemiyoloji yönetmek için Sivrisinek, tuzağa.
Ne yazık ki, bu alıcı 2016 acil durum da dahil olmak üzere geçerli tanı sınamaları yetkilerini kullanmak ve hızlandırılmış durumu, viral RNA ters transkripsiyon Polimeraz zincir araçları gerektiren tepkimesi (RT-PCR), tarafından eğitilmiş kullanıcılar, algılamak ve önemli numune hazırlama. Böylece, onlar süresi gerektiren "onaylanmış" referans laboratuvarlar için gönderilmesi gerekir. Gerçekten de, Ağustos 2016 yılında Merkezi hastalık kontrolü (CDC) için hamile kadınlar kim olduğunu soruyordu bir sivrisinek tarafından ısırılmış ve onlar enfekte olup olmadığını öğrenme önce kabul edilemez bir 2-4 hafta beklemeni Zika gösteren kurdeşen. Sitede, az kaynak ile eğitimli ama mutlaka lisanslı personel tarafından yapılabilir testler çok ihtiyacımız var.
Bu video tüm fazla numune hazırlama idrar veya serum (için hastalar) veya ezilmiş sivrisinek leşleri (için çevre gözetim), çalışma bu belirlemelerini karşılar bir tahlil göstermektedir. Sivrisinek leşleri biyolojik yönetmek için kuaterner amonyum grubu (Q-kağıt) tarafından amonyak tedavi takip taşıyan kağıda yakalanır. Bunlar daha sonra doğrudan, RNA izolasyon, soğutma yok zinciri gerek dondurularak reaktifler içeren tahlil tüpler içine konur. Değiştirilmiş bir form ile ters transkripsiyon döngü-aracılı izotermal amplifikasyon hedef özgü fluorescently etiketli displaceable probları ile okuma, 30 dk, üç renkli floresan sinyali olarak üretir. Bu bir turuncu filtre ile bir el, pilli cihaz ile görüntülenir. İleri kirlenme kapalı tüpler ve thermolabile urasil DNA glycosylase (UDG) huzurunda dUTP amplifikasyon karışımı kullanımı engellenir.
Introduction
Sivrisinek yoluyla bulaşan virüs enfeksiyonları, Dang, chikungunya ve Zika virüsler de dahil olmak üzere yükselişi ve isteğe bağlı Acil Yönetim Stratejileri vardır. Dang ve chikungunya virüs zaten endemik birçok tropikal bölgelerin nerede Zika şimdi Batı Yarımküre1yayılıyor. Zika virüs, Dang gibi Flaviviridae ailesinin üyesi olan ve bir Asya ve iki Afrika genetik soy2ile Afrika'e. Zika virüs tanımlaması geri 1947 için Tarih rağmen Pasifik ve Amerika'nın ortaya çıkan önce yarım yüzyıl için Zika enfeksiyon insanlarda, tek tük kaldı. 2007'de, Mikronezya Federal Devletleri Yap Adası üzerinde ateş oluştu Zika ilk bildirilen patlak 2013 ve 2014 Fransız Polinezyası tarafından takip ettim. Amerika'nın ilk büyük patlak 2015 yılında Brezilya'da oluştu.
Zika, chikungunya ve dang virüs öncelikle Aedes aegypti ve Aedes albopictustarafından iletilir. Ancak, Zika ek aşağı akım insandan insana iletim olanakları, büyük olasılıkla anne fetus etkileşim, cinsel temas yoluyla ve3,4,5emzirme yoluyla yaymak vardır. Zika ateş ilk sadece hafif hastalığa neden inanılıyordu. Ancak, daha sonra Yetişkin Guillain-Barré Sendromu, microcephaly Yenidoğan Bebeklerin ve yıl için geçen ay olabilir Kronik kas-iskelet hastalıkları ile ilişkili. Zika Enfeksiyon belirtileri bu diğer sivrisinek-yayılan virüs6benzer beri Zika hastalık tanısında, zor olabilir. Bu virüslerin ortak işbirliği enfeksiyonlar ayırıcı tanı daha da zorlu7,8olun. Bu nedenle, hızlı ve güvenilir Zika ve diğer virüs nükleik asitlerden tespiti Epidemiyoloji gerçek zamanlı olarak kontrol ve önleyici tedbirler başlatmak ve hasta bakımı9yönetmek için anlamak için gereklidir.
Bu virüsler için geçerli tanı sınamaları serolojik testler, virüs yalıtım, virüs sıralama ve ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) içerir. Standart serolojik yaklaşımlar genellikle yetersiz hassasiyeti muzdarip ve sonuçları olan daha önce diğer flaviviruses tarafından enfekte hastalarda tarafından karmaşık.
Bu nedenle, nükleik asit test algılamak ve bu virüsler ayırt etmek için en güvenilir yol kalır. Zika ve diğer sivrisinek yoluyla bulaşan virüs algılama genellikle RT-PCR ya da gerçek zamanlı RT-PCR biyolojik sıvıları, serum, idrar, tükürük, meni, anne sütü ve serebral sıvı10,11gibi çeşitli kullanılarak gerçekleştirilir. Onlar sergi beri daha az PCR-inhibisyon, daha yüksek viral yük, virüs varlığı daha uzun süreler ve artan koleksiyonu ve12,13Taşıma kolaylığı için idrar ve tükürük örnekleri üzerinde kan, genellikle tercih edilir. RT-PCR tabanlı tanı testleri ancak, kapsamlı örnek hazırlık adımları ve daha az bakım noktası için en iyi yapmak pahalı termal Bisiklete binme ekipman oluştururlar.
Ters transkripsiyon izotermal amplifikasyon (RT-lamba) döngü-aracılı yüksek duyarlılık ve özgüllük14nedeniyle güçlü bir RT-PCR alternatif olarak ortaya çıkmıştır, onun dayanıklılık için inhibitör maddelerin biyolojik örnekleri15, ve önemli ölçüde düşürür karmaşıklığı ve ilgili maliyetler, düşük kaynak ortamları için uygun hale tahlil tek sıcaklık işlem. Klasik uygulandığı gibi RT-lamba, sekiz farklı bölgelere hedef RNA içinde bind altı astar oluşmaktadır. 60 ve 70 ° C arasında sabit sıcaklıklarda çalışır ve bir ters transkriptaz ve DNA polimeraz güçlü strand etkinlik yerinden kullanır.
RT-lamba ilk aşamalarında, ileriye ve geriye doğru iç astar (FIP ve BIP, şekil 1A) dış ileriye ve geriye doğru astar (F3 ve B3) ile birlikte bir dumbbell yapısı, üstel lamba amplifikasyon tohum yapısını oluştururlar. Amplifikasyon daha da halter tek telli bölgelerinde bağlamak için tasarlanmış olan döngü ileriye ve geriye doğru astar tarafından (Eğer ve LB), hızlandırılmış ve birden fazla tekrarlayan olan concatemers oluşumu sonuçlarında döngüler16. Klasik lamba dayalı bulanıklık deneyleri veya17,18,19Zika çoğullama bazı düzeyde nerede, bakım nokta tespiti istenen okuma boyalar enterkalasyon DNA tarafından tamamen uygun değildir. Yanlış-mutlak hedef kapalı Arttırımlar nedeniyle oluşturmak eğilimli oldukları gibi çoğullama kolayca bu sistemlerinde alınır değil.
Bu sorunları yönetmek için edebiyat klasik RT-lamba mimari20,21,22' ye bir "strand yerini değiştirerek sonda" şeklinde başka bir bileşen ekler. Her sonda fingerprinting iki iplikçikli bölge ve bir tek iplikçikli astar bölgesi vardır. Sonda ile tek iplikçikli bölge bir 5'-fluorophore ile etiketlenir ve tamamlayıcı sonda 3' uç içki ile değiştirilir. Bir hedef olmaması durumunda, fluorophore ve içki yakın getiren hibridizasyon tamamlayıcı sonda iplikçiklerinin nedeniyle hiçbir Floresans görülmektedir. Bir hedef huzurunda floresan sonda tek iplikçikli bölümünü hedef, tamamlayıcı bağlar ve sonra polimeraz yerinden bir iplikçik tarafından genişletilmiş. Daha fazla polimeraz uzantısı ters astar tarafından içki Strand Floresan ()şekil 1B)emisyon izin onun fluorescently etiketli iplikçik, gelen ayrılma nedenleri. Bu tasarım ile sinyal yanlış sinyalleri şansını azaltır dumbbell oluşumu sonra oluşturulur.
Strand yerini değiştirerek sonda çift iplikçikli bölümü herhangi bir sıra olabilir ve çoğullama uygulandığında, aynı sıra farklı fluorophore-içki çiftleri ile kullanılabilir. Bu mimari, virüs bulaşmış idrar, serum veya sivrisinek ile kağıt üzerinde squished örnekleri doğrudan örnek hazırlık yapmadan tahlil tanıtıldı. Üç renkli floresan okuma insan gözüyle 30-45 dk içinde oluşturulan ve sinyalleri bir mavi LED ve turuncu bir filtre kullanan bir 3D baskılı gözlem kutusunun tarafından görüntülenmiştir. RT-lamba reaktifler dağılması soğutma gerek olmadan kaynak ayarları düşürmek için bu kit dağıtımını etkin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Doğrudan bu çalışmada kullanılan hayvanlar sadece sivrisinekler vardı. Kimin kanı bulaşmış sivrisinekler beslemek için kullanılan, tavuk, yönetme yönergeleri tarafından Florida Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Committee.Virus yayma IACUC iletişim kuralı #201507682 kabul edildi ve Sivrisinek enfeksiyon çalışmalar olduğunu Vero Beach Florida tıbbi Entomoloji laboratuvar BSL-3 tesisinde gerçekleştirilen, FL. RT-lamba deneyler FfAME ve Firebird biyomoleküler Bilimler LLC Alachua, FL tarafından paylaşılan BSL-2 laboratuvar gerçekleştirilmiştir
1. Astar ve Strand tasarım probları yerinden
- Viral dizileri Dang 1 için kadın Enstitüsü veritabanı23ayıklamak; Zika ve chikungunya NIAID virüs patojen veritabanı ve analiz kaynak24dizileri.
- Birden fazla sıra hizalamaları (MSAs) serileri için ilgi yazılım kas v3.8.3125kullanarak oluşturun. LAMBA astar kümeleri hedef korunmuş bir bölgesi içinde aramak için oluşturulan MSAs kullanın ve alt türlerinden bir hedef arasındaki farklar gibi non-ilgili veya istenmeyen hedefi kaçının.
- Açıklanan online (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/) lamba astar tasarım kuralları izleyin ve karışık üsleri astar içinde virüs ıraksak evrim süreçleri sonucu26kapsayacak şekilde kullanılsın. Astar kümeleri olan önlemek için NCBI RNA virüs veritabanı NCBI patlama27kullanarak oluşturulan lamba astar karşılaştırın. Çoğaltılmış bir tahlil NCBI patlama de kullanarak dimerize astar ortadan kaldırmak için her küme karşılaştırın.
- Ekran herhangi bir viral genom dizisi ve Sivrisinek genomik sıra karşı strand yerini değiştirerek soruşturması çift iplikçikli bölümünü. 5'-uçları floresein amidite (FAM), HEX boya ve Zika, chikungunya ve dang 1, 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) boya ile hedef bağlama probe sırasıyla değiştirin.
- İdrar numuneleri için ayarla pozitif kontrol astar bulunmaktadır. İnsan mitokondriyal DNA'yı hedeflemesini lamba astar tasarım. Etiket sonda ucunda 5'-TET ile strand yerini değiştirerek. Fluorescently her için kısmen tamamlayıcı etiket içki probları 3' uç (Tablo 1) (örneğin, Iowa siyah-FQ) içki ile probe etiketli.
2. virüs izole ve Sivrisinek örnekleri enfekte
- Kullanım Zika virüs (Porto Riko zorlanma), Chikungunya virüsü (La Réunion veya İngiliz Virgin Adaları zorlanma) ve dang serotip 1 virüs (Key West zorlanma) yalıtır. Viral titreleri plak tahlil28 veya kantitatif RT-PCR29kullanarak belirleyin. Piyasada bulunan RNA ayıklama Kitleri kullanarak viral RNA'ların ayıklayın.
Not: Bu çalışmada kullanılan her virüs izole viral titreleri Tablo 2 temsil eder. - Yaren ve ark. Ae. aegypti kadın Zika ve chikungunya virüsler20ile enfeksiyon hakkında detaylı bir iletişim kuralı tarafından yayınlanan makale izleyin. Zika virüs bulaşmış sivrisinek örnek viral titresi için Tablo 2 ' ye bakın.
3. RT-lamba Thermolabile urasil DNA Glycosylase ile birleştiğinde
-
10 x astar mix hazırlık.
- 100 µM hisse senedi çözüm her astar hazırlama ve (bkz. Adım 1) prob nükleaz boş su ekleyerek. Girdap iyi ve mağaza-20 ° c kadar kullan.
- FIP, 16 µL BIP, her Zika, Dang 1 veya mitokondrial DNA hedef, mix 16 µL için 10 X astar karışımı için F3, B3, eğer, lb, LB-floresan 3 µL 2 µL 5 µL 2 µL 2 µL sonda, içki inceleyebilirsek 4 µL etiketli ve toplam 100 µL hacim vermek için su nükleaz ücretsiz 50 µL.
- Chikungunya için 10 X astar karışımı karışımı için FIP, 16 µL BIP, F3, B3, lb, eğer, 2 µL 5 µL 2 µL 2 µL 16 µL Eğer floresan 3 µL sonda, içki inceleyebilirsek 4 µL ve toplam 100 µL hacim vermek için su nükleaz ücretsiz 50 µL etiketli.
Not: son floresan sonda ve 400 kullanır 300 nM açıklanan soruşturma konsantrasyonu içki sonda nM. Alternatif olarak, kullanım 80 nM fluorescently etiketli sonda ve 200 nM onun içki inceleyebilirsek gerçek zamanlı analiz için.
- 5 µL 10 X astar karışımı ekleyin (3-plex için her 10 astar mix X 5 µL Ekle), 10 X izotermal amplifikasyon arabellek 5 µL (1 X arabellek kompozisyon: 20 mM Tris-HCl tampon pH 8.8, 50 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 8 mM MgSO4 % 0,1 ara-20, 1 mM DTT), 7 µL dNTP karışımı (10 mM, dATP, dCTP ve dGTP; dTTP ve dUTP 5 mM), 16 adet 15 adet ters transkriptaz, rekombinant ribonükleaz inhibitör 80 adet, 2 adet thermolabile UDG, 1-2 µL VI değişen miktarlarda DNA polimeraz, RAL RNA'ların ve Toplam hacim en fazla 50 µL bir 0.25 mL PCR getirmek için su ( Tablo malzemelerigörmek) tüp.
- Bu aşamada negatif kontrol deneyleri viral RNA birim su ile değiştirerek içerir. Örnekleri için 1 h 45 dk 65-68 ° C arasında kuluçkaya sonra her örneğinin 5 µL % 2.5 özel jel etidyum bromür (0.4 µg/mL) içeren 1 X TBE tampon çalıştırarak analiz. Kullanım 25 bir bp veya jel üzerinde işaretleyici olarak 50 bp DNA merdiven.
Not: Sigara hedef belirli bir şablon isteğe bağlı eklenmesidir. - Patojenik RNA olup olmadığını belirlemek için her astar kümesi ve kendi no-şablonu kontrolü her RT-lamba astar kümesi değişen sıcaklıklarda (68 ° C 65 ° C) ya da magnezyum çalışma için tasarlanmış bu yana sıcaklık ve/veya magnezyum konsantrasyon, değişen tarafından test konsantrasyonları (6-10 mM son). Oda sıcaklığında deneyler hazırlayın.
4. RT-lamba Viral RNA çivili idrar kullanarak
- RT-lamba astar toplam reaksiyon birim 50 µL içinde idrar (% 0, % 10, % 20 ve % 50), final konsantrasyonlarının değişen sınayın. % 10 son idrar konsantrasyon için viral RNA'ın 1 µL idrar 5 µL için ekleyin. % 20 son idrar konsantrasyon için viral RNA'ın 1 µL idrar 10 µL için ekleyin. % 50 son idrar konsantrasyon için viral RNA'ın 1 µL idrar 25 µL için ekleyin.
- Gerçek zamanlı ve RT-lamba idrar yüzde 10'u izlemek için bir gerçek zamanlı PCR aleti kullanın (bkz. Tablo reçetesi) farklı fluorophore filtreleri ile.
- Floresan sinyallerini FAM etiketli amplicons Zika için okumak için 483--dan 533 için değişen bir filtre kullanın nm; HEX etiketli chikungunya için amplicons için 523--dan 568 için değişen bir filtre kullanın nm; TAMRA etiketli Dang 1 için amplicons için 558 610 için değişen bir filtre kullanın nm; ve TET etiketli mitokondrial DNA'ın amplicons için 523--dan 568 için değişen bir filtre kullanın nm.
Not: FAM 495 uyarma ve emisyon maxima vardır nm ve 520 nm, anılan sıraya göre. HEX 538 uyarma ve emisyon maxima vardır nm ve 555 nm, anılan sıraya göre. TAMRA 559 uyarma ve emisyon maxima vardır nm ve 583 nm, anılan sıraya göre. TET 522 uyarma ve emisyon maxima vardır nm ve 539 nm, anılan sıraya göre.
- Floresan sinyallerini FAM etiketli amplicons Zika için okumak için 483--dan 533 için değişen bir filtre kullanın nm; HEX etiketli chikungunya için amplicons için 523--dan 568 için değişen bir filtre kullanın nm; TAMRA etiketli Dang 1 için amplicons için 558 610 için değişen bir filtre kullanın nm; ve TET etiketli mitokondrial DNA'ın amplicons için 523--dan 568 için değişen bir filtre kullanın nm.
- Kullanım 96-şey plakaları ve mühür plaka şeffaf plastik bir levha ile o zaman 60-90 dk 65-68 ° C'de örnekleri kuluçkaya ve floresan her 30 kayıt s ışık cycler kullanarak. Başlangıçta 80 nM fluorescently etiketli probları ve sonra test 300 nM fluorescently etiketli probları kullanın.
- Sınırı algılama seri olarak ekleyerek her hedef için son idrar konsantrasyon % 10 viral RNA'ların seyreltilmiş belirlemek.
Not: gerçek zamanlı RT-lamba optimum sıcaklık, magnezyum konsantrasyon, fluorescently etiketli sonda konsantrasyon ve reaksiyon süresi belirlemek için kullanın.
- Sınırı algılama seri olarak ekleyerek her hedef için son idrar konsantrasyon % 10 viral RNA'ların seyreltilmiş belirlemek.
- Strand displaceable sondalar tarafından göz tarafından oluşturulan Floresans görselleştirmek için bir mavi LED ışık kaynağından bir ışık cycler uyarma, 470 ile kullanmak nm (herhangi bir Jel Elektroforez kutusu yerleşik mavi ışık kaynağı ile çalışmak, malzemelerin tabloya bakınız) ve görüntü kaydetmek karanlık oda sıcaklığında bir cep telefonu kamera ile.
Not: Kullanım 300 nM fluorescently etiketli probları, görselleştirme tüm üç renk mavi LED kullanarak göz tarafından gerektiğinde.
5. Q-kağıt teknolojisi kullanılarak Zika enfekte sivrisinek algılamayı RT-lamba
- Kuaterner amonyum-modified filtre kağıdı (Q-kağıt), hafif değişiklikler30ile daha önce yayımlanmış yöntemlerine göre hazırlayın.
- Selüloz filtre kağıdı çevrelerin ( Tablo malzemelerigörmek) 1 g 50 ml sulu NaOH çözüm 15dk için harekete geçirmek için %1,8 3,5 cm çaplarda bırakın.
- Tarafından vakum filtrasyon aktif kağıt daire toplamak ve sonra onları 40 mL sulu çözüm (2, 3-epoxypropyl) trimethylammonium klorür (0,28 g) bırakın gecede oda sıcaklığında.
Not: filtre kağıdı 0,28-1 (2, 3-epoxypropyl) trimethylammonium klorür kütle oranı tutmak. - Vakum filtrasyon tarafından elde edilen Katyonik kağıt toplamak ve 50 mL Asetik asit % 1'i ile etkisiz hale getirin.
- Kağıt üç kez etanol ile yıkayın ve bir başlık sabit hava akımı ile altında kuruması.
- Bir kağıt yumruk veya makas kullanılarak Q-kağıt sayfalarının küçük dikdörtgen (3 x 4 mm) içine kesti. Ae. aegypti dişi sivrisinekler potansiyel Zika ile her kağıt üzerinde mikro bir havaneli ile enfekte ezmek.
- Kağıt her 20 µL 1 M sulu amonyak çözüm (pH ≈ 12) için ekleyin ve 5 min için bekleyin. Sonra her kağıt 20 µL %50 alkol ile bir kez ve bir kez 20 µL nükleaz ücretsiz su ile yıkayın. BSL-2 Biyogüvenlik 1 h için kabine gazetede kuruması.
Not: Bu noktada, örnekleri-20 ° C'de gecede kullanımı kadar saklanır. - Cımbız kullanarak, RT-lamba tepki karışımı 100 µL içinde her kağıdı yerleştirin ve 65-68 ° C'de 45 dk. emin tam çözüm gazetede daldırın yapmak için kuluçkaya; Bu yüzen değil. Okumak ve mavi LED ışık kaynağı kullanarak Zika virüs ve turuncu ya da sarı filtre kaynaklanan Floresans kaydedin.
6. lyophilization tepki biriminin 100 µL RT-lamba Kimyasalları
- 10 X lamba astar karışımı Bölüm 3.1 göre ve dUTP göre Bölüm 3.2 içeren dNTP karışımı hazırlayın. Astar karışımı ve dNTPs-20 ° C'de kullanmak kadar saklamak.
- 10 mL gliserol, 1 M Tris-HCl pH 7.5, 1 m KCl, 0,5 M EDTA, 100 µL % 10 2 µL 500 µL 100 µL karıştırılarak kaldırmak için enzim diyaliz tamponunun hazırlamak Triton X-100, 100 µL 0.1 m DTT ve 9.198 mL su nükleaz ücretsiz. Diyaliz arabellek 4 ° C'de depolayın
Not: (0,2 mikron filtre) tüm arabellek reaktif çözümler kullanın ve 4 ° C'de depolamak için önceden filtre uygulamak emin olun- Ultrafiltrasyon membran ile 10 kDa kesme sınırı kullanın (bkz. Tablo malzeme). Ultrafiltrasyon membran ve 4 ° C'de 5 min için 14.000 x g, santrifüj diyaliz arabelleği 350 µL, DNA polimeraz 32 birimlerinin 4 µL, 2 µL transkriptaz 30 birimlerinin ve 80 RNase inhibitörü birimlerinin 2 µL yerleştirin
- Ultrafiltrasyon membran ve santrifüj (14.000 x g) başka bir 5 dakika boş toplama tüp süreyle başka bir 350 µL diyaliz arabelleği ekleyin ve bu adımı yineleyin, sonra (14.000 x g) santrifüj kapasitesi 3 dakikadır.
- Elüsyon, membran ters çevir ve yeni bir koleksiyon tüpü yerleştirin. 1000 x g 2 dk. ölçü elüsyon cilt için de spin; Eğer az 8 µL, diyaliz arabelleği ekleyerek 8 µL kadar ses getirmek. Elüsyon 4 ° C'de depolayın ve hemen sonraki adıma geçin.
Not: Bu iletişim kuralı tek tüp lyophilization için ama aynı Ultrafiltrasyon membran kullanarak bir defada en az 10 tepki tüpler hazırlamak ve diyaliz arabellek aynı miktarda kullanın.
- Eğer 10 X lamba astar 10 µL karıştırmak singleplex (3-plex için her 10 astar mix X 10 µL Ekle), 14 µL dNTP karışımı, diyaliz enzim karışımı 8 µL, 2 adet thermolabile UDG 2 µL ve su (3-plex için ücretsiz 66 µL nükleaz, 46 µL kullanın) 0.5 mL microcentrifuge tüp ve kapağı açık bırakın. Bunun yerine, başka bir kapak buhar Kaçmak izin vermek için bir iğne ile delinmiş ekleyin.
- Hemen tüpler için 2 h-80 ° C'de dondurmak ve 4 h kapak için tüp lyophilization odası ışık korunmak için alüminyum folyo ile lyophilize. Ne zaman reaktifler kurutulur, delinmiş kapakları çıkarın, orijinal kapağını kapatın ve karanlıkta liyofilize reaktifler 4 ° C'de tüplerini saklayın.
Not: Reaktifler gecede, gerekirse liyofilize.
7. test RT-lamba reaktifler idrar ve Sivrisinek örnekleri Zika içeren liyofilize
- Takımı'ndan aşağıdaki öğeleri kullanın (bkz. Tablo reçetesi) Zika için: tepki tüpler ZV Zika tespiti için etiketli bir 3D baskılı gözlem kutusuyla turuncu filtre (uzun geçiş filtresi, kesme-on ~ 540 nm), 2 adet AAA pil kutusu, gözlemlemek için liyofilize ve 1.1 X rehidrasyon arabellek 1,5 mL vida top tüpleri.
- 1.1 rehidrasyon arabellek X 50 mL 10 DNA polimeraz ile birlikte gelir izotermal amplifikasyon arabellek X 5.5 mL karıştırarak hazırlayın (bkz. Tablo reçetesi) 3,3 mL 100 mm MgSO4, 110 µL 0.5 m DTT ve 41.09 mL su nükleaz ücretsiz. Bu çözümün 1,5 mL vida üst borular için aliquot 1 mL karıştırın ve 4 ° C'de kullanmak kadar saklamak.
- 1.1 X rehidrasyon arabelleği 90 µL her tepki tüp (0.5 mL) ekleyin. Sıvı lyophilized reaktifleri (erime sallayarak, o zaman kısa bir süre karıştırma onlarla (1000 x g) spin) içeren tüp alt doldurduğuna emin olun. İdrar örneği (4.1 için ayrıntıları bakınız) reaksiyonu tüpler için viral RNA ile çivili 10 µL ekleyin.
- Sivrisinekler sınama olumlu sonuçlanırsa, bir dikdörtgen ekleyin Q-kağıt (adımlarda anlatıldığı Bölüm 5.2 ve 5.3 hazırlanırken) sivrisinek leşleri ile birlikte 10 µL tutarak saf su yerine İdrar numuneleri.
Not: Alternatif olarak, tükürük ya da serum örneklerinin idrar yerine 10 µL ekleyin. Örnekleri ayıklanan DNA veya RNA, 2-5 µL örnek rehydrated karışım içine ekleyin ve son örnek hacminin 10 µL nükleaz ücretsiz su ile tamamlamak.
- Sivrisinekler sınama olumlu sonuçlanırsa, bir dikdörtgen ekleyin Q-kağıt (adımlarda anlatıldığı Bölüm 5.2 ve 5.3 hazırlanırken) sivrisinek leşleri ile birlikte 10 µL tutarak saf su yerine İdrar numuneleri.
- Reaksiyon tüpler kapağını kapatın. Bunları bir ısı blok/banyo (veya KULUÇKA) 65-68 ° C'de önceden belirlenen yer 30-45 dk ama en fazla 1 saat kuluçkaya. Kuluçka sonra tüp ısı kaldırmak. Gelecekteki deneyleri kirlenmesini önlemek için bu tüpler kapalı kalmasını sağlamak.
- Reaksiyon tüpler gözlem kutuya koyun; Sıcaklık ortam sıcaklığı (tercihen 25 ° C) düşecek. Arkadaki gözlem kutusunun anahtarı açın. Örnek turuncu filtreden gözlemlemek ve nerede görüntü görüş alanı % 80'i doldurur bir mesafede düzenlenen bir cep telefonu kamera çekim.
Not: Daha iyi görselleştirme düşük ışık ortamlarda elde edilir. - Görselleştirme tamamlandıktan sonra kapatın açın. Sonraki görsel öğe gerekirse soğutma, tercihen karanlıkta kapalı tüpler saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başlangıçta, her RT-lamba astar (tablo 1) ile onun karşılık gelen viral RNA substrat denetimlerin yanı sıra, negatif performansları Jel Elektroforez tarafından değerlendirildi. RT-lamba astar hedef NS-5 'im bölge (RNA'ya bağımlı RNA polimeraz) Zika ve dang 1 ve nsP2 bölge (yapısal olmayan protein P2) Chikungunya için dizayn edilmiştir. Şablonları toplam RNA viral hisselerinde kültürlü Afrika yeşil maymun böbrek (Vero) hücreleri elde edildi. Bir durumda, toplam nükleik asit (DNA ve RNA) Chikungunya bulaşmış bir erkek ayıklandı Ae. aegypti (Tablo 2).
Şekil 2A RT-lamba temsilcisi bazı sonuçlar bu örnekler ile gerçekleştirilen gösterir. Hem singleplex hem çoğaltılmış (3-plexed) durumlarda, RT-lamba ürünleri üzerinde özel jel ne zaman koşmak concatemers bir merdiven olarak görünür. Negatif kontrol örnekleri için astar kendilerini toplam nükleik asit bir sigara enfekte Ae. aegypti kadın ayıkladığınız non-spesifik hedef denetimi de dahil olmak üzere yalnızca grup örnek verdi gibi su içeren sivrisinek şablon olarak kullanıldı.
Optimal RT-lamba koşullar bulmak için farklı magnezyum konsantrasyonlarının ve kuluçka sıcaklıklar denendi. Daha yüksek magnezyum konsantrasyonlarının ve düşük sıcaklıklar için yanlış pozitif sebebiyet veren non-spesifik amplicons yaratacaktır bulundu. Bu nedenle, magnezyum ve kuluçka 65 ° c 8 mM tüm deneyler o andan itibaren (şekil 2B) kullanılmıştır.
Jel Elektroforez deneyler diğer dizisi kirlenme için önceden oluşturulan amplicons, yanlış pozitif lider tarafından çıkmasına neden tepki tüp açılması gerekir. İleri kirlenmesini önlemek için dTTP böylece dUTP RT-lamba amplicons dahil olmak dTTP ve dUTP, eşit oranları tarafından değiştirildi. Bu amplicon bir substrat urasil-DNA glycosylase (UDG) için içine herhangi bir sonraki RT-lamba reaksiyonlar31,32hazırlanması sırasında bulaşıcı mümkün kapatır. UDG thermolabile bir sürümüyle kullanıldığında dU içeren amplicons oda sıcaklığında RT-AVİZE örnekleri ayarlanan ve UDG sırasında izotermal amplifikasyon inaktive sindirilir olun. Ayrıca, tepki tüp bir aşağı akım analizi için gerektiğinde açılabilir. UDG sindirim kullanılmasına ek olarak, bir mimari displaceable sonda kullanarak tepki tüp açmaya gerek okuyabilirsiniz Floresans oluşturur.
Şekil 3A floresan problar Zika RNA hedefleme kullanarak Zika için algılama (lod olarak) sınırının sonuçlar elde ediliyor. Seri seyreltme çalışmalar bu kadar düşük 1,42 pfu singleplex tahlil veya 3 plexed 30 dk içinde tespit edilemedi deneyleri gösterdi. Örnekleri daha fazla 0,71 pfu seyreltilmiş zaman floresan bir sinyal singleplex tahlil için 40 dk sonra ve 3-plexed karışımlar için 50 dk sonra gözlenmiştir. 35 dk sonra örnekleri mavi sinin bir turuncu filtre aracılığıyla ışık 470 bir uyarma dalga boyu ile LED sonra yanı sıra gerçek zamanlı RT-lamba, floresan görselleştirildiği nm (şekil 3B). Benzer şekilde, algılama sınırları 37.8 kopya ve 1.22 pfu Chikungunya ve dang 1, için sırasıyla ölçüldü (şekil 3 c-D).
Zika viral RNA optimum idrar konsantrasyonu belirlemek için (2.85 pfu) bir otantik insan idrar örneği (% 0, % 10, % 20 ve % 50) değişen konsantrasyonları eklendi. % 50 idrar tahlil kullanıldığında muhtemelen nedeniyle, elektrolitler, RT-lamba sinyal 15 35 dk için ertelendi. % 10 idrar alt arka plan sunulması nedeniyle en iyi olması konusunda kararlıydı. Zika hedefleri yokluğunda hiçbir amplifikasyon herhangi bir konsantrasyonu gözlendi, ama daha yüksek arka plan Floresans örneklerinde yüksek idrar konsantrasyon (şekil 3E) ile gözlenmiştir.
Farklı floresan renkler, 80 okuma ile çoğullama izin vermek için strand displaceable sondalar nM farklı fluorophores (FAM Zika, HEX Chikungunya için ve TAMRA Dang 1 için için) taşır, ama aynı içki (Iowa siyah-FQ) tarafından eşlik bir konsantrasyon 200 nM. Hücre kültür çıkarılan viral RNA'ların (2.85 pfu Zika için 242 viral RNA kopyaları Chikungunya ve dang 1 için 1.22 pfu) hedefleri, % 10 idrarda seyreltilmiş olarak kullanılmıştır. Gerçek zamanlı analiz Floresans veri bir gecikme astar tüm hedefler için mevcut neredeydin 3-plexed deneyleri için sinyal üretimi (yaklaşık 10 dakika) gösterdi. Singleplex durumlarda, öte yandan, reaksiyon (şekil 4A-C) 10-15 dk içinde tamamlandı. Floresan mavi LED ve turuncu filtre kullanarak görüntülenir zaman, sinyal gücü farklılıkları farklı fluorophores için FAM etiketli amplicons en görünür olduğu tespit edildi. Bu, uyarma, 470 beri beklenen nm FAM uyarma spektrum (şekil 4 d) en fazla yakın.
Tüm üç renk bir tek LED uyarma dalga boyu ile görselleştirme etkinleştirmek için (470 nm), 300'e displaceable sondalar konsantrasyonları artan nM ve tamamlayıcı içki sonda 400 nM. Singleplex durumlarda, sinyal üretimi Zika 10 dakikadır, Chikungunya için 20 dk ve dang 1 için 40 dk içinde tamamlandı. 3-plexed deneyleri, ancak, o daha fazla 20 dk içinde tüm deneyleri ()şekil 5Atarafından ertelendi- C). Yine de, kurban sinyal üretimi için zamanında tüm üç renk mavi LED ışık ile turuncu filtre kullanarak görselleştirme etkin. Yeşil Floresans probları 5' FAM, yeşil-sarı Floresans burada sonda 5'-ucu ile HEX etiketli ve turuncu-kırmızı Floresans Dang onun sonda 5' etiketli uç nerede 1 için kullanılır Chikungunya atandığı ışık ile etiketli uç kullanarak Zika için görülmektedir TAMRA ile (şekil 5 d).
Olası Zika enfeksiyonu olan sivrisinek örnekleri test etmek için laboratuvar Ae. aegypti enfekte dişi sivrisinek (Tablo 2) ezilmiş bir dikdörtgeni Q-kağıt, amonyak tedavi virüs sterilize etmek için ve maruz bağlamak için takip üzerinde viral RNA pozitif yüklü Q-kağıt üzerine. Kağıdın kısa bir süre pterin bileşikler Floresans okuma33,34ile etkileşebilir sivrisinek leşleri mevcut kaldırmak için etanol ile yıkandı. Q-kağıtları içeren sivrisinek sonra doğrudan RT-lamba karışımı ve kuluçka 65 ° c için 30 dk sonra batık, parlak yeşil Floresans Zika virüs (şekil 6) huzurunda gözlendi.
Soğutma ve tahlil kullanmak için RT-lamba reaktifler liyofilize ve rehydration arabellek tarafından eşlik ve 470 nm yayan kullandığı bir gözlem 3D baskılı kutu LİDERLİĞİNDEKİ kolaylaştırmak için bir zinciri ve bir turuncu filtre (rakam olmadan algılama kiti sunmak için 7A). 9 kullanarak birimleri rehidrasyon arabelleği ve idrar örneği 1 hacmi, görünür yeşil Floresans 30 dk içinde oluşturulan ve görüntü herhangi bir cep telefonu kamera (şekil 7B) tarafından yakalanabilir. Alternatif olarak, Q-kağıt üzerinde Sivrisinek örnekleri tarafından aynı tahlil su idrar örneği yerine 1 hacim ekleyerek kullanılabilir.
Şekil 1: lamba tahlil tasarımı (A)RT-lamba astar ve bir iplikçik DNA polimeraz yerinden tarafından bir dumbbell yapısı oluşumu. (B) giriş strand yerini değiştirerek probları çoğullama ve floresan okuma izin vermek için ve gerçek zamanlı olarak RT-lamba ilerlemesini izlemek için. Yaren ve ark. 201720izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Jel Elektroforez analizi amplicons. (A)test lamba astar singleplex veya multiplex (3-plex) uygun pozitif ve negatif kontrolleri ile biçimlendirmek. Pozitif denetimler aşağıdaki titreleri ile arıtılmış viral RNA içerir: 2,85 pfu Zika (ZV), 242 genomik kopya için Chikungunya (CH) ve 1.22 pfu Dang 1 (D1) için. NTC-z, NTC-c ve NTC-d şablon kontrol singleplex biçiminde Zika, Chikungunya ve dang 1 astar için sırasıyla taşımaktadır. NSC non-spesifik hedef denetim için toplam xNA (DNA ve RNA) enfeksiyon-Alerjik Ae. aegyptiayıkladığınız duruyor. M için işaretleyici (50 baz çifti DNA merdiven) duruyor. Bir aralığı RT-LAMP kuluçka sıcaklıklardan (70 ° c 55 ° C) test ederek testin (B) en iyi duruma getirme koşulları ve MgSO (den 10 mm 4 mM)4 konsantrasyonlarda biçimine yokluğu multiplex hedef RNA. Yaren ve ark. 201720izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: RT-lamba gerçek zamanlı olarak. (A)Singleplex ve algılama (lod olarak) için Zika (ZV) gerçek zamanlı kullanarak 80 nM FAM etiketli strand-yerinden sonda kullanarak çoğaltılmış limit gerçek zamanlı PCR enstrüman (kanal 483-533 nm). Örnekleri için yaklaşık 50dk (B) floresan olsa örnekleri 470, uyarma ve ardından bir turuncu filtre gözlendi 65 ° C'de inkübe nm mavi ışık ile. Örnekleri a görselleştirme için kullanılmıştır. LOD için (C) gerçek zamanlı analizine Chikungunya (CH) hedef 80 ile HEX taşıyan lamba nM probları Floresans kanal 523-568 nm bir gerçek zamanlı PCR araç üzerinde kullanarak singleplex biçiminde. (D) gerçek zamanlı analiz için LOD 80 ile Dang 1 (D1) hedeflerde nM TAMRA taşıyan lamba probları Floresans kanal 558-610 nm bir gerçek zamanlı PCR araç üzerinde kullanarak singleplex biçiminde. (E) maksimum idrar içerik RT-lamba tepki olarak belirlenmesi. Son idrar konsantrasyonu (%0-%50) bir dizi test edildi 80 nM FAM etiketli sonda Zika vRNA.NTC 2.85 pfu huzurunda kullanarak tüm panelleri üzerinde hiçbir şablon hakim =. Yaren ve ark. 201720izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Singleplex ve multiplex virüs tespiti için 80 nM sonda kullanarak idrar. (A)Zika algılama için % 10 idrar Zika (ZV) viral RNA'ın 2,85 pfu FAM etiketli sonda ile kullanarak singleplex ve multiplex formatında (80 nM). (B) Chikungunya algılama için % 10 idrar 242 Chikungunya (CH) viral RNA kopyaları ile HEX etiketli probe kullanarak singleplex ve multiplex formatında (80 nM). (C) Dang 1 algılama için % 10 idrar Dang 1 (D1) viral RNA'ın 1.22 pfu TAMRA etiketli sonda ile kullanarak singleplex ve multiplex formatında (80 nM). (D) uyarma 470, sonra turuncu filtresi ile görselleştirme RT-LAMP reaksiyonlar nm mavi LED ışık ile. Yaren ve ark. 201720izni ile yayımlanmaktadır. NTC tüm panelleri üzerinde hiçbir şablon hakim =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Singleplex ve multiplex virüs tespiti için 300 nM sonda kullanarak idrar. (A)Zika algılama için % 10 idrar Zika (ZV) viral RNA'ın 2,85 pfu FAM etiketli sonda ile kullanarak singleplex ve multiplex formatında (300 nM). (B) Chikungunya algılama için % 10 idrar 242 Chikungunya (CH) viral RNA kopyaları ile HEX etiketli probe kullanarak singleplex ve multiplex formatında (300 nM). (C) Dang 1 algılama için % 10 idrar Dengue1 1.22 pfu kullanarak singleplex ve multiplex formatında (D1) viral RNA TAMRA etiketli sonda ile (300 nM). (D) uyarma 470, sonra turuncu filtresi ile görselleştirme RT-LAMP reaksiyonlar nm mavi LED ışık ile. İdrar deneylerde pozitif kontrol insan mitokondriyal DNA'sı (mtDNA) hedefleme ayarla bir lamba astar TET etiketli sonda ile kullanıldı (300 nM). NTC tüm panelleri üzerinde hiçbir şablon hakim =. Yaren ve ark. 201720izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: İş akışı sağlıklı ve Zika enfekte Ae. aegypti ile (ZV 9, tablo 2) Q-kağıt teknolojisi kullanarak enfekte sivrisinek örnekleri Zika algılanması için. Yaren ve ark. 201720izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: gözlemleyerek kutusu. (GözlemleyerekA) kutusunu kullanan iki adet AAA pil Base. Bu piller dört delik yerleştirilmiş 0,5 mL tüpler düzenlenen örnekleri aydınlatmak 4 mavi LED Lamba güç. LED ışıkları bir anahtarı ile yanar. Örnekleri ile turuncu filtre görüntülenir. (B) floresan gözlem kutusunda. Soldan sağa: negatif, pozitif Zika, negatif ve pozitif Zika için için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Hedef virüs | Adı | Sıra (5' - 3') | Uzunluğu | Başlangıç pozisyonu | Bitiş pozisyonu | |||
| Zika | ZV-F3 | GAGACTGCTTGCCTAG | 16 | 9905 | 9920 | |||
| ZV-B3 | CTGGGGTCTTGTCTTC | 16 | 10145 | 10130 | ||||
| ZV-EĞER | CAGTTGGAACCCAGTCAAC | 19 | 10028 | 10010 | ||||
| ZV-LB | GTGGAACAGAGTGTGGATTG | 20 | 10093 | 10112 | ||||
| ZV-FIP | CCATGGATTGACCAGGTAGTTTTTTCGACTGATGGCCAATG | 41 | 9974 | 10053 | ||||
| ZV-BIP | ACCACTGARGACATGCTTGTTTTTCATGTGGTCGTTYTCC | 40 | 10070 | 10129 | ||||
| ZV-LB_NatTail |
FAM-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG GTGGAACAGAGTGTGGATTG |
60 | 10093 | 10112 | ||||
| Chikungunya | CH-F3 | CGTCAACGTACTCCTAAC | 18 | 2891 | 2908 | |||
| CH-B3 | ACGTTGGCTTTRTTTTGG | 18 | 3094 | 3077 | ||||
| CH-EĞER | AGCGTCTTTATCCACGGG | 18 | 2968 | 2951 | ||||
| CH-LB | AYGCATCRATAATGGCGGG | 19 | 3025 | 3043 | ||||
| CH-FIP | GAAGTTTCCTTTCGGTGGGTTTTTGGAAGACACTYTCYGG | 40 | 2932 | 2993 | ||||
| CH-BIP | AAGGAGTGGGAGGTGGATTTTTTCAYTTGGTGACTGCAG | 39 | 3006 | 3063 | ||||
| CH-LF_NatTail |
HEX-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG AGCGTCTTTATCCACGGG |
58 | 2968 | 2951 | ||||
| Dang-1 | D1-F3 | ACAGCYCTGAATGAYATGG | 19 | 9583 | 9601 | |||
| D1-B3 | GCAGTTTCTCTCAGGC | 16 | 9803 | 9788 | ||||
| D1-EĞER | CACTTGYTGCCARTCATTCC | 20 | 9666 | 9647 | ||||
| D1-LB | CCATGCCGYAACCAAG | 16 | 9727 | 9742 | ||||
| D1-FIP | CTGGTGGAARTGGTGTGATTTTTTGGGAACCTTCAAAAGG | 40 | 9628 | 9693 | ||||
| D1-BIP | GAAGGAYGGGAGGGAAATAGTTTTTTTAGCCCTRCCCA CAAG |
42 | 9702 | 9763 | ||||
| D1-LB_NatTail |
TAMRA-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG CCATGCCGYAACCAAG |
56 | 9727 | 9742 | ||||
| Mitokondriyal DNA | MtDNA-F3 | AGCCTACGTTTTCACAC | 17 | 9183 | 9199 | |||
| MtDNA-B3 | GCGCCATCATTGGTAT | 16 | 9410 | 9395 | ||||
| MtDNA-LB | GCCTAGCCATGTGATTTCAC | 20 | 9322 | 9341 | ||||
| MtDNA-Eğer | GGCATGTGATTGGTGGGT | 18 | 9254 | 9237 | ||||
| MtDNA-FIP | GTCATGGGCTGGGTTTTACTTTTTCTACCTGCACGACAAC | 40 | 9213 | 9228 | ||||
| MtDNA-BIP | CTCAGCCCTCCTAATGACCTTTTTGAGCGTTATGGAGTGG | 40 | 9359 | 9344 | ||||
| MtDNA-LB_NatTail |
TET-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG GCCTAGCCATGTGATTTCAC |
60 | 9322 | 9341 | ||||
| Ortak içki | CTGACCTGACGGACTGAACGGATGGCTGAGCGCA AACCCG-Iowa siyah FQ |
40 | ||||||
Tablo 1: astar ve strand displaceable sondalar. Yaren ve ark. 201720izni ile yayımlanmaktadır. Bold serilerinde probları yerinden Strand çift iplikçikli bölgesini temsil eden. FAM etiketli (yeşil Floresans görülen), HEX etiketli (hafif yeşil-sarı Floresans görüldü), TAMRA etiketli (turuncu-kırmızı Floresans görülen) ve TET etiketli (sarı Floresans görülen) probları Zika, Chikungunya, Dang 1, algılamak için atanmış ve Mitokondrial DNA'idrar, anılan sıraya göre. FAM vardır uyarma ve emisyon maxima 495 nm ve 520 nm, anılan sıraya göre. HEX vardır uyarma ve emisyon maxima 538 nm ve 555 nm, anılan sıraya göre. TAMRA 559 uyarma ve emisyon maxima vardır nm ve 583 nm, anılan sıraya göre. TET vardır uyarma ve emisyon maxima 522 nm ve 539 nm, anılan sıraya göre. Tüm fluorophores için bir tek içki kullanımını etkinleştirmek için Iowa siyah-FQ geniş emme yelpazesini nedeniyle (420-620 nm) kullanıldı.
| Virüs, zorlanma (GenBank katılım numarası) | Aile/cins | Viral titreleri |
| Zika virüs (ZV), Porto Riko (PRVABC59, KU501215.1) | Flaviviridae/Flavivirus grup IV, pozitif, ssRNA | 2.85 x 108 pfu/mL |
| Chikungunya virüsü (CH), İngiliz Virgin Adaları (Asya soy, KJ451624) | Togaviridae/Alphavirus grup IV, pozitif, ssRNA | 2.42 x 108 genleri/mL |
| Chikungunya virüsü (CH), La Reunion (Hint Okyanusu soy, LR2006-OPY1, KT449801) | Togaviridae/Alphavirus grup IV, pozitif, ssRNA | 1.89 x 108 genleri/mL |
| Chikungunya virüsü (CH), La Reunion çıkarılan toplam NA Aedes aegypti kadın üzerinden (Hint Okyanusu soy, LR2006-OPY1, KT449801) | Togaviridae/Alphavirus grup IV, pozitif, ssRNA | 3.85 105 genleri/mL x |
| Dang serotip 1 (D-1), Key West (FL) (JQ675358) | Flaviviridae/Flavivirus grup IV, pozitif, ssRNA | 1.22 x 106 pfu/mL |
| Zika (ZV) sivrisinek kimlik, zorlanma | Bacak titresi pfu/mL | |
| ZV 9, Puerto Rico | 4,76 x 103 |
Tablo 2: hücre kültürleri ve virüslü sivrisinek Viral titreleri. PFU: plak oluşturan birim. Yaren ve ark. 201720izni ile yayımlanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sivrisinek kaynaklı virüsler Zika, chikungunya ve dang gibi halk sağlığı ve son Zika salgınlar vurgulamak için düşük maliyetli bakım noktası algılama alternatifler sivrisinek gözetim yanı sıra hasta tanıları için ihtiyaç tehdit. İzotermal güçlendirme yöntemleri PCR tabanlı sistemler uygun fiyatlı alternatif olarak geliştirilmiştir. Özellikle, RT-lamba-temel platformlar çok çeşitli patojenler algılamak için uygulandı. Ancak, izotermal platformlar kullanımı tek hedef tespit için esas olarak sınırlı olmuştur. Rapor yöntemi burada aynı anda üç farklı hedef tespiti özellikle uygun olduğu kanıtlanmış bir mesafeden orta sıcaklık (65-68 ° C), çalışan bir tek tepki karışımı izin vermek için değiştirilmiş bir RT lamba kullanır çünkü daha yüksek sıcaklıklarda 60 ° C render Zika ve diğer virüsler bulaşıcı olmayan30,35.
Ayrıca, burada sunulan veri RT-lamba çeşitli biyolojik sıvı15dakika içinde mevcut olabilecek maddeler inhibe tolere kapasitesine sahip olduğunu gösterir. Bu viral RNA'ların RNA arıtma an gereğinden fazla adım doğrudan tepki karışım içine örnek ekleyerek kuvvetlendirilmesine izin verir. Örnek türüne bağlı olarak, örnek maksimum hacmi tepki inhibe değil ve arka plan floresan (yanlış pozitif) değil neden olarak kararlı olması gereken izin. Çalışma odaklanır % 10 son hacim kullanımı İdrar numuneleri için burada sunulan. Ancak, tükürük ve serum örnekleri aynı şekilde20tahlil için de uygulanabilir. Algılama sınırları oldukça hasta idrar13, hem de virüs bulaşmış sivrisinekler20,36,37bildirilen viral yük üzerinde bulundu.
Sivrisinek gözetim genellikle daha düşük bir öncelik, halk sağlığı kaynaklar için ucuz bir kit bir ev anket multiplexed veya alan kamu özel değer olurdu bu yüzden var. Bu nedenle, bu seti virüs tespiti sivrisinek içinde leşleri izin vermek için Q-kağıt toplama tarafından güncellenmiştir. Q-kağıt coulombic etkileşimleri aracılığıyla yüzeyinde viral nükleik asitler yakalama sağlayan kovalent bağlı kuaterner amonyum grubu, yüksek düzeyde içerir. Q-kağıt RT-lamba inhibe bir sorun olsa bile, Q-kağıt taşıyan sivrisinek leşleri doğrudan RT-lamba karışım içine ekleyerek, başarılı virüs algılama 30 dk içinde elde edilebilir olduğunu bulundu. Başarılı sinyal nesil için Q-kağıt küçük olması gerekiyor (3 x 4 mm 100 µL tepki birim için boyutlu yeterliörneğin,) RT-lamba tepki karışımı sokulmasına. O tepki tüp için çok büyük ya da sıvı içinde dalmış kalan yerine yüzen başlamak, reaksiyon yer alabilir değil ve sonuçlarının yanlış negatif görünebilir.
Başarılı algılama ve her virüs farklılaşma için her primer RT-lamba astar tasarımı, sondalar, yerinden için tasarım kuralları için yönergeleri takip ve çoğullama için fluorophores bir seçim ayarlayın. Her astar ihtiyaçları olan önlemek için farklı hedeflere karşı taranması için ayarlayın. Ayrıca, magnezyum konsantrasyon ve kuluçka sıcaklık her set için optimize edilmiş olması gerekir. Burada sunulan yöntemleri tarafından RT-lamba mimari için strand displaceable sondalar tanıtarak başarılı oldu göz Floresans dökümanları görünür kullanın. Her hedef virüs farklı fluorophores atandığında bu üç ayrı renk çoğaltılmış bir tahlil görüntülenmeyecektir. Tek hedef tespit ve hangi sıra özgü değildir ve oluşturma için yatkındır enterkalasyon veya floresan boyalar, kullanımı yayımlanmış yöntemlerin çoğu itimat beri bu varolan izotermal Zika algılama yöntemleri, avantajlar sağlar belirsiz amplicons.
Düşünün bir kritik fluorescently etiketli yerinden sondalar son konsantrasyonu tayini adımdır. Bulunan 80-100 nM probları yerini değiştirerek, floresan sinyallerini 15-20 dk içinde oluşturmak, oysa sinyal için zaman zaman 300 ertelendi nM sonda konsantrasyon kullanılmıştır. Deneyleri çoğaltılmış bir biçimde çalıştırıldığında reaksiyon süresi daha da ertelendi. 80 geçiş nedeni nM 300 nM olduğunu görsel olarak tüm üç fluorophores bir tek LED kaynağı'nı etkinleştirmek için. Mavi LED uyarma, 470 ile nm FAM etiketli probları için uygundur, ama daha az HEX veya TAMRA etiketli probları için uygundur. Bu nedenle, bir kurban Üç hedefin tümünü görselleştirmek için kuluçka zamanında yapılmıştır.
İleri Kirlilik RT-lambalı sorunlardan biri. RT-lamba amplicon büyük miktarda kısa kuluçka zamanında oluşturur ve amplicons kolayca aerosoller yayımlanan olabilir. Bu sorunu gidermek için dUTP ile birlikte UDG sindirim tahlil kurulum sırasında ve ardından diğer dNTPs dahil edildi. UDG yeni oluşturulan RT-lamba amplicons hazım önlemek için devre dışı bırakabilirsiniz için gerekli olduğundan UDG, ısı-değişken bir sürümünü kullanmak önemlidir.
Soğutma olmadan kitinin dağıtımına olanak tanımak için testin tüm bileşenleri liyofilize gerekiyordu ve kiti ile rehidratasyon tampon desteklenmiştir. Bu nedenle, gliserol lyophilization tarafından kaldırılamaz çünkü herhangi bir gliserol içinde piyasada bulunan enzimler mevcut Ultrafiltrasyon tarafından kaldırıldı. Bir karışımı bir yüksek konsantrasyonu, gliserol enzim aktivite ile girişime neden olabilir. Gliserol kaldırma işlemine dahil değil sadece enzim thermolabile UDG yapıldı. UDG bir küçük Moleküler ağırlığı 24.6 kDa olan Ultrafiltrasyon deneyleri için uygun olmayan hale enzimdir. Bu nedenle, lyophilization karışıma satın olarak eklendi. Artık gliserol tahlil'ın sonucu olumsuz yönde etkilemedi.
Bir floresan bu RT-lamba teknik sınırlamaları tek LED kaynak kullanımıdır. Deneyleri singleplex ya da çok katmanlı biçimde çalıştırıldığında, sonda yerinden daha yüksek konsantrasyonlarda tüm hedefler sinyal görselleştirme için ihtiyaç vardı. Ancak, bu değişiklik saat sinyalini üretimi gecikmelere neden olur. Bu sorunu aşmak için bir şekilde daha iyi diğer fluorophores (HEX ve TAMRA) yerleştirmek için iki LED kaynakların kullanılması olabilir. Bu şekilde, daha düşük sonda konsantrasyonu bir sinyal daha kısa kuluçka süreleri ile oluşturmak için kullanılabilir.
Dikkate ihtiyacı başka sınırlama Floresans renk göz loş ışıklı bir ortamda tarafından yargılıyor. Astar değil etkileşim ile her diğer için tasarlanmış bu yana tek bir hedef bir singleplex veya multiplex biçiminde, mevcut ise daha kolay olur. Tahlil birden çok hedef bir havuzu sivrisinek veya birden fazla viral enfeksiyonu olan bir hasta gibi bir tek tahlil tüp içinde yoktu Eğer yorumlamak daha zor olurdu. Bu göz göre yargılamak yerine dijital ekranı gibi okuma mimarisinin bir değişiklik gerektirir.
Olası bir gelecek yaklaşım sivrisinek kaynaklı arboviruses daha büyük bir panel oluşturarak çoğullama düzeyini artırmak için olacaktır. Bu astar astar astar etkileşimleri, önlemek için tasarım ve Moleküler tanıma sistemleri (SAMRS) kendi kendine kaçınmak gibi değiştirilmiş nükleik asit analogları kullanımını gerektirebilir ve genetik bilgi sistemi (AEGIS) yapay olarak genişletti dikkatli gerektirir daha iyi38çoğullama yüksek düzeyde karşılamak. Buna göre bir tek fluorophore her yerinden sonda için kullanın ve her hedef için benzersiz bir yerinden sırası atamak ve DNA tarafından sağlam bir yüzeye yerinden probları yakalamak için daha yüksek bir multiplex sisteminde sinyal okuma için çözüm olacaktır hibridizasyon. Bu bir tek fluorophore ve heyecanlandırmak için LED ile bir dizi biçimli platformu oluşturmak, ancak her hedef varlığı yargılamak dizi39konumunu temel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bazı yazarlar ve bu tahlil ile ilişkili kendi kurumları kendi fikri mülkiyet.
Acknowledgments
Çalışma kısmen FDOH-7ZK15 ve NIAID 1R21AI128188-01 tarafından desteklenmiştir. Bu yayında bildirilen araştırma kısmen ve kısmen Biyomedikal Araştırma programı, Florida Sağlık Bakanlığı Ulusal kurumları alerji ve enfeksiyon hastalıkları tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka NIH veya Florida Sağlık Bakanlığı resmi görüşlerini temsil etmiyor. Dinamik Kombinatorik kimya LLC bu projeye katkısı ve desteği için kabul edilmektedir.
Dang 1 virüs (zorlanma BOL-KW010) Florida bölümü, Sağlık Bürosu tarafından laboratuarlar sağlanan lütfen. Nezaketle Zika virüs ve chikungunya virüsü Asya soyundan tarafından Merkezleri Hastalık Kontrol ve Önleme için verilmiştir. Chikungunya virüsü ve Hint Okyanusu soyundan, UF-FMEL için lütfen Robert Tesh (ortaya çıkan virüs ve Arboviruses, Galveston, Texas Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi aracılığıyla dünya başvuru Merkezi) tarafından sağlandı. S. Bellamy, B. Eastmond, S. Ortiz, ö. Velez, K. Wiggins, R. ZimLer ve K. Zirbel enfeksiyon çalışmaları ile yardım için teşekkür. Biz de M. S. Kim Q-kağıt verdiğiniz için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
References
- Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
- Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636 (2014).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
- Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clin Microbiol Rev. 29, (2016).
- Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
- Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
- Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
- Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
- Shukla, S., Hong, S. -Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685 (2016).
- Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295 (2016).
- Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. Journal of Clinical Virology. 68, 53-55 (2015).
- Gourinat, A. C., O'Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M. Detection of zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 21, (2015).
- Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28, (2000).
- Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
- Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
- Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
- Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
- Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
- Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
- Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
- Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
- Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605 (2016).
- Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
- Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
- Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
- Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22 (2010).
- Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226 (2015).
- Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
- Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , 62,381,759 (2016).
