Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri

Published: January 23, 2018 doi: 10.3791/57053
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Nutrition, Dietetics and Food Science Department, Brigham Young University

Summary

Bu iletişim kuralı bozulmadan 832/13 beta yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri kullanarak hücreleri glikoz-aracılı değişiklikler doğal bileşikler huzurunda mitokondrial solunum etkisini ölçmek için hedeftir.

Abstract

Yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri izole mitokondri, hücre ve dokulara oksijen tüketimi ölçüm için sağlar. Beta hücreleri vücut tarafından kontrol kan şekeri düzeyleri insülin salgılanması yanıt olarak yükseltilmiş glikoz konsantrasyonu ile kritik bir rol oynamaktadır. İnsülin salgılanması glikoz metabolizması ve mitokondrial solunum tarafından kontrol edilir. Bu nedenle, bozulmamış beta hücre solunum ölçme şeker hastalığı için bir tedavi olarak beta hücre fonksiyonu geliştirmek için önemlidir. Sağlam 832/13 INS-1'i kullanarak beta hücreleri hücresel solunum glikoz konsantrasyonu artan etkisini ölçebilirsiniz türetilmiş. Bu iletişim kuralı bir etkilerini belirlemenize izin vererek çeşitli bileşenleri, başka yerde içinde beta hücre solunum ölçmek için bize izin verir bileşikler sağlam hücre solunum üzerinde verilen. Burada iki doğal olarak meydana gelen bileşikler, monomeric epikateşin ve curcumin, low (2.5 mM) veya yüksek glikoz (16,7 mM) koşulları altında varlığı beta hücre solunum üzerindeki etkisini göstermektedir. Bu teknik, çeşitli bileşikler etkisi olduğu gibi beta hücre solunum huzurunda farklı glikoz konsantrasyonu belirlemek için kullanılabilir.

Introduction

Pankreas beta hücre birincil amacı sistem normoglycemia glikoz uyarılmış insülin salgılanması ile muhafaza etmektir. Beta hücreleri glikoz büyük ölçüde nedeniyle düşük benzeşme, yüksek kapasiteli glikoz taşıyıcı GLUT2 dolaşan fizyolojik değişiklikler hissediyorum (glikoz taşıyıcı 2, Km 16,7 mM)1. Dolaşım Glikoz seviyesi yükseldikçe, bu yüksek kapasiteli düşük-benzeşme ışınlama beta hücre içinde hücre içi glikoz orantılı bir artış kolaylaştırır. Glikoz Glikoliz, TCA döngüsü (tricarboxylic asit döngüsü) ve mitokondrial solunum yükseltilmiş hücresel ATP (adenozin trifosfat) seviyelerinde kaynaklanan metabolize edilir. Yükseltilmiş ATP konsantrasyon membran depolarizasyon sonucu ATP hassas K+ kanalları, engeller. Membran depolarizasyon voltaj Kapılı Ca2 + kanal açılması neden olur ve sonraki sürümü vezikül insülin granülleri2bağlı. Beta hücre fonksiyon bozukluğu tip 2 diyabet (T2D) özelliğidir ve azalmış ve kötü kontrollü insülin salgılanması ve sonuçta beta hücre ölüm3ile sonuçlanır. Korumak veya beta hücre fonksiyonu geliştirmek mekanizmaları T2D için bir tedavi olarak kullanılabilir.

Çalışmaları doğal olarak meydana gelen yararlı etkilerini göstermiştir pankreas beta hücre4bileşikler bitkisel kökenli. Bu bileşiklerin onların etkisi ile artan beta hücre çoğalması, hayatta kalma veya glikoz uyarılmış insülin salgılanması olabilir. Örnek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda monomeric epikateşin mitokondrial solunum artan aracılığıyla glikoz uyarılmış insülin salgılanması artırır ve hücresel ATP artan5düzeyleri gösterdi. Bu nedenle, bu bileşiklerin fonksiyonel beta hücre artırabilir nasıl anlama kitle bu bileşikler potansiyel therapeutics kaldıraç önemlidir.

Hücresel solunum bir dizi araç ölçülebilir. Yüksek çözünürlüklü bir respirometer bir permeabilized ya da sağlam hücre nüfus6kimyasal modülatörler titrasyon için sağlar. Bu araç çeşitli bileşenleri, ek böylece geniş bir dizi bilgi veren farklı konsantrasyonları verir.

Glikoz metabolizması ve beta hücre fonksiyonu arasındaki samimi bağlantı göz önüne alındığında, hücresel solunum ölçümleri kritik öneme sahiptir. Hücresel solunum ölçümleri-ebilmek kılınmak istimal beta hücreleri, ya permeabilized ya da olduğu gibi her avantajları ve dezavantajları7,8, kendi kümesini having ile. Beta hücrelerinin permeabilization bir elektron taşıma zinciri farklı yönlerini ölçmek izin verirken, bunu solunum beta hücre, glikoz alımı ve metabolizma inducing mekanizmasını açısından olmadan yapar. Bu nedenle, unpermeabilized beta hücre solunum kullanımı oksijen tüketim göstergesi kullanarak çeşitli glikoz düzeyleri için beta hücreleri yanıt belirlemek için çok kullanışlı bir yöntemdir.

Bu teknik amacı sağlam INS-1 oksijen tüketimi ölçmek için 832/13 beta hücreleri türetilmiştir. Bu teknik bize beta hücreleri yanıt unstimulatory glikoz koşullarına (2.5 mM glikoz) belirlemek uyarıcı glikoz koşulları (16,7 mM glikoz) yanı sıra sağlar. Unpermeabilized hücreleri tek tek karmaşık test bize izin vermez iken ben, II veya III. elektron taşıma zinciri, tekniği ile karmaşık IV edilişi inhibisyon (Oligomycin A), solunum (FCCP-karbonil siyanür-ilgili ölçümler izin vermez 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone) ve tamamen inhibe solunum (Antimycin A). Bu çalışmada solunum sağlam unpermeabilized pankreas beta hücreleri yanı sıra iki doğal olarak meydana gelen bileşikler, monomeric epikateşin ve curcumin, beta hücre solunum üzerindeki etkisini ölçme etkinliği gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hücre kültürü

  1. Kültür INS-1 832/13 beta hücrelerinde RPMI % 10 fetal sığır serum (FBS), % 1 penisilin-streptomisin, 10 mM HEPES, 2 mM glutamin, 1 mM sodyum Pyruvate ve 0.05 mM 2-mercaptoethanol9,10,11 ile desteklenmiş 1640 türetilmiş ,12,13.
  2. 832/13 hücreleri bir T75 şişesi 2 mL % 0.25 Tripsin, 8 mL tam RPMI 1640 medya ekleyerek 10 dk. Nötrleştir tripsin için 37 ° C'de kuluçka kullanarak kaldırın.
  3. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve adım 1.2 içinde 900 µL PBS, hücre birimden 100 µL oranında seyreltin.
  4. 2 x 106 hücre/mL 6 yoğunluğu plaka 832/13 hücreleri de çanağı.
  5. Kültür hücreleri oksijen kuluçka solunum deney başlamadan önce 37 ° C ve % 5 CO2 48 h için.

2. yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri için hücreleri hazırlanması

  1. Kakao türetilmiş epikateşin monomer 832/13 hücrelerle tedavi.
    1. 832/13 hücreler için 24 saat sonra kaplama 37 ° C ve % 5 CO2oksijen bir kuluçka kültür.
    2. Medya 24 saat sonra kaplama değiştirmek ve araç kontrolü (3 Kuyu) veya kültür için bir ek 24 h (48 h toplam) oksijen kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2ardından 100 nM kakao monomer (3 Kuyu), 832/13 hücrelerle tedavi.
    3. 1 x düşük glukoz salgılanmasını tahlil arabellek (SAB) 5 dk. aspiratı arabelleği için hücrelerde 832/13 yıkama ve 3 h, 1 x düşük glikoz SAB her saat değiştirme için düşük glikoz SAB x 1 832/13 hücrelerde kuluçkaya.
      1. Yapmak 10 x SAB ile 33.32 gram NaCl, KCl, 1.73 gr KH2PO4, MgSO4 0.7 g 0,82 g ve H2O 500 mL son bir hacim için ekleyin. Steril filtre nihai çözüm.
      2. Yapmak 1 düşük glikoz SAB ile 10 SAB, 100 µL % 45 glikoz, 1 m HEPES, 1 mL 2 mL x 10 mL x 0,25 M CaCl2, 0,57 mL % 35 BSA çözeltisi, NaHCO3 0,21 g ve H2O son hacmi 100 mL için ekleyin. Steril filtre nihai çözüm.
  2. Curcumin 832/13 hücrelerle tedavi.
    1. 832/13 hücreler için 48 saat sonra kaplama 37 ° C ve % 5 CO2oksijen bir kuluçka kültür.
    2. 1 düşük glikoz SAB x 5 dk. aspiratı arabelleği için hücrelerde 832/13 yıkama ve 3 h, 1 x düşük glikoz SAB her saat değiştirme için düşük glikoz SAB x 1 832/13 hücrelerde kuluçkaya.
    3. 2,5 h, 1 düşük glikoz SAB x 3 h kuluçka sonra arabellek Aspire edin ve 1 x düşük glikoz SAB araç kontrolü ile ya da 30 dk 40 µM curcumin hücrelerde kuluçkaya. Kuluçka, arabellek Aspire edin.
  3. Tripsin yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri için hücrelerle hasat
    1. 1 düşük glikoz SAB x 3 h kuluçka sonra hücrelerin % 0.25 tripsin iyi başına 250 µL plakalı kaldırın.
    2. Tripsin araç kontrolü ile veya bileşik faiz SAB 4 mL 15 mL konik tüp ile tedavi 3 kuyulardan hücrelerde birleştirir.
    3. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve adım 2.3.2 900 µL PBS, hücre birimden 100 µL oranında seyreltin.
    4. 1 x düşük glikoz her odası için uygun toplama at 3 mL yapmak SAB hücrelerde uygun sayıda sulandırmak. Veri 1 x 106 hücre/mL konsantrasyonu en etkili olduğunu gösterir.
  4. Yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri için mekanik ayrışma hücrelerle hasat
    1. Düşük glikoz SAB, 1 x 3 h kuluçka sonra 1 mL 1 x düşük glikoz SAB her şey ve yavaşça havaya hücreleri mekanik ayrışma ile plaka dışına 1000 µL pipet ucu ile pipetting tarafından ekleyin.
    2. Araç kontrolü ile veya bileşik ilgi 3 mL SAB solunum için 15 mL konik tüp içinde toplam tedavi 3 kuyulardan hücreleri birleştirin.

3. yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri

  1. Yüksek çözünürlüklü respirometer hazırlanması.
    1. Yüksek çözünürlüklü respirometer açın ve respirometer analiz programı başlatarak masaüstüne bağlayın.
    2. Her iki odalarından % 70 etanol Aspire edin. Bu odaları 45 dk en az % 70 etanol içinde bekletin.
    3. Odalar her adımdan sonra alıyorum iki kez % 70 etanol ile yıkayın.
    4. Chambers GKD2her adımdan sonra alıyorum O, üç kez ile yıkayın.
    5. GKD2' O. odası itici durulama Bu kalıntı etanol itici ve titanyum bağlantı noktası kapalı temizler.
  2. Polarographic oksijen sensör kalibrasyonu.
    1. Sürekli manyetik heyecan çubukları kullanarak veri kayıt aralığı ile 750 rpm ve 37 ° C odasında 2.0 arabellek karıştırarak her oxygraph Odası'na, 1 düşük glikoz SAB arabellek x 2.4 mL ekleyin F7 butona da sekmesini açarak s "Sistemler" etiketli. İtici itmek ta ve İngiliz anahtarı havalandırma ayarına geri çek. En az 1 saat kadar istikrarlı oksijen akı elde edilir için equilibrate makine izin.
    2. Makine 37 ° C'de deneme süresini belirleyin. Polarizasyon gerilimi 800 için ayarla bir kazancı F7 butona da "Oksijen, O2"etiketli sekmesini açarak 2 mV. Oksijen konsantrasyonu da değişimdir kararlı iken en az 30 dk, SAB arabellek oksijen konsantrasyonu equilibrate (az 2 pmol/(s*mL)).
    3. Oksijen konsantrasyonu sabitleme oksijen konsantrasyonu üstü arka plan ölçü değişim oksijen konsantrasyonu kurmaya kararlı nerede bir bölge seçin.
      1. Üst karakter tuşunu, sol üzerinde fareyi tıklatmak itip seçili bölgede fareyi sürükleyerek bir bölge seçin. Her iki odaları ile karşılık gelen her iz için seçilen bölge ve "R1" değişiklik ile ilişkili adını tıklatın.
      2. Sol altta "O2 kalibrasyon" kutusuna çift tıklayın ve köşeleri ekranın sağ, R1 olarak "hava kalibrasyon" "işaretini seçin" düğmesini tıklatın ve sonra "kalibre ve panoya kopyala" her iki salonları için seçin.
  3. Solunum 832/13 beta hücre 2.1.5 veya 2.2.5 adımda hazırlanan değerlendirme.
    1. Her odası (kontrol tedavi araç hücreleri, bileşik işlem görmüş hücreleri ile bir odası ile bir odası) örnekte 2.4 mL 1 x düşük glikoz SAB. yük Hücre örneği protein Nefelometri için 0.5 mL BCA (Bicinchoninic asit) tahlil tarafından Eğer mekanik ayrışma yaklaşım (daha sonra ölçüm için donma-20 ° C'de) kullanarak korur.
      1. Dalgıç sonuna kadar itin ve rezidüel hacim Aspire edin. Hücreleri 750 devir/dakika ve 37 ° C tüm sonraki adımlar için denemeyi boyunca sürekli karıştırın. F4'e tıklayarak ve örnekleri yüklendiğinde "hücreler olarak" etiketleme bir işareti yapmak.
      2. 30 dk için ölçü örnekleri. Sinyal sabitleme sonra oksijen konsantrasyonu düşük glikoz koşulları (2.5 mM glikoz) 3.2.3 içinde açıklandığı gibi karşılık gelen değişim bir bölge seçin.
    2. Sinyal sabitleme ulaşıldıktan sonra 12.5 µL % 45 steril glikoz çözüm (16,7 mM son konsantrasyonu) kullanarak bağlantı noktası yükleme titanyum ile her odaya içine ekleyin. Bir işareti "tedavi eklendiğinde 3.3.1 içinde açıklanan glikoz" olarak ölçülen olun. Let sinyal stabilize etmek ve kayıt hücresel solunum kadar istikrarlı oksijen akı elde edilir. Bu bölge değişikliği oksijen konsantrasyonu 3.2.3 içinde açıklandığı gibi seçin. Bu 16,7 mM glikoz okuma ve uyarıcı koşullar7ile karşılık gelir.
    3. Sinyal sabitleme ulaşıldıktan sonra 5 mM oligomycin bir (2.5 µM son konsantrasyonu) her odasına yükleme limanı üzerinden 1 µL ekleyin. Bir işareti "tedavi eklendiğinde 3.3.1 içinde açıklanan OligoA" olarak ölçülen olun. Let sinyal stabilize etmek ve kayıt hücresel solunum kadar istikrarlı oksijen akı elde edilir. Bu alan eğrinin 3.2.3 içinde açıklandığı gibi seçin. Oligomycin A ATP sentaz engeller ve böylece akı tek oksijen meydana gelen yolu ile elektron ve oksidatif fosforilasyon7sızıntı.
    4. Sinyal sabitleme ulaşıldıktan sonra en fazla solunum oranı kurulana kadar 1 mM FCCP 1 µL artışlarla ekleyin. Bu maksimal edilişi solunum temsil eder. 3-4 µL arasında FCCP (maksimal edilişi solunum INS-1 832/13 hücre ikna etmek için yeterli 1.5-2.0 µM son konsantrasyonu) olduğunu. Tedavi eklendiğinde 3.3.1 içinde açıklandığı gibi "FCCP" etiketli bir işareti yapmak. Let sinyal stabilize etmek ve kayıt hücresel solunum kadar istikrarlı oksijen akı elde edilir. Bu alan eğrinin 3.2.3 içinde açıklandığı gibi seçin. FCCP uncoupling bir ajandır. Bu bize edilişi solunum7ölçmek sağlar.
    5. Sinyal sabitleme ulaşıldıktan sonra yükleme limanı ile her odaya içine 1 µL 5 mm Antimycin A (2.5 µM son konsantrasyonu) ekleyin. Tedavi eklendiğinde 3.3.1 içinde açıklandığı gibi "AntiA" etiketli bir işareti yapmak. Let sinyal stabilize etmek ve kayıt hücresel solunum kadar istikrarlı oksijen akı elde edilir. Bu alan eğrinin 3.2.3 içinde açıklandığı gibi seçin.
      Not: Antimycin A sitokrom C redüktaz bağlar, ubiquinone oksidasyonu engeller ve tüm solunum engeller. Bu tamamen solunum7durdurmak için bize izin verir.
  4. 832/13 beta hücreleri protein konsantrasyonu ve solunum normalleştirme için ölçme.
    1. Örnek yükleme BCA yöntemi13kullanarak ölçü protein örnek muhafaza 0.5 mL kullanarak.
    2. Her örnek nüsha, seyreltme, üreticinin yönergelerini takip olmadan çalışır.
  5. 832/13 beta hücre solunum hesaplamaları trypsinized hücrelerden.
    1. ML kullanım başına hücre sayısı tahlil F3 respirometer analiz programı düğmeye basarak girin. Hücre/mL birimlerini değiştirin, hücresel konsantrasyon girin ve orta SAB. için değiştirin
    2. Arka plan okuma seçerek ve O2 3.2.3 içinde açıklandığı gibi kalibrasyon formu içine girerek verileri normalleştirmek için seçin.
    3. Okumalar 2.5 mm glikoz, 16,7 mM glikoz, Oligomycin A, FCCP ve Antimycin 3.3.1 içinde açıklandığı gibi bir seçim yapın.
    4. Respirometer analiz programında, her odası için okuma protein konsantrasyonu girerek ve her tedavi sırasında solunum ölçümü için uygun ortalama değerleri seçerek sonra dışa aktarın. Bu tıklayarak F2 ve "kopya" Pano çalışması için bastırıyor tarafından yapılır. Bu diğer analiz programlarda kullanmak için veri verir. "O2 eğim negatif" değerler hesaplamalar için kullanın.
    5. Veri denetimleri araç 3-5 bağımsız ishal tedavi ve doğal olduğu gibi hücresel solunum INS-1 832/13 beta hücre üzerindeki etkisini belirlemek için işlem görmüş hücreleri bileşikler derleyin.
  6. 832/13 beta hücre solunum hesaplamalar mekanik hücre ayrışmış.
    1. Protein hesaplamalar BCA tahlil F3 respirometer analiz programı düğmeye basarak girin. Mg birimlerini değiştirin, BCA konsantrasyon girin ve orta SAB. için değiştirin
    2. Arka plan okuma seçerek ve O2 3.2.3 içinde açıklandığı gibi kalibrasyon formu içine girerek verileri normalleştirmek için seçin.
    3. Okumalar 2.5 mm glikoz, 16,7 mM glikoz, Oligomycin A, FCCP ve Antimycin 3.3.1 içinde açıklandığı gibi bir seçim yapın.
    4. Respirometer analiz programında, her odası için okuma protein konsantrasyonu girerek ve her tedavi sırasında solunum ölçümü için uygun ortalama değerleri seçerek sonra dışa aktarın. Bu tıklayarak F2 ve "kopya" Pano çalışması için bastırıyor tarafından yapılır. Bu diğer analiz programlarda kullanmak için veri verir. "O2 eğim negatif" değerler hesaplamalar için kullanın.
    5. Veri denetimleri araç 3-5 bağımsız ishal tedavi ve doğal olduğu gibi hücresel solunum INS-1 832/13 beta hücre üzerindeki etkisini belirlemek için işlem görmüş hücreleri bileşikler derleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hazırlanan ve iletişim kuralında tanımlandığı gibi hasat INS-1 832/13 beta hücreleri oksijen tüketimi çeşitli kimyasal müdahaleler (şekil 1A) göre modülasyon gösterecektir. Glikoz konsantrasyonu 16,7 mM glikoz (şekil 1B) arttı zaman solunum bir artış gözlenir. Sağlam hücreleri Oligomycin A. ile tedavi ederken solunum azalacak Bu solunum Bazal, nonphosphorylating solunum durumu olarak tanımlanır kaçak olarak bilinir. Beta hücreleri uncoupling Ajan ETS solunum veya elektron taşıma sistemi solunum olarak tanımlanan FCCP ile tedavi ederken maksimal solunum elde edilecektir. Son olarak, solunum Antimycin A, solunum hücresel oksijen tüketimi anlamına gelir ROX (kalan oksijen tüketimi) olarak etiketlenmiş ile tedavi ederken sıfıra düşecek.

Cep numarasını farklılıkları bu tekniği elde edilen verilerin kalitesini önemli ölçüde değişecektir. Glikoz neden solunum 0.5, 1 ve 2 x 106 hücre/mL (şekil 2A-2 C) ölçüldü. Hücre sayımları ve BCA kullanarak protein, protein konsantrasyonları (2D rakam) konsantrasyonları hesaplanan üç test hücreye karşılık gelen deneyleri. 0.5 x 10 kullanarak ölçüleri6 hücre/mL glikoz uyarılmış solunum (şekil 2A) ve sadece ETS artan solunum ilişkili göstermek için başarısız önemli olduğu gösterilmiştir. Bu düşük cep numarasını sonuçları zihnimi karıştıran gürültü oranı düşük sinyal sonuçları göstermektedir. Benzer şekilde, 2 x 106 hücre/mL ölçülerde Ayrıca istatistiksel anlamlılık sadece ETS ölçülerini (şekil 2C) ulaşıldı gösterildiği gibi önemli değişkenlik sonuçlandı. Bu muhtemelen odaları büyük değişkenlik örnek örnek sonuçlandı tahlil sırasında birden çok kez yeniden oksijen gerek kaynaklanmaktadır. 1 x 106 hücre/mL konsantrasyonları ölçümleri, solunum analizleri için gerekli olan önemli glikoz uyarılmış solunum içinde sızıntı ve ETS neden bu veri göstermek (şekil 2B ve 2E).

Solunum için hücreleri kaldırmak için iki yöntem bu protokol için sunulmaktadır. 37 ° C'de ölçümler tamamlandığında tripsin hücreleri kaldırmak için kullanma etkilidir Devamsızlık veya curcumin (şekil 3A) varlığı yapılan solunum ölçümleri gösterir bakım glikoz uyarılmış solunum, sızıntı ve ETS solunum. Tedavi edilmeyen hücrelerin hücrelere tedavi curcumin karşılaştırılması (3B şekil-C) bu solunum parametrelerden herhangi bir değişiklik olmaz gösterir. Devamsızlık veya kakao epikateşin monomer (şekil 3D) varlığı yapılan solunum ölçümleri de bakım solunum, glikoz uyarılmış gösterir SIZINTISI ve ETS solunum. Kakao epikateşin tedavi monomer hücreleri tedavi edilmezse hücrelere karşılaştırılması artan solunum SIZINTISI ve ETS solunum (3E rakam-F) yanı sıra, 2.5 mM ve 16,7 mM glikoz gösterir. Bu veriler curcumin 832/13 beta hücre solunum geliştirmez iken, kakao epikateşin monomer (şekil 3 g) göstermek. Curcumin fosfodiesteraz etkinliği14inhibe yoluyla insülin salgılanması artırmak için gösterilmiştir. Bizim veri o curcumin mitokondriyal işlev oransal yoluyla insülin salgılanması geliştirmez öneririz. Biz zaten kültür kakao epikateşin monomerleri huzurunda ifade mitokondrial elektron taşıma zinciri5çeşitli bileşenlerinin indükler gösterdi. Biz aynı zamanda artan solunum (oligomycin ile tedavi tarafından indüklenen) SIZINTISI durumunda gözlenen ve ETS (elektron taşıma sistemi, FCCP tarafından indüklenen) ile. Bu aracın kullanımı gelecekteki çalışmaları için potansiyel hedef sayısını göstermektedir.

Tripsin kaldırma hücre için alternatif olarak, mekanik ayrışma da 37 ° C'de tamamlandığında sunulan yıkama tekniği kullanılarak gerçekleştirilebilir Solunum ölçümleri yokluğu veya curcumin ya da kakao epikateşin monomer (şekil 4A-C) yapıldı. Bu veri hücreleri tripsin hazırlanması ile gözlenen eğilimler korunur olduğunu, ancak duyarlılığı azalmış görünüyor göstermektedir. Denetim ve kakao epikateşin monomer hücreleri glikoz uyarılmış tutulan tedavi ederken, sızıntı ve ETS solunum, curcumin ile tedavi hücreleri glikoz uyarılmış solunum artan örnek örnek değişkenlik nedeniyle sadece korudu. Tripsin hücre hazırlıkları ile gözlenen eğilimler (şekil 4 d-F) muhafaza iken önemi azalmış muhtemelen mekanik ayrışma tarafından tanıtılan büyük örnek örnek değişkenliği için tüm parametreleri ve normalleştirme protein konsantrasyonu tercihan--dan cep numarası için.

Bu veriler bu protokolü olduğu gibi INS-1 832/13 beta hücre solunum ölçmek için kullanılabilir göstermek. Ayrıca, bizim iletişim kuralı doğru ölçümler için bir en iyi cep telefonu numarasını ve hücrelerin hazırlanması için tercih edilen yöntemi sinyal gürültü oranı en üst düzeye çıkarmak için öneriyor.

Figure 1
Resim 1 : Temsilcisi solunum eğrisi bozulmadan 832/13 beta hücrelerinin. Sağlam 832/13 beta hücreleri için solunum (şekil 1A) 2.5 mM glikoz, 16,7 mM glikoz, 2.5 µM Oligomycin, 2 µM (karbonil siyanür -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) ve 2.5 µM Antimycin a FCCP içinde ölçülür 16,7 mM glikoz bölümü (şekil 1B) bir genişleme glikoz uyarılmış solunum artış göstermek için sunulmuştur. Hücreleri 1 x 106 hücre/mL konsantrasyonu ölçüldü. SIZINTI Bazal, nonphosphorylating solunum durumuna, ETS elektron taşıma sistemi solunum edilişi kapasitesini ifade eder ve mitokondrial solunum inhibe sonra kalan oksijen tüketimi ROX gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : 832/13 beta hücreleri glikoz kaynaklı solunum ölçümleri için gerekli belirlenmesi. Sağlam 832/13 beta hücreleri (A) 0.5 x 106 hücre/mL (B) 1 x 106 hücre/mL veya (C) 2 x 106 hücre/mL konsantrasyonlarda solunum için ölçülür. (D) x 106 hücre/mL, 1 x 106 hücre/mL ve 2 x 106 hücre/mL 0.5 ile karşılık gelen Protein konsantrasyonları. (E) 0.5 x 106 hücre/mL, 1 x 106 hücre/mL ve 2 x 106 hücre/mL, solunum karşılaştırılması. Solunum 2.5 mM glikoz, 16,7 mM glikoz, 2.5 µM altında ölçülen Oligomycin, 2 µM FCCP ve 2.5 µM Antimycin A koşulları. Solunum 2.5 ve 16,7 mM glikoz ile beta hücreleri glikoz uyarılmış solunum tepki göstermektedir. Solunum oligomycin sonra sızıntı solunum (solunum devlet Bazal, nonphosphorylating) gösterir. Solunum FCCP sonra (karbonil siyanür -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) tedavi gösterir (elektron taşıma sistemi, ETS edilişi solunum kapasitesi). n 6 bağımsız çalışır =. Ortalama ± SEM sunulan verilerin * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, *** p < 0,0001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : 832/13 beta hücre solunum ölçümleri tripsin kullanarak yayımlanmasından sonra. 832/13 beta hücreleri monomeric kakao epikateşin içinde kültürlü ya da curcumin ve solunum tripsin kullanarak hücreleri bırakmadan sonra ölçülen. Solunum 2.5 mM glikoz, 16,7 mM glikoz, 2.5 µM altında ölçülen Oligomycin, 2 µM FCCP ve 2.5 µM Antimycin A koşulları. 2.5 ve 16,7 mM glikoz ile solunum solunum glikoz uyarılmış göstermektedir. Solunum oligomycin sonra sızıntı solunum (solunum devlet Bazal, nonphosphorylating) gösterir. Solunum FCCP sonra (karbonil siyanür -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) tedavi gösterir (elektron taşıma sistemi, ETS edilişi solunum kapasitesi). Solunum antimycin bir tedavi sonra kalan oksijen tüketimi (ROX) gösterir. (A)tedavi 832/13 hücre curcumin ile solunum tedavileri nedeniyle uygun değişiklikleri korur. (B) temsilcisi izleme ve (C) ortalama veri hücreleri curcumin ile tedavi için 832/13 beta hücre solunum hiçbir değişiklik gösterir. (D) tedavi 832/13 hücre kakao epikateşin monomer ile solunum tedavileri nedeniyle uygun değişiklikleri korur. Kakao epikateşin tedavi monomer hücreleri gösterir için kakao epikateşin monomer tedaviden sonra tüm parametreleri içinde artan solunum (E) temsilcisi izleme ve (F) veri türlerini ortalama. (G) tüm üç parametre birlikte karşılaştırma için sunulmaktadır. n 6 bağımsız çalışır =. Ortalama ± SEM sunulan verilerin * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, *** p < 0,0001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : 832/13 beta hücre solunum ölçümleri mekanik ayrışma kullanarak yayımlanmasından sonra. 832/13 beta hücreleri monomeric kakao epikateşin içinde kültürlü ya da curcumin ve solunum den sonra serbest bırakmak hücrelere mekanik ayrışma kullanarak ölçülen. Solunum 2.5 mM glikoz, 16,7 mM glikoz, 2.5 µM altında ölçülen Oligomycin, 2 µM FCCP ve 2.5 µM Antimycin A koşulları. Solunum 2.5 ve 16,7 mM glikoz ile beta hücreleri glikoz tepki göstermektedir. Solunum oligomycin sonra sızıntı solunum (solunum devlet Bazal, nonphosphorylating) gösterir. Solunum FCCP sonra (karbonil siyanür -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) tedavi gösterir (elektron taşıma sistemi, ETS edilişi solunum kapasitesi). Ortalama veri hücreleri(a)tedavi edilmezse hücre veya hücreleri (B) curcumin ile tedavi veya (C) kakao epikateşin monomer göstermek o mekanik ayrışma için tutar glikoz uyarılmış solunum sızıntı sırasında tüm tedaviler içinde ve ETS önemi sadece tedavi curcumin hücrelerinde kayıp mı. Karşılaştırma (D) curcumin veya (E) kakao epikateşin monomer için tedavi edilmezse hücrelerinin tüm parametreleriyle solunum curcumin ile önemli bir değişiklik olmaz kakao epikateşin monomer ile artan solunum gösterir. (F) tüm üç parametre birlikte karşılaştırma için sunulmaktadır. n 6 bağımsız çalışır =. Ortalama ± SEM sunulan verilerin * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,0001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu iletişim kuralının amacı olduğu gibi pankreas beta hücrelerinde solunum oranları ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri kullanmaktır. Bu yöntem beta hücre yanıt olarak artan şekeri ölçüm sağlar. Protokol için de Önarıtma ile çeşitli bileşenleri, bu doğal olarak meydana gelen monomeric epikateşin veya curcumin4,5iletişim kuralıyla gösterildiği gibi sağlar. Bu iletişim kuralı ' (burada görüldüğü gibi) ön veya minimal değişiklikler temel protokolü ile solunum Odaları içinde davranarak çeşitli diğer bileşikler ile tedavi kullanılabilir.

Var çeşitli alışkanlıklar hangi tarafından bu yöntem değiştirilebiliyordu. Diğer beta hücre hatları kullanılabilir; Ancak, cep telefonu numarasını ve SAB yıkama kez deneysel olarak belirlenmesi gerekir. Birincil kemirgen ve insan adacıkları de kullanılabilir; Ancak, hücreleri veya adacık eşdeğerleri sayısını da deneysel olarak belirlenecek gerekir. En az bir çalışmada adacık oksijen tüketimi yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri15kullanarak ölçülen. Bu çalışmada tepki başına 400 adacıkları gerekmez, ancak bağlı glikoz solunum değişiklikleri ölçmek değil. Verilen bu birincil doku yüksek çözünürlüklü respirometers16,17ile sık sık kullanılır, bozulmamış adacıkları deneysel sorun giderme sonra kullanılabilir. Ancak, bu tahlil için gerekli adacıkları çok sayıda göz önüne alındığında, oksijen tüketimi ölçme diğer yöntemler daha iyi birincil adacık solunum ölçümleri için uygun olmayabilir.

Sunulan protokolü ile birkaç önemli adımlar vardır. İlk olarak, hücreleri yeterli sayıda sahip önemlidir. Çalışmalarımız 1 x 106 hücre/mL bir konsantrasyon 832/13 beta hücreleri glikoz uyarılmış solunum ölçümleri için yeterli olduğunu gösteriyor. 0.5 x 10 kullanarak ölçüleri6 hücre/mL düşük glikoz uyarılmış solunum ve düşük sinyal gürültü oranı gösterdi. Ayrıca, yüksek örnek için örnek değişkenliği ve gerekli hangi odası yeniden oksijen ve sık sık hızlı hücre ölümle sonuçlanan oksijen hızlı hücresel kullanımı 2 x 106 hücre/mL kullanarak ölçüleri sonuçlandı. Hücreler uygun sayıda deneysel olarak belli bir hücre satırı için bu kritik adımı gidermek için tespit edilmelidir.

İkinci önemli adım beta hücreleri yüksek glikoz düzeyleri için yanıt vermek için hazırlanıyor. RPMI 1640 kültür medya yüksek glikoz seviyesi vardır. Hücreleri yüksek glikoz düşük glikoz kültür taşınması gerekir. 1 x 3 h kuluçka düşük glikoz SAB ~16.7 mM glikoz ilavesi önemli etkileniriz beta hücreleri için yeterlidir. 3 h sonuç daha az bir süre glikoz ilavesi için değişken yanıt yıkayın. Glikoz yanıt sorunlarını giderme SAB yıkama süresini artırarak saptanabilir.

Üçüncü önemli bir adım hücrelerin ölçümleri için hazırlanması için yöntemidir. Bizim veri tripsin ve mekanik ayrışma her ikisi de kullanılabilir, tripsin hücreleri sonuç daha tutarlı okuma ve daha az örnek örnek değişkenlik yayımladı olduğunu gösterir. Her iki yöntem ile gözlenen trend devam, ancak veri gücünü tripsin kullanılarak hazırlanan hücrelerle büyük edildi. Hücre kazıma gibi diğer yöntemler kullanılabilir ise bizim verileri tripsin kullanımı ile daha az örnek örnek değişkenlik18,19en tekrarlanabilir sonuçlar neden olacaktır göstermektedir.

Bu yaklaşım sınırlamaları şunlardır. İlk olarak, sadece iki tedavi odaları ile bu yöntem eleme yüksek üretilen iş değil. Her iki örnek çalışması makineyi hazırlamak için zaman da dahil olmak üzere 3-4 saat arasında sürer. İkinci olarak, hücre nispeten büyük bir konsantrasyon ~2.2 mL odası gerekli örnek (ve ~2.2 x 106 hücreler) verilen tahlil için gereklidir. Örnek tahlil için gerekli miktarı nedeniyle, büyük bir kaynağı kullanılamıyorsa, bu aracı ve iletişim kuralı kullanılması için birincil adacıkları sınırlıdır. Adacıkları solunum Bu teknikte kullanılan önceki çalışmalarda ~ 400 adacıkları/odası15kullanılır. Bu, kabaca, adacıkları her iki fare üzerinden20odası gerektirir. Üçüncü permeabilized hücreleri kullanılan değil çünkü yetenek cep geçirgen olmayan bileşikler kullanarak tek tek elektron zinciri bileşenleri tedavinin etkisini belirlemek için kullanılamaz.

Bu protokol varolan yöntemleri ile ilgili olarak önemli avantajlar vardır. Birincisi, bu iletişim kuralı için bileşiklerin çeşitli membran geçirgen titrasyon kademeli sağlar. Bu izin gerekli konsantrasyonları doğru belirlenmesi için. İkinci olarak, bozulmamış beta hücreleri kullanımı sitozolik ve mitokondrial glikoz metabolizması7etkisi sorgulamak için bize izin verir. Bu fenotipleri glycolytic yolu, permeabilized hücreleri kullanırken kaybolur bir gözlem yapılan değişiklikler göstergesidir gözlemlemek için bize sağlar. Üçüncü olarak, sağlam hücreleri bize bu tahlil permeabilized türevleri kaybolur beta hücre fonksiyonu, ölçülü olarak yanıt-e doğru yüksek glikoz kullanmasına izin verir. Son olarak, bu iletişim kuralını beta hücre solunum, solunum ölçmek diğer araçları ile mevcut değil bir lüks bileşiklerin etkisi sorgulamak için çeşitli ve birden çok bileşikleri eklenmesi için sağlar.

Bu yöntemin gelecekte uygulamaları ATP, kalsiyum ve H2O2 düzeyleri solunum ölçümleri ile eşzamanlı gibi parametreleri ölçmek için içerir. Bu yöntem aynı zamanda solunum yağ asitleri veya ketonlar gibi diğer yakıt kaynakları huzurunda ölçüm sağlar. Son olarak, bazı değişiklikler ile ölçüm salgılanan insülin düzeyleri solunum ölçümleri ile eşlik eden de mümkün olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Yardımcısı ve bilimsel tartışma Tessem ve Hancock Labs'in üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar Andrew Neilson, doktora (Virginia Tech) kakao türetilmiş epikateşin monomer kesir verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu çalışmada JST için bir hibe-diyabet eylem araştırma ve Eğitim Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O2k Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 Instrument for high-resolution respirometry
DatLab 6 Program Oroboros Instruments 27141-01 Computer program for analysing high-reolution respirometry
INS-1 832/13 cell line Duke University Medical Center NONE Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard
Curcumin Sigma C7727 Pre-treatment of beta cells
Cocoa epicatechin monomer Virginia Polytechnic Institute and State University NONE Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson
Trypsin Sigma T4049 For cell culture
RPMI-1640 Sigma R8758 832/13 beta cell media
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 832/13 beta cell media component
Penicillin-streptomycin Sigma P4458 832/13 beta cell media component
HEPES Sigma H3662 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer
Glutamine Caisson GLL01 832/13 beta cell media component
Sodium Pyruvate Sigma S8636 832/13 beta cell media component
2-Mercaptoethanol Sigma M3148 832/13 beta cell media component
NaCl Fisher S271 Component of 10x SAB buffer
KCl Sigma P9541 Component of 10x SAB buffer
KH2PO4 Sigma P5655 Component of 10x SAB buffer
MgSO4 Sigma M2643 Component of 10x SAB buffer
D-(+)-Glucose Solution Sigma G8769 Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay
CaCl2 Sigma C5670 Component of 1x SAB buffer
35% BSA Solution Sigma A7979 Component of 1x SAB buffer
NaHCO3 Sigma S5761 Component of 1x SAB buffer
200 proof ethanol Sigma 459844 Washing Oxygraph O2k Chambers
Oligomycin A Sigma O4876 Chemicals for respiration assay
FCCP Sigma C2920 Chemicals for respiration assay
Anitmycin A Sigma A8674 Chemicals for respiration assay
BCA Protein Kit Thermo Fisher 23225 For determining protein concentration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mueckler, M., Thorens, B. The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  3. Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).
  4. Strat, K. M., et al. Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders. J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).
  5. Rowley, T. J. T., et al. Monomeric cocoa catechins enhance β-cell function by increasing mitochondrial respiration. J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).
  6. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells. J Vis Exp. (120), (2017).
  7. Reynolds, M. S., et al. beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).
  8. Hals, I. K., et al. Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia. PLoS One. 10 (9), e0138558 (2015).
  9. Ray, J. D., et al. Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos. FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).
  10. Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
  11. Tessem, J. S., et al. Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).
  12. Hobson, A., et al. Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway. Islets. 7 (1), e1027854 (2015).
  13. Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation. J Diabetes Res. 2016, 6375804 (2016).
  14. Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity. J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).
  15. Ma, Z., et al. Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction. Islets. 4 (3), 233-242 (2012).
  16. Chavanelle, V., et al. Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice. Sci Rep. 7 (1), 204 (2017).
  17. Jelenik, T., et al. Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver. Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).
  18. Spacek, T., et al. Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential. Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).
  19. Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells. Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).
  20. Johnson, J. D., et al. Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets. Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).

Tags

Hücresel biyoloji sayı: 131 Beta hücre mitokondri solunum glikoz yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri kakao epikateşin monomer curcumin
Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kener, K. B., Munk, D. J., Hancock,… More

Kener, K. B., Munk, D. J., Hancock, C. R., Tessem, J. S. High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds. J. Vis. Exp. (131), e57053, doi:10.3791/57053 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter