Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

С высоким разрешением Respirometry для измерения митохондриальной функции нетронутыми бета-клеток в присутствии природных соединений

Published: January 23, 2018 doi: 10.3791/57053
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Nutrition, Dietetics and Food Science Department, Brigham Young University

Summary

Цель настоящего Протокола заключается в измерить влияние глюкозы опосредованной изменений митохондриального дыхания, в присутствии природных соединений на нетронутыми 832/13 бета-клеток с высоким разрешением respirometry.

Abstract

С высоким разрешением respirometry позволяет для измерения потребления кислорода изолированных митохондриях, клеток и тканей. Бета-клетки играют решающую роль в организме путем контроля уровня глюкозы в крови через секреции инсулина в ответ на глюкозы в повышенных концентрациях. Секреции инсулина контролируется митохондриальное дыхание и метаболизм глюкозы. Таким образом измерения нетронутыми бета клеточного дыхания необходимо иметь возможность улучшить функции бета клеток для лечения диабета. С помощью нетронутыми 832/13 INS-1 производные бета-клеток, мы можем измерить эффект увеличения концентрации глюкозы на клеточное дыхание. Этот протокол позволяет нам оценить бета клеточного дыхания в наличие или отсутствие различных соединений, позволяя определить эффект дано соединений на нетронутыми клеточного дыхания. Здесь мы продемонстрировать эффект двух естественных соединений, мономерных эпикатехин и куркумин, на бета клеточного дыхания при наличии низких (2,5 мм) или высокой глюкозы (16,7 мм) условий. Этот метод может использоваться для определения влияния различных соединений нетронутыми бета клеточного дыхания, в присутствии различных концентраций глюкозы.

Introduction

Основная цель бета клеток поджелудочной железы является для поддержания системы нормогликемия через инсулина глюкоза стимулирует секрецию. Бета-клетки смысле физиологические изменения в распространении глюкозы в основном из-за низкого сродства высокой мощности транспортера глюкозы GLUT2 (глюкозы Transporter 2 Km 16,7 мм)1. С ростом уровня кровообращения глюкозы, этот перевозчик низкого сродства высокой емкости способствует пропорциональному увеличению внутриклеточных глюкозы в пределах бета клеток. Глюкоза метаболизируется путем гликолиза, цикла TCA (Цикл трикарбоновых кислот) и митохондриальное дыхание, что приводит к повышенной сотовой ATP (аденозинтрифосфата) уровнях. Повышенные концентрации ATP блокирует АТФ каналы чувствительных K+ , что приводит к деполяризации мембраны. Деполяризации мембраны вызывает открытие отстробировало Ca2 + каналов и последующее освобождение пузырьков связан инсулина гранул2. Дисфункция бета клеток является отличительной чертой диабета типа 2 (T2D) и приводит к секреции инсулина снизилась и плохо контролируемых и, в конечном счете, смерть клетки бета3. Механизмы, которые поддерживают или улучшить функцию бета клеток может использоваться в качестве лечения для T2D.

Исследования показали благотворное влияние естественных растительных соединений на поджелудочной железы клетки бета4. Эти соединения могут иметь их эффект через повышение бета пролиферации, выживания или секреции инсулина глюкоза стимулирует. Например недавние исследования показали, что мономерных epicatechin повышает секрецию инсулина глюкоза стимулируется путем увеличения митохондриальное дыхание и увеличение сотовой СПС уровнях5. Поэтому, понимая, как эти соединения могут увеличить функциональных бета клеток масса имеет важное значение для мобилизации этих соединений как потенциальные терапии.

Клеточное дыхание может быть измерена через ряд инструментов. Использование высокого разрешения респирометра позволяет для титрования химических Модуляторы для permeabilized или нетронутым клеток населения6. Этот инструмент позволяет добавление различных соединений, в различных концентрациях, таким образом давая широкий спектр информации.

Учитывая близкую связь между метаболизма глюкозы и функции бета клеток, размеры клеточного дыхания имеют решающее значение. Измерения клеточного дыхания может быть сделано с permeabilized или нетронутыми бета-клеток, каждая из которых имеет свой собственный набор преимуществ и недостатков7,8. Хотя permeabilization бета-клеток позволяет измерять различные аспекты электрон-транспортной цепи, она делает это без отношении механизм для стимулирования дыхания в бета ячейки, поглощение глюкозы и метаболизм. Таким образом использование unpermeabilized бета клеточного дыхания является очень полезным методом для определения бета-клеток ответ на различные уровни глюкозы, используя потребление кислорода как индикация.

Этот метод предназначен для измерения потребления кислорода в нетронутыми INS-1 производные 832/13 бета-клеток. Эта техника позволяет нам определить ответ бета-клеток в условиях unstimulatory глюкозы (2,5 мм глюкозы) а также условия стимулирующей глюкозы (16,7 мм глюкозы). В то время как unpermeabilized клетки не позволяет индивидуально проверить комплекс I, II или III электрона транспортной цепи, технику разрешения измерений, занимающихся сложными IV ингибирование (Oligomycin A), расцеплено дыхания (FCCP-карбонильных цианид- 4- phenylhydrazone (trifluoromethoxy)) и полностью препятствует дыхания (Antimycin A). Это исследование показывает эффективность измерения дыхания в неприкосновенности unpermeabilized бета-клеток поджелудочной железы, а также влияние двух естественных соединений, мономерных эпикатехин и куркумин, на бета клеточного дыхания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. клеточная культура

  1. Культура INS-1 производные 832/13 бета-клеток в RPMI 1640 с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 1% пенициллин стрептомицином, 10 мм HEPES, 2 глютамин, 1 мм пируват натрия и 0,05 мм 2-меркаптоэтанол9,10,11 ,12,13.
  2. Удаление ячеек 832/13 из T75 колбу с помощью 2 мл 0,25% трипсина, инкубации при 37 ° C для нейтрализации трипсина 10 мин, добавив 8 мл полного RPMI 1640 средств массовой информации.
  3. Подсчитать ячейки с помощью Горяева и разбавляют 100 мкл объема клетки с шагом 1,2 в 900 мкл PBS.
  4. Пластина 832/13 клетки на плотности 2 х 106 клеток/мл в 6 хорошо блюдо.
  5. Культура клетки для 48 ч в увлажненные инкубатора при 37 ° C и 5% CO2 до начала экспериментов дыхания.

2. Подготовка клеток с высоким разрешением Respirometry

  1. Лечение 832/13 клетки с какао эпикатехин производных мономера.
    1. Культура клетки 832/13 для 24 ч после покрытия в увлажненные инкубатора при 37 ° C и 5% CO2.
    2. Изменить СМИ 24 ч после покрытия и лечить 832/13 клетки с транспортного средства управления (3 скважины) или 100 Нм какао мономера (3 скважины), следуют культуре на дополнительные 24 часа (всего 48 h) в увлажненные инкубатора при 37 ° C и 5% CO2.
    3. Вымойте 832/13 клеток в 1 x низкий глюкозы секрецию Assay Buffer (НКС) для 5 минут аспирата буфера и инкубировать 832/13 клеток в 1 x низкий глюкозы SAB за 3 ч, 1 x низкий глюкозы SAB меняется каждый час.
      1. Сделать 10 x SAB с 33.32 г NaCl, 1.73 г хлористого калия, 0,82 г х2PO4, 0,7 г MgSO4 и добавить H2O окончательный объемом 500 мл. Стерильные фильтр окончательного решения.
      2. Сделайте 1 x низкий глюкозы САБ с 10 мл 10 x SAB, 100 мкл 45% глюкозы, 2 мл 1 м HEPES, 1 мл 0,25 М CaCl2, 0,57 мл раствора БСА 35%, 0,21 g NaHCO3 и добавить H2O конечный объем 100 мл. Стерильные фильтр окончательного решения.
  2. Лечение 832/13 клетки с куркумин.
    1. Культура клетки 832/13 в течение 48 часов после покрытия в увлажненные инкубатора при 37 ° C и 5% CO2.
    2. Вымойте 832/13 клеток в 1 x низкий глюкозы SAB 5 мин аспирата буфера и инкубировать 832/13 клеток в 1 x низкий глюкозы SAB за 3 ч, 1 x низкий глюкозы SAB меняется каждый час.
    3. После 2,5 ч 3 ч инкубации в 1 x низкий глюкозы SAB аспирационная буфера и инкубации клеток в 1 x SAB низкий глюкозы с управления транспортного средства или 40 мкм куркумин за 30 мин. После инкубации аспирационная буфера.
  3. Уборка клетки с трипсином для высокого разрешения respirometry
    1. После инкубации 3 h 1 x низкий глюкозы SAB удалите ячейки из пластины с 250 мкл трипсин 0.25% в колодец.
    2. Объединить ячейки в трипсина из 3 скважины, относились с управления транспортного средства или составные интерес с 4 мл SAB в 15 мл Конические трубки.
    3. Подсчитать ячейки с помощью Горяева и разбавляют 100 мкл объема клетки от шага 2.3.2 в 900 мкл PBS.
    4. Разбавьте соответствующее количество клеток в 1 x низкий глюкозы SAB сделать 3 мл в соответствующей концентрации для каждой камеры. Данных показывает, что концентрация 1 х 106 клеток/мл является наиболее эффективным.
  4. Уборка клетки с механическим диссоциации для высокого разрешения respirometry
    1. После инкубации в 1 x 3 h низкий глюкозы SAB, добавьте 1 mL 1 x низкий глюкозы SAB каждому хорошо и аккуратно удар клетки от пластины с механическим диссоциации дозирование с кончиком пипетки 1000 мкл.
    2. Объединить ячейки от 3 скважины, относились с управления транспортного средства или составные интерес в общей сложности 3 мл SAB в 15 мл Конические трубки для дыхания.

3. с высоким разрешением Respirometry

  1. Подготовка с высоким разрешением респирометра.
    1. Включите разрешением респирометра и подключиться к рабочему столу, запустив программу анализа респирометра.
    2. Аспирационная 70% этанола из обеих палат. Замочите эти камеры в 70% этанол как минимум на 45 мин.
    3. Вымойте камер дважды с 70% этиловом спирте, аспирационных после каждого шага.
    4. Вымойте камер три раза с ddH2O, аспирационных после каждого шага.
    5. Промойте палата плунжеров ddH2O. Это очищает от остаточного этанола от плунжеров и от порта титана.
  2. Калибровка датчиков полярографический кислорода.
    1. Добавить 2,4 мл 1 x низкий глюкозы SAB буфер для каждой камеры oxygraph, помешивая буфер непрерывно с помощью магнитных перемешать баров в камере при 37 ° C 750 об/мин с интервалом записи данных на 2.0 s, нажав на кнопку F7 и открыв вкладку с надписью «Системы». Нажмите плунжеров всю дорогу в и затем втягивается в параметр аэрации гаечный ключ. Пусть машина сбалансировать как минимум 1 час до получения стабильных кислорода поток.
    2. Установите машину при 37 ° C в течение всего эксперимента. Установите напряжение поляризации 800 МВ, с коэффициентом усиления 2, нажав на кнопку F7 и открыв вкладку «Кислорода, O2». Сбалансировать концентрация кислорода SAB буфера для по крайней мере 30 минут, в то время как изменения в концентрации кислорода является стабильным (менее 2 pmol/(s*mL)).
    3. После стабилизации концентрации кислорода выберите регион, где изменения концентрации кислорода стабильных установить фон измерение изменений в концентрации кислорода.
      1. Выберите регион, нажав клавишу shift, левой кнопкой мыши на мыши и перетаскивая указатель мыши через выбранного региона. Нажмите на письмо, связанные с выбранной области и изменения «R1» для каждой трассировки, соответствующие каждой из двух палат.
      2. Дважды щелкните на поле «O2 калибровки» в левом нижнем углу и правый углы экрана, нажмите кнопку «Выбрать Марк» для «калибровка воздуха» как R1 и затем выберите «калибровки и скопировать в буфер обмена» для обеих палат.
  3. 2.1.5 или 2.2.5 в шаги подготовить оценку дыхания 832/13 бета-клеток.
    1. Загрузить 2,4 мл образца в каждой палате (одна палата управления транспортного средства лечение клетками, одну камеру с составные обработанные клетки) в 1 x низкий глюкозы SAB. Сохраняют 0,5 мл ячейки выборки для белка количественный, пробирного BCA (Bicinchoninic кислота), при использовании механических диссоциации подход (замораживание при-20 ° C для измерения позже).
      1. Нажимаем плунжера всю дорогу и аспирационная остаточный объем. Перемешайте клетки непрерывно на протяжении всего эксперимента на 750 об/мин и 37 ° C для всех последующих шагов. Сделайте отметку, нажав F4 и маркировки как «клетки», когда образцы загружаются.
      2. Мера образцы для 30 мин. После стабилизации сигнала выберите область изменения в концентрации кислорода, соответствующей условиям низкий глюкозы (2,5 мм глюкозы), как описано в 3.2.3.
    2. После того, как будет достигнута стабилизация сигнала, мкл 12,5 45% стерильного раствора глюкозы (16.7 mM концентрации выпускных экзаменов) в каждую камеру через титана, с помощью шприца порт погрузки. Убедитесь, Марк измеряется «Глюкозы», как описано в 3.3.1 при добавлении лечение. Пусть сигнал стабилизации и записывать клеточное дыхание, пока не будет достигнута стабильная кислорода поток. Выберите этот регион изменения в концентрации кислорода, как описано в 3.2.3. Это чтение глюкозы 16,7 мм и соответствует стимулирующие условия7.
    3. После того, как будет достигнута стабилизация сигнала 1 мкл oligomycin 5 мм (2,5 мкм конечная концентрация) в каждую камеру через порт погрузки. Убедитесь, Марк измеряется «OligoA», как описано в 3.3.1 при добавлении лечение. Пусть сигнал стабилизации и записывать клеточное дыхание, пока не будет достигнута стабильная кислорода поток. Выберите Эта область кривой, как описано в 3.2.3. Oligomycin A подавляет АТФ-синтазы и таким образом только происходит поток кислорода через утечки не Оксидативное фосфорилирование7и электронов.
    4. После того, как будет достигнута стабилизация сигнала добавить 1 мм FCCP с шагом в 1 мкл до тех пор, пока максимальный дыхания ставка устанавливается. Это представляет максимальное центровку дыхания. Между 3-4 мкл FCCP является достаточно (1,5-2,0 мкм конечная концентрация) чтобы побудить максимальной центровку дыхания клеток INS-1 832/13. Сделайте отметку под названием «FCCP», как описано в 3.3.1 при добавлении лечение. Пусть сигнал стабилизации и записывать клеточное дыхание, пока не будет достигнута стабильная кислорода поток. Выберите Эта область кривой, как описано в 3.2.3. FCCP — агент расцеплять. Это позволяет нам оценить центровку дыхания7.
    5. После того, как будет достигнута стабилизация сигнала мкл 1 5 мм Antimycin A (конечная концентрация 2,5 мкм) в каждую камеру через порт погрузки. Сделайте отметку помечены «Антиа», как описано в 3.3.1 при добавлении лечение. Пусть сигнал стабилизации и записывать клеточное дыхание, пока не будет достигнута стабильная кислорода поток. Выберите Эта область кривой, как описано в 3.2.3.
      Примечание: Antimycin A связывает цитохром C редуктазы, тормозит окисление убихинон и блокирует все дыхания. Это позволяет нам полностью остановить дыхание7.
  4. Измерения 832/13 бета-клетки для нормализации дыхания и концентрации белка.
    1. Использование по 0,5 мл пробы сохранена при загрузке, образец протеина меру, с помощью метода BCA13.
    2. Запуск каждого образца в трех экземплярах, без разбавления, следуя инструкциям производителя.
  5. 832/13 бета клеток дыхания расчеты из trypsinized клеток.
    1. Введите количество клеток / мл использования в assay, нажав на кнопку F3 программы анализа респирометра. Изменить единицы измерения для клеток/мл, введите сотовой концентрации и изменить среднего SAB.
    2. Выберите фон чтений нормализовать данные, выбрав и вступления в O2 калибровки формы, как описано в 3.2.3.
    3. Сделать выбор чтений от 2,5 мм глюкозы, 16,7 глюкозы, Oligomycin, FCCP и Antimycin, как описано в 3.3.1.
    4. В рамках программы анализа Респирометр экспорт чтения для каждой камеры после ввода концентрацию белка и выбрав соответствующие средние значения для каждого лечения во время измерения дыхания. Это делается, нажав F2 и затем нажатием «копировать в буфер обмена функцией». Это экспортирует данные для использования в других программах анализа. Используйте значения «O2 склона НЭГ» для расчетов.
    5. Сбор данных для 3-5 независимых пробегов транспортного средства лечить контроля и природных соединений, обработанные клетки, чтобы определить влияние на нетронутыми клеточного дыхания INS-1 832/13 бета-клеток.
  6. 832/13 бета клеток дыхания вычисления от механически отделить клетки.
    1. Введите белка расчеты с BCA assay, нажав на кнопку F3 респирометра анализ программы. Изменить единицы измерения для мг, введите BCA концентрации и изменить среднего SAB.
    2. Выберите фон чтений нормализовать данные, выбрав и вступления в O2 калибровки формы, как описано в 3.2.3.
    3. Сделать выбор чтений от 2,5 мм глюкозы, 16,7 глюкозы, Oligomycin, FCCP и Antimycin, как описано в 3.3.1.
    4. В рамках программы анализа Респирометр экспорт чтения для каждой камеры после ввода концентрацию белка и выбрав соответствующие средние значения для каждого лечения во время измерения дыхания. Это делается, нажав F2 и затем нажатием «копировать в буфер обмена функцией». Это экспортирует данные для использования в других программах анализа. Используйте значения «O2 склона НЭГ» для расчетов.
    5. Сбор данных для 3-5 независимых пробегов транспортного средства лечить контроля и природных соединений, обработанные клетки, чтобы определить влияние на нетронутыми клеточного дыхания INS-1 832/13 бета-клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

INS-1 832/13 бета-клеток, которые готовятся и собрали как описано в протоколе будет демонстрировать модуляции в потребления кислорода, на основе различных химикатов (рис. 1A). Увеличение дыхание будет соблюдаться при увеличении концентрации глюкозы до 16,7 мм глюкозы (рис. 1B). Дыхание будет уменьшаться, когда нетронутыми клетки относятся с Oligomycin а. Это дыхание известен как утечки, которая определяется как состояние дыхательной базальной, nonphosphorylating. Максимальная дыхание будет достигаться при бета-клетки обрабатываются с расцеплять агента FCCP, который определяется как ETS дыхание, или переноса электронов системы дыхания. Наконец дыхание упадет до нуля при лечении с Antimycin, помечены как ROX (потребление остаточного кислорода), который ссылается на потребление-дыхательной клеточного кислорода.

Различия в номер ячейки будет существенно изменить качество данных, полученных от этой техники. Глюкоза побудить дыхания был измерен на 0,5, 1 и 2 х 106 клеток/мл (рисунок 2A-2 C). С помощью клеток и BCA assays белка, белка концентрации соответствующие три испытания ячейку, в которую были рассчитаны концентрации (Рисунок 2D). Измерения с использованием 0,5 x 106 клеток/мл смогла продемонстрировать, что глюкоза стимулирует дыхание (рисунок 2A) и только ETS связанные увеличение дыхание было показано значительное. Это свидетельствует о том, что номер низкой ячейки приводит к низкий сигнал шум, который смешивает результаты. Аналогичным образом измерения на 2 х 106 клеток/мл также привела к значительной изменчивости, как указано в статистической значимости, достигнут только для ETS измерений (рис. 2 c). Это предположительно из-за необходимости повторно кислородом камер несколько раз во время assay, что привело к большей вариативности в образец. Эти данные показывают, что концентрации 1 х 106 клеток/мл приведет к значительным глюкозы стимулирует дыхание, утечки и ETS измерений, которые необходимы для анализа дыхания (рис. 2B и 2E).

В этом протоколе представлены два метода для удаления клеток для дыхания. Удаление ячеек с помощью трипсин является эффективным, когда измерения выполнены при 37 ° C. Дыхание измерений в отсутствие или наличие куркумин (рис. 3A) демонстрирует содержание глюкозы стимулирует дыхание, утечки и ETS дыхания. Сравнение куркумин лечение клеток для без лечения клетки показывает, никаких изменений в любой из этих респираторных параметров (рисунок 3B-C). Дыхание измерений в отсутствие или наличие какао эпикатехин мономера (рис. 3D) также показывает содержание глюкозы стимулирует дыхание, утечки и ETS дыхания. Сравнение какао эпикатехин мономера лечение клеток для без лечения клетки показывает увеличение дыхание на 2,5 мм и 16,7 мм глюкозы, а также утечки и ETS дыхания (Рисунок 3E-F). Эти данные показывают, что, хотя куркумин не повысит 832/13 бета клеточного дыхания, какао эпикатехин мономера делает (Рисунок 3 g). Было показано, что куркумин повышения секреции инсулина путем ингибирования фосфодиэстеразы деятельности14. Наши данные показывают, что куркумин не повышения секреции инсулина путем модулирования митохондриальной функции. Мы уже продемонстрировали, что культура какао эпикатехин мономеров в присутствии Индуцирует экспрессию различных компонентов цепи митохондрий электронного транспорта5. Мы также наблюдали увеличение дыхания в государстве утечки (индуцированных лечение с oligomycin) и с ETS (транспортная система электронов, индуцированных FCCP). Использование этого инструмента предлагает ряд потенциальных целей для будущих исследований.

В качестве альтернативы для удаления трипсина клеток механические диссоциации может также осуществляться с использованием представленные Стиральная техника после завершения 37 ° c. Дыхание измерения были сделаны в отсутствие или наличие куркумин или какао эпикатехин мономера (рис. 4A-C). Эти данные показывают, что тенденции с трипсином подготовка клетки поддерживаются, однако, как представляется, быть уменьшена чувствительность. Хотя контроль и какао эпикатехин мономера лечить сохранить глюкозы стимулирует клетки, утечки и ETS дыхания, клетках, обработанных с куркумин только сохранить глюкозы стимулирует дыхание вследствие повышенной изменчивости образец. В то время как тенденций, наблюдаемых с препараты трипсина клетки были сохранены (Рисунок 4 d-F), значение сократилось во всех параметрах, предположительно к большей изменчивости образец, представленный механических диссоциации и нормализация белка концентрацию, вместо того, чтобы ячейки номер.

Эти данные показывают, что этот протокол может использоваться для измерения дыхания нетронутыми INS-1 832/13 бета-клеток. Кроме того наш протокол предлагает оптимальный мобильный номер для точных измерений и предпочтительный метод для подготовки клетки для максимизации соотношение сигнал-шум.

Figure 1
Рисунок 1 : Представитель дыхания кривой нетронутыми 832/13 бета клеток. Бета-клетки нетронутыми 832/13 измеряются для дыхания в Oligomycin (рис. 1A) 2,5 мм глюкозы, 16,7 мм глюкозы, 2,5 мкм, мкм 2 FCCP (карбонил цианид -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) и 2,5 мкм Antimycin а. Расширение 16,7 мм глюкозы секции (рис. 1B) представлен продемонстрировать увеличение глюкозы стимулирует дыхание. Клетки были измерены в концентрации 1 х 106 клеток/мл. УТЕЧКА относится к базальной, nonphosphorylating дыхательной государства, ETS ссылается на центровку дыхательных возможностей транспортная система электронов и ROX относится к потреблению остаточного кислорода после митохондриальное дыхание тормозится. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Определение количества 832/13 бета-клеток, необходимых для измерения глюкозы индуцированной дыхания. Бета-клетки нетронутыми 832/13 измеряются для дыхания в концентрациях (.A) 0,5 х 106 клеток/мл (B) 1 x 106 клеток/мл, или (C) 2 х 106 клеток/мл. (D) концентрации белков, которые соответствуют 0,5 x 106 клеток/мл, 1 х 106 клеток/мл и 2 x 106 клеток/мл. (E) сравнение дыхания на 0,5 x 106 клеток/мл, 1 x 106 клеток/мл и 2 x 106 клеток/мл. Дыхание было измерено под 2,5 мм глюкозы, 16,7 мм глюкозы, 2,5 мкм Oligomycin, 2 мкм FCCP и 2,5 мкм Antimycin A условий. Дыхание с 2,5 и 16,7 мм глюкозы продемонстрировать ответ глюкозы стимулирует дыхание бета-клеток. Дыхание после oligomycin демонстрирует утечки дыхания (базальный, nonphosphorylating дыхательной состояние). Дыхание после FCCP (карбонильных цианид -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) лечения демонстрирует (центровку дыхательных возможностей транспортная система электронов, ETS). n = 6 независимых бежит. Данные представлены в виде среднее ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, *** p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Дыхание измерения 832/13 бета-клеток после освобождения, используя трипсина. 832/13 бета-клетки были культивировали в наличие или отсутствие мономерных какао эпикатехин или дыхания и куркумин была измерена после выпуска клеток с использованием трипсина. Дыхание было измерено под 2,5 мм глюкозы, 16,7 мм глюкозы, 2,5 мкм Oligomycin, 2 мкм FCCP и 2,5 мкм Antimycin A условий. Дыхание с 2,5 и 16,7 мм глюкозы продемонстрировать глюкозы стимулирует дыхание. Дыхание после oligomycin демонстрирует утечки дыхания (базальный, nonphosphorylating дыхательной состояние). Дыхание после FCCP (карбонильных цианид -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) лечения демонстрирует (центровку дыхательных возможностей транспортная система электронов, ETS). Дыхание после antimycin лечения демонстрирует потребление остаточного кислорода (ROX). (A) лечение 832/13 клеток с куркумин поддерживает соответствующие изменения в дыхания из-за лечения. Представитель трассировки (B) и (C) средняя из данных для клетки лечат куркумин демонстрирует никаких изменений в 832/13 бета клеточного дыхания. (D) лечение 832/13 клеток с какао эпикатехин мономера поддерживает соответствующие изменения в дыхания из-за лечения. Представитель трассировки (E) и (F) в среднем данных для какао эпикатехин мономера лечение клетки демонстрирует увеличение дыхание после какао эпикатехин мономера лечения по всем параметрам. (G) все три параметра представлены вместе для сравнения. n = 6 независимых бежит. Данные представлены в виде среднее ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, *** p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Дыхание измерения 832/13 бета-клеток после освобождения, с использованием механических диссоциации. 832/13 бета-клетки были культивировали в наличие или отсутствие мономерных какао эпикатехин или дыхания и куркумин была измерена после выпуска клеток с использованием механических диссоциации. Дыхание было измерено под 2,5 мм глюкозы, 16,7 мм глюкозы, 2,5 мкм Oligomycin, 2 мкм FCCP и 2,5 мкм Antimycin A условий. Дыхание с 2,5 и 16,7 мм глюкозы продемонстрировать ответ глюкозы бета-клеток. Дыхание после oligomycin демонстрирует утечки дыхания (базальный, nonphosphorylating дыхательной состояние). Дыхание после FCCP (карбонильных цианид -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) лечения демонстрирует (центровку дыхательных возможностей транспортная система электронов, ETS). Среднее значение данных для клетки (A) не лечить клетки или клетки лечат куркумин (B) или (C) какао эпикатехин мономера продемонстрировать что механические диссоциации поддерживает глюкозы стимулирует дыхание во всех процедурах, во время утечки и ETS значение теряются только в клетках куркумин лечение. Сравнение необработанных клеток куркумин (D) или (E) какао эпикатехин мономера демонстрирует увеличение дыхания во всех параметрах с какао эпикатехин мономера без значительного изменения дыхания с куркумин. (F) все три параметра представлены вместе для сравнения. n = 6 независимых бежит. Данные представлены в виде среднее ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Цель настоящего Протокола заключается в использовании с высоким разрешением respirometry для измерения дыхания ставки в нетронутыми бета-клеток поджелудочной железы. Этот метод позволяет измерение бета клеток ответ на увеличение глюкозы. Протокол также позволяет для предварительной обработки с различными соединениями, как показано в этом протоколе с естественным мономерных epicatechin или куркумин4,5. Лечение с различными другими соединениями могут использоваться в настоящем Протоколе, с предварительной обработки (как показано ниже) или лечении респираторных камер с минимальными изменениями в базовом протоколе.

Существуют различные способы, которыми этот метод может быть изменен. Могут использоваться другие линии бета клетки; Однако количество клеток и SAB мыть раз нужно будет определить экспериментально. Основная грызунов и человеческих островках также могут быть использованы; Однако количество ячеек или эквиваленты островок также нужно будет определить экспериментально. По крайней мере одно исследование измеряется островок потребление кислорода с помощью высокого разрешения respirometry15. Это исследование требует 400 островков в реакции, но не измерения глюкозы индуцированные изменения дыхания. Учитывая, что основной ткани часто используется с высоким разрешением respirometers16,17, нетронутыми островков может использоваться после экспериментальной устранения неполадок. Однако учитывая большое количество островков, необходимых для этот assay, другие методы измерения потребления кислорода может быть лучше подходит для измерений первичных островок дыхания.

Есть несколько критических шагов с представленной протоколом. Во-первых важно иметь достаточное количество клеток. Наши исследования показывают, что 832/13 бета-клеток в концентрации 1 х 106 клеток/мл достаточно для измерения глюкозы стимулирует дыхание. Измерения с использованием 0,5 x 106 клеток/мл свидетельствует низкий глюкозы стимулирует дыхание и низкое соотношение сигнал-шум. Кроме того измерения с использованием 2 х 106 клеток/мл привели к высокой изменчивости в образец и быстрый сотовой использования кислорода, которого требуется камера повторно кислородом и часто приводит к быстрому клеточной гибели. Соответствующее количество клеток должны определяться экспериментально для заданной ячейки строки для того, чтобы устранить этот критический шаг.

Вторым важным шагом готовит бета-клеток реагировать на повышенных глюкозы. Средства массовой информации культуры RPMI 1640 имеет высокий глюкозы. Клетки должны быть перемещены из высокой глюкозы низкий глюкозы культуры. 3 ч инкубации в 1 x низкий глюкозы SAB достаточна для бета-клеток иметь значительный ответ с добавлением глюкозы ~16.7 мм. Вымойте периоды менее чем 3 h результат в переменной ответы с добавлением глюкозы. Устранение неполадок ответ глюкозы могут быть решены путем увеличения времени мыть SAB.

Третьим важнейшим шагом является метод подготовки клетки для измерений. Наши данные показывают, что хотя трипсина и механических диссоциации могут использоваться, трипсина выпустила клеток результат в более последовательного чтения и менее-пример изменчивости. Была сохранена тенденция наблюдается с обоих методов, однако сила данных было больше с клетками, подготовлен с использованием трипсина. Хотя могут быть использованы другие методы, например соскоб клеток, наши данные показывают, что использование трипсина приведет к наиболее воспроизводимость результатов с менее18,-пример изменчивости19.

Ограничения этого подхода включают в себя следующее. Во-первых с только два режима камеры, это не высокую пропускную способность, скрининг метод. Каждый запуск двух образцов занимает от 3-4 ч, включая время для подготовки машины. Во-вторых относительно большая концентрация клеток требуется для assay, учитывая ~2.2 мл образца (или ~2.2 x 106 клеток), необходимых каждой камеры. Из-за количества образцов, необходимых для assay использование этого инструмента и протокол для первичного островков ограничен, если имеется большой запас. В предыдущих исследованиях, которые использовали островков для дыхания в этой технике используется ~ 400 островков/Камера15. Это потребует, грубо говоря, островки из двух мышей для каждой камеры20. Третий потому что permeabilized клетки не используются, возможность определить эффект лечения на отдельных электронов цепи компонентов с помощью соединений, которые не являются клетки проницаемых не доступен.

Существует ряд значительных преимуществ этого протокола в отношении существующих методов. Во-первых этот протокол позволяет поэтапно титрования различных соединений проницаемой мембраны. Это позволяет для точного определения необходимой концентрации. Во-вторых использование нетронутыми бета-клеток позволяет нам запроса влияние на метаболизм глюкозы цитозольной и митохондриальной7. Это позволяет нам наблюдать фенотипов ориентировочных изменений в гликолитических путь, наблюдение, что теряется при использовании permeabilized клеток. В-третьих нетронутыми клетки позволяют нам использовать ответ на повышенных глюкозы как метрики функции бета ячейки, которая теряется в permeabilized вариантах этот assay. Наконец этот протокол позволяет для добавления различных и несколько соединений для запроса эффект соединений на бета клеточного дыхания, роскошь, которая не присутствует с другими инструментами, которые измеряют дыхания.

Будущего применения этого метода включают в себя способность измерять такие параметры, как СПС, кальция и H2O2 уровнях одновременно с измерениями дыхания. Этот метод также позволяет для измерения дыхания, в присутствии других источников топлива, например жирных кислот или кетонов. Наконец с некоторыми изменениями, измерения выделяется инсулин уровнях одновременно с измерениями дыхания также может быть возможным.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить членов Tessem и Хэнкок лабораторий для помощника и научной дискуссии. Авторы благодарят Эндрю Neilson, PhD (Virginia Tech) за предоставление какао эпикатехин производных мономера дроби. Это исследование было поддержано грант от действий исследования диабета и Фонд образования для JST.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O2k Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 Instrument for high-resolution respirometry
DatLab 6 Program Oroboros Instruments 27141-01 Computer program for analysing high-reolution respirometry
INS-1 832/13 cell line Duke University Medical Center NONE Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard
Curcumin Sigma C7727 Pre-treatment of beta cells
Cocoa epicatechin monomer Virginia Polytechnic Institute and State University NONE Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson
Trypsin Sigma T4049 For cell culture
RPMI-1640 Sigma R8758 832/13 beta cell media
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 832/13 beta cell media component
Penicillin-streptomycin Sigma P4458 832/13 beta cell media component
HEPES Sigma H3662 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer
Glutamine Caisson GLL01 832/13 beta cell media component
Sodium Pyruvate Sigma S8636 832/13 beta cell media component
2-Mercaptoethanol Sigma M3148 832/13 beta cell media component
NaCl Fisher S271 Component of 10x SAB buffer
KCl Sigma P9541 Component of 10x SAB buffer
KH2PO4 Sigma P5655 Component of 10x SAB buffer
MgSO4 Sigma M2643 Component of 10x SAB buffer
D-(+)-Glucose Solution Sigma G8769 Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay
CaCl2 Sigma C5670 Component of 1x SAB buffer
35% BSA Solution Sigma A7979 Component of 1x SAB buffer
NaHCO3 Sigma S5761 Component of 1x SAB buffer
200 proof ethanol Sigma 459844 Washing Oxygraph O2k Chambers
Oligomycin A Sigma O4876 Chemicals for respiration assay
FCCP Sigma C2920 Chemicals for respiration assay
Anitmycin A Sigma A8674 Chemicals for respiration assay
BCA Protein Kit Thermo Fisher 23225 For determining protein concentration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mueckler, M., Thorens, B. The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  3. Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).
  4. Strat, K. M., et al. Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders. J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).
  5. Rowley, T. J. T., et al. Monomeric cocoa catechins enhance β-cell function by increasing mitochondrial respiration. J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).
  6. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells. J Vis Exp. (120), (2017).
  7. Reynolds, M. S., et al. beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).
  8. Hals, I. K., et al. Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia. PLoS One. 10 (9), e0138558 (2015).
  9. Ray, J. D., et al. Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos. FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).
  10. Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
  11. Tessem, J. S., et al. Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).
  12. Hobson, A., et al. Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway. Islets. 7 (1), e1027854 (2015).
  13. Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation. J Diabetes Res. 2016, 6375804 (2016).
  14. Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity. J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).
  15. Ma, Z., et al. Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction. Islets. 4 (3), 233-242 (2012).
  16. Chavanelle, V., et al. Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice. Sci Rep. 7 (1), 204 (2017).
  17. Jelenik, T., et al. Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver. Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).
  18. Spacek, T., et al. Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential. Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).
  19. Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells. Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).
  20. Johnson, J. D., et al. Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets. Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).

Tags

Клеточная биология выпуск 131 бета клетки митохондрии дыхание глюкозы с высоким разрешением respirometry какао эпикатехин мономера куркумин
С высоким разрешением Respirometry для измерения митохондриальной функции нетронутыми бета-клеток в присутствии природных соединений
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kener, K. B., Munk, D. J., Hancock,… More

Kener, K. B., Munk, D. J., Hancock, C. R., Tessem, J. S. High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds. J. Vis. Exp. (131), e57053, doi:10.3791/57053 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter