Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

זיהוי של Variant התעתיק נדיר CDH1 ברקמות מוקפאות סרטן קיבה על ידי מבוססי שבב דיגיטלי PCR

Published: February 5, 2018 doi: 10.3791/57066
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

Summary

כתב היד מתאר מבוססי שבב דיגיטלי PCR assay לזהות נדיר CDH1 התעתיק variant (CDH1a) רגילה מוקפאות ורקמות הגידול המתקבל בחולים עם סרטן קיבה.

Abstract

CDH1a, תעתיק קאנונית של הגן CDH1 , נמצאה לבוא לידי ביטוי כמה שורות תאים של סרטן קיבה (GC), ואילו זה נעדר ב רירית קיבה נורמלית. לאחרונה, הבחנו variant תעתיק CDH1a ברקמות הגידול מוקפאות המתקבל חולים עם GC. הביטוי של זה וריאנט של דגימות רקמה נחקר על ידי מבוססי שבב דיגיטלי PCR (dPCR) הגישה המובאת כאן. dPCR מציע את הפוטנציאל מדידה מדויקת, חזקים, רגישה מאוד של חומצות גרעין, הוא מנוצל יותר ויותר עבור יישומים רבים בתחומים שונים. dPCR הוא מסוגל גילוי מטרות נדיר; בנוסף, dPCR מציע את האפשרות על כימות מוחלטת ומדויק של חומצות גרעין ללא צורך כיילים ועיקולים סטנדרטי. למעשה, התגובה למחיצות מעשיר את המטרה מהרקע, אשר משפר את עמידות בפני מעכבי ויעילות הגברה. תכונות אלה להפוך dPCR כלי אופטימלית עבור זיהוי בתמליל נדירים CDH1a .

Introduction

הגן CDH1 מקודד עבור E-קדהרין, גורם מפתח מעורב קיומם של האפיתל קיבה רגיל באמצעות ויסות תא אדהזיה, הישרדות, הפצה, העברה1. איבוד חלבון E-קדהרין כתוצאה germline ברישול או שינויים סומאטית של CDH1 היה קשור עם התפתחות GC2,3. Non-קנונית תעתיקים הנובעים אינטרון 2 של הגן יש גם היה שיערו לשחק תפקיד carcinogenesis קיבה4,5. בפרט, אחד תעתיק כזה, CDH1a, הוכח להתבטא שורות תאים GC אבל הוא נעדר מן בקיבה נורמלי4. לאחרונה גילינו CDH1a GC דגימות רקמות מחולים GC משתמש המבוסס על שבב dPCR5. dPCR שימש כדי להעריך, בפעם הראשונה, הנוכחות של בתמליל ג'ין CDH1a GC מעיים, רקמה נורמלית.

השיטה תקן הזהב כדי לקבוע ביטוי גנים היא PCR כמותי בזמן אמת (qPCR). עם זאת, הנתונים המתקבלים לפעמים יכול להיות משתנה, באיכות ירודה, במיוחד כאשר רמת היעד במדגם הוא נמוך. ההשתנות יכולה להיגרם על ידי מזהמים, ומפריעים פולימראז פעילות של פריימר חישול, המוביל שאינם ספציפיים הגברה צידו התחרותי תגובות6.

העקרונות הבסיסיים הביוכימי של dPCR אמנם דומים לאלה של qPCR, dPCR מראה כמה יתרונות, מתן אפשרות עבור מדידות מדויקות מאוד של דנ א גנומי (gDNA) / משלימים במולקולות דנ א (cDNA). אכן, dPCR הוא לתגובה מובילים המסתמך על מכוילת חלוקת מדגם לאלפי וולס, כך שכל אחד טוב מכיל אפס או מולקולה יעד בודד. הגברה ואז מתרחשת רק אצל הבארות המכיל עותק של המטרה, הוא הצביע על ידי אות ניאון. המספר המוחלט של היעד מולקולות במדגם המקורי ואז יכול להיות מחושב על-ידי קביעת יחס חיובי הכולל מחיצות באמצעות פואסון בינומי סטטיסטיקה7.

בנוסף, הטכניקה dPCR מבטל את הצורך להפעיל עיקול רגיל ומכאן הטיה המשויך ולשינויים, המאפשרות כימות ישירה של מטרות8,9; הוא מייצר תוצאות מדויקות יותר לשחזור ללא תלות מזהמים ויעילות בשל שלה עמידות גבוהה בפני מעכבי10; זה הוא רגיש יותר ספציפית יותר qPCR, והוא לכן שיטה אמינה עבור זיהוי מטרה נדיר. לבסוף, חלוקת המדגם לתוך תגובות מרובות מפחיתה את התחרות עם רקע מולקולות ומשפר את הגבול של גילוי מטרה, כך הגברה מאפשר והקלה הגילוי של מולקולות יחיד של gDNA/cDNA6 . זיהוי, כימות של חומצות גרעין על ידי מבוססי שבב dPCR יותר ויותר הוחל להעתיק מספר וריאציות, כימות של ה-DNA שברים, וניתוחים מוטציה11,12,13, נתן דיוק של החומר נמוכה קלט דרישה של השיטה. בנוסף, dPCR לאחרונה שולב הניתוח של שני מיקרו Rna14 וג'ין תעתיקים5,15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול עוקב אחר הקווים המנחים של ועדת האתיקה IRST מחקר אנושי.

הערה: הליך זה היא תוכננה במיוחד עבור זיהוי מספר נמוך של cDNA מולקולות ברקמות אנושיות מוקפאות. הסעיפים רקמות צומצמו בקרח יבש, בעוד עדיין קפוא, הגידול המאומת בעבר נגזר החולה קיבה או דגימות רקמה נורמלית.

1. RNA בידוד וטיהור

  1. החילוץ-RNA
    הערה: בידוד RNA מתבצע מתחת למכסה המנוע באמצעות מוצר מסוים (ראה טבלה של חומרים). עם זאת, מגוון רחב של אלייזה זמינים מסחרית.
    1. Homogenize 50-100 מ"ג של דגימת הרקמות קפוא טרי חתוך דק צינור 1.5 מ עם 1 מ"ל של RNA בידוד ריאגנט ו מערבולת נמרצות עבור Incubate ס' 15 הצינורות ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. דגירה של שפופרת המכילה את הדגימה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, מערבבים על-ידי vortexing עבור 15 s.
    3. לשמור את הצינורית על קרח, להוסיף 200 µL של כלורופורם, מערבולת נמרצות במשך 15 s.
    4. דגירה של הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 60 s, צנטריפוגה ב 12,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.
    5. להעביר את השלב מימית צינור 1.5 מ"ל ולהוסיף 20 µg של גליקוגן.
      הערה: חשוב להימנע בקפידה העברת לאטמוספרה או שכבה אורגני כדי לצמצם זיהום.
    6. להוסיף 500 µL של אלכוהול איזופרופיל, היפוך את הצינור כדי לערבב, דגירה על קרח למשך 10 דקות.
    7. Centrifuge את הצינור ב g x 12,000 למשך 15 דקות ב 4 ° C, כדי לזרז את ה-RNA.
      הערה: RNA יהיה נוכח גלולה דמוי ג'ל בצד ולמטה של הרכבת התחתית, לעתים קרובות בלתי נראה לאחר צנטריפוגה.
    8. הסר את תגובת שיקוע מבלי להפריע את התמיסה, לשטוף אותו עם 1 מ"ל של 75% אתנול על-ידי pipetting.
    9. Centrifuge את הצינור ב 7,500 g x עבור 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר.
    10. תן בגדר יבש עד התמיסה הופכת לשקופה, לפזר זאת בתוך µL 50 RNase ללא מים.
    11. להקפיא את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס לפחות ללילה לפני כמת.
  2. חיסול דנ א גנומי וטיהור RNA
    הערה: צעד עיכול DNase, ואחריו טיהור RNA מבוססי עמודה, מומלצת עבור ניתוחים של מטרות נמוך-שפע כדי לעכל דנ משחיתה.
    1. להמיס את DNase lyophilized אני (1,500 קוניץ יחידות) ב 550 µL של נטול RNase מים באמצעות מזרק, לערבב בעדינות על-ידי היפוך המבחנה, ולא לחלק את הפתרון מניות משוקם aliquots.
    2. העברת צינור 1.5 mL הנפח מחושב של הדגימה עם 15 µg של RNA µL 10 DNase העיכול מאגר הערכה (הרשומים בטבלה של חומרים), 2.5 µL של DNase אני הפתרון מניות, נטולת RNase למים ל 100 µL. Incubate בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    3. להוסיף 350 µL מאגר פירוק רקמת (הערכה, ראה טבלה של חומרים) על ידי pipetting.
    4. להוסיף 250 µL של 100% אתנול וביו -מיקס על ידי pipetting.
    5. להעביר את כל אמצעי האחסון (700 µL) לתוך עמודה חדשה ספין צנטריפוגה ב 12,000 x g 15 s.
    6. להעביר את המסנן לתוך צינור אוסף חדש, להוסיף 500 µL של 80% כוהל העמודה ואת צנטריפוגה ב 12,000 x g למשך 2 דקות.
    7. פותחים את המכסה של עמודה ספין, צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 5 דקות עם צינור אוסף חדש כדי לייבש את המסנן; ואז להעביר את המסנן צינור 1.5 מ.
    8. להוסיף µL 14 של מים נטולי RNase ישירות סינון העמודה ואילו צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 1 דקות.
    9. שומרים את הדגימות על הקרח להמשיך כימות באמצעות 2 µL של המדגם על ספקטרופוטומטרים ספסל-העליון או לאחסן את הרנ א ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.

2. cDNA סינתזה

  1. במקום 1,000 ng של RNA, µL 4 של מיקס מאסטר, µL 1 של רוורס טרנסקריפטאז ומים ללא RNase לאמצעי הסופי של 20 µL בשפופרת PCR סטרילי. לערבב בעדינות, ספין למטה.
  2. דגירה המיקס התגובה ב הצנטרפוגה תרמי, החלת התנאים הבאים: 5 דקות 25 ° c, 30 דקות ב- 42 ° C, 5 דקות ב 85 מעלות צלזיוס.
  3. Centrifuge הצינורות בקצרה להמשיך dPCR ניתוח או לאחסן ב-20 ° C עד שהוא נדרש.

3. PCR דיגיטלי תגובת להגדיר

  1. התגובה dPCR לערבב, לטעום הכנה
    1. להפשיר את תערובת הבסיס ואת וזמינותו בטמפרטורת החדר במשך לפחות 20 דקות.
    2. לדלל את דגימות cDNA ריכוז של 300 ng ב- 6 µL של מים.
    3. בעדינות מערבולת המאסטר לערבב, להכין את התמהיל בשפופרת סטרילי עם 8.7 µL של מיקס מאסטר, µL 0.87 של CDH1a assay מעוצב מותאם אישית ומהצמיגים 1.83 µL של מים נטולי נוקלאז נפח סופי של 11.4 µL.
      הערה: לקבלת CDH1a assay מעוצב מותאם אישית פריימר פרטים ראה את הטבלה של חומרים.
    4. µL 11.4 של המיקס מוכן להעביר הדגימה cDNA מדולל, מערבבים בעדינות, בקצרה צנטריפוגה.
      הערה: אמצעי אחסון כוללים 20% עודף כדי לפצות על אובדן נפח של pipetting. להכין את התערובת כל דוגמאות ופקד אין תבנית (NTC).
  2. הכנת צ'יפס
    הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות לטעון את האסימונים בהקדם האפשרי.
    1. הכנס מטעין שבב והמתן עד שנורית החיווי הופך לירוק.
    2. להסיר את הכובע של המזרק נוזלים טבילה על-ידי בעדינות למשוך בחזרה על הבוכנה 1-2 מ מ, משחררים אותו כדי להקל על שלב זה, ולהחליף אותו עם טיפ.
    3. שבב חדש ואין לרשום הקוד שנכתב על המכסה כדי לשייך אותה המדגם.
    4. להחזיק את המכסה בזהירות על ידי הצד שלו, הקילוף הסרט המגן ולמקם את המכסה עם הפנים נדבקים למעלה לכיוון הנכון.
    5. . ובזהירות לאסוף שבב, מטפל לא לגעת החלק הפנימי, להעמיס אותם על הקן שבב בתנוחה הנכונה על ידי לחיצה הידית כדי לפתוח את המלחציים
    6. לטעון להב הטעינה חדש לתוך מטעין ודחף אותו בעדינות כדי לוודא שהוא מחובר בחוזקה במקום.
    7. העברת µL 14.5 של המיקס תגובה dPCR על גבי הלהב הטעינה מבלי לבצע בועות אוויר הסחה הלהב, לאחר תודה השחור טעינת כפתור כדי להפיץ את עוצמת הקול על השבב.
    8. להשתמש במזרק נוזלים טבילה להעביר כ 20 טיפות על גבי משטח השבב מקפיד לא לעלות על פני השטח עם הקצה.
      הערה: חשוב לכסות את השטח כולו מבלי לשפוך נוזל פינות.
    9. לסובב את הזרוע מטעין כדי להפוך את המכסה לבוא במגע עם השבב ולחץ מטה עבור 15 s.
    10. לחץ על לחצן המכסה כדי לשחרר את השבב ולחזור הזרוע את מיקומו.
    11. להחזיק את השבב שהורכב בזווית של 45° בקפידה לוותר על הנוזל טבילה עם המזרק דרך היציאה מילוי, לסובב מעט את השבב, ודא כי קיימים אין בועות אוויר ו להסיר את כל הנוזלים העודפים עם מגבון סטרילי.
    12. לאטום את התיק שבב על ידי בעדינות פילינג משם את התווית על גבי שבב פנים העיתונות מעל הנמל למלא לפחות 5 s.
    13. לאחסן את השבב בחושך עד מוכן לטעון הצנטרפוגה תרמי.
      הערה: צ'יפס מוכן אמור לשמש בתוך שעתיים.
  3. תגובה dPCR
    1. פותחים את המכסה, להתקין מתאמי של שני בלוקים, אפילו כאשר בלוק יחיד משמש.
    2. מניחים את הז'יטונים על הרחוב דגימה בתנוחה הנכונה.
      הערה: הנמל המילוי חייב להיות מכוון לכיוון החלק הקדמי של הצנטרפוגה תרמי במיקום גבוה כדי לאפשר בועות אוויר כדי לצוף למעלה מבלי להפריע את החלון של השבב. השתמש שבבי ריק כדי לאזן את שני רחובות.
    3. שכב משטח תרמי על הרחוב דגימה לכסות לגמרי את האסימונים.
    4. סגור את המכסה. ולהתחיל את PCR לרוץ, החלת התנאים הבאים: להחזיק ב 96 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; 45 מחזורים של 60 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ו- 98 ° C ל 30 s; להחזיק ב 60 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; . תחזיק על 4 מעלות צלזיוס. כבה הצנטרפוגה תרמי ואת להפשיר את האסימונים בטמפרטורת החדר במשך לפחות 10 דקות.
      הערה: ניתוח שבב חייב להתבצע בתוך שעה אחת.
  4. ניתוח צ'יפ
    1. פתח את המכסה של הכלי, להסיר את רפידות תרמי ולאחר מכן להסיר את האסימונים המתאמים.
      הערה: אחסן את האסימונים במיקום כהה, נקי עד הניתוח.
    2. לנקות את השטח שבב עם אלכוהול איזופרופיל ולנגב סטרילי.
      הערה: לבדוק כל שבב נזילות או בעיות פוטנציאליות.
    3. הכנס ה-USB לתוך מערכת גלאי כדי לשמור את הנתונים.
    4. פתח את מגש שבב של מערכת גלאי, לטעון את השבב הפנים כלפי מעלה בתנוחה הנכונה ולאחר מכן סגור את המגש.
    5. המתן 30 s לעיבוד, ואז להסיר את השבב והכנס הבא.
    6. מחכים ניתוח להשלים עבור כל האסימונים מעובד ואז להוסיף את ה-USB למחשב. כדי להעביר את הקבצים.
      הערה: הזמן הכולל לניתוח הוא בסביבות 2 דקות 3/שבב.

4. נתוני ניתוח ופרשנות

  1. להתחבר פלטפורמת תוכנה מבוססי ענן הדרושים לביצוע כל הבדיקות במורד הזרם.
  2. יצירת פרוייקט, לייבא את כל קבצי הנתונים של האסימונים של עניין.
  3. הזן את השם מדגם; בחר את צבען ואת וזמינותו להשתמש בכרטיסיה "להגדיר צ'יפס".
  4. לקבוע אם השבב הוא מקובל דמיין זאת בכרטיסיה "סקירת נתונים", בודק איך ביסודיות המדגם היה טעון על גבי השבב, כמה נקודות הנתונים הן להערכה.
    הערה: דוחים צ'יפס עם פחות מ-13,000 נקודות נתונים להערכה.
  5. לעבור העלילה פיזור של השבב שנבחר בצד ימין של המסך. להחיל את הסף של 6,000 עבור אותות צבע (ציר y) כתב amidite (FAM) fluorescein על כל האסימונים.
    הערה: הסף להגדיר עשויים להשתנות על בסיס מבחני בשימוש.
  6. הסרה של סימנים חיוביים מפוקפק כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות על-ידי בחירת המקום היחסי על הפיזור מגרש באמצעות הכלי לאסו והקשה על "לא ידוע". כל נקודות חיוביות הנותרים את נוכחותם cDNA עותקים של המטרה נדיר מנותח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות ההליך המובאת כאן, בדקנו עבור הביטוי של variant התעתיק נדיר CDH1a ברקמות מוקפאות קיבה. ניתוח הנתונים על-ידי dPCR היה הופיעה על 21-זוגי רגיל וסרטן דגימות רקמה 11 דגימות הגידול נוספים. CDH1a היה לזיהוי גידולים 15 מתוך 32 (47%), ואילו דגימות רקמה נורמלית לא הראה הנוכחות של התעתיק נדיר זה5. בניתוח שלנו, נדחו צ'יפס עם פחות מ-13,000 נקודות נתונים, כמו צ'יפס עם טעינת אי-הומוגניות. איור 1 מראה לאסימון בדוגמאות עבור להערכה (איור 1 א') והן הלא-להערכה (איור 1B, ג). במקרה של האחרון, השבב חייב להיות מושלך בשל נוכחותם של בועות מרובים (איור 1B), בלון גדול יחיד (איור 1C), או מספר לא מספיק של נקודות נתונים מעל הסף (איור 1B). דגימות אלה יש להפעיל שוב כדי להשיג תוצאות interpretable. לגבי העלילה פיזור שמספקת התוכנה (איור 2), זה בדרך כלל מתארת את האותות של הכתב FAM לצבוע (ציר y) נגד אותות ויק (קנייניות של היצרן) כתב לצבוע (ציר x). נקודות הנתונים שהוצגו על העלילה פיזור מובחנים זה מזה, כאן, אנחנו רק דמיינו את האותות צבע הכתב FAM בכחול (איור 2 א), המציינת את הבארות שבו המטרה היה מוגבר. אותות אלה הינן ממוקמות קרוב יותר על ציר ה-y ויותר המקור של העלילה. הצבע השני על העלילה הוא צהוב והוא מרמז על הבארות אשר התרחשו ללא הגברה. סף אמין עבור אותות חיוביים היה להגדיר, חלה על כל האסימונים כדי למנוע הטיה השיחה. כאן, הסף שנבחר היה 6000 בהתבסס על הטווח של אותות שנצפו האסימונים שונים בניסויים אלה. CDH1a cDNA עותקים (סימנים כחולים) נמצאו במספר דגימות הגידול, מראה הבדל ברור משרעת מהמודיעין שלילי (איור 2 א). לעומת זאת, אין אותות מעל הסף שנבחר נמצאו בדגימות שליליים CDH1a תורגם, קרי, כל דוגמאות רקמה נורמלית של דגימות הגידול (איור 2B). באופן דומה, אין סימנים חיוביים אותרו ב- NTC שבו מים נוסף במקום cDNA, ומכאן הגשה פקד שלילי עבור התגובה dPCR (איור 2C).

ניתוח שבב בסדר שיש להחיל מסנן באיכות הנמוכה נקודות נתונים, לחסל את הסיכון של תוצאות חד משמעיים. הדבר נעשה על-ידי הצגת השבב כדי לקבוע את המיקום המדויק של האות המתאים חיובי: אם האות כחול ממוקם בנקודת הגבול מאוד של השבב (איור 3A) או סביב בועות (איור 1B), האות משוחררים מניתוח . כדי למנוע עוד יותר את הסיכון של תוצאות חיוביות שגויות, אותות מעל 6,000 עבור הערוץ FAM ו בקצה הימני של העלילה נחשבו כנראה aspecific, היו ובכך מסונן, למרות שהם נרשמו נקודתית בתוך השבב (איור 3B). בדרך זו, מדגם נחשב חיובי עבור הביטוי של תמליל נדיר, CDH1a, אפילו אם זה מראה אות הגברה יחיד, כל עוד האות הזה תואם התנאים הנ.

Figure 1
איור 1 . נציג להערכה אנד להערכה צ'יפס. נקודות כחולות הן בארות שבהם בתמליל CDH1a היה מוגבר; הנקודות הצהובות הם בארות אשר התרחשו ללא הגברה; נקודות לבנות הן בארות ריק. נקודות נתונים מעל הסף נקובים מתחת לכל שבב. (א) שבב להערכה עם כחול אותות מקומי טוב בגבולות של השבב. (B) א שבב להערכה עם פחות מ-13,000 נקודות נתונים מעל הסף. (ג) א שבב להערכה עם בועה גדולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . נציג פיזור PCR דיגיטלי מתווה של CDH1a הביטוי. מגרשים מתארים את אותות לצבוע כתב FAM (ציר y) נגד אותות לצבוע כתב ויק (ציר x). הנקודות כחול הם CDH1a אותות ביטוי חיובי, ואילו הנקודות הצהובות הם האותות "אין הגברה". (א) CDH1a-דוגמה חיובית. (B) CDH1a-דוגמה שלילית. (ג) אין שליטה תבנית (NTC) מציג את הביטוי CDH1a אפס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . ניתוח פיין-צ'יפ נציג של פיזור PCR דיגיטלי מגרשים. בצד השמאל היא התצוגה שבב עם האותות עניין שהתצוגה ב- שחור מרובע, ואילו בצד ימין זה העלילה פיזור המתאימים. (א) סימן כחול מקומי על השבר הנכון של העלילה, אבל על הגבול של השבב. (B) אותות הכחול 3 מודגשים באפור מקומי בקצה הימני של העלילה, אבל בתוך השבב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

dPCR פותחה במקור עבור ה-DNA מדידות מולקולרית10,11,12,13 , בזמן שטכנולוגיה זו הותאמה עבור כימות של מיקרו Rna ו- RNA תעתיקים5, 14,15. ב פרוטוקול זה הרחבנו את רשימת יישומים לכלול גילוי של תעתיקים נדירים נגזר דגימות רקמה מוקפאות. . למטרה הזאת אנחנו מנוצל כמות גבוהה למדי של cDNA (300 ng). למרות כמות זו אינה המרבי יכול לשמש dPCR, זה היה מספיק עבור הגדרת בתנאים מתוקננים להשוות כל הדגימות שלנו. על-ידי קביעת הסף אות florescence בגובה 6000 מתעסק המיקומים של אותות הגברה חיובית על מגרש צ'יפ וגם פיזור, בהצלחה שהבחנו יעד זה נדיר בדגימות רקמת הגידול קיבה.

מאת dPCR, אנחנו לא יכולים לכמת לחלוטין CDH1a, בשל סכום נמוך מאוד של היעד, אבל אנחנו באופן אמין יכול להעריך הנוכחות/היעדר זה התעתיק נדיר. אכן, הטבע כמותית של שיטה זו הוא מוגבל על ידי המספר ההתחלתי של מטרות נוכח דגימות שנותחה7. מידת הרלוונטיות, הטכניקה עצמה נשארת להיות יקר למדי ולא זמן אינטנסיבי. לכן, כאשר נדרש ניתוח דוגמאות רבות ו/או של מספר מטרות, טכניקות חלופיות להתייחס7,8.

זה נאמר, dPCR ללא ספק מספק פלטפורמת האולטימטיבי מדידה רגיש כימות של חומצות גרעין, שכן היא משפרת את הדיוק ואת הפארמצבטית ביחס7,qPCR8. יתר על כן, זה יכול להיחשב זמין השיטה היחידה לניתוח ביטוי גנים נמוך-בשפע חומצות גרעין זה ליד הגבול של רגישות qPCR6.

הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להתאים RNAs מן הטלוויזיה, המאפשר איתור מטרות נדירים, כמו המחקר שלנו. בנוסף, אפשרות להאריך את הבדיקה על כימות מוחלטת של תעתיקים. במקרים כאלה, מספר עותקים/µL שדווחו על-ידי הכלי עבור מדגם נתון חייב להיות פשוט מוכפל שעוצמת התגובה טעון, מחולק לפי כמות cDNA הראשונית. כדי להתגבר על השתנות המיוצר על ידי שעתוק לאחור, גנים ספציפיים כיילים צריך להיות כלול, במידת האפשר6. במבט לעתיד, dPCR בעלת פוטנציאל רב להיות פלטפורמת תקן הזהב, לא רק זיהוי רצף נדיר, אבל גם מוטציה נדירה זיהוי, כימות מספר7העתק מדויק. זה רלוונטי במיוחד בעוד פסיפס גנטי, גם כן כמו לחקר הסרטן שבו הגידול הזה יכול להשפיע התוצאה הקלינית של החולה ואת התגובה לטיפול.

מעשי מנקודת המבט, בעת הגדרת פרוטוקול dPCR ישנם מספר השלבים הקריטיים זה חייב להיות מודגשים. קודם כל, תערובת התגובה המכיל את הכמות המתאימה של cDNA בהתבסס על רמת ביטוי היעד צפוי, יועברו בקפידה רבה החרב טעינה כדי לא ליצור בועות אוויר, אשר עלולה להפריע מדגם הומוגניות. בנוסף, ללהב עצמו קודם שנמצאת. שמסמכי; אחרת זה יכול לגרום התפלגות הדגימה לא אחידה. יתר על כן, מספיק ציפוי עם טבילה נוזלים ומדויק איטום המכסה תמיד להתבצע. לגבי שבב עיבוד וניתוח, חשוב להיות מודעים לאפשרות של צבירת עיבוי על השבב; בתרחיש כזה, השבב צריך להיות מחה מחדש עם אלכוהול איזופרופיל וניתח מחדש. יתר על כן, כפי dPCR מבוסס על סטטיסטיקה פואסון, מספר מינימלי של הנתונים להערכה נקודות (> 10,000) חייב להיות נוכח על השבב, אחרת הדגימה צריכה לפעול שוב. לבסוף, לניסויים איתור עותק היעד נמוך, גורם קריטי מבלבלים יכול להיות יחס אות לרעש, אבל מיצוב הסף אמין יכול לעזור בזיהוי אותות חיובי מאוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מדווחים שאין ניגודי אינטרסים לעבודה זו.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות Gráinne טירני לסיוע העריכה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TRIazol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018
Glycogen 20 mg/ml ROCHE 10901393001
RNeasy MinElute Cleanup kit QIAGEN 74204
iScript cDNA Synthesis kit BioRad 1708891
QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2 Thermo Fisher Scientific A26358
CDH1a IDT custom designed assay Integrated DNA Technologies (IDT) NA F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG
(R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG
(P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/
[dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F),        900 nM (R), 250 nM (P)]
QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 Thermo Fisher Scientific A26316
Heraeus Biofuge Fresco Thermo  Scientific 75002402
Thermocycler (Labcycler) Sensoquest 011-103
GeneAmp PCR System 9700 Thermo Fisher Scientific N805-0200
Dual Flat Block Sample Module Thermo Fisher Scientific 4425757
QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700 Thermo Fisher Scientific 4486414
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific 4485513
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader Thermo Fisher Scientific 4482592
QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord Thermo Fisher Scientific 4489084

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule E-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
  2. Carneiro, P., et al. E-cadherin dysfunction in gastric cancer: cellular consequences, clinical applications and open questions. FEBS Lett. 586 (18), 2981-2989 (2012).
  3. Corso, G., et al. Somatic mutations and deletions of the E-cadherin gene predict poor survival of patients with gastric cancer. J Clin Oncol. 31 (7), 868-875 (2013).
  4. Pinheiro, H., et al. Transcription initiation arising from E-cadherin/CDH1 intron2: a novel protein isoform that increases gastric cancer cell invasion and angiogenesis. Hum Mol Genet. 21 (19), 4253-4269 (2012).
  5. Abou Khouzam, R., et al. Digital PCR identifies changes in CDH1 (E-cadherin) transcription pattern in intestinal-type gastric cancer. Oncotarget. 8 (12), 18811-18820 (2017).
  6. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Sci Rep. 7 (1), (2017).
  7. Basu, A. S. Digital Assays Part I: Partitioning statistics and digital PCR. SLAS Technol. 22 (4), 369-386 (2017).
  8. Huggett, J. F., Whale, A. Digital PCR as a novel technology and its potential implications for molecular diagnostics. Clin Chem. 59 (12), 1691-1693 (2013).
  9. Alikian, M., et al. RT-qPCR and RT-Digital PCR: A comparison of different platforms for the evaluation of residual disease in chronic myeloid leukemia. Clin Chem. 63 (2), 525-531 (2017).
  10. Hoshino, T., Inagaki, F. Molecular quantification of environmental DNA using microfluidics and digital PCR. Syst Appl Microbiol. 35 (6), 390-395 (2012).
  11. Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
  12. Tessitore, M. V., et al. Detection of newly produced T and B lymphocytes by digital PCR in blood stored dry on nylon flocked swabs. J.Transl.Med. 15 (1), (2017).
  13. Sho, S., et al. Digital PCR Improves mutation analysis in pancreas fine needle aspiration biopsy specimens. PLoS One. 12 (1), e0170897 (2017).
  14. Conte, D., et al. Novel method to detect microRNAs using chip-based QuantStudio 3D digital PCR. BMC Genomics. 16, 849 (2015).
  15. Sanders, R., Mason, D. J., Foy, C. A., Huggett, J. F. Evaluation of digital PCR for absolute RNA quantification. PLoS One. 8 (9), e75296 (2013).

Tags

לחקר הסרטן גיליון 132 CDH1a dPCR התעתיק נדיר משתנה סרטן קיבה רקמות מוקפאות גידול רקמות הרקמות
זיהוי של Variant התעתיק נדיר <em>CDH1</em> ברקמות מוקפאות סרטן קיבה על ידי מבוססי שבב דיגיטלי PCR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Molinari, C., Abou Khouzam, R.,… More

Molinari, C., Abou Khouzam, R., Salvi, S., Rossi, T., Ranzani, G. N., Calistri, D. Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR. J. Vis. Exp. (132), e57066, doi:10.3791/57066 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter