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Biology

Hochauflösender Respirometrie, mitochondriale Funktion intakt Beta-Zellen in Anwesenheit von Naturstoffen zu messen

Published: January 23, 2018 doi: 10.3791/57053
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Nutrition, Dietetics and Food Science Department, Brigham Young University

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirkung der Glukose-vermittelte Änderungen an mitochondrialen Atmung im Beisein von Naturstoffe auf intakt 832/13 Beta-Zellen mit Hilfe hochauflösender Respirometrie messen.

Abstract

Hochauflösender Respirometrie ermöglicht die Messung des Sauerstoffverbrauchs von isolierten Mitochondrien, Zellen und Geweben. Beta-Zellen spielen eine wichtige Rolle im Körper durch die Kontrolle des Blutzuckerspiegels durch Insulin-Sekretion als Reaktion auf erhöhten Glukosekonzentration. Insulin-Sekretion wird durch Glukosestoffwechsel und die mitochondriale Atmung gesteuert. Daher unbedingt messen intakt Beta Zellatmung Beta-Zellfunktion zur Behandlung von Diabetes verbessern zu können. Mit intakt 832/13 INS-1 abgeleitet Betazellen messen wir den Effekt der Erhöhung der Glukosekonzentration auf die Zellatmung. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Beta Zellatmung in das Vorhandensein oder Fehlen von verschiedenen Verbindungen, so dass man die Wirkung der bestimmen messen Verbindungen auf intakte Zellatmung gegeben. Hier zeigen wir die Wirkung von zwei natürlich vorkommenden Verbindungen, Monomere Epicatechin und Curcumin, auf Beta Zellatmung unter Anwesenheit von niedrig (2,5 mM) "oder" hohe Glukose (16,7 mM) Bedingungen. Diese Technik kann verwendet werden, um die Wirkung der verschiedenen Verbindungen auf intakte Beta Zellatmung in Anwesenheit von unterschiedlichen Glukosekonzentration zu bestimmen.

Introduction

Der primäre Zweck des Pankreas Beta-Zellen ist System Normoglycemia durch Glukose-stimulierten Insulinsekretion zu pflegen. Die Beta-Zellen spüren physiologische Veränderungen im zirkulierenden Glukose vor allem auf die geringe Affinität, hohe Kapazität Glukosetransporters GLUT2 (Glucose Transporter 2, Km 16,7 mM)1. Kreislauf Blutzuckerspiegel steigen, erleichtert diese Hochleistungs-Low-Affinität Transporter eine proportionale Zunahme der intrazellulären Glukose innerhalb der Beta-Zellen. Glukose wird durch Glykolyse, TCA-Zyklus (Tricarboxylic Säure Zyklus) und der mitochondrialen Atmung, was zu erhöhten zellulären ATP (Adenosin Triphosphat) metabolisiert. Die erhöhten ATP-Konzentration blockiert die ATP empfindliche K+ Kanäle, Membran-Depolarisation führt. Membran-Depolarisation bewirkt, dass die Öffnung der Spannung gated Ca2 + -Kanäle und anschließende Freisetzung Vesikel gebunden Insulin Granulat2. Beta-Zellen Dysfunktion ist ein Markenzeichen von Typ-2-Diabetes (T2D) und führt zu verringerte und schlecht kontrollierten Insulinsekretion und letztlich Beta-Zellen Tod3. Mechanismen, die Erhaltung oder Verbesserung der Beta-Zellfunktion konnte als Behandlung für T2D verwendet werden.

Studien belegen die positiven Auswirkungen des natürlich vorkommenden pflanzlichen Verbindungen auf die Bauchspeicheldrüse Beta-Zellen4. Diese Verbindungen haben ihre Wirkung durch steigende Beta-Zell-Proliferation, überleben oder Glukose-stimulierten Insulinsekretion. Als Beispiel haben jüngste Studien gezeigt, dass Monomere Epicatechin Glukose-stimulierten Insulinsekretion erhöht durch Erhöhung der mitochondrialen Atmung und Erhöhung der zellulären ATP5Ebenen. Daher zu verstehen, wie diese Verbindungen funktionelle Beta-Zellen steigern können Masse ist wichtig, diese Verbindungen als potenzielle Therapeutika nutzen können.

Zellatmung kann durch eine Reihe von Werkzeugen gemessen werden. Verwendung von hochauflösenden Respirometer kann für die Titration der chemische Modulatoren, eine permeabilized oder intakte Zelle Bevölkerung6. Dieses Tool ermöglicht die Zugabe von verschiedenen Verbindungen in verschiedenen Konzentrationen, wodurch eine Vielzahl von Informationen.

Da die innige Verbindung zwischen Glukose-Stoffwechsel und Beta-Zell-Funktion, sind Messungen der Zellatmung entscheidend. Messungen der Zellatmung können erfolgen mit permeabilized oder intakte Beta-Zellen, mit jeweils einen eigenen Satz von vor- und Nachteile7,8. Während Permeabilisierung der Betazellen werden verschiedene Aspekte der Elektronentransport-Kette messen kann, geschieht dies ohne Rücksicht auf den Mechanismus zur Induktion der Atmung in die Beta-Zellen, die Glukoseaufnahme und den Stoffwechsel. Daher ist die Verwendung von unpermeabilized Beta Zellatmung eine sehr nützliche Technik, um die Beta-Zellen als Reaktion auf verschiedene Blutzuckerspiegel, mit Sauerstoff-Verbrauch als das Auslesen zu bestimmen.

Diese Technik dient Sauerstoffverbrauch in intakten INS-1 Messen 832/13 Beta-Zellen abgeleitet. Diese Technik ermöglicht es uns, die Antwort von Beta-Zellen für unstimulatory Glukose Bedingungen (2,5 mM Glukose) bestimmen sowie stimulierende Glukose Bedingungen (16,7 mM Glukose). Während die unpermeabilized Zellen nicht erlauben, einzeln testen Komplex I, II oder III des Elektrons Transportkette, die Technik erlaubt Messungen der Umgang mit komplexen IV Hemmung (Oligomycin A) abgekoppelt Atmung (FCCP-Carbonyl Zyanid- 4-(Trifluormethoxy-) Phenylhydrazone), und vollständig gehemmt Atmung (Antimycin A). Diese Studie zeigt die Wirksamkeit zur Messung der Atmung in den intakten unpermeabilized pankreatischen Betazellen, sowie die Wirkung von zwei natürlich vorkommenden Verbindungen, Monomere Epicatechin und Curcumin, auf Beta Zellatmung.

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Protocol

(1) Zellkultur

  1. Kultur INS-1 abgeleitet 832/13 Betazellen RPMI 1640 ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol9,10,11 ,12,13.
  2. Entfernen Sie 832/13 Zellen aus einem T75 Kolben mit 2 mL von 0,25 % Trypsin, Inkubation bei 37 ° C für 10 min. neutralisieren Trypsin durch Zugabe von 8 mL komplette RPMI 1640 Medien.
  3. Zählen von Zellen mit einem Hemocytometer und 100 µL das Zellvolumen aus Schritt 1.2 in 900 µL PBS verdünnen.
  4. Platte 832/13 Zellen bei einer Dichte von 2 x 106 Zellen/mL in einem 6 Gericht gut.
  5. Zellkulturen für 48 h in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 vor Beginn der Atmung Experimente.

2. Vorbereitung der Zellen hochauflösender Respirometrie

  1. Behandlung von 832/13 Zellen mit Kakao abgeleiteten Epicatechin Monomer.
    1. Kulturzellen Sie 832/13 für 24 h nach der Beschichtung in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.
    2. Ändern Sie Medien 24 h nach Beschichtung und behandeln Sie 832/13 Zellen mit Fahrzeugkontrolle (3 Brunnen) oder 100 nM Kakao Monomer (3 Brunnen), gefolgt von Kultur für weitere 24 h (48 h insgesamt) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2zu.
    3. Waschen Sie 832/13 Zellen in 1 x niedrige Glukose Sekretion Testpuffer (SAB) für 5 min. Aspirat Puffer zu, und inkubieren Sie 832/13 Zellen in 1 x niedrige Glukose SAB für 3 h, 1 x niedrige Glukose SAB stündlich ändern.
      1. Stellen 10 X SAB mit 33,32 g NaCl, KCl, 0,82 g KH2PO4, 0,7 g MgSO4 1,73 g und H2O zu einem Endvolumen von 500 mL hinzufügen. Sterilfilter die endgültige Lösung.
      2. 1 x niedrige Glukose SAB mit 10 mL 10 x SAB, 100 µL von 45 % Glucose, 2 mL 1 M HEPES, 1 mL von 0,25 M CaCl2, 0,57 mL 35 % BSA Lösung, 0,21 g Nahco33 machen und H2O zu einem Endvolumen von 100 mL hinzufügen. Sterilfilter die endgültige Lösung.
  2. Behandlung von 832/13 Zellen mit Curcumin.
    1. Kulturzellen Sie 832/13 für 48 h nach der Beschichtung in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.
    2. Waschen Sie 832/13 Zellen in 1 x niedrige Glukose SAB für 5 min. Aspirat Puffer zu, und inkubieren Sie 832/13 Zellen in 1 x niedrige Glukose SAB für 3 h, 1 x niedrige Glukose SAB stündlich ändern.
    3. Aspirieren Sie nach 2,5 h 3 h Inkubation in 1 x niedrige Glukose SAB Puffer und inkubieren Sie Zellen in 1 x Low Glukose SAB mit Fahrzeugkontrolle oder 40 µM Curcumin für 30 min. Nach Inkubation Aspirieren des Puffers.
  3. Zellen mit Trypsin für hochauflösender Respirometrie Ernte
    1. Entfernen Sie nach 3 h Inkubation in 1 x niedrige Glukose SAB die Zellen aus der Platte mit 250 µL 0.25 % Trypsin pro Bohrloch.
    2. Kombinieren Sie die Zellen in Trypsin aus 3 Brunnen mit Fahrzeugkontrolle oder Verbindung von Interesse mit 4 mL SAB in einem 15 mL konische Röhrchen behandelt.
    3. Zählen von Zellen mit einem Hemocytometer und 100 µL das Zellvolumen aus Schritt 2.3.2 in 900 µL PBS verdünnen.
    4. Verdünnen Sie die entsprechende Anzahl von Zellen in 1 x niedrige Glukose SAB 3 mL bei der entsprechenden Konzentration für jede Kammer zu machen. Die Daten zeigen, dass eine Konzentration von 1 x 106 Zellen/mL am effektivsten ist.
  4. Zellen mit mechanischen Dissoziation für hochauflösender Respirometrie Ernte
    1. Nach 3 h Inkubation in 1 X niedrige Glukose SAB, fügen Sie 1 mL 1 X niedrige Glukose SAB zu jedem gut und sanft Zellen aus der Platte mit mechanischen Dissoziation durch Schlag mit einem 1000 µL Pipettenspitze pipettieren.
    2. Kombinieren Sie die Zellen aus 3 Brunnen mit Fahrzeugkontrolle oder zusammengesetzte Interesse an insgesamt 3 mL SAB in einem 15 mL konische Röhrchen für die Atmung behandelt.

(3) hochauflösender Respirometrie

  1. Erstellung von hochauflösenden Respirometer.
    1. Die hochauflösende Respirometer und eine Verbindung zum Desktop durch die Einführung der Respirometer-Analyse-Programm.
    2. 70 % Ethanol aus beiden Kammern anzusaugen. Diese Kammern in 70 % igem Ethanol mindestens 45 Minuten lang einweichen.
    3. Waschen Sie die Kammern zweimal mit 70 % Ethanol, nach jedem Schritt absaugen.
    4. Waschen Sie die Kammern dreimal mit DdH2O, nach jedem Schritt absaugen.
    5. Spülen Sie die Kammer Kolben in DdH2O. Dies reinigt die restlichen Ethanol aus der Kolben und die Titan-Port.
  2. Kalibrierung der polarographischen Lambda-Sonden.
    1. Jede Oxygraph Kammer, unter ständigem Rühren den Puffer ständig mit magnetischen rühren Bars in der Kammer bei 750 u/min und 37 ° C mit einer Daten-Aufzeichnungsintervall bei 2,0 2,4 mL 1 x Low Glukose SAB Puffer hinzufügen s durch Drücken der F7-Taste und öffnen die Registerkarte mit der Bezeichnung "Systeme". Drücken Sie Kolben ganz hinein, und dann auf den Schraubenschlüssel Belüftung Einstellung zurücknehmen. Lassen Sie die Maschine equilibrate für ein Minimum von 1 Stunde bis stabile Sauerstoff Fluss erreicht ist.
    2. Stellen Sie die Maschine bei 37 ° C für die Dauer des Experiments. Stellen Sie Polarisation Spannung bis 800 mV, mit einem Gewinn von 2 durch Drücken der F7-Taste und öffnen die Registerkarte "Sauerstoff, O2". Equilibrate die Sauerstoffkonzentration des Puffers SAB für mindestens 30 min, während die Änderung der Sauerstoffkonzentration stabil ist (weniger als 2 pmol/(s*mL)).
    3. Wählen Sie nach Sauerstoff-Konzentration-Stabilisierung eine Region, wo die Änderung der Sauerstoffkonzentration stabile Hintergrundmessung des Wandels Sauerstoffkonzentration zu etablieren.
      1. Wählen Sie eine Region durch Drücken der Shift-Taste, Links-Klick auf die Maus und ziehen mit der Maus über den ausgewählten Bereich. Klicken Sie auf den Buchstaben der ausgewählten Region und Änderung "R1" für jede Spur, mit jedem der beiden Kammern entsprechend zugeordnet.
      2. Klicken Sie doppelt auf das "O2 Kalibrierung" Feld in der unteren linken und rechten Sie Ecken des Bildschirms, klicken Sie auf die "wählen Sie" für die "Luft-Kalibrierung" als R1 und wählen Sie dann "kalibrieren" und in die Zwischenablage kopieren"für beide Kammern.
  3. Beurteilung der Atmung von 832/13 Beta-Zellen in den Schritten 2.1.5 oder 2.2.5 vorbereitet.
    1. Laden Sie 2,4 mL der Probe in jeder Kammer (eine Kammer mit Fahrzeug behandelt Kontrollzellen, eine Kammer mit zusammengesetzten behandelten Zellen) 1 X niedrige Glukose SAB Behalten Sie 0,5 mL der Zellprobe für Protein Quantifizierung von BCA (Bicinchoninic Säure) Assay, wenn den mechanische Dissoziation Ansatz (Einfrieren bei-20 ° C für die Messung später) zu verwenden.
      1. Kolben ganz einschieben und das Restvolumen Aspirieren. Rühren Sie die Zellen kontinuierlich während des Experiments bei 750 u/min und 37 ° C für alle weiteren Schritte. Machen Sie eine Markierung, indem Sie auf F4 und Kennzeichnung als "Zellen", wenn Proben geladen werden.
      2. Proben für 30 min zu messen. Wählen Sie nach Signal-Stabilisierung eine Region des Wandels im Sauerstoff-Konzentration, die niedrige Glukose-Bedingungen (2,5 mM Glukose) entspricht, wie in 3.2.3 beschrieben.
    2. Nachdem Signal Stabilisierung erreicht ist, fügen Sie 12,5 µL einer 45 % sterile Glucoselösung (16,7 mM Endkonzentration) in jeder Kammer durch das Titan Verladehafen mit einer Spritze. Machen Sie eine Markierung gemessen "Glukose" als in 3.3.1 beschrieben, wenn Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie Signal zu stabilisieren und Zellatmung aufzuzeichnen, bis ein stabile Sauerstoff-Fluss erreicht wird. Wählen Sie diese Region des Wandels in Sauerstoff-Konzentration, wie 3.2.3 beschrieben. Dies ist die 16,7 mM Glukose Lesung und stimulierende Bedingungen7entspricht.
    3. Nach dem Signal Stabilisierung erreicht ist fügen Sie 1 µL 5mM Oligomycin eine (2,5 µM Endkonzentration) in jeder Kammer durch die Ladeöffnung hinzu. Machen Sie eine Markierung gemessen "OligoA" als in 3.3.1 beschrieben, wenn Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie Signal zu stabilisieren und Zellatmung aufzuzeichnen, bis ein stabile Sauerstoff-Fluss erreicht wird. Wählen Sie diesen Bereich der Kurve wie in 3.2.3 beschrieben. Oligomycin A hemmt die ATP-Synthase und ist somit die einzige Sauerstoff Flussmittel auftretenden über Leck von Elektronen und nicht Oxidative Phosphorylierung7.
    4. Nach Signal Stabilisierung erreichen hinzufügen 1 mM FCCP in Schritten von 1 µL bis eine maximale Atemfrequenz hergestellt wird. Dies entspricht maximal abgekoppelt Atmung. Zwischen 3-4 µL ist FCCP ausreichend (1,5-2,0 µM Endkonzentration) maximale abgekoppelt Atmung INS-1 832/13 Zellen induzieren. Machen Sie eine Markierung mit der Bezeichnung "FCCP" wie unter 3.3.1 beschrieben, wenn Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie Signal zu stabilisieren und Zellatmung aufzuzeichnen, bis ein stabile Sauerstoff-Fluss erreicht wird. Wählen Sie diesen Bereich der Kurve wie in 3.2.3 beschrieben. FCCP ist ein abkoppeln Agent. So lassen sich abgekoppelt Atmung7messen.
    5. Nach Signal Stabilisierung erreichen fügen Sie 1 µL 5 mM Antimycin A (2,5 µM Endkonzentration hinzu) in jeder Kammer durch die Ladeöffnung. Machen Sie eine Markierung mit der Bezeichnung "AntiA" wie unter 3.3.1 beschrieben, wenn Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie Signal zu stabilisieren und Zellatmung aufzuzeichnen, bis ein stabile Sauerstoff-Fluss erreicht wird. Wählen Sie diesen Bereich der Kurve wie in 3.2.3 beschrieben.
      Hinweis: Antimycin A bindet Cytochrom C-Reduktase, Ubichinon Oxidation hemmt und blockiert alle Atmung. Dies ermöglicht es uns, Atmung7vollständig zu stoppen.
  4. Messzellen 832/13 Beta für Protein-Konzentration und Atmung-Normalisierung.
    1. Mit Hilfe der 0,5 mL der Probe beim Laden, Maßnahme Protein Probe mit der BCA Methode13beibehalten.
    2. Führen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung, ohne Verdünnung, nach den Anweisungen des Herstellers.
  5. 832/13 Beta-Zelle Atmung Berechnungen aus trypsiniert Zellen.
    1. Geben Sie die Anzahl der Zellen pro mL Einsatz im Test durch Drücken der F3-Taste der Respirometer-Analyse-Programm. Ändern Sie die Einheiten in Zellen/mL, geben Sie die zelluläre Konzentration ein und ändern Sie Medium, SAB
    2. Wählen Sie Hintergrund Lesungen, die Daten zu normieren, indem auswählen und eingeben in der O2 Kalibrierung Form wie in 3.2.3 beschrieben.
    3. Treffen Sie die Auswahl der Lesungen von 2,5 mM Glukose, 16,7 mM Glukose, Oligomycin A, FCCP und Antimycin A wie unter 3.3.1 beschrieben.
    4. Innerhalb der Respirometer-Analyse-Programm exportieren Sie die Messwerte für jede Kammer nach Eingabe Proteinkonzentration und wählen die entsprechenden Mittelwerte für jede Behandlung während der Atmung-Messung. Dies geschieht, indem Sie auf F2 und dann drücken die "Copy to Clipboard-Funktion". Die Daten für den Einsatz in andere Programme exportiert. Verwenden Sie die "O2 Hang neg." Werte für Berechnungen.
    5. Kompilieren Sie Daten für 3 bis 5 unabhängigen Läufe des Fahrzeugs Kontrollen behandelt und natürlichen behandelten Zellen Verbindungen, um den Effekt auf intakte Zellatmung von INS-1 832/13 Beta-Zellen zu bestimmen.
  6. 832/13 Beta-Zelle Atmung Berechnungen von mechanisch getrennt Zellen.
    1. Geben Sie die Protein-Berechnungen von der BCA-Test durch Drücken der F3-Taste der Respirometer-Analyse-Programm. Ändern Sie die Einheiten in mg, geben Sie die BCA-Konzentration und verändern Medium, SAB
    2. Wählen Sie Hintergrund Lesungen, die Daten zu normieren, indem auswählen und eingeben in der O2 Kalibrierung Form wie in 3.2.3 beschrieben.
    3. Treffen Sie die Auswahl der Lesungen von 2,5 mM Glukose, 16,7 mM Glukose, Oligomycin A, FCCP und Antimycin A wie unter 3.3.1 beschrieben.
    4. Innerhalb der Respirometer-Analyse-Programm exportieren Sie die Messwerte für jede Kammer nach Eingabe Proteinkonzentration und wählen die entsprechenden Mittelwerte für jede Behandlung während der Atmung-Messung. Dies geschieht, indem Sie auf F2 und dann drücken die "Copy to Clipboard-Funktion". Die Daten für den Einsatz in andere Programme exportiert. Verwenden Sie die "O2 Hang neg." Werte für Berechnungen.
    5. Kompilieren Sie Daten für 3 bis 5 unabhängigen Läufe des Fahrzeugs Kontrollen behandelt und natürlichen behandelten Zellen Verbindungen, um den Effekt auf intakte Zellatmung von INS-1 832/13 Beta-Zellen zu bestimmen.

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Representative Results

INS-1 832/13 Beta-Zellen, die vorbereitet und geerntet wie im Protokoll beschrieben zeigen Modulation in Sauerstoff-Verbrauch anhand der verschiedenen chemischen Interventionen (Abb. 1A). Eine Zunahme der Atmung wird beobachtet werden, wenn die Glukosekonzentration auf 16,7 mM Glukose (Abbildung 1 b) erhöht wird. Atmung sinken, wenn die intakten Zellen mit Oligomycin A. behandelt werden Diese Atmung bekannt als Leck, definiert als die basale, nonphosphorylating Atemwege Zustand. Maximale Atmung soll erreicht werden, wenn die Beta-Zellen mit dem abkoppeln Agent FCCP, behandelt werden definiert als ETS Atmung oder Elektronentransport System Atmung. Zu guter Letzt sinkt Atmung auf Null wenn behandelt mit Antimycin A, beschriftet als ROX (Restsauerstoff Verbrauch) bezieht sich auf die nicht-respiratorischen zellulären Sauerstoff-Verbrauch.

Unterschiede in der Anzahl von Zellen werden wesentlich die Qualität der von dieser Technik gewonnenen Daten ändern. Glukose-induzieren Atmung wurde bei 0,5, 1 und 2 x 106 Zellen/mL (Abbildung 2A-2 C) gemessen. Mit Zellzahlen und BCA assays Protein, Proteinkonzentrationen entspricht der drei getesteten Zelle Konzentrationen berechnet wurden (Bild 2D). Messungen mit 0,5 x 10 zeigte6 Zellen/mL nicht nachgewiesen, dass Glukose stimulierte Atmung (Abbildung 2A) und nur die ETS erhöhte Atmung verbunden sind, erheblich sein. Dies deutet darauf hin, dass die niedrige Zellzahl ein low-Signal Rauschabstand ergibt, der die Ergebnisse verwirrt. In ähnlicher Weise führte Messungen bei 2 x 106 Zellen/mL auch erhebliche Variabilität, wie durch statistische Signifikanz nur erreicht wird, für die ETS-Messungen (Abbildung 2). Dies ist vermutlich auf die Notwendigkeit, die Kammern mehrere Male während der Test wieder mit Sauerstoff führte zu größeren Variabilität von Probe zu Probe. Diese Daten belegen, dass Konzentrationen von 1 x 106 Zellen/mL signifikante Glukose stimuliert die Atmung, Leckage- und ETS Messungen ergeben, die für die Atmung Analysen notwendig sind (Abb. 2 b und 2E).

Zwei Methoden zum Entfernen der Zellen für die Atmung werden in diesem Protokoll dargestellt. Mit Trypsin um Zellen zu entfernen, ist wirksam, wenn Messungen bei 37 ° c vollständig sind Atmung-Messungen in das Fehlen oder Vorhandensein von Curcumin (Abbildung 3A) zeigt Wartung von Glukose stimuliert die Atmung, Leckage- und ETS Atmung. Vergleich zu unbehandelten Zellen Curcumin behandelt Zellen zeigt keine Veränderung bei einem dieser respiratorischen Parameter (Abb. 3 b-C). Atmung-Messungen in das Fehlen oder Vorhandensein von Kakao Epicatechin Monomer (Abbildung 3D) zeigt auch Wartung der Glukose stimuliert die Atmung, Leckage- und ETS Atmung. Vergleich der Kakao Epicatechin Monomer behandelt zu unbehandelten Zellen Zellen zeigt erhöhte Atmung auf 2,5 mM und 16,7 mM Glukose sowie in Leck und ETS Atmung (Abbildung 3E-F). Diese Daten zeigen, dass Curcumin nicht 832/13 Beta Zellatmung verbessern, Kakao Epicatechin Monomer (Abbildung 3 wird). Curcumin hat sich gezeigt, zur Verbesserung der Insulin-Sekretion durch Hemmung der Phosphodiesterase Aktivität14. Unsere Daten deuten darauf hin, dass, dass Curcumin Insulinsekretion durch modulierende Funktion der Mitochondrien nicht verbessert. Wir haben bereits bewiesen, dass Kultur im Beisein von Kakao Epicatechin Monomere Ausdruck der verschiedenen Komponenten der mitochondrialen Elektronentransport-Kette5induziert. Wir beobachteten auch erhöhte Atmung in den Leck-Zustand (induziert durch Behandlung mit Oligomycin) und mit der ETS (Elektronentransportsystem, induziert durch FCCP). Die Verwendung dieses Tools enthält eine Reihe von potenziellen Zielen für zukünftige Studien.

Als Alternative zu Trypsin Entfernung von Zellen kann mechanische Dissoziation auch durchgeführt werden mit Hilfe der vorgestellten waschen-Technik nach Abschluss bei 37 ° C. Atmung-Messungen erfolgten in das Fehlen oder Vorhandensein von Curcumin oder Kakao Epicatechin Monomer (Abbildung 4A-C). Diese Daten zeigen, dass die Trends beobachtet mit Trypsin Vorbereitung der Zellen sind gepflegt, allerdings scheint die Empfindlichkeit vermindert werden. Während Kontrolle und Kakao Epicatechin Monomer beibehalten, die Glukose-stimulierten Zellen behandelt, behielten Leckage- und ETS Atmung, Zellen mit Curcumin behandelt nur die Glukose stimulierte Atmung durch die erhöhte Variabilität von Probe zu Probe. Während die Trends mit Trypsin Zelle Vorbereitungen beobachtet (Abb. 4-F) gepflegt wurden, sank die Bedeutung in allen Parametern, vermutlich um die größere Probe zu Probe Variabilität durch die mechanische Dissoziation eingeführt und die Normierung auf Protein-Konzentration statt Zelle Nummer.

Diese Daten zeigen, dass dieses Protokoll verwendet werden, um die Atmung der intakten INS-1 832/13 Beta-Zellen zu messen. Darüber hinaus schlägt unser Protokoll eine optimale Zelle Nummer für genaue Messungen und eine bevorzugte Methode für die Vorbereitung der Zellen, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren.

Figure 1
Abbildung 1 : Repräsentative Atmung Kurve der intakt 832/13 Betazellen. Intakt 832/13 Beta-Zellen sind für die Atmung in (Abbildung 1A) 2,5 mM Glukose, 16,7 mM Glukose, 2,5 µM Oligomycin, 2 µM FCCP (Carbonyl Zyanid -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) und 2,5 µM Antimycin a gemessen. Eine Erweiterung der 16,7 mM Glukose Abschnitt (Abbildung 1 b) wird vorgestellt, um die Erhöhung der Glukose-stimulierten Atmung zu demonstrieren. Zellen wurden in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/mL gemessen. Leck bezieht sich auf den basalen nonphosphorylating Atemwege Zustand, ETS bezieht sich auf die entkoppelten Atemvolumen Das Elektronentransportsystem und ROX bezieht sich auf den Restsauerstoff Verbrauch nach mitochondriale Atmung gehemmt wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Bestimmung der Anzahl von 832/13 Beta-Zellen für Glukose-induzierte Atmung Messungen. Intakt 832/13 Beta-Zellen sind für die Atmung bei Konzentrationen von (A) 0,5 x 106 Zellen/mL (B) 1 x 106 Zellen/mL oder (C) 2 x 106 Zellen/mL gemessen. (D) Protein-Konzentrationen, die mit 0,5 x 106 Zellen/mL, 1 x 106 Zellen/mL und 2 x 106 Zellen/mL entsprechen. (E) Vergleich der Atmung bei 0,5 x 106 Zellen/mL, 1 x 106 Zellen/mL und 2 x 106 Zellen/mL. Atmung unter 2,5 mM Glukose, 16,7 mM Glukose, 2,5 µM gemessen wurde Oligomycin, 2 µM FCCP und 2,5 µM Antimycin A-Bedingungen. Beatmung mit 2,5 und 16,7 mM Glukose demonstrieren die Glukose stimulierte Atmung Reaktion der Beta-Zellen. Atmung nach Oligomycin zeigt die Leck-Atmung (basale, nonphosphorylating Atemwege Zustand). Atmung nach FCCP (Carbonyl Zyanid -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) Behandlung zeigt (abgekoppelt Atemvolumen Elektronentransportsystem, ETS). n = 6 unabhängige Pisten. Daten werden dargestellt, als durchschnittliche ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 *** p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Atmung Messungen der Betazellen 832/13 nach der Entlassung mit Trypsin. 832/13 Beta-Zellen wurden in das Vorhandensein oder Fehlen von Monomeren Kakao Epicatechin kultiviert oder Curcumin und Atmung wurde nach der Veröffentlichung von Zellen mittels Trypsin gemessen. Atmung unter 2,5 mM Glukose, 16,7 mM Glukose, 2,5 µM gemessen wurde Oligomycin, 2 µM FCCP und 2,5 µM Antimycin A-Bedingungen. Beatmung mit 2,5 und 16,7 mM Glukose demonstrieren Glukose stimulierte Atmung. Atmung nach Oligomycin zeigt die Leck-Atmung (basale, nonphosphorylating Atemwege Zustand). Atmung nach FCCP (Carbonyl Zyanid -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) Behandlung zeigt (abgekoppelt Atemvolumen Elektronentransportsystem, ETS). Atmung nach Antimycin eine Behandlung zeigt verbleibende Sauerstoffverbrauch (ROX). (A) Behandlung von 832/13 Zellen mit Curcumin unterhält die entsprechenden Änderungen in der Atmung durch die Behandlungen. Repräsentative Trace (B) und (C) im Durchschnitt der Daten für Zellen mit Curcumin behandelt zeigt keine Änderung 832/13 Beta Zellatmung. (D) Behandlung von 832/13 Zellen mit Kakao Epicatechin Monomer unterhält die entsprechenden Änderungen in der Atmung durch die Behandlungen. Repräsentative Trace (E) und (F) Durchschnitt der Daten für Kakao Epicatechin Monomer behandelt Zellen zeigt erhöhte Atmung in allen Parametern nach Kakao Epicatechin Monomer Behandlung. (G) alle drei Parameter werden zusammen zum Vergleich präsentiert. n = 6 unabhängige Pisten. Daten werden dargestellt, als durchschnittliche ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 *** p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Atmung Messungen der Betazellen 832/13 nach der Entlassung mit mechanischen Dissoziation. 832/13 Beta-Zellen wurden in das Vorhandensein oder Fehlen von Monomeren Kakao Epicatechin kultiviert oder Curcumin und Atmung wurde nach der Veröffentlichung von Zellen unter Verwendung von mechanischen Dissoziation gemessen. Atmung unter 2,5 mM Glukose, 16,7 mM Glukose, 2,5 µM gemessen wurde Oligomycin, 2 µM FCCP und 2,5 µM Antimycin A-Bedingungen. Beatmung mit 2,5 und 16,7 mM Glukose demonstrieren die Glukose-Reaktion der Beta-Zellen. Atmung nach Oligomycin zeigt die Leck-Atmung (basale, nonphosphorylating Atemwege Zustand). Atmung nach FCCP (Carbonyl Zyanid -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) Behandlung zeigt (abgekoppelt Atemvolumen Elektronentransportsystem, ETS). Mittelwert der Daten für Zellen (A) unbehandelten Zellen oder Zellen mit (B) Curcumin behandelt oder (C) Kakao Epicatechin Monomer zu demonstrieren, dass mechanische Dissoziation unterhält Glukose stimulierte Atmung bei allen Behandlungen, während Leck und ETS Bedeutung sind nur in Curcumin behandelt Zellen verloren. Vergleich der unbehandelten Zellen (D) Curcumin oder (E) Kakao Epicatechin Monomer zeigt erhöhte Atmung in allen Parametern mit Kakao Epicatechin Monomer mit keine signifikante Veränderung zur Beatmung mit Curcumin. (F) alle drei Parameter werden zusammen zum Vergleich präsentiert. n = 6 unabhängige Pisten. Daten werden dargestellt, als durchschnittliche ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Das Ziel dieses Protokolls ist mit hochauflösender Respirometrie Atemfrequenz in intakten pankreatischen Betazellen messen. Diese Methode ermöglicht die Messung der Reaktion der Beta-Zellen auf erhöhte Blutzuckerwerte. Das Protokoll ermöglicht auch die Vorbehandlung mit verschiedenen Verbindungen, wie in diesem Protokoll mit den natürlich vorkommenden Monomere Epicatechin oder Curcumin4,5gezeigt. Behandlung mit verschiedenen anderen Verbindungen könnte in diesem Protokoll mit der Vorbehandlung (wie hier gezeigt) oder durch die Behandlung innerhalb der Atemwege Kammern mit minimalen Änderungen an der Basis-Protokoll verwendet werden.

Es gibt verschiedene Möglichkeiten, mit denen diese Methode geändert werden kann. Andere Beta-Zell-Linien könnten verwendet werden; Allerdings müssen die Zellzahl und SAB Waschzeiten experimentell ermittelt werden. Primäre Nagetier und menschlichen Inselchen könnte auch verwendet werden; die Anzahl der Zellen oder Insel-äquivalente müssen jedoch auch experimentell bestimmt werden. Mindestens eine Studie hat Inselchen Sauerstoffverbrauch mit hochauflösender Respirometrie15gemessen. Diese Studie 400 Inseln pro Reaktion erforderlich, aber nicht Glukose induzierte Atmung Veränderungen messen. Angesichts der Tatsache, dass primäre Gewebe mit hochauflösenden Respirometers16,17häufig verwendet wird, könnte intakte Inselchen nach experimentellen Fehlersuche verwendet werden. Allerdings ist angesichts der großen Zahl von Inseln, die für diesen Test benötigt, andere Methoden zur Messung der Sauerstoff-Verbrauch besser für Messungen der primären Inselchen Atmung geeignet.

Es gibt ein paar wichtige Schritte mit dem vorgestellten Protokoll. Erstens ist es wichtig, mit einer ausreichenden Anzahl von Zellen. Unsere Studien zeigen, dass 832/13 Beta-Zellen in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/mL ist ausreichend für Glukose stimulierte Atmung Messungen. Messungen mit 0,5 x 10 gezeigt6 Zellen/mL, niedrige Glukose stimulierte Atmung und ein low-Signal Rauschabstand. Zudem führte Messungen mit 2 x 106 Zellen/mL hohe Variabilität von Probe zu Probe und schnelle zelluläre Verwendung von Sauerstoff die erforderlichen Kammer wieder mit Sauerstoff und häufig führte zu schnellen Zelltod. Die entsprechende Anzahl von Zellen sollten für die gegebenen Zellinie experimentell ermittelt werden, um diesen wichtigen Schritt zu beheben.

Ein zweiter wichtiger Schritt bereitet den Beta-Zellen reagieren auf erhöhte Blutzuckerwerte. Die Nährmedien RPMI 1640 hat hohe Blutzuckerwerte. Die Zellen müssen auf eine niedrige Glukose-Kultur aus der hohen Glukose verschoben werden. Ein 3 h Inkubation in 1 X Low Glukose SAB ist ausreichend für die Beta-Zellen haben eine deutliche Reaktion auf die Zugabe von ~16.7 mM Glukose. Waschen Sie Zeiträume von weniger als 3 h Ergebnis in Variable Antworten auf die Zugabe von Glukose. Problembehandlung bei Glukose Reaktion kann durch Erhöhung der Länge der SAB Waschzeit angesprochen werden.

Ein dritter wichtiger Schritt ist die Methode für die Vorbereitung der Zellen Messungen. Unsere Daten zeigen, dass während Trypsin und mechanische Dissoziation beide verwendet werden können, Trypsin Zellen Ergebnis konsequenter Lesungen und weniger Probe zu Probe Variabilität veröffentlicht. Mit beiden Methoden beobachtete Trend war gepflegt, aber die Stärke der Daten mit den Zellen zubereitet Trypsin größer war. Während andere Methoden, z. B. Zelle Schaben, verwendet werden, können unsere Daten deuten darauf hin, dass die Verwendung von Trypsin in den meisten reproduzierbare Ergebnisse mit weniger Variabilität von Probe zu Probe18,19 führt.

Grenzen dieses Ansatzes sind die folgenden. Zunächst mit nur zwei Behandlungskammern ist dies keine Hochdurchsatz-screening-Methode. Jede Ausführung zweier Proben dauert zwischen 3-4 h, einschließlich der Zeit, die Maschine vorzubereiten. Zweitens ist eine relativ große Konzentration von Zellen für den Assay, angesichts die ~2.2 mL der Probe (oder ~2.2 X 106 Zellen) benötigt pro Kammer erforderlich. Aufgrund der Menge der Probe für den Test benötigt ist die Verwendung von diesem Tool und Protokoll für primäre Inselchen begrenzt, es sei denn, ein großes Angebot zur Verfügung steht. Die frühere Studien, die Inseln für die Atmung in dieser Technik verwendet haben verwendet ~ 400 Inseln/Kammer15. Dies würde erfordern, etwa, Inselchen aus zwei Mäuse für jede Kammer20. Drittens weil permeabilized Zellen nicht verwendet werden, ist die Fähigkeit, bestimmen die Wirkung der Behandlung auf einzelne Elektron Kette Komponenten mithilfe von Verbindungen, die nicht Zelle durchlässig sind nicht verfügbar.

Es gibt eine Reihe wesentlicher Vorteile dieses Protokolls in Bezug auf bestehende Methoden. Erstens können dieses Protokoll für die stufenweise Titration der verschiedenen Verbindungen, die Membran durchlässig. Dies ermöglichen die genaue Bestimmung der notwendigen Konzentrationen. Verwendung von intakten Betazellen ermöglicht uns die Auswirkungen auf die cytosolische und mitochondriale Glukose-Stoffwechsel-7Abfragen. Dies ermöglicht es uns, Phänotypen bezeichnend für Änderungen an den glykolytischen Weg, eine Beobachtung zu beobachten, die verloren geht, wenn permeabilized Zellen mit. Drittens erlauben die intakten Zellen uns, die Reaktion auf erhöhten Glukose als Metrik der Beta-Zellen-Funktion verwenden, die in permeabilized Varianten des Assays verloren geht. Schließlich ermöglicht dieses Protokoll für die Zugabe von verschiedenen und mehrere Verbindungen, die Wirkung von Verbindungen auf Beta Zellatmung, Luxus abzufragen, die nicht mit anderen Tools vorhanden ist, die Atmung zu messen.

Zukünftige Anwendungen dieser Methode umfassen die Möglichkeit, Parameter wie ATP, Kalzium und H2O2 Ebenen gleichzeitig mit Messungen der Atmung zu messen. Diese Methode ermöglicht auch für die Messung der Atmung im Beisein von anderen Energiequellen, wie Fettsäuren oder Ketone. Schließlich können mit einigen Änderungen auch Messhöhen sekretierten Insulin mit Atmung Messungen möglich sein.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren möchten den Tessem und Hancock Labors für Assistenten und wissenschaftliche Diskussion danken. Die Autoren danken für die Bereitstellung der Kakao abgeleiteten Epicatechin Monomer Bruchteil Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech). Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Diabetes Action Research and Education Foundation, JST.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O2k Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 Instrument for high-resolution respirometry
DatLab 6 Program Oroboros Instruments 27141-01 Computer program for analysing high-reolution respirometry
INS-1 832/13 cell line Duke University Medical Center NONE Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard
Curcumin Sigma C7727 Pre-treatment of beta cells
Cocoa epicatechin monomer Virginia Polytechnic Institute and State University NONE Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson
Trypsin Sigma T4049 For cell culture
RPMI-1640 Sigma R8758 832/13 beta cell media
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 832/13 beta cell media component
Penicillin-streptomycin Sigma P4458 832/13 beta cell media component
HEPES Sigma H3662 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer
Glutamine Caisson GLL01 832/13 beta cell media component
Sodium Pyruvate Sigma S8636 832/13 beta cell media component
2-Mercaptoethanol Sigma M3148 832/13 beta cell media component
NaCl Fisher S271 Component of 10x SAB buffer
KCl Sigma P9541 Component of 10x SAB buffer
KH2PO4 Sigma P5655 Component of 10x SAB buffer
MgSO4 Sigma M2643 Component of 10x SAB buffer
D-(+)-Glucose Solution Sigma G8769 Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay
CaCl2 Sigma C5670 Component of 1x SAB buffer
35% BSA Solution Sigma A7979 Component of 1x SAB buffer
NaHCO3 Sigma S5761 Component of 1x SAB buffer
200 proof ethanol Sigma 459844 Washing Oxygraph O2k Chambers
Oligomycin A Sigma O4876 Chemicals for respiration assay
FCCP Sigma C2920 Chemicals for respiration assay
Anitmycin A Sigma A8674 Chemicals for respiration assay
BCA Protein Kit Thermo Fisher 23225 For determining protein concentration

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References

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Zellbiologie Ausgabe 131 Beta-Zellen Mitochondrien Atmung Glukose hochauflösender Respirometrie Kakao Epicatechin Monomer curcumin
Hochauflösender Respirometrie, mitochondriale Funktion intakt Beta-Zellen in Anwesenheit von Naturstoffen zu messen
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Kener, K. B., Munk, D. J., Hancock, C. R., Tessem, J. S. High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds. J. Vis. Exp. (131), e57053, doi:10.3791/57053 (2018).

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