칩 기반 디지털 PCR에 의해 신선한 냉동 위 암 조직에서 CDH1 드문 사본 이체의 탐지

Summary

원고는 칩 기반 디지털 PCR 분석 결과를 신선한 냉동 정상에 드문 CDH1 사본 이체 (CDH1a) 및 위 암 환자에서 얻은 종양 조직 검출을 설명 합니다.

Abstract

반면 결 석 CDH1a, CDH1 유전자의 정식이 아닌 대 본 일부 위 암 (GC) 셀 라인에 표현 될 발견 되었습니다 정상 위 점 막에서. 최근에, 우리는 GC 가진 환자에서 얻은 신선한 냉동 종양 조직에 CDH1a 사본 이체를 감지. 조직 샘플에서이 이체의 식 칩 기반 디지털 PCR (dPCR) 접근 방식에 의해 여기에 제시 된 조사 했다. dPCR 핵 산의 정확한, 강력한, 그리고 매우 중요 한 측정에 대 한 잠재력을 제공 하 고 점점 더 다양 한 분야에 많은 응용 프로그램에 대 한 활용. dPCR는 감지 드문 목표; 또한, dPCR는 교정기 및 표준 곡선에 대 한 필요 없이 핵 산의 완전 하 고 정확한 정량화에 대 한 가능성을 제공합니다. 사실, 증폭 효율과 억제제에 내성 향상 배경에서 대상을 풍요롭게 반응 분할. 이러한 특성 dPCR CDH1a 희소 한 대 본의 검출을 위한 최적의 도구를 확인합니다.

Introduction

CDH1 유전자 세포 접착, 생존, 확산, 및 마이그레이션¹의 규제를 통해 정상적인 위 상피의 유지에 관여 하는 핵심 요소 E cadherin 위한 인코딩합니다. 해로운 생식의 결과로 전자 cadherin 단백질의 손실 또는 CDH1 의 체세포 변경 GC^2,3의 개발과 관련 된 되었습니다. Intron의 유전자 2에서 발생 하는 비 정식 성적 증명서 또한 위 발암^4,5에 역할을 가설 되어 있다. 특히, 이러한 한 사본, CDH1a, GC 셀 라인에 표현 될 표시 되었습니다 하지만 결 석 정상 위⁴에서. 우리는 최근 칩 기반 dPCR⁵를 사용 하 여 GC 환자에서 GC 조직 샘플에서 CDH1a 를 감지. dPCR CDH1a 유전자 사본 장 GC에 정상 조직에의 존재를 처음으로 평가 하는 데 사용 되었다.

유전자 발현을 확인 하기 위해 표준 방법은 실시간 양이 많은 PCR (정량)입니다. 그러나, 결과 데이터 때로는 변수 수 이며 가난한 품질, 특히 때 샘플에는 대상의 수준 낮은. 이 변화는 일반적인 증폭 및 경쟁 측 반응⁶뇌관 어 닐 링, 및 중 합 효소 활동을 억제 하는 오염 물질에 의해 발생할 수 있습니다.

DPCR의 기본적인 생 화 확 적인 원리는 정량의 그들과 유사 하, dPCR genomic DNA (gDNA)의 매우 정확한 측정을 위해 수 있도록 하는 몇 가지 장점을 보여줍니다 / 보완 DNA (cDNA) 분자. 실제로, dPCR 각각 잘 0 또는 단일 대상 분자 포함 되도록 수천 웰 스, 샘플의 보정 분할에 의존 하는 끝점 반응입니다. 증폭 대상의 복사본을 포함 하는 우물에만 발생 합니다 그리고 형광 신호에 의해 표시 됩니다. 원래 샘플에서 대상 분자의 절대 수 다음 이항 포아송 통계⁷를 사용 하 여 전체 파티션을 긍정적인의 비율을 결정 하 여 계산할 수 있습니다.

DPCR 기술 표준 곡선을 실행 하기 위한 필요성을 제거 하는 또한, 및, 따라서, 연결 된 바이어스 및 다양성, 대상^8,9;의 직접 정량화에 대 한 허용 그것은 오염 물질과 효율성 억제제¹⁰; 높은 관용 때문에 독립적으로 더 정확 하 고 재현 가능한 결과 생산 하 그것 더 과민 하 고 정량, 보다 구체적 이며 따라서 드문 대상의 검출에 대 한 신뢰할 수 있는 방법입니다. 마지막으로, 여러 반응으로 샘플의 분할 배경 분자와 경쟁 줄어들고 대상 검출, 증폭을 가능 하 게 하 고 gDNA/cDNA^{6의 단일 분자의 검출 한계 향상} . 검색 및 칩 기반 dPCR에 의해 핵 산의 정량화 점점에 적용 된 복사 번호 유사, DNA의 정량화는 파편, 그리고 돌연변이 분석^11,,1213, 주어진는 정밀도 낮은 자료 입력 방법의 요구 사항. 또한, dPCR는 최근 두 microRNAs¹⁴ 그리고 유전자 사본^5,15의 분석에 통합 되었습니다.

Protocol

프로토콜은 IRST 인간의 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 참고:이 절차는 신선한 냉동 인간의 조직에 cDNA 분자의 낮은 수의 탐지를 위해 특별히 설계 되었습니다. 조직 섹션 동안 여전히 동결, 이전 검증된 환자 파생 위 종양 또는 정상적인 조직 샘플에서 드라이 아이스에 잘라 왔다. 1. RNA 분리 및 정화 RNA 추출참고: 특정 제품을…

Representative Results

여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 우리는 위 신선한 냉동 조직에 드문 사본 이체 CDH1a 의 표현에 대 한 확인 합니다. DPCR에 의해 분석 및 11 추가 종양 샘플 21 쌍 정상 및 암 조직 샘플에서 수행 되었다. 아니 정상적인 조직 샘플 보여이 희소 한 대 본5의 존재 하는 반면 CDH1a 15 중 32 (47%) 종양에서 감지 했다. 우리의 분석으로 비 균질 로드 칩 미…

Discussion

dPCR는 원래 위해 개발 DNA 분자 측정^10,11,,1213 시간 microRNAs 및 RNA 사본^{5의 정량화에이 기술을 적응 했다 , 1415}. 이 프로토콜에서 우리는 신선한 냉동 조직 샘플에서 파생 된 희귀 증명서의 탐지를 포함 하는 응용 프로그램의 목록을 확…

Materials

TRIazol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Glycogen 20 mg/ml	ROCHE	10901393001
RNeasy MinElute Cleanup kit	QIAGEN	74204
iScript cDNA Synthesis kit	BioRad	1708891
QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2	Thermo Fisher Scientific	A26358
CDH1a IDT custom designed assay	Integrated DNA Technologies (IDT)	NA	F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F),        900 nM (R), 250 nM (P)]
QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2	Thermo Fisher Scientific	A26316
Heraeus Biofuge Fresco	Thermo  Scientific	75002402
Thermocycler (Labcycler)	Sensoquest	011-103
GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	N805-0200
Dual Flat Block Sample Module	Thermo Fisher Scientific	4425757
QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	4486414
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4485513
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader	Thermo Fisher Scientific	4482592
QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord	Thermo Fisher Scientific	4489084