基于芯片的数字 PCR 检测新鲜冷冻胃癌组织中的一个CDH1罕见转录变体
Summary
该手稿描述了一种基于芯片的数字 PCR 方法, 用于检测从胃癌患者中获得的新鲜冰冻正常和肿瘤组织中罕见的CDH1转录变体 (CDH1a)。
Abstract
CDH1a是CDH1基因的非规范化转录, 它被发现在一些胃癌 (GC) 细胞系中表达, 而在正常的胃粘膜中没有。最近, 我们在 GC 患者的新鲜冰冻肿瘤组织中检测到了CDH1a成绩单变体。本文采用基于芯片的数字 PCR (dPCR) 方法, 研究了该变异体在组织样品中的表达。dPCR 提供了一个准确的, 强健的, 高度敏感的核酸测量的潜力, 并越来越多地用于不同领域的应用。dPCR 能探测稀有目标;此外, dPCR 提供了绝对和精确的核酸定量的可能性, 不需要校准仪和标准曲线。事实上, 反应分区从背景中丰富了目标, 提高了放大效率和对抑制剂的耐受性。这样的特性使 dPCR 成为检测CDH1a稀有脚本的最佳工具。
Introduction
CDH1基因对 e-钙黏蛋白进行编码, 这是通过调节细胞黏附、存活、增殖和迁移来维持正常胃上皮的关键因素,1。由于CDH1的有害系或体细胞的改变而导致 e-钙黏附蛋白的丧失, 已与 GC23的开发相关。来自基因内含子2的非规范转录也被假设在胃癌癌变中起到一定作用4,5。特别是, 一个这样的成绩单, CDH1a, 已被证明是用 GC 细胞系表达, 但没有从正常胃4。最近, 我们在 gc 患者使用基于芯片的 dPCR5中检测到气相色谱组织样本中的CDH1a 。dPCR 用于第一次评估在肠道 GC 和正常组织中存在的 CDH1a基因转录。
测定基因表达的金标准方法是实时定量 PCR (qPCR)。但是, 结果数据有时可能是可变的, 质量较差, 尤其是当样本中的目标级别较低时。这种变化可能是由污染物引起的, 它抑制聚合酶活性和底漆退火, 导致非特异的放大和竞争性的副反应6。
虽然 dPCR 的基本生物化学原理与 qPCR 相似, 但 dPCR 显示出一些优势, 允许对基因组 dna (gDNA)/互补 dna (cDNA) 分子进行非常精确的测量。事实上, dPCR 是一个最终点的反应, 它依赖于将一个样本的标定分成数千个井, 因此每个井都包含零个或一个目标分子。放大然后发生在包含目标的拷贝的井, 并且由一个萤光信号指示。然后, 通过用二项式泊松统计值确定正向总分区的比值来计算原始样本中的目标分子的绝对数量7。
此外, dPCR 技术消除了运行标准曲线的需要, 从而避免了相关的偏差和可变性, 从而可以直接量化目标8,9;由于其对抑制剂的高耐受性, 它可以独立于污染物和效率产生更精确和可重现的结果10;它比 qPCR 更灵敏、更特异, 因此是检测稀有靶点的可靠方法。最后, 将样本分成多个反应, 减少了与背景分子的竞争, 提高了目标检测的极限, 使放大成为可能, 并促进了单分子 gDNA/cDNA 的检测6.以芯片为基础的核酸的检测和定量 dPCR 已越来越多地应用于拷贝数变异, DNA 片段的量化, 和突变分析11,12,13, 给出精度和低材料输入要求的方法。另外, dPCR 最近被集成了入分析 rna14和基因抄本5,15。
Protocol
Representative Results
Discussion
dPCR 最初开发了为脱氧核糖核酸分子测量10,11,12,13 , 并且在时间这技术是适应的定量的 rna 并且 RNA 抄本5, 14,15。在本协议中, 我们扩展了应用程序列表, 包括检测来自新鲜冰冻组织样本的稀有记录。为此, 我们使用了相当高的 cDNA (300 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者希望感谢 Gráinne 蒂尔尼的编辑协助。
Materials
| TRIazol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Glycogen 20 mg/ml | ROCHE | 10901393001 | |
| RNeasy MinElute Cleanup kit | QIAGEN | 74204 | |
| iScript cDNA Synthesis kit | BioRad | 1708891 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2 | Thermo Fisher Scientific | A26358 | |
| CDH1a IDT custom designed assay | Integrated DNA Technologies (IDT) | NA | F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F), 900 nM (R), 250 nM (P)] |
| QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 | Thermo Fisher Scientific | A26316 | |
| Heraeus Biofuge Fresco | Thermo Scientific | 75002402 | |
| Thermocycler (Labcycler) | Sensoquest | 011-103 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | N805-0200 | |
| Dual Flat Block Sample Module | Thermo Fisher Scientific | 4425757 | |
| QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | 4486414 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4485513 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader | Thermo Fisher Scientific | 4482592 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord | Thermo Fisher Scientific | 4489084 |
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