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उच्च संकल्प Respirometry प्राकृतिक यौगिकों की उपस्थिति में बरकरार बीटा कोशिकाओं के Mitochondrial समारोह को मापने के लिए

Published: January 23, 2018 doi: 10.3791/57053
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Nutrition, Dietetics and Food Science Department, Brigham Young University

Summary

उच्च संकल्प respirometry का उपयोग कर बरकरार 832/13 बीटा कोशिकाओं पर प्राकृतिक यौगिकों की उपस्थिति में mitochondrial श्वसन के लिए ग्लूकोज मध्यस्थता परिवर्तन के प्रभाव को मापने के लिए इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है.

Abstract

उच्च संकल्प respirometry अलग mitochondria, कोशिकाओं और ऊतकों की ऑक्सीजन की खपत की माप के लिए अनुमति देता है । बीटा कोशिकाओं को उन्नत ग्लूकोज सांद्रता के जवाब में इंसुलिन स्राव के माध्यम से रक्त शर्करा के स्तर को नियंत्रित करने से शरीर में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. इंसुलिन स्राव ग्लूकोज चयापचय और mitochondrial श्वसन द्वारा नियंत्रित किया जाता है । इसलिए, बरकरार बीटा सेल श्वसन को मापने के लिए मधुमेह के लिए एक इलाज के रूप में बीटा सेल समारोह में सुधार करने में सक्षम होना आवश्यक है । बरकरार 832/13 INS-1 व्युत्पंन बीटा कोशिकाओं का उपयोग हम सेलुलर श्वसन पर ग्लूकोज एकाग्रता में वृद्धि के प्रभाव को मापने कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल हमें उपस्थिति या विभिंन यौगिकों की अनुपस्थिति में बीटा सेल श्वसन उपाय करने के लिए, एक बरकरार सेल श्वसन पर दिया यौगिकों के प्रभाव का निर्धारण करने की अनुमति देता है । यहाँ हम दो स्वाभाविक रूप से होने वाली यौगिकों के प्रभाव का प्रदर्शन, monomeric epicatechin और curcumin, कम (२.५ मिमी) या उच्च ग्लूकोज (१६.७ मिमी) की स्थिति की उपस्थिति के तहत बीटा सेल श्वसन पर. इस तकनीक को अलग ग्लूकोज सांद्रता की उपस्थिति में बरकरार बीटा सेल श्वसन पर विभिन्न यौगिकों के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

अग्नाशय के बीटा कोशिका के प्राथमिक उद्देश्य ग्लूकोज प्रेरित इंसुलिन स्राव के माध्यम से प्रणाली normoglycemia बनाए रखने के लिए है. बीटा कोशिकाओं को काफी हद तक कम अपनत्व, उच्च क्षमता ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर GLUT2 (ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 2, कश्मीरएम १६.७ मिमी)1के कारण परिचालित ग्लूकोज में शारीरिक परिवर्तन भावना. के रूप में संचार ग्लूकोज का स्तर वृद्धि, इस उच्च क्षमता कम आत्मीयता ट्रांसपोर्टर बीटा सेल के भीतर intracellular ग्लूकोज में एक आनुपातिक वृद्धि की सुविधा. ग्लूकोज glycogen के माध्यम से metabolized है, टीसीए चक्र (tricarboxylic एसिड चक्र) और mitochondrial श्वसन ऊंचा सेलुलर एटीपी (adenosine ट्राइफॉस्फेट) के स्तर में जिसके परिणामस्वरूप. ऊंचा एटीपी एकाग्रता ब्लॉक एटीपी संवेदनशील कश्मीर+ चैनलों, झिल्ली ध्रुवीकरण में जिसके परिणामस्वरूप. झिल्ली ध्रुवीकरण वोल्टेज gated Ca के उद्घाटन का कारण बनता है2 + चैनलों और पुटिका बाध्य इंसुलिन granules के बाद रिलीज2. बीटा कोशिका शिथिलता प्रकार की एक बानगी है 2 मधुमेह (T2D), और परिणाम में कमी आई और खराब नियंत्रित इंसुलिन स्राव और अंततः बीटा सेल मौत3. तंत्र है कि बनाए रखने या बीटा सेल समारोह में सुधार T2D के लिए एक इलाज के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

अध्ययनों से अग्नाशय बीटा सेल4पर स्वाभाविक रूप से होने वाले संयंत्र आधारित यौगिकों के लाभकारी प्रभाव का प्रदर्शन किया है । इन यौगिकों बढ़ती बीटा कोशिका प्रसार, अस्तित्व, या ग्लूकोज प्रेरित इंसुलिन स्राव के माध्यम से अपने प्रभाव हो सकता है. एक उदाहरण के रूप में, हाल के अध्ययनों से प्रदर्शन किया है कि monomeric epicatechin बढ़ती mitochondrial श्वसन के माध्यम से ग्लूकोज प्रेरित इंसुलिन स्राव को बढ़ाता है और सेलुलर एटीपी स्तर में वृद्धि5. इसलिए, समझ कैसे इन यौगिकों कार्यात्मक बीटा सेल बड़े पैमाने पर वृद्धि कर सकते है इन यौगिकों संभावित चिकित्सकीय के रूप में लाभ उठाने के लिए महत्वपूर्ण है ।

सेलुलर श्वसन उपकरणों की एक संख्या के माध्यम से मापा जा सकता है । एक उच्च संकल्प आत्मशोधन का उपयोग एक permeabilized या बरकरार सेल जनसंख्या6के लिए रासायनिक संग्राहक के अनुमापन के लिए अनुमति देता है । इस उपकरण विभिंन यौगिकों के अलावा, विभिंन सांद्रता पर अनुमति देता है, इस प्रकार जानकारी की एक विस्तृत सरणी दे रही है ।

ग्लूकोज चयापचय और बीटा सेल समारोह के बीच अंतरंग संबंध को देखते हुए, सेलुलर श्वसन की माप महत्वपूर्ण हैं. सेलुलर श्वसन की माप या तो permeabilized या बरकरार बीटा कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है, लाभ और कमियां7,8के अपने स्वयं के सेट होने के साथ । जबकि बीटा कोशिकाओं के permeabilization एक इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के विभिन्न पहलुओं को मापने के लिए अनुमति देता है, यह ऐसा करता है के बिना बीटा कोशिका, ग्लूकोज और चयापचय में श्वसन उत्प्रेरण के लिए तंत्र का संबंध है. इसलिए, unpermeabilized बीटा सेल श्वसन का उपयोग एक बहुत ही उपयोगी तकनीक को विभिंन ग्लूकोज के स्तर के लिए बीटा कोशिकाओं की प्रतिक्रिया का निर्धारण, readout के रूप में ऑक्सीजन की खपत का उपयोग कर रहा है ।

इस तकनीक का उद्देश्य बरकरार INS-1 व्युत्पंन 832/13 बीटा कोशिकाओं में ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए है । यह तकनीक हमें ग्लूकोज की स्थिति (२.५ mm ग्लूकोज) के साथ ही stimulatory ग्लूकोज की स्थिति (१६.७ mm ग्लूकोज) unstimulatory करने के लिए बीटा कोशिकाओं की प्रतिक्रिया निर्धारित करने की अनुमति देता है । जबकि unpermeabilized कोशिकाओं को व्यक्तिगत रूप से जटिल मैं, द्वितीय या इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के III परीक्षण करने की अनुमति नहीं है, तकनीक जटिल चतुर्थ निषेध के साथ काम माप की अनुमति करता है (Oligomycin एक), कुछ श्वसन (FCCP-Carbonyl साइनाइड- 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone), और पूरी तरह से बाधित श्वसन (Antimycin A) । यह अध्ययन बरकरार unpermeabilized अग्नाशय बीटा कोशिकाओं में श्वसन को मापने की प्रभावकारिता को दर्शाता है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दो स्वाभाविक रूप से होने वाली यौगिकों के प्रभाव, monomeric epicatechin और curcumin, बीटा सेल श्वसन पर.

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Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. संस्कृति INS-1 व्युत्पंन 832/13 बीटा कोशिकाओं RPMI १६४० में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक, 1% पेनिसिलिन-streptomycin, 10 मिमी HEPES, 2 मिमी Glutamine, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, और ०.०५ मिमी 2-mercaptoethanol9,10,11 ,12,13.
  2. एक T75 कुप्पी से 832/13 कोशिकाओं को निकालें ०.२५% trypsin के 2 मिलीलीटर का उपयोग कर, 10 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीनिंग trypsin को पूरा RPMI १६४० मीडिया के 8 मिलीलीटर जोड़कर बेअसर ।
  3. एक hemocytometer का उपयोग करते हुए कक्षों की गणना करें और १०० µ l को सेल वॉल्यूम के चरण १.२ में से ९०० µ में
  4. प्लेट 832/13 कोशिकाओं के घनत्व पर एक 6 अच्छी डिश में 2 x 106 कोशिकाओं/
  5. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified मशीन में ४८ ज के लिए संस्कृति कोशिकाओं और 5% सह श्वसन प्रयोगों की शुरुआत से पहले2 .

2. उच्च संकल्प Respirometry के लिए कोशिकाओं की तैयारी

  1. कोको के साथ 832/13 कोशिकाओं का इलाज epicatechin मोनोमर व्युत्पंन ।
    1. संस्कृति 832/13 कोशिकाओं के लिए 24 ज ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified मशीन में चढ़ाना के बाद और 5% सह2।
    2. परिवर्तन मीडिया 24 ज चढ़ाना के बाद, और वाहन नियंत्रण (3 कुओं) या १०० एनएम कोको मोनोमर (3 कुओं) के साथ 832/13 कोशिकाओं का इलाज, एक अतिरिक्त 24 एच के लिए संस्कृति के बाद (४८ एच कुल) ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified मशीन में और 5% सह2।
    3. धो 832/13 सेल में 1x कम ग्लूकोज स्राव परख (सब) 5 min. महाप्राण बफर के लिए, और 3 ज के लिए 1x कम ग्लूकोज सब में 832/13 कोशिकाओं की मशीन, 1x कम ग्लूकोज सब हर घंटे बदल रहा है ।
      1. ३३.३२ जी के NaCl के साथ 10x सब बनाओ, १.७३ जी के KCl, ०.८२ ग्राम के KH2पीओ4, MgSO4 के ०.७ ग्राम और जोड़ें एच2ओ के एक अंतिम मात्रा के लिए ५०० मिलीलीटर. अंतिम समाधान बाँझ फ़िल्टर ।
      2. 10x सब के 10 मिलीलीटर के साथ 1x कम ग्लूकोज सब बनाओ, १०० µ l की ४५% ग्लूकोज, 2 मिलीलीटर की 1 मीटर HEPES, 1 मिलीलीटर की 0.25 मीटर CaCl2, ०.५७ मिलीलीटर की ३५% BSA सॉल्यूशन, ०.२१ जी की NaHCO3 और जोड़ो एच2ओ को अंतिम मात्रा में १०० मि. ग्रा. अंतिम समाधान बाँझ फ़िल्टर ।
  2. curcumin के साथ 832/13 कोशिकाओं का इलाज.
    1. संस्कृति 832/13 ४८ एच के लिए कोशिकाओं को एक humidified मशीन में चढ़ाना के बाद ३७ ° c और 5% CO2।
    2. 5 min. महाप्राण बफर के लिए 1x कम ग्लूकोज सब में 832/13 कोशिकाओं धो, और 3 एच के लिए 1x कम ग्लूकोज सब में 832/13 कोशिकाओं की मशीन, 1x कम ग्लूकोज सब हर घंटे बदल रहा है ।
    3. के बाद २.५ 1x कम ग्लूकोज सब में 3 एच की मशीन के एच, महाप्राण बफर और वाहन नियंत्रण या ४० µ मीटर curcumin के साथ 1x कम ग्लूकोज सब में कोशिकाओं की गर्मी 30 मिनट के लिए । निंनलिखित मशीन, महाप्राण बफर ।
  3. उच्च संकल्प respirometry के लिए trypsin के साथ कटाई कोशिकाओं
    1. 1x कम ग्लूकोज सब में 3 एच की मशीन के बाद, प्लेट से २५० µ एल के साथ कोशिकाओं को दूर ०.२५% trypsin के प्रति अच्छी तरह से ।
    2. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सब के 4 मिलीलीटर के साथ वाहन नियंत्रण या ब्याज की यौगिक के साथ इलाज 3 कुओं से trypsin में कोशिकाओं का मिश्रण ।
    3. एक hemocytometer का उपयोग करते हुए कक्षों की गणना करें और १०० µ l को सेल वॉल्यूम के चरण 2.3.2 से ९०० µ में
    4. प्रत्येक कक्ष के लिए उपयुक्त एकाग्रता पर 3 मिलीलीटर बनाने के लिए 1x कम ग्लूकोज सब में कोशिकाओं की उचित संख्या को पतला । डेटा दर्शाता है कि 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता सबसे प्रभावी है ।
  4. उच्च संकल्प respirometry के लिए यांत्रिक पृथक्करण के साथ कटाई कोशिकाओं
    1. 1x कम ग्लूकोज सब में 3 एच की मशीन के बाद, एक अच्छी तरह से और एक १००० µ l पिपेट टिप के साथ pipetting द्वारा यांत्रिक पृथक्करण के साथ प्लेट से धीरे उड़ा सेल के लिए 1x कम ग्लूकोज सब के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. श्वसन के लिए एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 3 मिलीलीटर सब में से एक कुल में वाहन नियंत्रण या ब्याज के यौगिक के साथ इलाज 3 कुओं से कोशिकाओं का मिश्रण ।

3. उच्च संकल्प Respirometry

  1. उच्च संकल्प आत्मशोधन की तैयारी ।
    1. उच्च-रिज़ॉल्यूशन आत्मशोधन चालू करें और आत्मशोधन विश्लेषण प्रोग्राम को लॉंच करके डेस्कटॉप से कनेक्ट करें ।
    2. महाप्राण ७०% दोनों मंडलों से इथेनॉल । ४५ मिनट की एक ंयूनतम के लिए ७०% इथेनॉल में इन कक्षों सोख ।
    3. एक कदम के बाद ७०% इथेनॉल, aspirating के साथ दो बार मंडलों धो लो ।
    4. प्रत्येक चरण के बाद चैम्बर्स को ddH2O, aspirating के साथ तीन बार धोएं ।
    5. ddH2ओ में चैंबर plungers कुल्ला । यह plungers से अवशिष्ट इथेनॉल से साफ और टाइटेनियम बंदरगाह से ।
  2. polarographic ऑक्सीजन सेंसर का अंशांकन ।
    1. प्रत्येक oxygraph कक्ष के लिए २.४ है 1x कम ग्लूकोज सब बफर की मिलीलीटर जोड़ें, बफर लगातार सरगर्मी में कक्ष में ७५० rpm और ३७ ° c पर एक डेटा के साथ-रिकॉर्डिंग अंतराल के साथ उपयोग करके २.० s पर F7 बटन धक्का और "सिस्टम" लेबल टैब खोलने । में सभी तरह plungers पुश, और फिर रिंच वातन सेटिंग के लिए वापस लेना । मशीन को 1 घंटे की एक ंयूनतम के लिए equilibrate जब तक स्थिर ऑक्सीजन फ्लक्स प्राप्त की है चलो ।
    2. प्रयोग की अवधि के लिए मशीन को ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेट करें । सेट ध्रुवीकरण वोल्टेज ८०० एमवी के लिए, F7 बटन धक्का और टैब खोलने "ऑक्सीजन, ओ2" द्वारा 2 का लाभ के साथ । Equilibrate में ऑक्सीजन एकाग्रता में परिवर्तन स्थिर है (कम से कम 30 मिनट के लिए सब बफर की ऑक्सीजन एकाग्रता,) (एस * एमएल)) ।
    3. ऑक्सीजन एकाग्रता स्थिरीकरण के बाद, एक क्षेत्र है जहाँ ऑक्सीजन एकाग्रता के परिवर्तन ऑक्सीजन एकाग्रता में परिवर्तन की पृष्ठभूमि माप स्थापित करने के लिए स्थिर है का चयन करें ।
      1. shift कुंजी को धकेल कर, माउस पर क्लिक करके और चयनित क्षेत्र में माउस को खींचकर किसी क्षेत्र का चयन करें । चयनित क्षेत्र के साथ जुड़े पत्र पर क्लिक करें और प्रत्येक ट्रेस, दो कक्षों में से प्रत्येक के साथ संगत के लिए "R1" के लिए बदल जाते हैं ।
      2. स्क्रीन के नीचे बाएँ और दाएँ कोनों में "ओ2 अंशांकन" बॉक्स पर डबल क्लिक करें, R1 के रूप में "एयर अंशांकन" के लिए "का चयन करें मार्क" बटन पर क्लिक करें और फिर दोनों मंडलों के लिए "जांचना और क्लिपबोर्ड करने के लिए कॉपी" चुनें ।
  3. चरणों में तैयार 832/13 बीटा कोशिकाओं के श्वसन का मूल्यांकन 2.1.5 या 2.2.5.
    1. प्रत्येक कक्ष में नमूना के २.४ मिलीलीटर लोड (नियंत्रण वाहन कोशिकाओं के साथ एक कक्ष, यौगिक इलाज कोशिकाओं के साथ एक कक्ष) 1x कम ग्लूकोज सब में । बीसीए (Bicinchoninic एसिड) परख द्वारा प्रोटीन quantitation के लिए सेल के नमूने के ०.५ मिलीलीटर बरकरार रखें यदि यांत्रिक पृथक्करण दृष्टिकोण का उपयोग (पर फ्रीज-20 ° c बाद में माप के लिए) ।
      1. सभी तरह से सवार पुश और अवशिष्ट मात्रा महाप्राण । सभी क्रमिक चरणों के लिए ७५० rpm और ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्रयोग के दौरान लगातार कोशिकाओं हलचल । जब नमूने लोड किए गए हों, तो F4 और "कक्ष" के रूप में लेबल क्लिक करके कोई चिह्न बनाएं ।
      2. 30 मिनट के लिए नमूनों को मापने । संकेत स्थिरीकरण के बाद, 3.2.3 में वर्णित के रूप में कम ग्लूकोज की स्थिति (२.५ mM ग्लूकोज) के लिए इसी ऑक्सीजन एकाग्रता में परिवर्तन के एक क्षेत्र का चयन करें ।
    2. सिग्नल स्थिरीकरण के बाद, एक सिरिंज का उपयोग कर टाइटेनियम लोडिंग बंदरगाह के माध्यम से प्रत्येक कक्ष में एक ४५% बाँझ ग्लूकोज समाधान (१६.७ mM अंतिम एकाग्रता) के १२.५ µ एल में पहुंच गया है । एक "ग्लूकोज" जब उपचार जोड़ा जाता है 3.3.1 में वर्णित के रूप में मापा निशान बनाओ । संकेत स्थिर और एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह प्राप्त होता है जब तक सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड करते हैं । ऑक्सीजन एकाग्रता में परिवर्तन के इस क्षेत्र का चयन करें, के रूप में 3.2.3 में वर्णित है । यह १६.७ mM ग्लूकोज पढ़ने है, और stimulatory शर्तों के साथ संगत7।
    3. संकेत स्थिरीकरण के बाद 5 मिमी oligomycin एक (२.५ µ मीटर अंतिम एकाग्रता) के 1 µ एल जोड़ने के लिए लोड हो रहा है बंदरगाह के माध्यम से प्रत्येक कक्ष में पहुंच गया है । "OligoA" जब उपचार जोड़ा जाता है 3.3.1 में वर्णित के रूप में एक मार्क मापा बनाओ । संकेत स्थिर और एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह प्राप्त होता है जब तक सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड करते हैं । 3.2.3 में बताए गए अनुसार वक्र के इस क्षेत्र का चयन करें । Oligomycin एक को रोकता है एटीपी सिंथेस और इस प्रकार केवल ऑक्सीजन प्रवाह होने वाले इलेक्ट्रॉनों के रिसाव के माध्यम से है और नहीं oxidative फास्फारिलीकरण7।
    4. संकेत स्थिरीकरण के बाद एक अधिकतम श्वसन दर स्थापित किया जाता है जब तक 1 µ एल वृद्धि में 1 मिमी FCCP जोड़ने तक पहुँच गया है. यह अधिक से अधिक जोड़े श्वसन का प्रतिनिधित्व करता है । 3-4 µ एल FCCP के बीच पर्याप्त है (1.5-2.0 µ एम अंतिम एकाग्रता) के लिए भारतीय नौसेना पोत-1 832/13 कोशिकाओं के अधिक से अधिक जोड़े श्वसन प्रेरित । "FCCP" जब उपचार जोड़ा जाता है 3.3.1 में वर्णित के रूप में लेबल एक निशान बनाओ । संकेत स्थिर और एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह प्राप्त होता है जब तक सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड करते हैं । 3.2.3 में बताए गए अनुसार वक्र के इस क्षेत्र का चयन करें । FCCP एक unयुग्मन एजेंट है । यह हमें दो संवेदनाएं7को मापने के लिए अनुमति देता है ।
    5. संकेत स्थिरीकरण के बाद 5 मिमी Antimycin एक (२.५ µ मीटर अंतिम एकाग्रता) के 1 µ एल जोड़ने के लिए लोड हो रहा है बंदरगाह के माध्यम से प्रत्येक कक्ष में पहुंच गया है । "अंटिया" जब उपचार जोड़ा जाता है 3.3.1 में वर्णित के रूप में लेबल एक निशान बनाओ । संकेत स्थिर और एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह प्राप्त होता है जब तक सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड करते हैं । 3.2.3 में बताए गए अनुसार वक्र के इस क्षेत्र का चयन करें ।
      नोट: Antimycin एक बांध cytochrome सी रिडक्टेस, ubiquinone ऑक्सीकरण रोकता है, और सभी श्वसन ब्लॉकों । यह हमें पूरी तरह से श्वसन7बंद करने के लिए अनुमति देता है ।
  4. प्रोटीन एकाग्रता और श्वसन सामान्यीकरण के लिए 832/13 बीटा कोशिकाओं को मापने.
    1. ०.५ एमएल का उपयोग कर लोड पर बनाए रखा, उपाय प्रोटीन नमूना बीसीए विधि13का उपयोग कर ।
    2. तपसिल में प्रत्येक नमूना, कमजोर पड़ने के बिना, निर्माता के निर्देशों का पालन चलाते हैं ।
  5. trypsinized कक्षों से 832/13 बीटा कक्ष श्वसन परिकलन।
    1. आत्मशोधन विश्लेषण कार्यक्रम के F3 बटन धक्का द्वारा परख में मिलीलीटर उपयोग प्रति कोशिकाओं की संख्या दर्ज करें । इकाइयों को बदलने के लिए कोशिकाओं/एमएल, सेलुलर एकाग्रता दर्ज करें, और सब के माध्यम बदलने के लिए ।
    2. 3.2.3 में वर्णित के अनुसार O2 अंशांकन प्रपत्र में चयन करके और दर्ज करके डेटा को सामान्य करने के लिए पृष्ठभूमि रीडिंग का चयन करें ।
    3. २.५ mm ग्लूकोज, १६.७ mm ग्लूकोज, Oligomycin ए, FCCP और Antimycin एक के रूप में 3.3.1 में वर्णित से रीडिंग का चयन करें ।
    4. आत्मशोधन विश्लेषण कार्यक्रम के भीतर, प्रोटीन एकाग्रता में प्रवेश करने और श्वसन मापन के दौरान प्रत्येक उपचार के लिए उपयुक्त औसत मूल्यों का चयन करने के बाद प्रत्येक चैंबर के लिए रीडिंग निर्यात. यह F2 क्लिक करके किया जाता है और फिर "क्लिपबोर्ड समारोह में कॉपी" धक्का । यह अंय विश्लेषण प्रोग्रांस में उपयोग के लिए डेटा निर्यात करता है । परिकलनों के लिए "O2 ढलान नेग." मान का उपयोग करें ।
    5. 3-5 के लिए डेटा संकलित करें वाहन के स्वतंत्र रन इलाज नियंत्रण और प्राकृतिक यौगिकों कोशिकाओं का इलाज के लिए भारतीय नौसेना पोत-1 832/13 बीटा कोशिकाओं के बरकरार सेलुलर श्वसन पर प्रभाव का निर्धारण ।
  6. यांत्रिक रूप से असंबद्ध कक्षों से 832/13 बीटा कक्ष श्वसन परिकलन।
    1. आत्मशोधन विश्लेषण कार्यक्रम के F3 बटन धक्का द्वारा बीसीए परख से प्रोटीन गणना दर्ज करें । इकाइयों को एमजी में बदलें, बीसीए एकाग्रता दर्ज करें, और सब के माध्यम से बदल जाते हैं ।
    2. 3.2.3 में वर्णित के अनुसार O2 अंशांकन प्रपत्र में चयन करके और दर्ज करके डेटा को सामान्य करने के लिए पृष्ठभूमि रीडिंग का चयन करें ।
    3. २.५ mm ग्लूकोज, १६.७ mm ग्लूकोज, Oligomycin ए, FCCP और Antimycin एक के रूप में 3.3.1 में वर्णित से रीडिंग का चयन करें ।
    4. आत्मशोधन विश्लेषण कार्यक्रम के भीतर, प्रोटीन एकाग्रता में प्रवेश करने और श्वसन मापन के दौरान प्रत्येक उपचार के लिए उपयुक्त औसत मूल्यों का चयन करने के बाद प्रत्येक चैंबर के लिए रीडिंग निर्यात. यह F2 क्लिक करके किया जाता है और फिर "क्लिपबोर्ड समारोह में कॉपी" धक्का । यह अंय विश्लेषण प्रोग्रांस में उपयोग के लिए डेटा निर्यात करता है । परिकलनों के लिए "O2 ढलान नेग." मान का उपयोग करें ।
    5. 3-5 के लिए डेटा संकलित करें वाहन के स्वतंत्र रन इलाज नियंत्रण और प्राकृतिक यौगिकों कोशिकाओं का इलाज के लिए भारतीय नौसेना पोत-1 832/13 बीटा कोशिकाओं के बरकरार सेलुलर श्वसन पर प्रभाव का निर्धारण ।

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Representative Results

इन-1 832/13 बीटा कोशिकाओं है कि तैयार है और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में काटा जाता है विभिंन रासायनिक हस्तक्षेप (चित्र1a) के आधार पर ऑक्सीजन की खपत में मॉडुलन प्रदर्शित करेगा । जब ग्लूकोज एकाग्रता १६.७ mM ग्लूकोज (आंकड़ा 1b) को बढ़ा दिया है श्वसन में वृद्धि मनाया जाएगा । Oligomycin के साथ बरकरार कोशिकाओं का इलाज कर रहे हैं जब श्वसन कम हो जाएगा. यह श्वसन रिसाव, जो बेसल, nonphosphorylating श्वसन राज्य के रूप में परिभाषित किया गया है के रूप में जाना जाता है । बीटा कोशिकाओं unयुग्मन एजेंट FCCP, जो ETS श्वसन, या इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली श्वसन के रूप में परिभाषित किया गया है के साथ इलाज कर रहे हैं जब अधिक से अधिक श्वसन प्राप्त होगा । अंत में, श्वसन शूंय को छोड़ जब Antimycin एक, ROX (अवशिष्ट ऑक्सीजन खपत) जो गैर श्वसन सेलुलर ऑक्सीजन की खपत को संदर्भित करता है के रूप में लेबल के साथ इलाज किया जाएगा ।

सेल संख्या में अंतर काफी इस तकनीक से प्राप्त डेटा की गुणवत्ता में परिवर्तन होगा । ग्लूकोज प्रेरित श्वसन ०.५, 1, और 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल (चित्रा 2a-2c) में मापा गया था । सेल की गिनती और बीसीए प्रोटीन परख का उपयोग, प्रोटीन तीन परीक्षण सेल सांद्रता के अनुरूप सांद्रता (चित्रा 2d) की गणना की गई । ०.५ x 106 कोशिकाओं/एमएल का उपयोग माप ग्लूकोज उत्तेजित श्वसन (चित्रा 2a) प्रदर्शित करने में विफल रहा है, और केवल ETS जुड़े बढ़ी श्वसन महत्वपूर्ण होना दिखाया गया था । यह पता चलता है कि कम सेल संख्या शोर अनुपात है कि परिणाम के लिए एक कम संकेत में परिणाम है । इसी प्रकार, माप में 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल भी महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता के परिणामस्वरूप, सांख्यिकीय महत्व केवल ETS माप (चित्रा 2c) के लिए पहुँचा जा रहा द्वारा संकेत के रूप में. यह संभवतः के लिए फिर से की जरूरत के कारण है चैंबर्स कई बार परख, जो नमूना से अधिक से अधिक परिवर्तनशीलता के परिणामस्वरूप के दौरान नमूना आक्सीजन । इन आंकड़ों का प्रदर्शन है कि सांद्रता 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल महत्वपूर्ण ग्लूकोज-उत्तेजित श्वसन, रिसाव और ETS माप है, जो श्वसन विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं (चित्रा बी और 2E) में परिणाम ।

श्वसन के लिए कोशिकाओं को हटाने के लिए दो तरीकों इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत कर रहे हैं । trypsin का प्रयोग कोशिकाओं को हटाने के लिए प्रभावी है जब माप ३७ डिग्री सेल्सियस पर पूरा कर रहे हैं । श्वसन curcumin के अभाव या उपस्थिति में किया माप (3ए) ग्लूकोज उत्तेजित श्वसन, रिसाव और ETS श्वसन के रखरखाव को दर्शाता है. अनुपचारित कोशिकाओं को curcumin इलाज कोशिकाओं की तुलना इन श्वसन मापदंडों में से किसी के लिए कोई परिवर्तन नहीं दर्शाता है (चित्र बी-सी). श्वसन अभाव या कोको epicatechin मोनोमर की उपस्थिति में किया माप (चित्रा 3 डी) भी ग्लूकोज उत्तेजित श्वसन, रिसाव और ETS श्वसन के रखरखाव को दर्शाता है. कोको की तुलना epicatechin मोनोमर इलाज कोशिकाओं को अनुपचारित कोशिकाओं को प्रदर्शित करता है २.५ mm और १६.७ mm ग्लूकोज, साथ ही रिसाव और ETS श्वसन (चित्रा 3E-F) में वृद्धि की संवेदनाएं । इन आंकड़ों का प्रदर्शन है कि जबकि curcumin 832/13 बीटा सेल श्वसन में वृद्धि नहीं करता है, कोको epicatechin मोनोमर करता है (चित्रा 3 जी) । Curcumin को बाधा phosphodiesterase गतिविधि के माध्यम से इंसुलिन स्राव को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है14. हमारे डेटा curcumin mitochondrial समारोह संग्राहक के माध्यम से इंसुलिन स्राव में वृद्धि नहीं करता है कि सुझाव देते हैं. हम पहले से ही कोको epicatechin मोनोमर की उपस्थिति में है कि संस्कृति का प्रदर्शन किया है mitochondrial इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला5के विभिंन घटकों की अभिव्यक्ति लाती है । हम भी रिसाव राज्य में वृद्धि की संवेदनाएं मनाया (oligomycin के साथ उपचार द्वारा प्रेरित) और ETS के साथ (इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली, FCCP द्वारा प्रेरित) । इस उपकरण का उपयोग भविष्य के अध्ययन के लिए संभावित लक्ष्यों की एक संख्या से पता चलता है ।

trypsin हटाने के लिए एक विकल्प के रूप में, यांत्रिक पृथक्करण भी ३७ डिग्री सेल्सियस पर पूरा जब प्रस्तुत वाशिंग तकनीक का उपयोग किया जा सकता है । श्वसन मापन के अभाव या curcumin या कोको epicatechin मोनोमर (चित्रा 4a-सी) की उपस्थिति में किया गया । इन आंकड़ों का प्रदर्शन है कि प्रवृत्तियों कोशिकाओं के trypsin तैयारी के साथ मनाया बनाए रखा, लेकिन संवेदनशीलता को कम प्रतीत होता है । जबकि नियंत्रण और कोको epicatechin मोनोमर इलाज कोशिकाओं ग्लूकोज उत्तेजित, रिसाव और ETS श्वसन बनाए रखा, कोशिकाओं curcumin के साथ इलाज केवल ग्लूकोज-प्रेरित बढ़ नमूना करने के लिए नमूना परिवर्तनशीलता के कारण श्वसन बनाए रखा. हालांकि रुझान trypsin सेल की तैयारी के साथ मनाया (चित्रा 4d-एफ) बनाए रखा गया था, सभी मापदंडों में कम महत्व, संभवतः अधिक से अधिक नमूना करने वाली नमूना परिवर्तनशीलता यांत्रिक पृथक्करण द्वारा शुरू की और सामान्य रूप से प्रोटीन एकाग्रता के बजाय कोशिका संख्या.

इन आंकड़ों को प्रदर्शित करता है कि इस प्रोटोकॉल बरकरार INS-1 832/13 बीटा कोशिकाओं की संवेदनाएं मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल सटीक माप और शोर अनुपात करने के लिए संकेत को अधिकतम करने के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए एक पसंदीदा तरीका के लिए एक इष्टतम सेल नंबर पता चलता है.

Figure 1
चित्र 1 : बरकरार 832/13 बीटा कोशिकाओं के प्रतिनिधि श्वसन वक्र । बरकरार 832/13 बीटा कोशिकाओं में श्वसन के लिए मापा जाता है (चित्र 1a) २.५ mm ग्लूकोज, १६.७ mm ग्लूकोज, २.५ µ एम Oligomycin, 2 µ एम FCCP (Carbonyl साइनाइड-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone) और २.५ µ एम Antimycin ए. १६.७ mM ग्लूकोज खंड (चित्र 1b) का एक विस्तार ग्लूकोज उत्तेजित श्वसन में वृद्धि प्रदर्शित करने के लिए प्रस्तुत किया है । कोशिकाओं को 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर मापा गया । रिसाव बेसल, nonphosphorylating श्वसन राज्य को संदर्भित करता है, ETS इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली की जोड़ी श्वसन क्षमता को संदर्भित करता है, और ROX mitochondrial श्वसन के बाद अवशिष्ट ऑक्सीजन की खपत को संदर्भित करता है हिचकती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : ग्लूकोज प्रेरित श्वसन माप के लिए आवश्यक 832/13 बीटा कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण. बरकरार 832/13 बीटा कोशिकाओं (ए) की सांद्रता पर श्वसन के लिए मापा जाता है ०.५ x 106 कोशिकाओं/एमएल (बी) 1 एक्स 106 कोशिकाओं/एमएल, या (ग) 2 एक्स 106 कोशिकाओं/एमएल । (घ) प्रोटीन सांद्रता कि ०.५ x 106 कोशिकाओं के साथ संगत/एमएल, 1 एक्स 106 कोशिकाओं/एमएल, और 2 एक्स 106 कोशिकाओं/ (E) ०.५ x 106 कोशिकाओं/एमएल, 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल, और 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल में श्वसन की तुलना । श्वसन २.५ mm ग्लूकोज, १६.७ mm ग्लूकोज, २.५ µ एम Oligomycin, 2 µ एम FCCP और २.५ µ एम Antimycin एक शर्त के तहत मापा गया था । २.५ और १६.७ mM ग्लूकोज के साथ श्वसन, बीटा कोशिकाओं के ग्लूकोज उत्तेजित श्वसन प्रतिक्रिया प्रदर्शित करता है । oligomycin के बाद संवेदनाएं प्रदर्शित करता है रिसाव श्वसन (बेसल, nonphosphorylating श्वसन राज्य) । FCCP के बाद श्वसन (Carbonyl साइनाइड-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone) उपचार को दर्शाता है (इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली, ETS की कुछ श्वसन क्षमता) । n = 6 स्वतंत्र रन । डेटा औसत ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : trypsin का उपयोग कर रिहाई के बाद 832/13 बीटा कोशिकाओं के श्वसन मापन. 832/13 बीटा कोशिकाओं उपस्थिति या monomeric कोको epicatechin या curcumin और श्वसन की अनुपस्थिति में प्रसंस्कृत थे trypsin का उपयोग कर कोशिकाओं को रिहा करने के बाद मापा गया था । श्वसन २.५ mm ग्लूकोज, १६.७ mm ग्लूकोज, २.५ µ एम Oligomycin, 2 µ एम FCCP और २.५ µ एम Antimycin एक शर्त के तहत मापा गया था । २.५ और 16.7 mm ग्लूकोज के साथ श्वसन ग्लूकोज उत्तेजित श्वसन का प्रदर्शन । oligomycin के बाद संवेदनाएं प्रदर्शित करता है रिसाव श्वसन (बेसल, nonphosphorylating श्वसन राज्य) । FCCP के बाद श्वसन (Carbonyl साइनाइड-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone) उपचार को दर्शाता है (इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली, ETS की कुछ श्वसन क्षमता) । श्वसन antimycin के बाद एक उपचार अवशिष्ट ऑक्सीजन की खपत (ROX) को दर्शाता है । (क) curcumin के साथ 832/13 कोशिकाओं का उपचार उपचार के कारण श्वसन में उपयुक्त परिवर्तन रखता है. (B) प्रतिनिधि ट्रेस और (C) curcumin के साथ उपचारित कक्षों के लिए डेटा का औसत 832/13 बीटा कक्ष श्वसन में कोई परिवर्तन नहीं दर्शाता है । (घ) कोको epicatechin मोनोमर के साथ 832/13 कोशिकाओं का उपचार उपचार के कारण श्वसन में उपयुक्त परिवर्तन रखता है । (E) प्रतिनिधि ट्रेस और (F) कोको epicatechin मोनोमर इलाज कोशिकाओं के लिए डेटा का औसत कोको epicatechin मोनोमर उपचार के बाद सभी मापदंडों में वृद्धि की संवेदनाएं प्रदर्शित करता है । (G) सभी तीन पैरामीटर तुलना के लिए एक साथ प्रस्तुत किए गए हैं । n = 6 स्वतंत्र रन । डेटा औसत ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : यांत्रिक पृथक्करण का उपयोग कर रिहाई के बाद 832/13 बीटा कोशिकाओं के श्वसन माप. 832/13 बीटा कोशिकाओं उपस्थिति या monomeric कोको epicatechin या curcumin और श्वसन की अनुपस्थिति में प्रसंस्कृत थे यांत्रिक पृथक्करण का उपयोग कर कोशिकाओं को रिहा करने के बाद मापा गया था । श्वसन २.५ mm ग्लूकोज, १६.७ mm ग्लूकोज, २.५ µ एम Oligomycin, 2 µ एम FCCP और २.५ µ एम Antimycin एक शर्त के तहत मापा गया था । २.५ और १६.७ mM ग्लूकोज के साथ श्वसन बीटा कोशिकाओं के ग्लूकोज प्रतिक्रिया प्रदर्शित करता है । oligomycin के बाद संवेदनाएं प्रदर्शित करता है रिसाव श्वसन (बेसल, nonphosphorylating श्वसन राज्य) । FCCP के बाद श्वसन (Carbonyl साइनाइड-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone) उपचार को दर्शाता है (इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली, ETS की कुछ श्वसन क्षमता) । कोशिकाओं (एक) अनुपचारित कोशिकाओं या (ख) curcumin या (ग) कोको epicatechin मोनोमर के साथ इलाज कोशिकाओं के लिए डेटा का औसत प्रदर्शित करता है कि यांत्रिक पृथक्करण सभी उपचार में ग्लूकोज उत्तेजित श्वसन का कहना है, जबकि रिसाव और ETS महत्व केवल curcumin इलाज कोशिकाओं में खो रहे हैं । अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना करने के लिए (D) curcumin या (ई) कोको epicatechin मोनोमर मोनोमर के साथ श्वसन के लिए कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन के साथ कोको epicatechin curcumin के साथ सभी मापदंडों में वृद्धि की संवेदनाएं प्रदर्शित करता है । (च) तुलना के लिए सभी तीन पैरामीटर एक साथ प्रस्तुत किए गए हैं । n = 6 स्वतंत्र रन । डेटा औसत ± SEM. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * * p < 0.0001 के रूप में प्रस्तुत किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य बरकरार अग्नाशय बीटा कोशिकाओं में श्वसन दर को मापने के लिए उच्च संकल्प respirometry का उपयोग करने के लिए है । इस विधि में वृद्धि हुई ग्लूकोज के स्तर के लिए बीटा सेल प्रतिक्रिया के माप की अनुमति देता है । प्रोटोकॉल भी विभिंन यौगिकों के साथ इलाज के लिए अनुमति देता है, के रूप में स्वाभाविक रूप से होने वाली monomeric epicatechin या curcumin4,5के साथ इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन किया । विभिंन अंय यौगिकों के साथ उपचार इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है, उपचार के साथ (के रूप में यहां दिखाया गया है) या आधार प्रोटोकॉल के लिए ंयूनतम संशोधनों के साथ श्वसन कक्षों के भीतर इलाज ।

विभिंन तरीके है जिसके द्वारा इस विधि को संशोधित किया जा सकता है । अंय बीटा कक्ष लाइनों का उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, सेल नंबर और सब धो बार प्रयोग करने के लिए निर्धारित की आवश्यकता होगी । प्राथमिक मूषक और मानव-टाप का भी उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, कोशिकाओं या टाप समकक्षों की संख्या का भी प्रयोग तय करने की आवश्यकता होगी । एक अध्ययन में उच्च संकल्प respirometry15का उपयोग कर टाप ऑक्सीजन की खपत मापा गया है । इस अध्ययन के प्रति प्रतिक्रिया ४०० टाप करने की आवश्यकता है, लेकिन ग्लूकोज प्रेरित श्वसन परिवर्तन को मापने नहीं किया । यह देखते हुए कि प्राथमिक ऊतक अक्सर उच्च संकल्प respirometers16,17के साथ प्रयोग किया जाता है, बरकरार टाप प्रयोगात्मक समस्या निवारण के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, इस परख के लिए आवश्यक टाप की बड़ी संख्या को देखते हुए, ऑक्सीजन की खपत को मापने के अंय तरीकों को प्राथमिक टाप श्वसन की माप के लिए बेहतर अनुकूल हो सकता है ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं । सबसे पहले, कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या होने महत्वपूर्ण है । हमारे अध्ययनों से पता चलता है कि 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर 832/13 बीटा कोशिकाओं ग्लूकोज प्रेरित श्वसन माप के लिए पर्याप्त है । माप ०.५ x 106 कोशिकाओं/एमएल का उपयोग कम ग्लूकोज उत्तेजित श्वसन और शोर अनुपात के लिए एक कम संकेत का प्रदर्शन किया । इसके अलावा, माप 2 x 106 कोशिकाओं का उपयोग कर/एमएल नमूना परिवर्तनशीलता के लिए उच्च नमूना में परिणाम, और ऑक्सीजन की तेजी से सेलुलर उपयोग जो आवश्यक चैंबर पुनः आक्सीजन और अक्सर तेजी से सेल मौत के परिणामस्वरूप । कक्षों की उचित संख्या को इस महत्वपूर्ण चरण के निवारण के लिए दिए गए कक्ष पंक्ति के लिए प्रायोगिक रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए ।

एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम उंनत ग्लूकोज के स्तर का जवाब देने के लिए बीटा कोशिकाओं को तैयार कर रहा है । RPMI १६४० संस्कृति मीडिया उच्च शर्करा का स्तर है । कोशिकाओं उच्च ग्लूकोज से एक कम ग्लूकोज संस्कृति के लिए ले जाया जाना चाहिए. 1x कम ग्लूकोज सब में एक 3 एच मशीन बीटा कोशिकाओं के लिए पर्याप्त है ~ १६.७ mM ग्लूकोज के अलावा करने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया है । ग्लूकोज के अतिरिक्त करने के लिए चर प्रतिक्रियाओं में से कम 3 ज परिणाम की धो अवधि. समस्या निवारण ग्लूकोज प्रतिक्रिया समस्याओं सब धो समय की लंबाई बढ़ाने के द्वारा संबोधित किया जा सकता है ।

एक तीसरा महत्वपूर्ण कदम माप के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए विधि है । हमारा डेटा दर्शाता है कि trypsin और यांत्रिक पृथक्करण दोनों का इस्तेमाल किया जा सकता है, trypsin जारी कोशिकाओं को और अधिक सुसंगत रीडिंग और कम नमूना-नमूना परिवर्तनशीलता में परिणाम है । दोनों तरीकों के साथ मनाया प्रवृत्ति बनाए रखा गया था, लेकिन डेटा की ताकत trypsin का उपयोग कर तैयार कोशिकाओं के साथ अधिक था. जबकि अन्य विधियों, जैसे कि सेल स्क्रैपिंग, हमारे डेटा का उपयोग किया जा सकता है सुझाव है कि trypsin का उपयोग कम नमूना-से-नमूना परिवर्तनशीलता18,19के साथ सबसे प्रतिलिपि परिणाम में परिणाम होगा ।

इस approach की सीमाएं निंन शामिल हैं । सबसे पहले, केवल दो उपचार कक्षों के साथ, यह एक उच्च प्रवाह जांच पद्धति नहीं है । दो नमूनों की प्रत्येक चलाने के लिए मशीन तैयार करने के लिए समय सहित 3-4 ज, के बीच लेता है । दूसरा, कोशिकाओं के एक अपेक्षाकृत बड़े एकाग्रता परख के लिए आवश्यक है, दिया ~ नमूना (या ~ २.२ x 106 कोशिकाओं) प्रति चैंबर की जरूरत के २.२ मिलीलीटर । परख के लिए आवश्यक नमूना की राशि के कारण, प्राथमिक टाप के लिए इस उपकरण और प्रोटोकॉल का उपयोग सीमित है जब तक एक बड़ी आपूर्ति उपलब्ध है । पिछले अध्ययनों कि इस तकनीक के इस्तेमाल में श्वसन के लिए टाप का इस्तेमाल किया है ~ ४०० टाप/15चैंबर/ यह आवश्यकता होती है, मोटे तौर पर, प्रत्येक चैंबर के लिए दो चूहों से टाप20. तीसरा क्योंकि permeabilized कोशिकाओं का उपयोग नहीं किया जा रहा है, जो कोशिका पारगंय नहीं है यौगिकों का उपयोग करके व्यक्तिगत इलेक्ट्रॉन श्रृंखला घटकों पर उपचार के प्रभाव का निर्धारण करने की क्षमता उपलब्ध नहीं है ।

वहां मौजूदा तरीकों के संबंध में इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण लाभ की एक संख्या हैं । सबसे पहले, इस प्रोटोकॉल विभिंन झिल्ली पारगंय यौगिकों के stepwise अनुमापन के लिए अनुमति देता है । यह आवश्यक सांद्रता के सटीक निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं । दूसरा, बरकरार बीटा कोशिकाओं का उपयोग हमें cytosolic और mitochondrial ग्लूकोज चयापचय7पर प्रभाव क्वेरी करने के लिए अनुमति देता है. यह हमें glycolytic मार्ग, एक प्रेक्षण है कि खो दिया है जब permeabilized कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए परिवर्तन का संकेत phenotypes निरीक्षण करने के लिए अनुमति देता है । तीसरा, बरकरार कोशिकाओं हमें बीटा सेल समारोह के एक मीट्रिक है, जो इस परख के permeabilized वेरिएंट में खो दिया है के रूप में उंनत ग्लूकोज के लिए प्रतिक्रिया का उपयोग करने की अनुमति । अंत में, इस प्रोटोकॉल बीटा सेल श्वसन, एक लक्जरी है कि अंय उपकरणों के साथ मौजूद नहीं है पर यौगिकों के प्रभाव को क्वेरी करने के लिए विभिंन और कई यौगिकों के अलावा के लिए अनुमति देता है कि श्वसन उपाय ।

इस विधि के भविष्य के अनुप्रयोगों जैसे एटीपी, कैल्शियम, और एच2ओ2 स्तर श्वसन माप के साथ समवर्ती के रूप में मापदंडों को मापने की क्षमता शामिल हैं । इस विधि भी फैटी एसिड या ketones के रूप में अंय ईंधन स्रोतों की उपस्थिति में श्वसन की माप के लिए अनुमति देता है । अंत में, कुछ संशोधनों के साथ, स्रावित इंसुलिन श्वसन मापन के साथ सहवर्ती स्तर को मापने भी संभव हो सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक सहायक और वैज्ञानिक चर्चा के लिए Tessem और Hancock लैब्स के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । लेखकों एंड्रयू Neilson, पीएचडी epicatechin मोनोमर अंश प्राप्त कोको प्रदान करने के लिए (वर्जीनिया टेक) धंयवाद । इस अध्ययन में डायबिटीज एक्शन रिसर्च और एजुकेशन फाउंडेशन से JST को अनुदान का समर्थन मिला ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O2k Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 Instrument for high-resolution respirometry
DatLab 6 Program Oroboros Instruments 27141-01 Computer program for analysing high-reolution respirometry
INS-1 832/13 cell line Duke University Medical Center NONE Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard
Curcumin Sigma C7727 Pre-treatment of beta cells
Cocoa epicatechin monomer Virginia Polytechnic Institute and State University NONE Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson
Trypsin Sigma T4049 For cell culture
RPMI-1640 Sigma R8758 832/13 beta cell media
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 832/13 beta cell media component
Penicillin-streptomycin Sigma P4458 832/13 beta cell media component
HEPES Sigma H3662 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer
Glutamine Caisson GLL01 832/13 beta cell media component
Sodium Pyruvate Sigma S8636 832/13 beta cell media component
2-Mercaptoethanol Sigma M3148 832/13 beta cell media component
NaCl Fisher S271 Component of 10x SAB buffer
KCl Sigma P9541 Component of 10x SAB buffer
KH2PO4 Sigma P5655 Component of 10x SAB buffer
MgSO4 Sigma M2643 Component of 10x SAB buffer
D-(+)-Glucose Solution Sigma G8769 Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay
CaCl2 Sigma C5670 Component of 1x SAB buffer
35% BSA Solution Sigma A7979 Component of 1x SAB buffer
NaHCO3 Sigma S5761 Component of 1x SAB buffer
200 proof ethanol Sigma 459844 Washing Oxygraph O2k Chambers
Oligomycin A Sigma O4876 Chemicals for respiration assay
FCCP Sigma C2920 Chemicals for respiration assay
Anitmycin A Sigma A8674 Chemicals for respiration assay
BCA Protein Kit Thermo Fisher 23225 For determining protein concentration

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References

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Kener, K. B., Munk, D. J., Hancock, C. R., Tessem, J. S. High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds. J. Vis. Exp. (131), e57053, doi:10.3791/57053 (2018).

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