चिप आधारित डिजिटल पीसीआर द्वारा ताजा जमे हुए गैस्ट्रिक कैंसर ऊतकों में एक CDH1 दुर्लभ प्रतिलिपि संस्करण का पता लगाने
Summary
पांडुलिपि का वर्णन एक चिप आधारित डिजिटल पीसीआर परख एक दुर्लभ CDH1 प्रतिलिपि प्रकार (CDH1a) ताजा जमे हुए सामांय और ट्यूमर गैस्ट्रिक कैंसर के साथ रोगियों से प्राप्त ऊतकों में पता लगाने के लिए ।
Abstract
CDH1a, एक गैर CDH1 जीन के विहित प्रतिलिपि, कुछ गैस्ट्रिक कैंसर में व्यक्त किया जा पाया गया है (जीसी) सेल लाइनों, जबकि यह सामांय गैस्ट्रिक म्यूकोसा में अनुपस्थित है । हाल ही में, हम नए सिरे से जमे हुए ट्यूमर के साथ GC रोगियों से प्राप्त ऊतकों में CDH1a प्रतिलिपि संस्करण का पता लगाया । ऊतक नमूनों में इस वैरिएंट की अभिव्यक्ति की जांच चिप आधारित डिजिटल पीसीआर (dPCR) के दृष्टिकोण से यहां प्रस्तुत की गई. dPCR न्यूक्लिक एसिड की एक सटीक, मजबूत, और अत्यधिक संवेदनशील माप के लिए क्षमता प्रदान करता है और तेजी से विभिन्न क्षेत्रों में कई अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है । dPCR दुर्लभ लक्ष्यों का पता लगाने में सक्षम है; इसके अलावा, dPCR औजार और मानक curves के लिए की आवश्यकता के बिना न्यूक्लिक एसिड की निरपेक्ष और सटीक ठहराव के लिए संभावना प्रदान करता है । वास्तव में, प्रतिक्रिया विभाजन पृष्ठभूमि है, जो प्रवर्धन क्षमता और अवरोधकों को सहिष्णुता में सुधार से लक्ष्य को समृद्ध करता है । इस तरह की विशेषताओं का पता लगाने के लिए dPCR एक इष्टतम उपकरण बनाने के CDH1a दुर्लभ प्रतिलिपि ।
Introduction
ई-cadherin, सेल आसंजन, अस्तित्व, प्रसार, और प्रवासन के विनियमन के माध्यम से सामांय गैस्ट्रिक उपकला के रखरखाव में शामिल एक प्रमुख कारक के लिए CDH1 जीन encodings1। बचके germline या CDH1 के दैहिक परिवर्तन का एक परिणाम के रूप में ई cadherin प्रोटीन की हानि जीसी2,3के विकास के साथ जुड़ा हुआ है । गैर विहित टेप जीन के 2 intron से उत्पंन भी गैस्ट्रिक कैंसरजनन4में एक भूमिका निभाने के लिए परिकल्पना की गई है,5। विशेष रूप से, एक ऐसी प्रतिलिपि, CDH1a, GC सेल लाइनों में व्यक्त किया जा दिखाया गया है, लेकिन सामांय पेट4से अनुपस्थित है । हमने हाल ही में gc रोगियों से जीसी ऊतक के नमूनों में चिप-आधारित dPCR5का उपयोग कर CDH1a का पता लगाया. dPCR का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, पहली बार के लिए, CDH1a जीन प्रतिलिपि के आंत्र GC में और सामांय ऊतक में उपस्थिति ।
सोने मानक विधि जीन अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) है । हालांकि, परिणामी डेटा कभी भी चर और खराब गुणवत्ता का हो सकता है, खासकर जब नमूना में लक्ष्य का स्तर कम है । यह परिवर्तनशीलता दूषित होने की वजह से हो सकता है, जो पोलीमरेज़ गतिविधि और प्राइमरी एनीलिंग को बाधित करते हैं, गैर-विशिष्ट प्रवर्धन और प्रतिस्पर्धी पक्ष प्रतिक्रियाओं6के लिए अग्रणी ।
हालांकि dPCR के बुनियादी जैव रासायनिक सिद्धांतों qPCR के उन लोगों के समान हैं, dPCR कुछ लाभ से पता चलता है, जीनोमिक डीएनए (gDNA)/complementary डीएनए (सीडीएनए) अणुओं की बहुत सटीक माप के लिए अनुमति देता है । दरअसल, dPCR एक अंत बिंदु प्रतिक्रिया है कि कुओं के हजारों में एक नमूने के नपे विभाजन पर निर्भर करता है, ताकि प्रत्येक अच्छी तरह से शूंय या एक एकल लक्ष्य अणु शामिल है । प्रवर्धन तो केवल लक्ष्य की एक प्रति युक्त कुओं में होता है और एक फ्लोरोसेंट संकेत द्वारा संकेत दिया है । मूल नमूने में लक्ष्य अणुओं की निरपेक्ष संख्या तो कुल द्विपद Poisson सांख्यिकी7का उपयोग कर विभाजन के लिए सकारात्मक के अनुपात का निर्धारण करके गणना की जा सकती है ।
इसके अलावा, dPCR तकनीक एक मानक वक्र चलाने के लिए की जरूरत समाप्त और, इसलिए, संबद्ध पूर्वाग्रह और परिवर्तनशीलता, लक्ष्य8,9के एक प्रत्यक्ष ठहराव के लिए अनुमति; यह अवरोधकों के लिए अपनी उच्च सहिष्णुता के कारण संदूषणों और दक्षता के स्वतंत्र रूप से और अधिक सटीक और प्रतिलिपि परिणाम पैदा करता है10; यह अधिक संवेदनशील और qPCR से विशिष्ट है, और इस प्रकार एक दुर्लभ लक्ष्य का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय तरीका है । अंत में, कई प्रतिक्रियाओं में नमूने के विभाजन पृष्ठभूमि अणुओं के साथ प्रतिस्पर्धा को कम कर देता है और लक्ष्य का पता लगाने की सीमा में सुधार, प्रवर्धन संभव बनाने और gDNA/सीडीएनए 6 के एकल अणुओं का पता लगाने की सुविधा . पता लगाने और चिप आधारित dPCR द्वारा न्यूक्लिक एसिड की ठहराव तेजी से संख्या में भिन्नता, डीएनए टुकड़े की ठहराव, और उत्परिवर्तन विश्लेषणों के लिए लागू किया गया है11,12,13, दिया विधि की परिशुद्धता और कम सामग्री इनपुट की आवश्यकता । इसके अलावा, dPCR हाल ही में दोनों microRNAs14 और जीन टेप5,15के विश्लेषण में एकीकृत किया गया है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
dPCR मूल रूप से डीएनए के लिए विकसित किया गया था आणविक माप10,11,12,13 और समय में इस प्रौद्योगिकी microRNAs और आरएनए के ठहराव के लिए अनुकूलित किया गया था5, <sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को संपादकीय सहायता के लिए Gráinne Tierney शुक्रिया अदा करना चाहता हूं ।
Materials
| TRIazol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Glycogen 20 mg/ml | ROCHE | 10901393001 | |
| RNeasy MinElute Cleanup kit | QIAGEN | 74204 | |
| iScript cDNA Synthesis kit | BioRad | 1708891 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2 | Thermo Fisher Scientific | A26358 | |
| CDH1a IDT custom designed assay | Integrated DNA Technologies (IDT) | NA | F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F), 900 nM (R), 250 nM (P)] |
| QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 | Thermo Fisher Scientific | A26316 | |
| Heraeus Biofuge Fresco | Thermo Scientific | 75002402 | |
| Thermocycler (Labcycler) | Sensoquest | 011-103 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | N805-0200 | |
| Dual Flat Block Sample Module | Thermo Fisher Scientific | 4425757 | |
| QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | 4486414 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4485513 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader | Thermo Fisher Scientific | 4482592 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord | Thermo Fisher Scientific | 4489084 |
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